KR102207825B1 - 백수오와 이엽우피소 판별용 조성물 및 이를 이용한 판별방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백수오와 이엽우피소 판별용 조성물, 판별용 키드 및 이를 이용한 판별방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 백수오와 이엽우피소 두 종의 미토콘드리아 내의 InDel 부위를 탐색하여 종 특이적인 InDel 마커와 PCR 증폭을 통하여 두 종을 판별 할 수 있는 백수오와 이엽우피소 판별용 InDel 마커 및 이를 이용한 판별 방법을 제공한다. 이로부터 백수오와 이엽우피소의 원료 혼입시 정확하게 판별이 가능하다.

Description

백수오와 이엽우피소 판별용 조성물 및 이를 이용한 판별방법{Composition for discrimination of Cynanchum wilfordii and Cynanchum auriculatum and method for use thereof}

본 발명은 백수오와 이엽우피소의 미토콘드리아 염기서열간의 InDel(Insert/Deletion) 영역을 이용하여 백수오와 이엽우피소를 동시 판별할 수 있는 조성물 및 이를 이용한 백수오와 이엽우피소의 판별방법에 관한 것이다.

최근 분자생물학의 급속한 발전으로 DNA 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질의 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류ㆍ동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석 등을 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequencerepeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성(polymorphism) 검출로 각광을 받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하며, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 개체 내의 초위성체를 분석하는 방법으로, 상기 단순염기서열의 반복수는 품종 간 또는 개체 간에 다르기 때문에 이 부분을 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타날 수 있으나, 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않다는 단점이 있다.

이에 반해 InDel(insertion/deletion) 마커는 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 하는 장점을 유지하면서 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 SSR 마커의 단점을 보완하는 것으로, 특정 위치에 있는 DNA의 염기서열 분석을 통해 품종간 염기서열의 삽입 또는 결실을 기반으로 PCR 프라이머를 제작하는 방법이다.

백수오는 큰조롱(Cynanchum wilfordii, 은조롱)의 뿌리를 말하며 한약재 및 건강보조식품으로 사용되고 있다. 같은 분류군에 속하는 이엽우피소(Cynanchum auriculatum, 넓은잎큰조롱)는 독성을 가지는 것으로 알려져 있음에도 큰조롱보다 재배가 쉽고 백수오와 뿌리 형태가 유사하여, 뿌리 채취ㆍ유통ㆍ판매 단계에서 백수오와 혼동을 유발하고 있고, 이로 인해 백수오를 이용한 제품에 이엽우피소 뿌리의 혼입이 초래되고 있다.

종래에는 백수오와 이엽우피소를 구분하기 위한 기술로 광학현미경을 이용하여 외부 및 내부 형태를 비교하여 구분하였으나, 시중에 유통되고 있는 건조한 뿌리에 적용하는 경우 형태적 특성으로는 구분하기 어려운 점이 있다. 따라서 백수오(큰조롱)와 이엽우피소 뿌리를 판별할 수 있는 분자표지의 개발과 이를 재배ㆍ유통ㆍ판매 시료에 적용하는 것이 필요하다.

백수오와 이엽우피소 판별을 위해 엽록체 psbA-trnH 유전자간 서열(intergenic spacer)의 변이에 기반한 백수오 판별용 프라이머 1쌍과 이엽우피소 판별용 프라이머 1쌍이 개발되었으나, 이들 프라이머는 백수오와 이엽우피소 각각에 특이적인 서열을 이용하므로, 백수오와 이엽우피소를 동시에 판별할 수는 없고 한 시료에 대해서 두 번의 분석을 반복해야만 하는 단점이 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 백수오와 이엽우피소를 구별을 위해 효율적으로 이용될 수 있는 분자 마커에 대한 연구를 수행하여, 백수오와 이엽우피소의 미토콘드리아 유전체에서 기반한 Indel(insertion/deletion) 마커를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-1954673호

본 발명의 해결하고자 하는 과제는 서열번호1 및 서열번호2로 이루어진 프라이머 세트 또는 서열번호3 및 서열번호4로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 백수오(Cynanchum. wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum. auriculatum) 판별용 조성물를 제공하는 것이다.

