KR102579955B1

KR102579955B1 - 비타민 c 함량을 증대시키는 배추 유래 광수용체 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102579955B1
Application number: KR1020200171492A
Authority: KR
Inventors: 이수인; 김진아; 무투사미; 김종희
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2023-10-05
Also published as: KR20220081701A

Abstract

본 발명은 비타민 C 함량을 증대시키는 배추 유래 광수용체 유전자와 이의 용도에 관한 것으로, 상기 비타민 C 함량을 증대시키는 유전자, 이를 포함하는 형질전환 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체 및 비타민 C 함량이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 배추 유래의 BrCRY3 유전자가 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 비타민 C 함량이 증진되므로, 이를 이용하면 비기능성 물질이 풍부한 고품질 농산물 생산으로 부가가치와 농가소득을 증대시킬 수 있다.

Description

비타민 C 함량을 증대시키는 배추 유래 광수용체 유전자 및 이의 용도{Photoreceptor gene derived from Brassica rapa for increasing vitamin C content and uses thereof}

본 발명은 비타민 C 함량을 증대시키는 배추 유래 광수용체 유전자와 이의 용도에 관한 것으로, 상기 비타민 C 함량을 증대시키는 유전자, 이를 포함하는 형질전환 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체 및 비타민 C 함량이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.

배추는 한국인의 식생활에 중요한 위치를 차지하는 김치의 주재료이다. 김치 제조과정 또는 저장과정 중 다양하게 변화되며 비타민 성분 중에서도 비타민 C는 김치에 많이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 비타민 C(vitamin C)는 괴혈병(scurvy)을 방지하는 물질이며, 아스코르브산(ascorbic acid)은 항괴혈병 역할에서 유래된 용어다. 비타민 C는 항산화 물질로, 신체를 활성산소로부터 보호하여, 암, 동맥경화 및 류머티즘 등을 예방해 주며, 면역체계도 강화시킨다. 또한 비타민 C는 위궤양 및 십이지장궤양의 원인인 헬리코박터 파이로리 균의 번식을 억제하며, 노인의 인지 능력과 기억력 유지를 돕고, 알츠하이머병(치매) 예방에도 도움이 된다고 알려져 있다.

크립토크롬(Cryptochrome, CRY)은 플라빈계 색소로, 식물의 빛 형태형성에 중요한 역할을 하는 색소 단백질이다. 청색광 효과라고 불리는 불가역적 반응을 하며, 적색광과 근적외선과 반응하는 피토크롬계 색소와 함께 형태형성에 관여한다. 크립토크롬이 활성화되면 줄기의 성장을 억제하며, 안토시아닌의 합성을 촉진하여 단파장 빛 스트레스에 대응하며, 식물의 날짜 주기를 재설정하기도 한다. 특히 크립토크롬 3(CRY3)는 청색광 수용체로비타민C 생합성, 안토시아닌 생합성 등 물질대사 생합성에 영향을 끼친다고 알려져 있다.

본 발명자들은 항산화 물질이 증진된 고품질 농산물 생산으로 부가가치와 농가소득 증대의 일환으로, 비타민 C가 증대된 작물을 생산하기 위해 노력한 결과, 식물체에 청색광을 처리하였을 때 강하게 발현되는 배추의 BrCRY3 유전자가 도입된 형질전환체는 비타민 C가 증대되었음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-1557417호

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 비타민 C가 증대된 유전자, 상기 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체 및 비타민 C 함량이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 BrCRY3 단백질을 코딩하며, 비타민 C 함량을 증진시키는 유전자를 제공한다.

상기 유전자는 서열번호 1의 BrCRY3 유전자일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하며, 비타민 C 함량을 증진시키는 형질전환 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

상기 식물체는 배추, 무, 애기장대, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 BrCRY3 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 비타민 C 함량 증진용 조성물을 제공한다.

