KR102463948B1

KR102463948B1 - 안트라퀴논 생합성 기능을 가지는 결명자 유래 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102463948B1
Application number: KR1020200075168A
Authority: KR
Inventors: 강상호; 송재경; 프라사드 판데이 라메스
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장); 선문대학교 산학협력단
Priority date: 2020-06-19
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2022-11-07
Also published as: KR20210157193A

Abstract

본 발명은 폴리케타이드합성효소(polyketide synthase) 활성을 가지는 결명자 유래 CHS-L 단백질, 및 이의 유전자에 관한 것으로, 본 발명의 결명자 유래 CHS-L는 에모딘 전구체인 아트로크리좀 카르복시산(atrochrysome carboxylic acid) 또는/및 엔도크로신 안트론(endocrocin anthrone) 생합성에 활성을 가져, 안트라퀴논(에모딘) 함량이 증진된 작물 개발 또는 에모딘 전구체 및 에모딘 생합성에 유용하게 활용 가능하다.

Description

안트라퀴논 생합성 기능을 가지는 결명자 유래 유전자 및 이의 용도{Senna-tora derived gene having anthoraquinone biosynthesis function and use thereof}

본 발명은 안트라퀴논 생합성에 관여하는 결명자 유래 CHS-L 단백질, 이의 유전자 및 이들의 용도에 관한 것이다.

결명자는 콩과에 속하는 한해살이 초본으로 초결명자(Senna obtusifolia)와 결명자(Senna tora)의 두 품종이 알려져 있다. 이의 성숙한 종자는 눈을 맑게 한다는 의미에서 결명자라 알려져 있다. 약리성분으로는 비타민A의 전구체인 카로틴(carotene), 알로에 향과 쓴맛을 내는 알로인(Alloin), 레인(Rhein), 에모딘(emodin), 크리소판올(Chrysophanol), 알로에-에모딘(Aloe-emodin), 피션(Physcion), 오브튜신(Obtusin), 아우란티오-오브튜신(Aurantio-obtusin), 루브로퓨산리(Rubrofusrin), 토라크리손(Torachryson), 토라락톤(Tora lactone) 등이 있다. 이들 성분들 중 에모딘(Emodin)은 안트라퀴논(Anthraquinone)계 화합물로써, 탄소수 14개의 C₆-C₂-C₆의 기본 골격을 갖고 있으며 1,3,8-트리히드록시-6-메틸-9,10-안트라세네디온(1,3,8-trihydroxy-6-methyl-9,10-anthracenedione)이라는 화학명을 갖는다. 에모딘은 항암, 항염, 항균, 이뇨와 면역억제 같은 다양한 생물학적 활성이 보고되어 있다.

결명자 추출물로부터 안트라퀴논(Anthraquinone)계의 생리활성물질의 구조분석이나 생리활성 효과를 보는 연구는 많이 보고 되었다. 그러나 결명자 추출물 중 안트라퀴논계의 생리활성물질들에 대한 미생물에서의 생합성 연구는 크리소파놀(chrysophanol) 외에는 거의 없는 실정이다. 동맥경화에 효과가 있는 크리소파놀의 생합성 연구는 2008년 The journal of antibiotics에서 방선균에서 크리소파놀 중간체의 합성에 대한 연구와 2009년에 phytochemistry에서 생합성에 관련된 연구가 개시된바 있다. 그러나 에모딘 생합성에 대한 연구는 상당히 미비한 실정이다.

대한민국 등록특허 제 10-2072017 호

본 발명의 해결하고자 하는 과제는 폴리케타이드합성효소(polyketide synthase) 활성을 가지는 결명자 유래 CHS-L 단백질, 상기 CHS-L 단백질을 암호화 하는 CHS-L 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 등을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 폴리케타이드합성효소(polyketide synthase) 활성을 가지는 서열번호2의 아미노산 서열로 표시되는 결명자 유래 CHS-L 단백질을 제공한다.

상기 폴리케타이드합성효소(polyketide synthase)는 말로닐코에이(malonyl-CoA) 기질을 이용하여 에모딘 전구체를 합성하는 것일 수 있다.

상기 에모딘 전구체는 아트로크리좀 카르복시산(atrochrysome carboxylic acid) 또는 엔도크로신 안트론(endocrocin anthrone)일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 CHS-L 단백질을 암호화 하는 서열번호1로 표시되는 CHS-L 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 CHS-L 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

상기 형질전환체는 대장균 BL21(DE3) 균주일 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호1로 표시되는 CHS-L 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호5 및 서열번호6으로 표시되는 프라이머 세트를 제공한다.

또한 본 발명은 CHS-L 단백질과 말로닐코에이(malonyl-CoA)를 반응시키는 단계를 포함하는 에모딘 전구체의 생산방법을 제공한다.

상기 생산방법은 NADPH 보조 인자를 추가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 결명자 유래 CHS-L를 활용하여 에모딘 전구체를 생산할 수 있으며, 안트라퀴논(에모딘) 함량이 증진된 작물을 개발할 수 있다.

도 1은 폴리케타이드 합성효소에 의한 안트라퀴논 예상 생합성 경로이다.
도 2는 결명자 및 다른 4종의 콩과 식물 유전체(C. fasciculata, A. hypogaea, M. truncatula, G. max)에서 CHS-L 유전자 계통의 계통적 특이성을 확인한 결과이다.
도 3은 결명자 CHS-L(Sto07g228250) 또는 CHS(Sto03g054970) 재조합 단백질의 발현을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다. (a) Sto07g228250 SDS-PAGE 분석결과로, 레인 1: 표준 단백질 마커; 레인 2: 가용성 단백질; 레인 3: 불용성 단백질; 레인 4 및 5: 정제된 단백질이다. (b) Sto03g054970 SDS-PAGE 분석결과로, 레인 1: 가용성 단백질; 레인 2: 불용성 단백질; 레인 3 및 4: 정제된 단백질; 레인 5: 표준 단백질 마커이다.
도 4는 결명자 CHS-L에 효소 반응 결과물의 TOF ESI-MS 분석결과이다.

본 발명은 폴리케타이드합성효소(polyketide synthase) 활성을 가지는 서열번호2의 아미노산 서열로 표시되는 결명자 유래 CHS-L 단백질을 제공한다.

