KR102212054B1 - 오미자 종을 구별하기 위한 엽록체 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오미자 종을 구별하기 위한 엽록체 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 분자마커는 오미자, 흑오미자 및 남오미자를 간단하고 신속하게 구별할 수 있으므로 오미자 식물의 원료가 혼용되는 것을 효과적으로 방지할 수 있을 것이다.

Description

오미자 종을 구별하기 위한 엽록체 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker based on chloroplast genome sequence for discriminating Schisandrae Fructus and uses thereof}

본 발명은 오미자 종을 구별하기 위한 엽록체 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

국내 오미자(Schisandra chinensis)는 인삼을 제외한 특용작물(도라지, 더덕, 둥글레, 땅두릅, 오가피, 오미자, 산수유, 삽주, 칡 등) 재배 면적 중 약 18%를 차지하고 있으며, 식용 및 약용으로 활용되어 경제적, 산업적으로 중요한 작물이다. 오미자는 오미자나무과(Schisandraceae)에 속하고, 국내에 2속 3종이 분포하고 있으며 이 중 대한약전에서 약으로 사용 가능하게 지정된 종은 오미자(S. chinensis)이다. 오미자의 주요 성분은 리그난(lignan)과 트리테르페노이드(triterpenoid)이며 전신쇠약, 정신적·육체적 피로, 신경쇠약, 저혈압, 심장기능 저하 등에 효능을 가지고 있다. 그 외 오미자나무과에 속하는 남오미자(Kadsura japonica)는 국내 남부 도서지역과 제주도 저지대의 온난한 지역에 분포 하고 있으며 약용으로는 거의 이용하지 않고 있다. 흑오미자(Schisandra repanda)는 국내 제주도 한라산의 국소지역에서 자생하는 특산 식물로서, 식용 및 약용으로 효과가 있으나 대한약전 등에서 한약재 용도로 지정되어 있지 않다. 각 오미자는 주요 약리 성분 및 이에 따른 효능의 차이로 사용되는 용도가 다르므로, 혼·오용의 문제가 발생하는 것을 방지하기 위해 정확한 원료 판별 시스템이 요구된다.

약용식물의 판별방법으로는 크게 (1) 형태적 판별, (2) 이화학적 판별, (3) DNA 분자마커를 이용한 판별 등으로 나눌 수 있다. 식물의 형태적 특성에 의한 판별은 주로 판별코자 하는 식물의 화기의 구조 및 모양, 지상부 및 지하부의 형태 등 외관상 특징으로 구분하는 것이 일반적이다. 식물의 형태적 판별은 근연속실생식물의 종간 구분이 어려우며, 질적형질보다는 양적형질인 경우도 많아 재배 환경에 따른 변이가 일어날 수도 있을 뿐만 아니라, 타식에 의한 혼연 종 발생이 빈번하여 식물 종간 형태적 구분이 어렵다. 특히 약용식물은 약용부위에 따라 박피, 절편, 건조 등 다양한 방법으로 가공 유통되므로 전문가가 아니면 구분이 어려운 실정이다. 이화학적 성분분석에 의한 판별의 경우 분석을 위한 시간과 노력이 많이 들며, 약용식물의 재배환경 및 생육조건에 따라 약리적 성분에 변화가 올 수 있어 판별에 한계가 있다. DNA 분석에 의한 분자생물학적 식물판별기술은 위와 같은 문제점을 해결하기 위한 도구로서 인정받고 있는데, DNA 유전체는 환경의 변화에 따른 변화가 없으며, 가공 유통되어 식물 원재료를 쉽게 판별할 수 없는 한약재의 판별에도 유용하게 이용될 수 있다.