상기 유전자는 서열번호 1의 BrCRY3 유전자일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 BrCRY3 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 비타민 C 함량이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

상기 유전자는 서열번호 1의 BrCRY3 유전자일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 BrCRY3 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 식물체의 비타민 C 함량을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 배추 유래의 BrCRY3 유전자가 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 비타민 C 함량이 증진되므로, 이를 이용하면 비기능성 물질이 풍부한 고품질 농산물 생산으로 부가가치와 농가소득을 증대시킬 수 있다.

도 1은 배추의 BrCRY3 유전자 LED 광원별, 시기별 처리시 청색광 수용체 (cryptochromes) 유전자의 발현을 분석한 것이다.
도 2는 배추 유래 BrCRY3 (Bra009798)의 염기 서열 및 추론된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 배추 형질전환용 과발현 벡터 모식도를 나타낸 것이다 (pLSI66).
도 4는 배추 형질전환용 저발현 벡터 모식도를 나타낸 것이다 (pLSI72).
도 5는 BrCRY3 유전자 도입 배추 형질전환체의 T-DNA 인접서열 시퀀싱 방법에 의한 분석 결과이다.
도 6은 BrCRY3 과발현 형질전환 배추의 qRT-PCR 분석 결과이다.
도 7은 BrCRY3 저발현(RNAi) 형질전환 배추의 qRT-PCR 분석 결과이다.
도 8은 BrCRY3 과발현 또는 BrCRY3 과발현 형질전환 배추의 비타민 C 함량을 분석 결과이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 항산화 물질이 증진된 고품질 농산물 생산으로 부가가치와 농가소득 증대의 일환으로, 비타민 C가 증대된 작물을 생산하기 위해 노력한 결과, 식물체에 청색광을 처리하였을 때 강하게 발현되는 배추의 BrCRY3 유전자가 도입된 형질전환체는 비타민 C가 증대되었음을 확인함으로써 완성되었다.

본 발명은 일 관점에서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 BrCRY3 단백질을 코딩하며, 비타민 C 함량을 증진시키는 유전자에 관한 것이다.

본 발명에서 BrCRY3 유전자는 서열번호 2의 단백질을 코딩하는 유전자이다.

본 발명에서 상기 BrCRY3 유전자는 배추 유래 Bra009798 유전자로 구체적으로, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자일 수 있다. 상기 서열번호 1의 유전자는 배추에서 사용가능한 코돈을 활용하여 코돈이 변경된 BrCRY3일 수 있다.

상기 BrCRY3 유전자는 유래로, 구체적으로 Brassica rapa L. ssp. pekinensis 유래일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 BrCRY3 유전자는 서열번호 1의 염기서열에 한정되지 않으며, 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 염기서열을 포함한다. 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 염기서열은 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 구체적으로는 70%의 상동성, 보다 더 구체적으로는 80%의 상동성, 가장 구체적으로는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 크립토크롬 3 (CRY3)은 청색광 수용체로서 크립토크롬의 보존된 영역인 DASH 도메인뿐만 아니라 DNA 광분해효소(DNA photolyase), FAD 결합도메인(binding domain)을 포함하고 있었다. BrCRY3(Bra009798)은 다른 식물과의 아미노산 서열을 이용한 유연관계 비교 시 상동성은 약 85-90%을 보였음을 확인하였으며, 이 유전자의 기능 분석 연구를 위해 선택하였다.

또한, BrCRY3 유전자의 비타민 C 함량 증진 효과를 확인하고자, BrCRY3의 과발현 재조합 벡터(pLSI66) 및 BrCRY3의 저발현 재조합 벡터(pLSI72)를 제조하였다. 또한, 제조된 pLSI66 또는 pLSI72 벡터를 배추에 형질도입하여 BrCRY3 과발현 또는 저발현 형질전환 배추를 제조하였다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, BrCRY3 과발현 형질전환 배추(pLSI66-6 및 pLSI66-10)에서 비타민 C 함량의 증대(19∼144%)를 확인하였으며, BrCRY3 저발현 형질전환 배추(pLSI72-1, pLSI72(2)-3)에서 비타민 C의 함량이 현저히 감소(62∼68%)되었음을 확인하였다.