본 발명은 다른 과제는 상기 조성물을 포함하는 백수오(Cynanchum. wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum. auriculatum)의 판별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 또 과제는 대상시료에서 DNA를 분리하는 단계, 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 조성물를 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계 및 상기 증폭산물을 검출하는 단계를 포함하는 백수오(Cynanchum. wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum. auriculatum)의 판별 방법을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 하나의 양태로 서열번호1 및 서열번호2로 이루어진 프라이머 세트 또는 서열번호3 및 서열번호4로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 백수오(Cynanchum. wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum. auriculatum) 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 서열번호1 및 서열번호2로 이루어진 프라이머 세트 또는 서열번호3 및 서열번호4로 프라이머 세트를 포함한다.

상기 프라이머 세트는, 표적서열의 증폭을 위하여 사용될 수 있으며, 구체적으로 백수오(Cynanchum. wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum. auriculatum)를 판별하기 위한 InDel(insertion/deletion) 마커의 증폭을 위해 사용될 수 있다.

본 발명에서 "Indel(Insertion/deletion) 마커"는 DNA의 염기배열에서 일부 염기가 중간에 삽입되거나(insertion) 결실된(deletion) 변이를 총칭한다. 상기 Indel 마커는 표준유전체와 실험에 사용된 품종의 유전체 정보를 비교 분석하는 방법을 통해 표준유전체보다 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 영역을 탐색하고 그 정보를 바탕으로 프라이머를 제작한다. 따라서 그 증폭 결과는 표준유전체와 비교하여 밴드크기가 큰 경우(insertion)와 작은 경우(deletion)의 두 종류 타입을 나타낼 수 있다. 본 발명에서 "마커(marker)"는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 의미하며, 상기 용어, "유전자좌"는 분자 마커의 유전자 지도상의 위치를 의미한다.

본 발명에서 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존한다.

본 발명에서 상기 프라이머 세트에 포함되는 프라이머는 올리고뉴클레오티드가 이용될 수 있고, 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명에서 "백수오"는 박주과리과 덩굴성 여러해살이 풀인 큰조롱(Cynanchum. wilfordii)의 덩이뿌리를 의미한다.

본 발명에서 "이엽우피소"는 협죽도과의 넓은잎큰조롱(Cynanchum auriculatum)의 덩이뿌리를 의미한다.

본 발명의 실시예에서 백수오 및 이엽우피소에서 분리된 DNA를 서열번호1 및 서열번호2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 결과, PCR 산물의 크기가 백수오는 224bp, 이엽우피소는 204bp로 InDel 영역(M1)에 의해 20bp의 크기가 차이남을 확인하였으며, 서열번호3 및 서열번호4의 프라이머 세트로 PCR 수행한 결과, 백수오는 184bp, 이엽우피소는 192bp로 InDel 영역(M2)에 의해 8bp의 크기 차이가 났다. 즉, 이들 프라이머 세트를 이용하여 백수오와 이엽우피소를 판별할 수 있음을 확인하였다.

본 발명은 다른 양태로 상기 조성물을 포함하는 백수오(Cynanchum. wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum. auriculatum)의 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 조성물 이외에 상기 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 구체적으로 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또 다른 양태로 대상시료에서 DNA를 분리하는 단계, 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 조성물을 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계 및 상기 증폭산물을 검출하는 단계를 포함하는 백수오(Cynanchum. wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum. auriculatum)의 판별 방법을 제공한다.