또한, 상기 서열번호2의 아미노산 서열을 이루는 단백질과 기능적 동등물이 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명에서 결명자는 콩과에 속하는 한해살이 초본으로 결명속(Senna) 식물로, 초결명자(Senna obtusifolia)와 결명자(Senna tora)의 두 품종이 알려져 있다. 과거에는 초결명자 및 결명자를 카시아속(Cassia)으로 분류하였으나, 현재는 결명속(Senna)으로 분류한다. 결명자는 초결명, 긴강남차라고도 한다. 초결명자는 중앙아메리카 원산으로 일본 등지에서 결명자는 열대아시아산으로 중국, 우리나라 등지에서 재배된다.

결명자의 열매의 모양은 불규칙한 육각주상으로 한쪽은 뾰족하다. 외면의 색깔은 황갈 내지 흑갈색이고, 길이 3 내지 6mm, 지름 2 내지 3.5mm이다. 종피는 견고하고 윤택하며, 좌우 양측에 광택이 있는 폭이 좁은 한 줄의 패어진 무늬가 있고, 약간 특이한 냄새가 난다. 초결명자는 종자가 대립이고, 결명자는 소립이다.

본 발명의 실시예에서 결명자에서 서열번호1의 CHS-L(Sto07g228250) 유전자를 분리하였으며, 분리된 CHS-L 단백질이 폴리케타이드합성효소(polyketide synthase) 활성을 가져 에모딘 생합성 경로에 관여하며, 구체적으로 말로닐코에이(malonyl-CoA) 기질을 이용하여 에모딘 전구체인 아트로크리좀 카르복시산(atrochrysome carboxylic acid) 및 엔도크로신 안트론(endocrocin anthrone)을 합성함을 확인하였다.

따라서 본 발명의 결명자는 결명자(Senna tora) 품종일 수 있다.

본 발명의 실시예에서 결명자 유래 CHS-L 단백질이 폴리케타이드합성효소(polyketide synthase) 활성을 가져, 말로닐코에이(malonyl-CoA) 기질을 이용하여 에모딘 전구체인 아트로크리좀 카르복시산(atrochrysome carboxylic acid) 또는 엔도크로신 안트론(endocrocin anthrone)를 합성함을 확인하였는바, 본 발명의 CHS-L 단백질은 폴리케타이드합성효소(polyketide synthase) 활성을 가진다.

본 발명에서 폴리케타이드합성효소(polyketide synthase)는 말로닐코에이(malonyl-CoA) 기질을 이용하여 에모딘 전구체 또는 에모딘을 합성하는 효소이다.

본 발명에서 에모딘은 안트라퀴논(Anthraquinone)계 화합물로써, 탄소수 14개의 C6-C2-C6의 기본 골격을 갖고 있으며 1,3,8-트리히드록시-6-메틸-9,10-안트라세네디온(1,3,8-trihydroxy-6-methyl-9,10-anthracenedione)이라는 화학명을 갖는다.

본 발명에서 전구체는 어떤 물질대사나 반응에서 특정 물질이 되기 전 단계의 물질로, 말로닐코에이(malonyl-CoA)가 폴리케타이드합성효소(polyketide synthase)에 의해 에모딘으로 생합성되는 경로에 생산되는 중산산물을 의미한다.

본 발명에서 에모딘 전구체는 아트로크리좀 카르복시산(atrochrysome carboxylic acid) 또는 엔도크로신 안트론(endocrocin anthrone)일 수 있다.

본 발명의 CHS-L 유전자는 서열번호2의 CHS-L 단백질을 암호화하는 유전자로 서열번호1로 표시된다.

상기 CHS-L 유전자는 서열번호1의 염기서열에 한정되지 않으며, 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 염기서열을 포함한다. 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 염기서열은 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 구체적으로는 70%의 상동성, 보다 더 구체적으로는 80%의 상동성, 가장 구체적으로는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.

본 발명의 실시예에서 결명자 유래 CHS-L 유전자를 15종의 식물체(콩과 14종, 포도과 1종)의 유전자와 비교분석한 결과, 11종의 CHS-L 서브 패밀리 유전자가 없었다. 반면, 결명자(Senna tora)는 16개, C. fasciculata는 5개, A. hypogaea는 2개, M. truncatula는 1개, G. max는 1개의 CHS-L 서브 패밀리 유전자를 포함함을 확인하였다.

즉, 결명자는 다른 15종의 식물종의 유전체와 비교하여 CHS-L 계열 유전자가 특별히 많이 존재하고 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 CHS-L 유전자는 결명자에서 유래된 유전자일 수 있다.

또한 본 발명은 CHS-L 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 재조합 벡터는 CHS-L 단백질을 암호화 하는 서열번호1로 표시되는 CHS-L 유전자를 포함한다.

전술한 실시예에서 결명자 유래 CHS-L 단백질이 에모딘 전구체 합성에 관여하는 것을 확인하였는바, 본 발명의 재조합 벡터는 에모딘 전구체의 생합성을 촉진 또는 증진시키는 재조합 벡터일수 있다.

본 발명에서 용어 “재조합”은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서 "형질전환용 재조합 벡터"란 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물로, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다.

본 발명의 "형질전환용 재조합 벡터"는 상기 CHS-L 유전자가 발현될 수 있도록, 발현조절 서열과 기능적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 벡터는 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 일실시예에서는 pET28a(+) 대장균 발현 벡터에 CHS-L 유전자를 재조합하여 대장균 발현용 재조합 벡터를 제조하였다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은, 유전물질인 DNA를 다른 계통의 살아 있는 세포에 주입했을 때, DNA가 그 세포에 들어가 유전형질(遺傳形質)을 변화시키는 현상으로, 형질변환, 형전환, 또는 형변환이라고도 한다.

본 발명에서 상기 벡터로 미생물 또는 식물체를 "형질전환"하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다.

구체적으로는, 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method) 또는 아그로박테리아 분사법(Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "식물체"는, 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미이다.