따라서 본 발명의 BrCRY3 유전자는 식물체에서 비타민 C 함량을 증진시키는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서 상기 유전자를 포함하며, 비타민 C 함량을 증진시키는 형질전환 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 “재조합”은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서 "형질전환 재조합 벡터"란 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물로, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다.

본 발명의 "형질전환 재조합 벡터"는 상기 BrCRY3 유전자가 발현될 수 있도록, 발현조절 서열과 기능적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 벡터는 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 일실시예에서는, BrCRY3 유전자가 과발현되며, CaMV35S 프로모터에 의해 조절 받으며, 항생제 선발 마커로 하이그로마이신 저항성 유전자를 포함하는 pLSI66 형질전환 벡터 및 BrCRY3 유전자가 저발현되며, CaMV35S 프로모터에 의해 조절 받으며, 항생제 선발 마커로 하이그로마이신 저항성 유전자를 포함하는 pLSI72 형질전환 벡터를 제작하였다.

본 발명에서 상기 재조합 벡터는 형질전환 재조합 벡터를 포함한다. 또한, 본 발명의 상기 재조합 벡터는 비타민 C 함량을 증진시키는 재조합 벡터일 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 비타민 C함량이 증진된 식물체에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은, 유전물질인 DNA를 다른 계통의 살아 있는 세포에 주입했을 때, DNA가 그 세포에 들어가 유전형질을 변화시키는 현상으로, 형질변환, 형전환, 또는 형변환이라고도 한다.

본 발명에서 상기 벡터로 식물체를 "형질전환"하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로는, 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션 (electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법 (microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method) 또는 아그로박테리아 분사법 (Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법 또는 아그로박테리아 분사법(Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "식물체"는, 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 수 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미이다.

본 발명에서 상기 식물체는 배추, 무, 애기장대, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며, 구체적으로는 식량 작물류이며, 바람직하게는 배추(Brassica rapa)이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 형질전환된 식물체는 BrCRY3 유전자 또는 이의 단백질을 발현하므로, 상기 BrCRY3 유전자 또는 BrCRY3 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 도입함으로써 식물체에 존재하는 BrCRY3 단백질의 발현을 증진시킬 수 있다.

본 발명의 전술한 실시예에서 BrCRY3이 과발현된 식물체가 대조군과 비교하여 배추의 비타민 C 함량이 현저하게 증진되었음을 확인하였으며, 반대로 BrCRY3이 저발현된 식물체가 대조군과 비교하여 배추의 비타민 C 함량이 현저하게 감소되었음을 확인하였다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 BrCRY3 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 비타민 C 함량 증진용 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 BrCRY3 단백질을 코딩하는 유전자를 포함함으로써 또는 상기 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터를 포함함으로써 비타민 C 함량을 증진시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 BrCRY3 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 BrCRY3 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 비타민 C 함량이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 상기 비타민 C 함량을 증진시키는 BrCRY3 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고, 이를 식물체에 형질전환시켜, 비타민 C 함량이 증진된 형질전환 식물체의 제조가 가능하다.

상기 식물체를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같으며, 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물체로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다 (Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 BrCRY3 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 식물체의 비타민 C 함량을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "형질전환 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계"는 특정 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제작하고, 그 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 의미한다.

본 발명에 의하면, 상기 BrCRY3 유전자의 발현이 증진되는 경우, 식물체의 비타민 C 함량을 증진시키기 위하여, 전술한 바와 같이 BrCRY3 유전자의 발현을 증진하는 형질전환용 벡터를 이용하여, 식물체를 형질전환하거나 또는 다른 인위적인 물질의 처리에 의해 상기 유전자의 발현을 증진시켜 식물체의 식물체의 비타민 C 함량을 증진시키는 것도 가능하며, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[실시예 1] 배추 유래 크립토크롬3 (BrCRY3) 유전자의 특성 분석

크립토크롬 3 (CRY3)은 청색광 수용체로 식물의 줄기 신장, 잎 확장, 안토시아닌 생합성 등 신호전달(signal transduction) 역할을 통해 식물의 성장과 발달에 중요한 기능을 수행한다. 애기장대의 AtCRY3는 생장과 발달 혹은 빛이나 자기장과 같은 환경변화를 감지하여 적응하는데 관여하는 등 식물체에서 광주기 개화 경로(photoperiodic flowering pathway), 안토시아닌 생합성 경로(anthocyanin biosynthesis pathway) 등 다양한 역할을 수행한다.