본 발명에서 대상시료는 백미(Cynanchum)속 식물에서 유래된 것일 수 있으며, 상기 백미속 식물은 백수오(Cynanchum. wilfordii) 또는 이엽우피소(Cynanchum. auriculatum)를 포함한다. 구체적으로 상기 백수오(Cynanchum. wilfordii) 또는 이엽우피소(Cynanchum. auriculatum)의 뿌리 또는 이의 건조물을 포함할 수 있다.

본 발명에서 DNA를 추출하는 방법은, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다. 예컨대, CRAB 방법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 등을 이용하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 증폭하는 단계는 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 또는 서열번호3 및 4의 프라이머 세트를 이용하여 표적서열을 증폭시키는 것이다. 여기서 "표적서열"은 변이 영역을 포함하는 Indel 마커를 의미한다.

본 발명에서 표적서열을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적서열을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 검출하는 단계는 증폭산물에서 Indel 마커를 검출하는 것으로, DNA 칩, 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다. 또한, 은염색 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 가시화될 수 있다.

본 발명은 백수오와 이엽우피소 판별용 조성물, 이를 포함하는 판별용 키트 및 이를 이용한 판별방법에 관한 것으로, 백수오와 이엽우피소의 미토콘드리아 염기서열간의 InDel(Insert/Deletion) 영역을 이용하여 통해 백수오와 이엽우피소를 동시 판별할 수 있는 분자마커를 제공하며, 백수오와 이엽우피소의 재배, 판매, 사용상에 혼용을 방지할 수 있다.

도 1은 백수오와 이엽우피소의 genomic DNA를 (A) M1 분자표지, (B) M2 분자표지를 이용하여 PCR하고 전기영동한 결과이다. L : 100bp+ ladder

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예1> 백수오 및 이엽우피소의 완전장 미토콘드리아 유전체 서열 비교 분석 및 변이지역 탐색

백수오 미토콘드리아 완전장 유전체 3개 타입의 염기서열과 이엽우피소 미토콘드리아 완전장 유전체 3개 타입의 서열을 이용하였다(표 1).

백수오와 이엽우피소의 완전장 미토콘드리아 유전체 서열을 MAFFT 및 BlastZ 등의 염기서열 비교 프로그램을 이용하여 정렬하고 비교 분석하여, 백수오와 이엽우피소의 미토콘드리아 유전자 염기서열간의 변이지역을 탐색하였다.

표 1은 분석에 사용된 백수오 및 이엽우피소의 미토콘드리아 유전체 염기서열에 대한 정보이다.

종명	미토콘드리아 유전체 타입(type)	총길이 (bp)	GenBank Acc. No.
큰조롱(백수오) (Cynanchum wilfordii)	Type 1	379,060	MF611847
	Type 2	352,767	MF611848
	Type 3	111,332	MF611849
이엽우피소 (Cynanchum auriculatum)	Type 1	614,836	MH410146
	Type 2	426,495	MH410147
	Type 3	4,478	MH410148

<실시예2> 백수오 및 이엽우피소 판별용 분자표지 설계

실시예1의 분석결과를 바탕으로 백수오와 이엽우피소 두 종간 미토콘드리아 유전체간 길이차이가 나는 InDel 지역 2곳을 선택하고, 해당 지역 주변에서 InDel 검출용 프라이머를 설계함으로써, 백수오와 이엽우피소 두 종을 동시에 판별 가능한 2개의 분자표지(co-dominant marker)를 설계하였다 (표 2).

표 2를 참고하면, nad3 내지 nad5 사이의 위치한 M1 분자표지(서열번호1, 서열번호2 프라이머 쌍)의 PCR 산물은 백수오 224bp, 이엽우피소 204bp로 InDel 영역에 의해 20bp의 크기 차이가 나며, rrn26 내지 rrn5에 위치한 M2 분자표지(서열번호3, 서열번호 4 프라이머 쌍)의 PCR 산물에서 백수오 184bp, 이엽우피소 192bp로 InDel 영역에 의해 8bp의 크기 차이가 난다.