본 발명에서 상기 식물체는 특별히 제한되지 않으며, 일례로서 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명에서 상기 형질전환된 식물체는 CHS-L 유전자 또는 이의 단백질을 발현하므로, 상기 CHS-L 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 도입함으로써 식물체에 존재하는 CHS-L 유전자의 발현을 증진시킬 수 있다. 따라서 에모딘 전구체의 생합성을 촉진할 수 있으며, 또한, 에모딘 전구체의 생합성을 촉진 또는 증진하여 에모딘 생산을 촉진할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 대장균 BL21(DE3) 균주에 CHS-L 재조합 벡터를 도입하여, CHS-L의 발현을 촉진하고, 이들 발현된 단백질을 분리하였으며, 분리된 CHS-L 단백질을 이용하여 malonyl-CoA 기질을 아트로크리좀 카르복시산(atrochrysome carboxylic acid) 또는 엔도크로신 안트론(endocrocin anthrone)로 합성하였다.

따라서 본 발명의 형질전환체는 미생물일 수 있으며, 구체적으로 대장균 BL21(DE3)일 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호1로 표시되는 CHS-L 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호5 및 서열번호6로 표시되는 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 실시예에서 CHS-L을 암호화하는 Sto07g228250(1,173 bp, 서열번호1) 유전자를 서열번호5 및 서열번호6로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였다.

따라서 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호5 및 서열번호6로 표시되는 프라이머를 포함한다. 상기 프라이머 세트는 CHS-L 유전자를 특이적으로 증폭하는 것으로, 구체적으로 서열번호1의 CHS-L 유전자를 특이적으로 증폭하는 것일 수 있다.

본 발명에서 프라이머 세트는 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머 세트를 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 세트이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 CHS-L 단백질과 말로닐코에이(malonyl-CoA)를 반응시키는 단계를 포함하는 에모딘 전구체의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 에모딘 전구체의 생산방법은 서열번호2의 아미노산 서열로 표시되는 결명자 유래 CHS-L 단백질과 말로닐코에이(malonyl-CoA)을 반응시키는 단계를 포함한다.

상기 반응시키는 단계는 CHS-L 단백질과 말로닐코에이를 혼합하고 20 내지 40℃에서 효소반응을 진행하는 것으로, 구체적으로 CHS-L 단백질과 말로닐코에이를 혼합하고 25 내지 35℃에서 3 내지 12시간 동안 효소반응을 진행시키는 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에서 대장균 형질전환체에서 분리한 CHS-L 재조합 단백질을 이용하여 malonyl-CoA 기질을 30℃에서 6시간 동안 효소반응 시킨 결과, 아트로크리좀 카르복시산(atrochrysome carboxylic acid)이 합성됨을 확인하였으며, 1 mM NADPH 보조 인자를 추가한 효소반응 malonyl-CoA 기질을 아트로크리좀 카르복시산(atrochrysome carboxylic acid) 또는 엔도크로신 안트론(endocrocin anthrone)이 합성됨을 확인하였다.

따라서 본 발명의 에모딘 전구체의 생산방법은 NADPH 보조 인자를 추가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

1. 결명자의 안트라퀴논 생합성 과정 경로 분석

폴리케타이드합성효소(Polyketide synthase)에 의해 생합성되는 안트라퀴논은 8개의 말로닐코에이(malonyl-CoA) 분자가 축합반응을 거쳐 옥타케타이드(octaketide)가 생성되고, 옥타케디트(octaketide)는 고리화(cyclization)와 에놀화(enolization) 등의 순차적 반응을 거쳐 polyketide synthase로 부터 atrochrysome carboxylic acid와 같은 안트라노이드(anthranoid) 계열의 물질이 생합성되는 것으로 예상된다. 이후 탈카복실반응(decarboxylation)과 산화(oxidation) 과정을 거쳐 안트라퀴논 중 한 종류인 에모딘(emodin)이 생성되고, 또 다른 생합성 과정은 dehydration 및 enolization 등을 거쳐 크리소파놀(chrysophanol)과 이슬란디신(islandicin)과 같은 안트라퀴논이 생합성되는 것으로 예상된다(도 1).

2. 결명자 유래 CHS-L 유전자의 진화 분석

2.1. 칼콘합성효소(chalcone synthase, CHS) 및 chalcone synthase-like, CHS-L 비교 분석

칼콘합성효소(Chalcone synthase, CHS) 및 chalcone synthase-like(CHS-L) 유전자는 식물의 생물학적 과정에서 다양한 천연물 생합성에 관여한다. 이에 결명자, 콩과 14종 및 포도 1종(총 16종)의 유전체에서 칼콘합성효소(Chalcone synthase, CHS) 또는 chalcone synthase-like(CHS-L)의 서브 패밀리 유전자를 비교 분석하였다.

표 1은 상기 16종의 식물 유전체에서 CHS-L 및 CHS 유전자 서브 패밀리(subfamily)를 분석한 결과이다. 표 1을 참조하면 미모사(Mimosa pudica, MIMPU), 겨울가시 아카시아 나무(Faidherbia albida, FAIAL), 병아리콩(Cicer arientinum, CICAR), 시서 레티쿨라툼(Cicer reticulatum, CICRE), 완두콩(Pisum sativum, PISSA), 비둘기콩(Cajanus cajan, CAJCA), 강낭콩(Phaseolus vulgaris, PHAVU), 녹두(Vigna radiata, VIGRA), 팥(Vigna angularis, VIGAN), 동부콩(Vigna unguiculata, VIGUN), 포도나무(Vitis vinifera, VITVI)의 유전체에서는 CHS-L 계열 유전자가 나타나지 않았다. 반면 결명자(Senna tora, SETOT)는 16개, 파트리지 콩(Partridge pea; Chamaecrista fasciculata, CHAFA)은 5개, 땅콩(Arachis hypogaea, ARHYP)은 2개, 메디카고 트룬카룰라(Medicago truncatula, MEDTR)는 1개, 콩(Glycine max, GLYMA)는 1개의 CHS-L 계열 유전자를 포함함을 확인하였다.

즉, 결명자는 다른 15종의 식물종의 유전체와 비교하여 CHS-L 계열 유전자가 특별히 많이 존재하고 있음을 확인하였다.

CHS 유전자는 결명자 유전체에 12개가 존재하였으며, 완두콩(Pisum sativum, PISSA)에는 존재하지 않고, 그 외 14종의 식물종의 유전체에서 6 내지 48개가 존재함을 확인하였다.