도 1을 살펴보면, LED 광원별 및 시기별 처리 청색광 수용체 (cryptochromes) 유전자의 발현을 분석한 결과, 배추의 BrCRY3 유전자는 식물체에 청색광을 처리하였을 때 강하게 발현됨을 확인하였다.

배추 유래 BrCRY3의 유연관계를 확인하기 위하여 공공데이터베스를 이용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2를 살펴보면, 크립토크롬 3 (CRY3)은 색광 수용체로서 크립토크롬의 보존된 영역인 DASH 도메인뿐만 아니라 DNA 광분해효소(DNA photolyase), FAD 결합도메인(binding domain)을 포함하고 있었다. BrCRY3(Bra009798)은 다른 식물 (애기장대, 유채, 갓 등)과의 아미노산 서열을 이용한 유연관계 비교 시 상동성은 약 85-90%을 보였으며, 특히 유채와 가장 유사함을 확인하였다.

[실시예 2] 배추 유래 BrCRY3 유전자의 형질전환체 이용 발현 분석

1. 배추 과발현 형질전환용 벡터

배추에서 총 RNA를 분리하고 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하여 BrCRY3 (Bra009798) 유전자에 특이적이면서 attB1과 attB2 서열 12bp를 포함하는 Bra009798_F_B1 (서열번호 3)과 Bra009798_R_B2 (서열번호 4) 프라이머를 이용하여 1차 PCR을 통해 유전자를 분리하였다. attB1 (서열번호 5)과 attB2 (서열번호 6) 프라이머를 이용하여 2차 PCR을 수행하고 pDONR221 운반체에 BP 반응을 통해 삽입시켰다. 염기서열 분석을 통해 BrCRY3 (Bra009798) 유전자의 서열을 확인한 후, LR 반응을 통해 pH2GW7 운반체에 클로닝하였다.

BrCRY3 (Bra009798) 유전자의 염기서열 (서열번호 1)과 상기 BrCRY3 단백질의 아미노산 서열 (서열번호 2)을 하기 표 1에 나타내었다.