Maker no.	Marker type	Primer		PCR Product Size (bp) 이엽우피소 (Ca) / 백수오 (Cw)	Locus	Location
M1	Co-dominant	F	GCTTCCGGAATGTCATGATT (서열번호1)	204 / 224	nad3 ~ nad5	Intergenic
		R	CCATTGTCTTTGCGAAGGTT (서열번호2)
M2	Co-dominant	F	TCCTGCCAGCGAATAACTAA (서열번호3)	192 / 184	rrn26 ~ rrn5	Intergenic
		R	CGCAGATCTTGCCAACTACA (서열번호4)

F: 정방향 프라이머(forward primer)/ R: 역방향 프라이머(reverse primer)

<실시예3> PCR을 이용한 DNA 증폭 및 백수오와 이엽우피소의 판별

실시예2의 분자표지(M1, M2)를 이용하여 백수오와 이엽우피소를 판별하기 위해 PCR을 수행하여 백수오와 이엽우피소를 판별하였다. 백수오 계통 5종류(Cw_01(농과원), Cw_02(서울대), Cw_03(서울대), Cw_04(서울대), Cw_05(서울대))과 이엽우피소 계통 4종류(Ca_01(서울대), Ca_02(서울대), Ca_03(서울대), Ca_04(서울대))의 잎 시료로부터 genomic DNA를 추출하고, M1 분자표지(서열번호1 및 서열번호 2의 프라이머쌍) 또는 M2 분자표지(서열번호3, 및 서열번호4의 프라이머쌍)을 이용하여 genomic DNA PCR을 수행하였다.

상기에서 추출한 genomic DNA(25~100ng)에 1x reaction buffer, 0.2 mM dNTP, 1.25 units Taq DNA polymerase (Dr. MAX, Doctor protein INC, Korea, cat. No. DR00302), 0.25 pmole forward primer(서열번호1 또는 서열번호3), 0.25 pmole reverse primer(서열번호2 또는 서열번호4)를 첨가하고 표 3의 조건으로 PCR을 수행하였다.

단계	온도(℃)	시간
전 변성	95	5분
변성	95	30초
결합	55	30초
신장	72	1분
변성단계로 돌아가 34회 추가 반복
최종신장	72	7분

PCR 산물은 Fragment Analyzer (Advanced Analytical Technologies Inc.) 기기와 dsDNA Reagent Kit (DNF-905 for 35~500bp)을 이용하여 모세관 전기영동(automated capillary electrophoresis)을 수행하여 PCR 산물의 크기 차이를 확인하였다. 또한 PCR 산물의 염기서열을 direct ABI sequencing 통하여 확인하였다.

도 1A는 이엽우피소 4종과 백수오 5종의 잎에서 추출한 DNA를 주형으로 하여 M1 분자표지(서열번호 1 및 2의 프라이머 세트)로 PCR한 PCR 산물의 전기영동 결과이고, 도 1B는 이엽우피소 4종과 백수오 5종의 잎에서 추출한 DNA를 주형으로 하여 M2 분자표지(서열번호3 및 서열번호4의 프라이머 세트)로 PCR한 PCR 산물의 전기영동 결과이다.

M1과 M2 분자표지를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 이엽우피소 4종류와 백수오 5종류 모두에서 예측된 InDel 크기만큼 차이가 남을 확인하였다. 또한 PCR 산물의 염기서열 분석을 통해서 완전장 미토콘드리아 유전체에서 확인된 것과 동일한 서열이 PCR로 증폭되었음을 확인하였다(도 1).