＊E/C represents expansion/contraction.

† Rapid_E and Rapid_C indicate rapid expansion and rapid contraction.

‡ 종명: 결명자(Senna tora, SETOT), 파트리지 콩(Partridge pea; Chamaecrista fasciculata, CHAFA), 미모사(Mimosa pudica, MIMPU), 겨울가시 아카시아 나무(Faidherbia albida, FAIAL), 땅콩(Arachis hypogaea, ARHYP), 메디카고 트룬카룰라(Medicago truncatula, MEDTR), 병아리콩(Cicer arientinum, CICAR), 시서 레티쿨라툼(Cicer reticulatum, CICRE), 완두콩(Pisum sativum, PISSA), 콩(Glycine max, GLYMA), 비둘기콩(Cajanus cajan, CAJCA), 강낭콩(Phaseolus vulgaris, PHAVU), 녹두(Vigna radiata, VIGRA), 팥(Vigna angularis, VIGAN), 동부콩(Vigna unguiculata, VIGUN), 포도나무(Vitis vinifera, VITVI).

다음으로 결명자((Senna tora)와 콩과 식물 4종(Chamaecrista fasciculata, Arachis hypogaea, Medicago truncatula, Glycine max)에 포함된 각 CHS-L 계열 유전자의 계통적 특이성을 확인하였다. 그 결과, 결명자의 CHS-L 유전자 16개 중 1개는 염색체 2에 위치하였으며, 나머지 15개 유전자는 염색체 7에 분포하고 있음을 확인하였다(도 2).

2.2. 결명자 유래 CHS-L 및 CHS 유전자 서열 확보

결명자 전사체 데이터베이스를 통해 결명자 유래 타입 Ⅲ 폴리케타이드 합성효소의 cDNA 서열을 확보하였다. CHS-L 유전자를 암호화하는 Sto07g228250(서열번호1)와 CHS 유전자를 암호화하는 Sto03g054970(서열번호3)의 ORF를 선택하여 기능을 분석하였다.

	염기/아미노산 서열
CHS-L 유전자 (서열번호1)	ATGGAGAGTGCTGCAGAAAAGAAGGGATTCGCCACAGTGCTTGCTATTGGCACTGCAAATCCCCCAAACATTTATCTTCAATCTGAGTTTCCTGATTTCTTCTTCAGAGTCACCAATAGTGAGCATCATGTCCAACTCAAGCAGAAGTTCAAGCGCATGTGTGACAACTCCAATATCAGGAAGCGCCATTTTCTTGTTGATGAAGATATTCTTAAAGAGCATCCAAACATCAGCACCTATGGAGCTCCTTCGTTGGATACACGCAGAGAAATAGTAACTAAGTACATTCCTAAGCTTGGGAAGGAAGCAGCCTTGAAATGTATTAAAGAATGGGGCCAACCTTTATCTAAGATCACACATCTCATCTTCTGCACATCTTCATGCATCAACAGCATTCCTGGACCTGATTTCTACCTTGCCAGAGAAATTGGCCTCCCAGCCACTTGTAACCGCCTTGTGATTTATGATCATGGTTGTCACGCTGGTGGTTCAGTCATTCGTGTAGCCAAGGCTCTTGCTGAGAGCATCCCTGGCTCACGTGTGCTCACTGTGTGTGCTGAGACCATGCTTACTTCCTTCCAAGCCCCAAGTCCGTCACATATGGACATTGTGGTTGGGCACGCCTTGTTTGGAGATGGTGCTGCTGCCATGATTGTCGGTACAGATCCTATCCCCAATGTTGAACGTCCACTGTTTGAGTTTGTGTTGGCTGCACAACAGACAGTGGGAGGATCTGAGGAGGCAATTCATGGACATGCAACTGAAAGAGGTCAAACTTACTTTTTAGGAAAAGAGATTCCAAATGTTGTTGCTGGTAATGTGAAGAAGTGTATGCATGATGCATTTGGGACGCTTGGTATGACAATCAATGAAGGAGAGTGGAATTCGTTGTTCTACGTGGTGCATCCTGGTGGGAAGGCAGTACTGAATGGGATGGAAGAGGTGCTTGAGTTGAAGGAAGAGAAGCTTGCTGCGAGTAGGACTATTTTGAGAGAGTACGGAAACATGTGGAGTCCATGTGTGTTCTTCGTGTTGGATGAAATGAGAAAGAAATCTTCCAACGAAGGGAAGTCCACAACCGGAGAAGGACATGACTGGGGTGCTTTGATGACCTTTGGACCAGGTTTGACGGTTGAAACAATTGTTTTGCATTCCATTTCCCTGAAGGACTAG
CHS-L 단백질 (서열번호2)	MESAAEKKGFATVLAIGTANPPNIYLQSEFPDFFFRVTNSEHHVQLKQKFKRMCDNSNIRKRHFLVDEDILKEHPNISTYGAPSLDTRREIVTKYIPKLGKEAALKCIKEWGQPLSKITHLIFCTSSCINSIPGPDFYLAREIGLPATCNRLVIYDHGCHAGGSVIRVAKALAESIPGSRVLTVCAETMLTSFQAPSPSHMDIVVGHALFGDGAAAMIVGTDPIPNVERPLFEFVLAAQQTVGGSEEAIHGHATERGQTYFLGKEIPNVVAGNVKKCMHDAFGTLGMTINEGEWNSLFYVVHPGGKAVLNGMEEVLELKEEKLAASRTILREYGNMWSPCVFFVLDEMRKKSSNEGKSTTGEGHDWGALMTFGPGLTVETIVLHSISLKD*
CHS유전자 (서열번호3)	ATGGTGAATGTGGAAGAGATCCGTAAGGCACAACGAGCGGAAGGTGCTGCTACAGTAATGGCTATCGGTACAGCGACCCCAACAAACTGTATAGAACAAAGTACCTATCCAGATTACTATTTTCGTATTACAAACAGTGAGCACATGACAGAGTTGAAAGAGAAATTCCAGCGCATGTGTGATAAGTCAATGATAAAAAAGAGATATATGCACTTGACAGAGGAGATCTTAAAGGAGAACCCTAATATGTGTGCTTACATGGCACCTTCTATTGATGCAAGGCAAGATATAGTGGTTTTGGAAGTACCAAAGCTTGGAAAAGAGGCTGCAACAAAGGCCATTAAGGAATGGGGCCAACCCAAATCCAAAATTACGCACTTGATCTTTTGCACTACAAGTGGTGTGGACATGCCAGGAGCTGACTACCAACTCACAAAGCTCTTAGGTCTTCGCCCATCTGTGAAGCGATACATGATGTACCAACAAGGTTGCTTTGCAGGCGGTACGGTGCTCCGTTTAGCCAAAGACTTGGCTGAGAATAACAAAGGAGCACGTGTACTTGTGGTTTGTTCTGAGATTACTGCAGTTACATTCCGTGGGCCTACTGATACCCATCTTGACAGCCTTGTGGGCCAAGCATTGTTTGGCGATGGGGCAGCTGCTGTTATTGTTGGATCTGACCCAATCCCACAAGTTGAGAAGCCTTTATTTGAACTTGTATGGACAGCACAAACTATTCTTCCCGATAGTGAAGGGGCTATTGATGGGCATCTTCGTGAAGTTGGGCTCACATTCCATCTTCTGAAAGATGTTCCTGGGCTCATCTCAAAGAACATTGAGAAAGCCTTGGTTGAAGCCTTCAAACCATTGGGAATTTCTGATTATAACTCAATTTTCTGGATTGCTCACCCAGGTGGGCCTGCAATTTTGGACCAAGTTGAGGCCAAATTAGAGTTGAAGCCCGAAAAGATGCAGGCCACTAGACACGTGCTTAGTGAGTATGGAAACATGTCCAGTGCATGCGTGTTATTCATTTTGGATGAAATGAGGAGAAAATCAGCAAAAGATGGACTTGGCACAACAGGTGAAGGACTTGAGTGGGGTGTTCTATTTGGATTTGGGCCTGGCCTTACTGTTGAGACCGTTGTGCTCCACAGTATTGCTATTTAA
CHS 단백질 (서열번호4)	MVNVEEIRKAQRAEGAATVMAIGTATPTNCIEQSTYPDYYFRITNSEHMTELKEKFQRMCDKSMIKKRYMHLTEEILKENPNMCAYMAPSIDARQDIVVLEVPKLGKEAATKAIKEWGQPKSKITHLIFCTTSGVDMPGADYQLTKLLGLRPSVKRYMMYQQGCFAGGTVLRLAKDLAENNKGARVLVVCSEITAVTFRGPTDTHLDSLVGQALFGDGAAAVIVGSDPIPQVEKPLFELVWTAQTILPDSEGAIDGHLREVGLTFHLLKDVPGLISKNIEKALVEAFKPLGISDYNSIFWIAHPGGPAILDQVEAKLELKPEKMQATRHVLSEYGNMSSACVLFILDEMRRKSAKDGLGTTGEGLEWGVLFGFGPGLTVETVVLHSIAI*