분자마커란 중합효소연쇄반응(Polymorphism Chain Reaction) 기술을 사용하여 다형성을 검출하는 방법으로 기본적으로 간단하고 신속하며 재배환경이나 식물의 발육단계, 연구자의 주관성 등 여러 환경적 요인으로부터 결과에 영향을 받지 않는다. InDel 마커는 DNA의 염기서열에서 삽입(insertion) 되거나 결실(deletion) 되어진 염기서열을 분자표지로 탐색하여 사용한다. cpInDel이란 엽록체 DNA 부위에 존재하는 InDel 부위를 말하며 비교적 엽록체 게놈 내에 고루 분포한다. 또한 특정 유전자 부위에 존재하여 아미노산의 종류를 결정짓는 코돈의 일부가 아니기 때문에 자연선발의 대상이 아니며, 표현형에 있어서 공우성의 특징을 나타낸다.

한편, 한국등록특허 제1299557호에는 '오미자 종 식별 SNP 마커, 이를 이용한 오미자 종 식별 방법 및 오미자 종 식별 키트'가 개시되어 있으나, 본 발명의 오미자 종을 구별하기 위한 엽록체 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 오미자(만생종, 중생종, 조생종 및 재래종), 흑오미자 및 남오미자의 엽록체 유전체 정보를 비교하여 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 분자마커를 개발하였고, 상기 InDel 분자마커를 이용하여 오미자, 흑오미자 및 남오미자를 대상으로 PCR을 수행한 결과, 본 발명의 InDel 분자마커가 각각의 오미자 종을 정확하게 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 오미자 종 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 오미자 종 구별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 오미자 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 오미자 종을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 InDel 분자마커는 오미자, 흑오미자 및 남오미자를 신속하고 정확하게 판별할 수 있으므로, 한약재로 가공되어 국내 한약재 시장에서 유통되는 오미자의 원료 혼용 방지 및 원료 품질관리에 대한 지표로서 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 cpInDel marker 1 set(A)와 cpInDel marker 2 set(B)의 증폭산물을 포함하는 약 2kb의 염기서열을 NCBI database에 공개된 유전자 정보와 비교 분석한 결과로, NCBI database 분석 결과 중 상위에 매칭된 10개의 유전자를 나타내었다. ANP25649.1(NADH dehydrogenase subunit 5, Schisandra chinensis), YP_009378460.1(NADH dehydrogenase subunit 5, Schisandra chinensis), AXR89807.1(NADH-plastoquinone oxidoreductase subunit 5 partial, Schisandra henryi), AXR89389.1(NADH-plastoquinone oxidoreductase subunit 5 partial, Schisandra henryi), AXR89473.1(NADH-plastoquinone oxidoreductase subunit 5 partial, Schisandra henryi), AXR89244.1(NADH-plastoquinone oxidoreductase subunit 5, Schisandra henryi), AXR89639.1(NADH-plastoquinone oxidoreductase subunit 5 partial, Schisandra henryi), YP_009467111.1(NADH-plastoquinone oxidoreductase subunit 5, Schisandra sphenanthera), QCS25129.1(NADH-plastoquinone oxidoreductase subunit 5, Kadsura longipedunculata), QCS25126.1(hypothetical chloroplast RF21, Kadsura longipedunculata), YP_009467108.1(hypothetical chloroplast RF21, Schisandra sphenanthera), AXR89304.1(hypothetical protein RF2, Schisandra henryi), ANP25646.1(Ycf2, Schisandra chinensis), YP_009378456.1(Ycf2, Schisandra chinensis), YP_009544191.1(Ycf2, Kadsura coccinea), YP_009365393.1(Ycf2, Illicium floridanum), YP_009365787.1(Ycf2, Illicium verum), YP_009366966.1(Ycf2, Illicium anisatum).
도 2는 본 발명의 cpInDel marker 1 set(A)와 cpInDel marker 2 set(B)를 이용한 PCR 증폭산물을 아가로스 겔에 전기영동한 결과이다. 오미자, Schisandra chinensis; 흑오미자, S. repanda; 남오미자, Kadsura japonica.
도 3은 본 발명의 cpInDel marker 1 set(A)와 cpInDel marker 2 set(B)를 이용한 PCR 증폭산물의 Fragment Analyze^TM Automated CE System을 이용한 분석결과이다. 오미자, Schisandra chinensis; 흑오미자, S. repanda; 남오미자, Kadsura japonica.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 오미자 종 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 상기 오미자 종은 오미자(Schisandra chinensis), 남오미자(Kadsura japonica) 및 흑오미자(S. repanda)일 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 2개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 2개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다. 상기 2개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 오미자 종을 더욱 효율적으로 구별할 수 있다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 서열번호 1, 2, 3 및 4의 서열 내의 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오드티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 상기 서열번호 중 홀수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 짝수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.