상기 결과를 통해 백수오와 이엽우피소를 종 특이적인 InDel 마커를 통해 PCR 기법으로 간편하고 정확하게 판별이 가능함을 확인하였으며, 본 발명의 방법을 통해서 백수오와 이엽우피소의 원료 내 혼입여부를 간편하고 정확하게 판별이 가능하다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) Industry-University Cooperation Foundation Sunmoon University <120> Senna tora-derived gene having anthoraquinone biosynthesis function and use thereof <130> DP20200066 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHS-L gene <400> 1 atggagagtg ctgcagaaaa gaagggattc gccacagtgc ttgctattgg cactgcaaat 60 cccccaaaca tttatcttca atctgagttt cctgatttct tcttcagagt caccaatagt 120 gagcatcatg tccaactcaa gcagaagttc aagcgcatgt gtgacaactc caatatcagg 180 aagcgccatt ttcttgttga tgaagatatt cttaaagagc atccaaacat cagcacctat 240 ggagctcctt cgttggatac acgcagagaa atagtaacta agtacattcc taagcttggg 300 aaggaagcag ccttgaaatg tattaaagaa tggggccaac ctttatctaa gatcacacat 360 ctcatcttct gcacatcttc atgcatcaac agcattcctg gacctgattt ctaccttgcc 420 agagaaattg gcctcccagc cacttgtaac cgccttgtga tttatgatca tggttgtcac 480 gctggtggtt cagtcattcg tgtagccaag gctcttgctg agagcatccc tggctcacgt 540 gtgctcactg tgtgtgctga gaccatgctt acttccttcc aagccccaag tccgtcacat 600 atggacattg tggttgggca cgccttgttt ggagatggtg ctgctgccat gattgtcggt 660 acagatccta tccccaatgt tgaacgtcca ctgtttgagt ttgtgttggc tgcacaacag 720 acagtgggag gatctgagga ggcaattcat ggacatgcaa ctgaaagagg tcaaacttac 780 tttttaggaa aagagattcc aaatgttgtt gctggtaatg tgaagaagtg tatgcatgat 840 gcatttggga cgcttggtat gacaatcaat gaaggagagt ggaattcgtt gttctacgtg 900 gtgcatcctg gtgggaaggc agtactgaat gggatggaag aggtgcttga gttgaaggaa 960 gagaagcttg ctgcgagtag gactattttg agagagtacg gaaacatgtg gagtccatgt 1020 gtgttcttcg tgttggatga aatgagaaag aaatcttcca acgaagggaa gtccacaacc 1080 ggagaaggac atgactgggg tgctttgatg acctttggac caggtttgac ggttgaaaca 1140 attgttttgc attccatttc cctgaaggac tag 1173 <210> 2 <211> 390 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CHS-L protein <400> 2 Met Glu Ser Ala Ala Glu Lys Lys Gly Phe Ala Thr Val Leu Ala Ile 1 5 10 15 Gly Thr Ala Asn Pro Pro Asn Ile Tyr Leu Gln Ser Glu Phe Pro Asp 20 25 30 Phe Phe Phe Arg Val Thr Asn Ser Glu His His Val Gln Leu Lys Gln 35 40 45 Lys Phe Lys Arg Met Cys Asp Asn Ser Asn Ile Arg Lys Arg His Phe 50 55 60 Leu Val Asp Glu Asp Ile Leu Lys Glu His Pro Asn Ile Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Gly Ala Pro Ser Leu Asp Thr Arg Arg Glu Ile Val Thr Lys Tyr Ile 85 90 95 Pro Lys Leu Gly Lys Glu Ala Ala Leu Lys Cys Ile Lys Glu Trp Gly 100 105 110 Gln Pro Leu Ser Lys Ile Thr His Leu Ile Phe Cys Thr Ser Ser Cys 115 120 125 Ile Asn Ser Ile Pro Gly Pro Asp Phe Tyr Leu Ala Arg Glu Ile Gly 130 135 140 Leu Pro Ala Thr Cys Asn Arg Leu Val Ile Tyr Asp His Gly Cys His 145 150 155 160 Ala Gly Gly Ser Val Ile Arg Val Ala Lys Ala Leu Ala Glu Ser Ile 165 170 175 Pro Gly Ser Arg Val Leu Thr Val Cys Ala Glu Thr Met Leu Thr Ser 180 185 190 