3. 결명자 CHS-L 및 CHS 유전자 클로닝 및 발현

3.1. CHS-L 및 CHS 유전자 클로닝

CHS-L을 암호화하는 Sto07g228250(1,173 bp, 서열번호1) 및 CHS를 암호화하는 Sto03g054970(1,170 bp, 서열번호3)을 클로닝하기 위해 표 3과 같이 프라이머를 디자인하였다.

유전자명	정방향(forward)	역방향(reverse)
CHS-L Sto07g228250	AAGGATCCATGGAGAGTGCTGGAG (서열번호5)	AACTCGAGCTAGTCTCTCAGAGGG (서열번호6)
CHS Sto03g054970	GGATCCATGGTGAATGTGGAAGAGATC (서열번호7)	GAATTCTTAGACAGCCACACTATGGAG (서열번호8)

상기 프라이머를 이용하여 하기 조건으로 RT-PCR 후, CHS-L은 BamHI 및 XhoI 제한효소 자리를 사용하여 pET28a(+) 대장균 발현 벡터에 재조합하였으며, CHS은 BamHI 및 EcoRI 제한효소 자리를 이용하여 pET28a(+) 대장균 발현 벡터에 재조합하였다. 발현 벡터에 재조합된 플라스미드를 각각 pET28a(+)_Sto07g228250와 pET28a(+)_Sto03g054970라 명명하였다.

RT-PCR 조건:

94℃ 7분 1 cycle,

94℃ 1분, 58-62℃ 1분 30 cycles,

72℃ 1분, 72℃ 7분 1 cycle

3.2. CHS-L 및 CHS 유전자 발현

대장균 BL21(DE3) 균주에 상기 pET28a(+)_Sto07g228250 또는 pET28a(+)_Sto03g054970 플라스미드를 형질도입하여 재조합 균주를 제조하고, 이들 균주에서 CHS-L 및 CHS 단백질을 발현시켰다.

구체적으로, 재조합 균주를 LB 배지에 접종한 후 0.4 mM IPTG로 발현을 유도한 후 20℃에서 20 내지 24시간 동안 배양하여 재조합 단백질(CHS-L 또는 CHS)을 발현시켰다. 재조합 단백질을 분리하고자, 재조합 균주의 배양액을 원심 분리하여 균체만 모은 후, 10% 글리세롤을 함유하는 100mM 포스페이트 완충용액 (pH 7.5)으로 2회 세척 후 초음파 처리하여 세포벽을 파괴하였다. 그 후 4℃, 12,000 rpm (13,475 × g)에서 30분간 원심 분리하여 침전물(불용성 균체 파편)을 제거하고 상등액을 수득하였다.

다음으로 상등액에서 발현된 단백질을 정제하였다. 정제 컬럼에 수득된 상층액을 넣고 1 ㎖의 His6 Ni-Superflow Resin(Takara, Japan)과 100 mM 포스페이트 완충용액(pH 7.5, 500 mM NaCl, 5 mM 이미다졸, 1 mM 디티오트레이톨 및 10% 글리세롤 포함) 존재 하에 1시간 이상 단백질을 His-태그 레진에 결합시켰다. 6X His-태그에 결합한 재조합 단백질을 컬럼 부피의 8배의 50mM 및 250mM의 이미다졸을 함유하는 포스페이트 완충용액을 흘려 정제된 재조합 단백질을 수득하였다.