본 발명에 따른 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 흑오미자에서는 확인되지 않으나, 오미자와 남오미자의 엽록체 게놈 서열에서 각각 21bp, 35bp 염기가 결실된 다형성 영역을 특이적으로 확인할 수 있는 프라이머 세트이고; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 오미자에서는 확인되지 않으나, 흑오미자와 남오미자의 엽록체 게놈 서열에서 각각 25bp, 68bp 염기가 결실된 다형성 영역을 특이적으로 확인할 수 있는 프라이머 세트이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 오미자 종 구별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트는 전술한 바와 같으며, 구별 가능한 오미자 종은 오미자(Schisandra chinensis), 남오미자(Kadsura japonica) 및 흑오미자(S. repanda)일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

오미자 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 오미자 종을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 오미자 종은 오미자(Schisandra chinensis), 남오미자(Kadsura japonica) 및 흑오미자(S. repanda)일 수 있고, 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.

본 발명의 방법은 오미자 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 오미자 종은 이에 한정되지 않으나, 오미자 식물체의 잎, 열매 혹은 열매가 건조된 형태로 가공된 산물일 수 있다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 오미자 종을 구별하기 위한 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 오미자 식물 자원수집 및 DNA 추출

오미자(Schisandra chinensis) 12개 자원(만생종 3개, 중생종 3개, 조생종 3개 및 재래종 3개)은 전라북도 농업기술원 약용자원연구소 약초시험장에서 수집하였고, 흑오미자(S. repanda) 6개 자원 및 남오미자(Kadsura japonica) 3개 자원은 제주특별자치도 농업기술원에서 수집하였으며, 상기 수집된 오미자 자원들은 -80℃의 초저온 냉동고에 보관하였다. 상기 수집된 총 21개의 오미자 자원의 잎을 액체질소로 동결시키고 막자사발을 이용하여 분쇄한 후 CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) 방법으로 DNA를 추출하고 Tris-EDTA 버퍼에 용출하였다.

2. 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 DNA 증폭

CTAB 방법을 사용하여 추출한 오미자, 흑오미자 및 남오미자의 DNA를 각각 10 ng/㎕로 희석하여 DNA 2㎕, 프라이머 혼합물 2㎕(2μM의 정방향 프라이머 1㎕, 2μM의 역방향 프라이머 1㎕), Taq mixture 10㎕, 증류수 6㎕을 혼합하여 20㎕의 PCR 반응 혼합물을 만들었다. PCR 과정은 전변성 94℃ 3분; 변성(denaturation) 94℃ 30초, 결합(annealing) 54℃ 30초, 신장(extension) 72℃ 1분의 과정을 총 34회 반복; 최종 신장 72℃ 10분의 조건으로 수행하였다. PCR 증폭 산물은 3% 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인하거나, Fragment Analyze^TM Automated CE System(Advanced Analytical Technologies, Inc. Ames. USA)을 사용하여 확인하였다.

3. PCR에 사용된 엽록체 서열 기반 InDel 마커

본 발명의 엽록체 서열 기반 InDel 마커 증폭용 프라이머 세트는 genomic DNA를 분석하여 얻은 오미자 종의 엽록체 염기서열을 이용하여 오미자, 흑오미자 또는 남오미자의 엽록체 게놈 서열에서 삽입 또는 결실된 영역에 특이적인 2개의 InDel 마커(cpInDel marker 1 set 및 cpInDel marker 2 set)를 제작하였다(표 1).

