KR102174019B1 - 더덕과 만삼을 구별하기 위한 엽록체 서열 기반 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 더덕과 만삼을 구별하기 위한 엽록체 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 분자마커는 더덕과 만삼을 간단하고 신속하게 구별할 수 있으므로 더덕과 만삼 식물의 원료가 혼용되는 것을 효과적으로 방지할 수 있을 것이다.

Description

더덕과 만삼을 구별하기 위한 엽록체 서열 기반 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker based on chloroplast sequence for discriminating Codonopsis lanceolata and Codonopsis pilosula and uses thereof}

본 발명은 더덕과 만삼을 구별하기 위한 엽록체 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

더덕(Codonopsis lanceolata)은 초롱꽃과(Companulaceae)에 속하는 다년생의 쌍자엽 식물로 한국, 일본, 중국 및 러시아 극동지방 등 습기가 있는 초지, 숲 또는 계곡에 자생하는 식물이다. 더덕의 건조된 뿌리는 양유(羊乳)라는 생약명의 한약재로 사용되고 있으며, 폴리아세틸렌(polyacetylene), 페닐프로파노이드(phenylpropanoid), 알칼로이드(alkaloid), 트리테르페노이드(triterpenoid), 다당류 또는 사포닌 등이 많이 함유되어 있다. 사포닌은 기침을 멎게 하고 가래를 억제하는 효과, 기관지염, 편도선염, 인후염 등의 호흡기 질환에 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

만삼(C. pilosula)은 초롱꽃과에 속하는 덩굴성 다년생 식물로 한국, 중국 등에서 자생하는 식물이다. 만삼의 건조된 뿌리는 당삼(黨蔘)이라는 생약명의 한약재로 사용되고 있으며, 강장, 건위, 조혈, 혈압강하, 진해거담 작용 등에 사용된다. 이처럼 국내에는 더덕과 만삼이 다양한 용도의 약재 및 식용으로 사용되고 있으나, 뿌리를 말려 가공되어 유통되는 한약재 시장에서는 육안으로 더덕과 만삼 원료를 식별하는데 제한적이기 때문에 정확한 원료판별 시스템이 요구된다.

약용식물의 판별방법으로는 크게 (1) 형태적 판별, (2) 이화학적 판별, (3) DNA 분자마커를 이용한 판별 등으로 나눌 수 있다. 식물의 형태적 특성에 의한 판별은 주로 판별코자 하는 식물의 화기의 구조 및 모양, 지상부 및 지하부의 형태 등 외관상 특징으로 구분하는 것이 일반적이다. 식물의 형태적 판별은 근연속실생식물의 종간 구분이 어려우며, 질적형질보다는 양적형질인 경우도 많아 재배 환경에 따른 변이가 일어날 수도 있을 뿐만 아니라, 타식에 의한 혼연 종 발생이 빈번하여 식물 종간 형태적 구분이 어렵다. 특히 약용식물은 약용부위에 따라 박피, 절편, 건조 등 다양한 방법으로 가공 유통되므로 전문가가 아니면 구분이 어려운 실정이다. 이화학적 성분분석에 의한 판별의 경우 분석을 위한 시간과 노력이 많이 들며, 약용식물의 재배환경 및 생육조건에 따라 약리적 성분에 변화가 올 수 있어 판별에 한계가 있다. DNA 분석에 의한 분자생물학적 식물판별기술은 위와 같은 문제점을 해결하기 위한 도구로서 인정받고 있는데, DNA 유전체는 환경의 변화에 따른 변화가 없으며, 가공 유통되어 식물 원재료를 쉽게 판별할 수 없는 한약재의 판별에도 유용하게 이용될 수 있다.

분자마커란 중합효소연쇄반응(Polymorphism Chain Reaction) 기술을 사용하여 다형성을 검출하는 방법으로 기본적으로 간단하고 신속하며 재배환경이나 식물의 발육단계, 연구자의 주관성 등 여러 환경적 요인으로부터 결과에 영향을 받지 않는다. InDel 마커는 DNA의 염기서열에서 삽입(insertion) 되거나 결실(deletion) 되어진 염기서열을 분자표지로 탐색하여 사용한다. cpInDel이란 엽록체 DNA 부위에 존재하는 InDel 부위를 말하며 비교적 엽록체 게놈 내에 고루 분포한다. 또한 특정 유전자 부위에 존재하여 아미노산의 종류를 결정짓는 코돈의 일부가 아니기 때문에 자연선발의 대상이 아니며, 표현형에 있어서 공우성의 특징을 나타낸다.

한편, 한국등록특허 제2010279호에는 '더덕 속에서 더덕 종을 구별하기 위한 분자마커 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제1954673호에는 '더덕 품종 구별을 위한 분자마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 더덕과 만삼을 구별하기 위한 엽록체 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 더덕 속 식물인 더덕(Codonopsis lanceolata)과 만삼(C. pilosula)의 엽록체 유전체 정보를 비교하여 cplP 유전자에서 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 분자마커를 개발하였고, 상기 InDel 분자마커를 이용하여 더덕과 만삼 시료를 대상으로 PCR을 수행한 결과, 본 발명의 InDel 분자마커가 더덕과 만삼을 정확하게 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 더덕(Codonopsis lanceolata)과 만삼(C. pilosula) 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 더덕과 만삼 구별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 더덕 또는 만삼 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 더덕과 만삼을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 InDel 분자마커는 더덕과 만삼을 신속하고 정확하게 판별할 수 있으므로, 한약재로 가공되어 국내 한약재 시장에서 유통되는 더덕과 만삼 식물의 원료 혼용 방지 및 원료 품질관리에 대한 지표로서 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 Cs_D_CpInDel 마커를 이용하여 더덕(Codonopsis lanceolata)과 만삼(C. pilosula)을 구별한 PCR 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 더덕(Codonopsis lanceolata)과 만삼(C. pilosula) 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 만삼에서는 확인되지 않으나, 더덕의 엽록체 게놈의 cplP 유전자 서열에서만 특이적으로 삽입된 45bp 염기를 증폭할 수 있는 프라이머 세트로, 더덕과 만삼을 각각 특이적으로 구분할 수 있는 프라이머 세트이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 더덕(Codonopsis lanceolata)과 만삼(C. pilosula) 구별용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