정제된 단백질을 아미콘 울트라 15(Amicon Ultra 15, Millipore, 30 K NMWL centrifugal filters)를 사용하여 농축하였다. 단백질 농도는 브래드포드 분석(Bradford assay, Protein Assay Dc, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 수행하였으며, 표준 단백질로 알부민 사용하였다.

분리한 재조합 단백질의 순도 및 분자질량은 12% SDS-PAGE를 이용하여 확인하였다. CHS-L(Sto07g228250) 및 CHS(Sto03g054970)로부터 His-tag이 수식된 재조합 단백질을 발현하여 확인한 결과 ~48 kDa임을 확인하였다(도 3).

4. CHS-L 및 CHS 효소 반응 및 검정

4.1. CHS-L 및 CHS의 폴리케타이드합성효소(polyketide synthase) 활성

다음으로 안트라퀴논 생합성 과정에서의 CHS-L(Sto07g228250) 또는 CHS(Sto03g054970) 단백질의 역할을 분석하고자, 정제한 CHS-L 또는 CHS의 재조합 단백질의 폴리케타이드합성효소(polyketide synthase) 활성을 분석하였다.

CHS-L 단백질의 폴리케타이드합성효소(polyketide synthase) 활성을 분석하고자, 5mM의 malonyl-CoA, 10mM의 MgCl₂, 100mM phosphate buffer(pH 7.5), 10㎍/㎖의 정제된 단백질을 사용하여 1㎖ 부피로 반응을 진행하였다. 또한, 대조 반응으로 위와 동일한 조건에서 열에 의해 불활성화된 재조합 단백질을 이용하여 반응을 진행하였다. 반응 혼합물에 추가 1 mM NADPH 보조 인자를 갖는 유사한 반응 성분으로 별도의 반응을 수행하였다. 또한, 위와 같은 반응조건을 이용하여 malonyl-CoA 대신 방사성 동위원소로 표지된 13C3-malonyl-CoA로 반응을 진행하였다.

반응 시간은 30℃에서 6 시간 동안 반응하였고, 반응 후 85℃에서 3 분간 열처리를 통하여 반응을 종료시켰다.

CHS(Sto03g054970) 효소 반응의 경우, 반응 출발 물질(기질)로는 p-coumaroyl-CoA를 사용하였고, 탄소 골격을 확장해 주는 기질로는 malonyl-CoA 및 13C3-malonyl-CoA을 사용하여 반응을 진행하였으며, 반응은 각각 3번씩 반복하여 진행하였다.

4.2. CHS-L(Sto07g228250) 및 CHS(Sto03g054970) 효소 검정

CHS-L 또는 CHS 단백질의 효소 반응 결과물을 TOF ESI-MS가 연결된 UPLC로 분석하였다. 이온크로마토그램(EIC)을 통해 CHS-L(Sto07g228250) 효소와의 반응 결과물을 분석한 결과, 분자 질량이 319.08 Da 및 301.07 Da 결과를 얻었다(도 4a (i), b(i)). 그러나 CHS(Sto03g054970) 및 열변성 CHS-L (Sto07g228250 대조군) 효소에서는 같은 질량을 가진 반응 결과물이 검출되지 않았다.

구체적으로, 도 4a(i)에서 머무름 시간(retention time, tR) 4.45분에서 m/z⁺ 319.0827의 결과 값을 나타내었다. 이는 도 1의 폴리케타이드합성효소 반응의 결과물 중 에모딘 합성 전구체인 카복실산 아트로크리좀 카르복시산(atrochrysome carboxylic acid, 분자식 C₁₆H₁₄O₇)의 이론적 분자량(319.0818)과 동일하였다. 따라서 효소반응에 의해 생성된 물질은 atrochrysome carboxylic acid임을 알 수 있다. 또한, 동위원소로 처리된 기질(¹³C₃-malonyl-CoA)과 반응한 결과물의 이론적 질량값과 실제 동위 원소를 이용한 실험한 결과물의 질량값이 정확히 일치함을 확인하였다(도 4a(ⅱ)).

또한, 1 mM NADPH 보조 인자를 추가한 효소반응 결과물의 ESI-MS 스펙트럼 분석하였다. 분석결과, atrochrysome carboxylic acid 이외의 머무름 시간 4.62분에서 m/z⁺ 301.0715의 결과 값을 나타내었다. 이는 도 1의 폴리케타이드합성효소 반응의 결과물 중 에모딘 합성 전구체인 엔도크로신 안트론(endocrocin anthrone, 분자식 C₁₆H₁₂O₆)의 이론적 분자량(301.0712)과 동일하였다. 따라서 효소반응에 의해 생성된 물질은 endocrocin anthrone이다(도 4b(ⅰ)). 또한, 동위원소로 처리된 기질(¹³C₃-malonyl-CoA)과 반응한 결과물의 이론적 질량값과 실제 동위 원소를 이용한 실험한 결과물의 질량값이 정확히 일치함을 확인하였다(도 4b(ⅱ)).

상기 결과를 통해 CHS-L(Sto07g228250)이 폴리케타이드합성효소 활성을 가지며, malonyl-CoA 기질로 이용하여 에모딘 전구체인 atrochrysome carboxylic acid 또는 endocrocin anthrone을 합성함을 확인하였다.

또한, Atrochrysome carboxylic acid 및 endocrocin anthrone 대사산물을 제외한 탈카복시화(decarboxylation), 산화(oxidation)의 추가 반응이 필요한 에모딘 안트론(emodin anthrone), 엔도크로친(endocrocin), 에모딘(emodin), 크리소파놀(chrysophanol), 또는 이슬란디신(islandicin) 등의 산물은 검출되지 않았다.