Phe Gln Ala Pro Ser Pro Ser His Met Asp Ile Val Val Gly His Ala 195 200 205 Leu Phe Gly Asp Gly Ala Ala Ala Met Ile Val Gly Thr Asp Pro Ile 210 215 220 Pro Asn Val Glu Arg Pro Leu Phe Glu Phe Val Leu Ala Ala Gln Gln 225 230 235 240 Thr Val Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ile His Gly His Ala Thr Glu Arg 245 250 255 Gly Gln Thr Tyr Phe Leu Gly Lys Glu Ile Pro Asn Val Val Ala Gly 260 265 270 Asn Val Lys Lys Cys Met His Asp Ala Phe Gly Thr Leu Gly Met Thr 275 280 285 Ile Asn Glu Gly Glu Trp Asn Ser Leu Phe Tyr Val Val His Pro Gly 290 295 300 Gly Lys Ala Val Leu Asn Gly Met Glu Glu Val Leu Glu Leu Lys Glu 305 310 315 320 Glu Lys Leu Ala Ala Ser Arg Thr Ile Leu Arg Glu Tyr Gly Asn Met 325 330 335 Trp Ser Pro Cys Val Phe Phe Val Leu Asp Glu Met Arg Lys Lys Ser 340 345 350 Ser Asn Glu Gly Lys Ser Thr Thr Gly Glu Gly His Asp Trp Gly Ala 355 360 365 Leu Met Thr Phe Gly Pro Gly Leu Thr Val Glu Thr Ile Val Leu His 370 375 380 Ser Ile Ser Leu Lys Asp 385 390 <210> 3 <211> 1170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHS gene <400> 3 atggtgaatg tggaagagat ccgtaaggca caacgagcgg aaggtgctgc tacagtaatg 60 gctatcggta cagcgacccc aacaaactgt atagaacaaa gtacctatcc agattactat 120 tttcgtatta caaacagtga gcacatgaca gagttgaaag agaaattcca gcgcatgtgt 180 gataagtcaa tgataaaaaa gagatatatg cacttgacag aggagatctt aaaggagaac 240 cctaatatgt gtgcttacat ggcaccttct attgatgcaa ggcaagatat agtggttttg 300 gaagtaccaa agcttggaaa agaggctgca acaaaggcca ttaaggaatg gggccaaccc 360 aaatccaaaa ttacgcactt gatcttttgc actacaagtg gtgtggacat gccaggagct 420 gactaccaac tcacaaagct cttaggtctt cgcccatctg tgaagcgata catgatgtac 480 caacaaggtt gctttgcagg cggtacggtg ctccgtttag ccaaagactt ggctgagaat 540 aacaaaggag cacgtgtact tgtggtttgt tctgagatta ctgcagttac attccgtggg 600 cctactgata cccatcttga cagccttgtg ggccaagcat tgtttggcga tggggcagct 660 gctgttattg ttggatctga cccaatccca caagttgaga agcctttatt tgaacttgta 720 tggacagcac aaactattct tcccgatagt gaaggggcta ttgatgggca tcttcgtgaa 780 gttgggctca cattccatct tctgaaagat gttcctgggc tcatctcaaa gaacattgag 840 aaagccttgg ttgaagcctt caaaccattg ggaatttctg attataactc aattttctgg 900 attgctcacc caggtgggcc tgcaattttg gaccaagttg aggccaaatt agagttgaag 960 cccgaaaaga tgcaggccac tagacacgtg cttagtgagt atggaaacat gtccagtgca 1020 tgcgtgttat tcattttgga tgaaatgagg agaaaatcag caaaagatgg acttggcaca 1080 acaggtgaag gacttgagtg gggtgttcta tttggatttg ggcctggcct tactgttgag 1140 accgttgtgc tccacagtat tgctatttaa 1170 <210> 4 <211> 389 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CHS protein <400> 4 Met Val Asn Val Glu Glu Ile Arg Lys Ala Gln Arg Ala Glu Gly Ala 1 5 10 15 Ala Thr Val Met Ala Ile Gly Thr Ala Thr Pro Thr Asn Cys Ile Glu 20 25 30 Gln Ser Thr Tyr Pro Asp Tyr Tyr Phe Arg Ile Thr Asn Ser Glu His 35 40 45 Met Thr Glu Leu Lys Glu Lys Phe Gln Arg Met Cys Asp Lys Ser Met 50 55 60 Ile