더덕 또는 만삼 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 더덕(Codonopsis lanceolata)과 만삼(C. pilosula)을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 더덕 또는 만삼의 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 더덕 또는 만삼의 시료는 이에 한정되지 않으나, 더덕 또는 만삼으로 의심되는 식물체의 뿌리, 혹은 이의 절편형태로 가공된 산물일 수 있다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 더덕과 만삼을 구별하기 위한 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 더덕 및 만삼 식물 자원수집 및 DNA 추출

실험에 사용된 더덕(C. lanceolata)과 만삼(C. pilosula) 식물은 충북대학교 특용식물학과에서 수집하여 -80℃의 초저온 냉동고에 보관하였다. 더덕과 만삼의 어린 잎을 채취하여 액체질소로 동결시키고 막자사발을 이용하여 분쇄한 후 CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) 방법으로 DNA를 추출하고 Tris-EDTA 버퍼에 용출하였다.

2. 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 DNA 증폭

CTAB 방법을 사용하여 추출한 더덕과 만삼의 DNA를 5 ng/㎕로 희석하여 DNA 2㎕(DNA 10ng), 프라이머 혼합물 2㎕(2μM의 정방향 프라이머 1㎕, 2μM의 역방향 프라이머 1㎕), Taq mixture 10㎕, 증류수 6㎕을 혼합하여 20㎕의 PCR 반응 혼합물을 만들었다. PCR 과정은 전변성 95℃ 5분; 변성(denaturation) 95℃ 30초, 결합(annealing) 51℃ 30초, 신장(extension) 72℃ 1분의 과정을 총 34회 반복; 최종 신장 72℃ 10분의 조건으로 수행하였다. PCR 증폭 산물은 3% 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인하였다.

3. PCR 에 사용된 엽록체 기반 InDel 마커

PCR에 사용된 엽록체 기반 InDel 마커 증폭용 프라이머 세트 개발을 위한 엽록체 염기서열은 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, https://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 얻은 더덕의 엽록체 서열(MH018574.1)과 충북대학교 특용식물학과에서 만삼의 genomic DNA를 분석하여 얻은 만삼의 엽록체 염기서열을 이용하였다. 그 후, CLC Main Workbewnch program(version 8.0.1)을 이용하여 비교 분석하여 더덕과 만삼 엽록체 게놈의 cplP 유전자에 존재하는 45bp의 염기서열이 더덕에서는 삽입되고 만삼에서는 결실된 것을 확인하였다(표 1). 또한, 더덕의 엽록체 게놈 서열에서 특이적으로 삽인된 영역을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 Codonopsis species_discrimination_chloroplast_InDel(이하, Cs_D_CpInDel) 마커를 개발하였다(표 2).

더덕 InDel 다형성 염기서열 정보

더덕 (MH018574.1; 77,000∼77,200bp 사이에서 45bp 염기서열 삽입) (서열번호 3)

GATTTGCATATATAGGACAAATACTCCCATTACCACTTCTTTTTTCTCAATTCATGCATTCCAAAAAATAATTGTAGTCTTCATGCATATTACTCG ATTGATTAAGAGACCAGTTTAAGATCACTTCTATTTACAAATAAA ATTGATTAAGAGAACAGTTTAAGATCACTTCTATTTACAAATAAATTAATATAAGGAGTA

굵은 글씨 및 밑줄: 염기서열이 삽입된 위치.

Ada_D_CpInDel 마커의 프라이머 염기서열 정보

프라이머명	서열(5'→3')
Cs_D_CpInDel_Fwd	CTCCCATTACCACTTCTTT (서열번호 1)
Cs_D_CpInDel_Rev	AGTATCTTGGCTCCGTTT (서열번호 2)

실시예 1. InDel 분자마커를 이용한 더덕과 만삼의 구별

상기 개발된 분자마커 Cs_D_CpInDel가 더덕과 만삼을 판별할 수 있는지 검증하기 위해 더덕과 만삼 DNA 시료를 주형으로 PCR 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 1에 개시된 것과 같이 더덕과 만삼에서 각각 228bp, 183bp의 서로 다른 크기의 밴드가 확인되어, 더덕과 만삼 식물체가 정확하게 구별되는 것을 확인하였다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker based on chloroplast sequence for discriminating Codonopsis lanceolata and Codonopsis pilosula and uses thereof <130> PN19344 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctcccattac cacttcttt 19 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agtatcttgg ctccgttt 18 <210> 3 <211> 201 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Codonopsis lanceolata <400> 3 gatttgcata tataggacaa atactcccat taccacttct tttttctcaa ttcatgcatt 60 ccaaaaaata attgtagtct tcatgcatat tactcgattg attaagagac cagtttaaga 120 tcacttctat ttacaaataa aattgattaa gagaacagtt taagatcact tctatttaca 180 aataaattaa tataaggagt a 201

Claims (5)

1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 더덕(Codonopsis lanceolata)과 만삼(C. pilosula) 구별용 프라이머 세트.
2. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 더덕(Codonopsis lanceolata)과 만삼(C. pilosula) 구별용 키트.
3. 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
4. 더덕 또는 만삼 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 더덕(Codonopsis lanceolata)과 만삼(C. pilosula)을 구별하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.

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