결론적으로 결명자 유래 CHS-L(Sto07g228250) 단백질이 타입 Ⅲ polyketide의 생합성 경로를 통해서 에모딘 전구체인 Atrochrysome carboxylic acid 및 endocrocin anthrone의 생합성을 하며, 안트라퀴논의 일종인 에모딘 생합성 경로에 관여함을 확인하였다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) Industry-University Cooperation Foundation Sunmoon University <120> Senna tora-derived gene having anthoraquinone biosynthesis function and use thereof <130> DP20200066 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHS-L gene <400> 1 atggagagtg ctgcagaaaa gaagggattc gccacagtgc ttgctattgg cactgcaaat 60 cccccaaaca tttatcttca atctgagttt cctgatttct tcttcagagt caccaatagt 120 gagcatcatg tccaactcaa gcagaagttc aagcgcatgt gtgacaactc caatatcagg 180 aagcgccatt ttcttgttga tgaagatatt cttaaagagc atccaaacat cagcacctat 240 ggagctcctt cgttggatac acgcagagaa atagtaacta agtacattcc taagcttggg 300 aaggaagcag ccttgaaatg tattaaagaa tggggccaac ctttatctaa gatcacacat 360 ctcatcttct gcacatcttc atgcatcaac agcattcctg gacctgattt ctaccttgcc 420 agagaaattg gcctcccagc cacttgtaac cgccttgtga tttatgatca tggttgtcac 480 gctggtggtt cagtcattcg tgtagccaag gctcttgctg agagcatccc tggctcacgt 540 gtgctcactg tgtgtgctga gaccatgctt acttccttcc aagccccaag tccgtcacat 600 atggacattg tggttgggca cgccttgttt ggagatggtg ctgctgccat gattgtcggt 660 acagatccta tccccaatgt tgaacgtcca ctgtttgagt ttgtgttggc tgcacaacag 720 acagtgggag gatctgagga ggcaattcat ggacatgcaa ctgaaagagg tcaaacttac 780 tttttaggaa aagagattcc aaatgttgtt gctggtaatg tgaagaagtg tatgcatgat 840 gcatttggga cgcttggtat gacaatcaat gaaggagagt ggaattcgtt gttctacgtg 900 gtgcatcctg gtgggaaggc agtactgaat gggatggaag aggtgcttga gttgaaggaa 960 gagaagcttg ctgcgagtag gactattttg agagagtacg gaaacatgtg gagtccatgt 1020 gtgttcttcg tgttggatga aatgagaaag aaatcttcca acgaagggaa gtccacaacc 1080 ggagaaggac atgactgggg tgctttgatg acctttggac caggtttgac ggttgaaaca 1140 attgttttgc attccatttc cctgaaggac tag 1173 <210> 2 <211> 390 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CHS-L protein <400> 2 Met Glu Ser Ala Ala Glu Lys Lys Gly Phe Ala Thr Val Leu Ala Ile 1 5 10 15 Gly Thr Ala Asn Pro Pro Asn Ile Tyr Leu Gln Ser Glu Phe Pro Asp 20 25 30 Phe Phe Phe Arg Val Thr Asn Ser Glu His His Val Gln Leu Lys Gln 35 40 45 Lys Phe Lys Arg Met Cys Asp Asn Ser Asn Ile Arg Lys Arg His Phe 50 55 60 Leu Val Asp Glu Asp Ile Leu Lys Glu His Pro Asn Ile Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Gly Ala Pro Ser Leu Asp Thr Arg Arg Glu Ile Val Thr Lys Tyr Ile 85 90 95 Pro Lys Leu Gly Lys Glu Ala Ala Leu Lys Cys Ile Lys Glu Trp Gly 100 105 110 Gln Pro Leu Ser Lys Ile Thr His Leu Ile Phe Cys Thr Ser Ser Cys 115 120 125 Ile Asn Ser Ile Pro Gly Pro Asp Phe Tyr Leu Ala Arg Glu Ile Gly 130 135 140 Leu Pro Ala Thr Cys Asn Arg Leu Val Ile Tyr Asp His Gly Cys His 145 150 155 160 Ala Gly Gly Ser Val Ile Arg Val Ala Lys Ala Leu Ala Glu Ser Ile 165 170 175 Pro Gly Ser Arg Val Leu Thr Val Cys Ala Glu Thr Met Leu Thr Ser 180 185 190 Phe Gln Ala Pro Ser Pro Ser His Met Asp Ile Val Val Gly His Ala 195 200 205 Leu Phe Gly Asp Gly Ala Ala Ala Met Ile Val Gly Thr Asp Pro Ile 210 215 220 Pro Asn Val Glu Arg Pro Leu Phe Glu Phe Val Leu Ala Ala Gln Gln 225 230 235 240 Thr Val Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ile His Gly His Ala Thr Glu Arg 245 250 255 Gly Gln Thr Tyr Phe Leu Gly Lys Glu Ile Pro Asn Val Val Ala Gly 260 265 270 Asn Val Lys Lys Cys Met His Asp Ala Phe Gly Thr Leu Gly Met Thr 275 280 285 Ile Asn Glu Gly Glu Trp Asn Ser Leu Phe Tyr Val Val His Pro Gly 290 295 300 Gly Lys Ala Val Leu Asn Gly Met Glu Glu Val Leu Glu Leu Lys Glu 305 310 315 320 Glu Lys Leu Ala Ala Ser Arg Thr Ile Leu Arg Glu Tyr Gly Asn Met 325 330 335 Trp Ser Pro Cys Val Phe Phe Val Leu Asp Glu Met Arg Lys Lys Ser 340 345 350 Ser Asn Glu Gly Lys Ser Thr Thr Gly Glu Gly His Asp Trp Gly Ala 355 360 365 Leu Met Thr Phe Gly Pro Gly Leu Thr Val Glu Thr Ile Val Leu His 370 375 380 Ser Ile Ser Leu Lys Asp 385 390 <210> 3 <211> 1170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHS gene <400> 3 atggtgaatg tggaagagat ccgtaaggca caacgagcgg aaggtgctgc tacagtaatg 60 gctatcggta cagcgacccc aacaaactgt atagaacaaa gtacctatcc agattactat 120 tttcgtatta caaacagtga gcacatgaca gagttgaaag agaaattcca gcgcatgtgt 180 gataagtcaa tgataaaaaa gagatatatg cacttgacag aggagatctt aaaggagaac 240 cctaatatgt gtgcttacat ggcaccttct attgatgcaa ggcaagatat agtggttttg 300 gaagtaccaa agcttggaaa agaggctgca acaaaggcca ttaaggaatg gggccaaccc 360 aaatccaaaa ttacgcactt gatcttttgc actacaagtg gtgtggacat gccaggagct 420 gactaccaac tcacaaagct cttaggtctt cgcccatctg tgaagcgata catgatgtac 480 caacaaggtt gctttgcagg cggtacggtg ctccgtttag ccaaagactt ggctgagaat 540 aacaaaggag cacgtgtact tgtggtttgt tctgagatta ctgcagttac attccgtggg 600 cctactgata cccatcttga cagccttgtg ggccaagcat tgtttggcga tggggcagct 660 gctgttattg ttggatctga cccaatccca caagttgaga agcctttatt tgaacttgta 720 tggacagcac aaactattct tcccgatagt gaaggggcta ttgatgggca tcttcgtgaa 780 gttgggctca cattccatct tctgaaagat gttcctgggc tcatctcaaa gaacattgag 840 aaagccttgg ttgaagcctt caaaccattg ggaatttctg attataactc aattttctgg 900 attgctcacc caggtgggcc tgcaattttg gaccaagttg aggccaaatt agagttgaag 960 cccgaaaaga tgcaggccac tagacacgtg cttagtgagt atggaaacat gtccagtgca 1020 tgcgtgttat tcattttgga tgaaatgagg agaaaatcag caaaagatgg acttggcaca 1080 acaggtgaag gacttgagtg gggtgttcta tttggatttg ggcctggcct tactgttgag 1140 accgttgtgc tccacagtat tgctatttaa 1170 <210> 4 <211> 389 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CHS protein <400> 4 Met Val Asn Val Glu Glu Ile Arg Lys Ala Gln Arg Ala Glu Gly Ala 1 5 10 15 Ala Thr Val Met Ala Ile Gly Thr Ala Thr Pro Thr Asn Cys Ile Glu 20 25 30 Gln Ser Thr Tyr Pro Asp Tyr Tyr Phe Arg Ile Thr Asn Ser Glu His 35 40 45 Met Thr Glu Leu Lys Glu Lys Phe Gln Arg Met Cys Asp Lys Ser Met 50 55 60 Ile Lys Lys Arg Tyr Met His Leu Thr Glu Glu Ile Leu Lys Glu Asn 65 70 75 80 Pro Asn Met Cys Ala Tyr Met Ala Pro Ser Ile Asp Ala Arg Gln Asp 85 90 95 Ile Val Val Leu Glu Val Pro Lys Leu Gly Lys Glu Ala Ala Thr Lys 100 105 110 Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln Pro Lys Ser Lys Ile Thr His Leu Ile 115 120 125 Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Asp Met Pro Gly Ala Asp Tyr Gln Leu 130 135 140 Thr Lys Leu Leu Gly Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Tyr Met Met Tyr 145 150 155 160 Gln Gln Gly Cys Phe Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Leu Ala Lys Asp 165 170 175 Leu Ala Glu Asn Asn Lys Gly Ala Arg Val Leu Val Val Cys Ser Glu 180 185 190 Ile Thr Ala Val Thr Phe Arg Gly Pro Thr Asp Thr His Leu Asp Ser 195 200 205 Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ala Ala Ala Val Ile Val 210 215 220 Gly Ser Asp Pro Ile Pro Gln Val Glu Lys Pro Leu Phe Glu Leu Val 225 230 235 240 Trp Thr Ala Gln Thr Ile Leu Pro Asp Ser Glu Gly Ala Ile Asp Gly 245 250 255 His Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr Phe His Leu Leu Lys Asp Val Pro 260 265 270 Gly Leu Ile Ser Lys Asn Ile Glu Lys Ala Leu Val Glu Ala Phe Lys 275 280 285 Pro Leu Gly Ile Ser Asp Tyr Asn Ser Ile Phe Trp Ile Ala His Pro 290 295 300 Gly Gly Pro Ala Ile Leu Asp Gln Val Glu Ala Lys Leu Glu Leu Lys 305 310 315 320 Pro Glu Lys Met Gln Ala Thr Arg His Val Leu Ser Glu Tyr Gly Asn 325 330 335 Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe Ile Leu Asp Glu Met Arg Arg Lys 340 345 350 Ser Ala Lys Asp Gly Leu Gly Thr Thr Gly Glu Gly Leu Glu Trp Gly 355 360 365 Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Val Glu Thr Val Val Leu 370 375 380 His Ser Ile Ala Ile 385 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHS-L forward primer <400> 5 aaggatccat ggagagtgct ggag 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHS-L reverse primer <400> 6 aactcgagct agtctctcag aggg 24 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHS forward primer <400> 7 ggatccatgg tgaatgtgga agagatc 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHS reverse primer <400> 8 gaattcttag acagccacac tatggag 27