오미자의 경우 완성된 표준 유전체 정보가 존재하지 않아 본 발명의 프라이머 세트가 표적으로 하는 유전자 위치를 정확하게 확인하는 것이 불가하여, NCBI GenBank accession number ANP25649.1 또는 ANP25646.1의 오미자 게놈 서열과 본 발명의 InDel 마커 증폭 구간을 비교하여 대략적인 위치를 확인하였다.

구체적으로, 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 cpInDel marker 1 set 및 cpInDel marker 2 set에 의해 증폭되는 염기서열 구간을 포함하는 2kb의 서열을 NCBI database에 검색하여 유사성이 높은 순으로 후보 유전자 100개를 확인하였다. 이 중, cpInDel marker 1 set에 의해 증폭되는 염기서열이 'NCBI accession number_ANP25649(NADH dehydrogenase subunit 5, Schisandra chinensis)'와 가장 유사하고, cpInDel marker 2 set에 의해 증폭되는 염기서열이 'NCBI accession number_ANP25646.1(Ycf2, Schisandra chinensis)'와 가장 유사한 것을 확인하였다. cpInDel marker 1 set는 오미자 유전자 ANP25649의 약 500bp 정도 떨어진 영역에 존재하고, cpInDel marker 2 set는 오미자 유전자 ANP25646.1 영역 내에 존재하는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 프라이머 염기서열 정보

프라이머명	서열(5'→3') (서열번호)	Tm(℃)
cpInDel marker 1 set	F: CGTTGTGGAACTGATTGATT (1)	54
	R: TCAATTGAAACGGGACTCG (2)
cpInDel marker 2 set	F: CGAAAGACCCGATGAATT (3)	54
	R: TGAAAACACAAAGACAAAGGGC (4)

실시예 1. InDel 분자마커를 이용한 오미자, 흑오미자 및 남오미자의 구별

상기 개발된 CpInDel 분자마커가 오미자, 흑오미자 및 남오미자를 판별할 수 있는지 검증하기 위해 다양한 오미자 종의 DNA 시료를 주형으로 PCR을 수행하였으며, PCR 증폭산물을 아가로스 겔에 전기영동하거나 fragment analyzer를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 프라이머 세트 cpInDel marker 1 set를 사용한 경우에는 오미자(만생종, 중생종, 조생종 및 재래종), 흑오미자 및 남오미자에서 각각 207bp, 228bp, 193bp의 서로 다른 크기의 밴드가 확인되었고, 프라이머 세트 cpInDel marker 2 set를 사용한 경우에는 오미자(만생종, 중생종, 조생종 및 재래종), 흑오미자 및 남오미자에서 각각 320bp, 295bp, 252bp의 서로 다른 크기의 밴드가 확인되었다(도 2 및 도 3).

이를 통해, 본 발명의 cpInDel marker 1 set는 흑오미자 엽록체 게놈 서열을 기준으로 오미자와 남오미자의 엽록체 게놈 서열에서 각각 21bp, 35bp 염기가 결실된 영역에 특이적인 프라이머 세트이고, cpInDel marker 2 set는 오미자 엽록체 게놈 서열을 기준으로 흑오미자와 남오미자의 엽록체 게놈 서열에서 각각 25bp, 68bp 염기가 결실된 영역에 특이적인 프라이머 세트임을 알 수 있었다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Molecular marker based on chloroplast genome sequence for discriminating Schisandrae Fructus and uses thereof <130> PN19345 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cgttgtggaa ctgattgatt 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcaattgaaa cgggactcg 19 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgaaagaccc gatgaatt 18 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgaaaacaca aagacaaagg gc 22

Claims (8)

1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 오미자(Schisandra chinensis), 남오미자(Kadsura japonica) 및 흑오미자(S. repanda) 구별용 프라이머 세트.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 오미자(Schisandra chinensis), 남오미자(Kadsura japonica) 및 흑오미자(S. repanda) 구별용 키트.
5. 제4항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
6. 오미자 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 오미자(Schisandra chinensis), 남오미자(Kadsura japonica) 및 흑오미자(S. repanda)를 구별하는 방법.
7. 삭제
8. 제6항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.

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