Lys Lys Arg Tyr Met His Leu Thr Glu Glu Ile Leu Lys Glu Asn 65 70 75 80 Pro Asn Met Cys Ala Tyr Met Ala Pro Ser Ile Asp Ala Arg Gln Asp 85 90 95 Ile Val Val Leu Glu Val Pro Lys Leu Gly Lys Glu Ala Ala Thr Lys 100 105 110 Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln Pro Lys Ser Lys Ile Thr His Leu Ile 115 120 125 Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Asp Met Pro Gly Ala Asp Tyr Gln Leu 130 135 140 Thr Lys Leu Leu Gly Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Tyr Met Met Tyr 145 150 155 160 Gln Gln Gly Cys Phe Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Leu Ala Lys Asp 165 170 175 Leu Ala Glu Asn Asn Lys Gly Ala Arg Val Leu Val Val Cys Ser Glu 180 185 190 Ile Thr Ala Val Thr Phe Arg Gly Pro Thr Asp Thr His Leu Asp Ser 195 200 205 Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ala Ala Ala Val Ile Val 210 215 220 Gly Ser Asp Pro Ile Pro Gln Val Glu Lys Pro Leu Phe Glu Leu Val 225 230 235 240 Trp Thr Ala Gln Thr Ile Leu Pro Asp Ser Glu Gly Ala Ile Asp Gly 245 250 255 His Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr Phe His Leu Leu Lys Asp Val Pro 260 265 270 Gly Leu Ile Ser Lys Asn Ile Glu Lys Ala Leu Val Glu Ala Phe Lys 275 280 285 Pro Leu Gly Ile Ser Asp Tyr Asn Ser Ile Phe Trp Ile Ala His Pro 290 295 300 Gly Gly Pro Ala Ile Leu Asp Gln Val Glu Ala Lys Leu Glu Leu Lys 305 310 315 320 Pro Glu Lys Met Gln Ala Thr Arg His Val Leu Ser Glu Tyr Gly Asn 325 330 335 Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe Ile Leu Asp Glu Met Arg Arg Lys 340 345 350 Ser Ala Lys Asp Gly Leu Gly Thr Thr Gly Glu Gly Leu Glu Trp Gly 355 360 365 Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Val Glu Thr Val Val Leu 370 375 380 His Ser Ile Ala Ile 385 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHS-L forward primer <400> 5 aaggatccat ggagagtgct ggag 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHS-L reverse primer <400> 6 aactcgagct agtctctcag aggg 24 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHS forward primer <400> 7 ggatccatgg tgaatgtgga agagatc 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHS reverse primer <400> 8 gaattcttag acagccacac tatggag 27

Claims (5)

1. 서열번호3 및 서열번호4로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 백수오(Cynanchum. wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum. auriculatum) 판별용 조성물.
2. 제 1항의 조성물을 포함하는 백수오(Cynanchum. wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum. auriculatum)의 판별용 키트.
3. 제 2항에 있어서,
   증폭반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 판별용 키트.
4. 대상시료에서 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 조성물를 이용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭산물을 검출하는 단계를 포함하는,
   백수오(Cynanchum. wilfordii)와 이엽우피소(Cynanchum. auriculatum)의 판별 방법.
5. 제 4항에 있어서,
   상기 대상시료는 백미(Cynanchum)속 식물에서 유래된 것을 특징으로 하는 판별방법.

Images