Claims

폴리케타이드합성효소(polyketide synthase) 활성을 가지는 서열번호2의 아미노산 서열로 표시되는 결명자 유래 CHS-L 단백질.
제 1항에 있어서,
상기 폴리케타이드합성효소(polyketide synthase)는 말로닐코에이(malonyl-CoA) 기질을 이용하여 에모딘 전구체를 합성하는 것인, 단백질.
제 2항에 있어서,
상기 에모딘 전구체는 아트로크리좀 카르복시산(atrochrysome carboxylic acid) 또는 엔도크로신 안트론(endocrocin anthrone)인 것인, 단백질.
제 1항의 CHS-L 단백질을 암호화하는 서열번호1로 표시되는 CHS-L 유전자.
제 4항의 CHS-L 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제 5항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제 6항에 있어서,
상기 형질전환체는 대장균 BL21(DE3) 균주인 것인, 형질전환체.
서열번호1로 표시되는 CHS-L 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호5 및 서열번호6으로 표시되는 프라이머 세트.
제 1항의 단백질과 말로닐코에이(malonyl-CoA)를 반응시키는 단계를 포함하는, 에모딘 전구체의 생산방법.
제 9항에 있어서,
NADPH 보조 인자를 추가하는 단계를 더 포함하는, 생산방법.
제 9항에 있어서,
상기 에모딘 전구체는 아트로크리좀 카르복시산(atrochrysome carboxylic acid) 또는 엔도크로신 안트론(endocrocin anthrone)인 것인, 생산방법.