명칭 (서열번호)	염기서열
BrCRY3 유전자 염기서열 (서열번호 1)	ATGAACGGACATATACACCGTGTTCCTGCCCTCGAGGAAGAGGAGATGGAATCAGTCGCCGGGAAAACGTTTGAGAGATACGCGTTGCCTTCTTCAGCGAAGAGAAACGGCAAAGGAACCGCGATTCTCTGGTTTAGGAACGATCTTAGAGTGCTTGACAACGAAGCATTGTACAGAGCTTGGTCTTCCTCTGATACCCTTTTGCCTGTTTACTGTCTTGATCCACGTCTCTTTCACACAACTCACTACTTCCCCTTCCCTAAAACCGGTGCTTTGAGAGGTGCTTTTCTGATGGAGTGTTTGGCTGATTTGAGAAAGAATCTGATGAAAAGAGGAGTCAATCTTCTTATTCGGAGTGGTAAACCAGAAGACATTCTTCCCTCTCTTGCTAAAGATTTTGGAGCTCACTCAGTGTTCGGTCATAAAGAAACGTGCAGCGAGGAGCTACAGGTTGAAAGACTTGTGGGTCAAGCTTTGAAAGGGGCTGGAAATGGAACTAAGCTTAAGCTTATCTGGGGAAGCACAATGTACCACAAAGATGATCTTCCATTTGATGTTCTTGATTTGCCTGATATGTACACCCAGTTTCGTAAGTCGGTGGAAGCCAAGTGTAGAATCAGAAGCTCCACTCGGATTCCAATTTCTCTAGGGCCAACACCTTCTGTTGATAACTGGGGAGATGTTCCAACTCTTGGTCAACTTGGAATCGAGCCACAAGAGGTGACCAGAGGAATGAGATTTGTAGGTGGTGAAAGTGCTGGAGTAGGCAGAGTTTTTGAGTACTTCTGGAAGAAGGATCTTTTAAAAGTATATAAAGAGACAAGGAACGGAATGTTGGGACCTGATTACTCGACGAAGTTCTCTCCATGGCTTGCCTTTGGGTGTATCTCTCCTCGCTTTATCTACGAAGAGGTTCAAAAATATGAAAAAGAGAGAGTAGTAAACAACTCAACATACTGGGTGTTGTTTGAGTTAATATGGAGGGATTACTTTAGGTTTCTTTCAATCAAGTGTGGCAATTCCTTGTTCCACCTAGGTGGTCCAAGGAATGTTCAAGGTGAACGGAGTCAAGATAAGAAGCTGTTTGAGTCTTGGAGAGATGGCAAGACCGGGTATCCTATTATAGATGCAAACATGAAGGAGTTATCTACAACAGGTTTCATGTCAAATCGAGGCCGGCAGATTGTTTGTTCGTTTCTGGTGAGGGACATGGGGTTGGACTGGCGGATGGGTGCAGAATGGTTTGAGACATGTCTTTTGGACTATGATCCTTGTTCTAACTACGGAAACTGGACCTATGGAGCAGGAGTTGGAAATGATCCTAGAGAAGATCGGTACTTCAGCATTCCCAAGCAAGCACAGAACTATGATCCAGAAGGGGAATACGTAGCGTATTGGGTGCAGCAGCTGCGACGGCTTCCAAAAGAGAAGAGGCATTGGCCAGGGAGATTGATGTATATGGACACGGTTGTGCCATTGAAGCATGGTCATCATGGTGGTGGTGGTGGTAATGCTCAAACGTCTCGAGGGTCGAAGTCTAGTGGTGGTGGTTTCAGAGGGAATCACAGCGGGAGACGTTCAAGACACAATGGTCCTCCTTAG
BrCRY3 단백질 아미노산 서열 (서열번호 2)	MNGHIHRVPALEEEEMESVAGKTFERYALPSSAKRNGKGTAILWFRNDLRVLDNEALYRAWSSSDTLLPVYCLDPRLFHTTHYFPFPKTGALRGAFLMECLADLRKNLMKRGVNLLIRSGKPEDILPSLAKDFGAHSVFGHKETCSEELQVERLVGQALKGAGNGTKLKLIWGSTMYHKDDLPFDVLDLPDMYTQFRKSVEAKCRIRSSTRIPISLGPTPSVDNWGDVPTLGQLGIEPQEVTRGMRFVGGESAGVGRVFEYFWKKDLLKVYKETRNGMLGPDYSTKFSPWLAFGCISPRFIYEEVQKYEKERVVNNSTYWVLFELIWRDYFRFLSIKCGNSLFHLGGPRNVQGERSQDKKLFESWRDGKTGYPIIDANMKELSTTGFMSNRGRQIVCSFLVRDMGLDWRMGAEWFETCLLDYDPCSNYGNWTYGAGVGNDPREDRYFSIPKQAQNYDPEGEYVAYWVQQLRRLPKEKRHWPGRLMYMDTVVPLKHGHHGGGGGNAQTSRGSKSSGGGFRGNHSGRRSRHNGPP
Bra009798_F_B1 (서열번호 3)	AAA AAG CAG GCT ATG AAC GGA CAT ATA CACC
Bra009798_R_B2 (서열번호 4)	AGA AAG CTG GGT CTA AGG AGG AAC ATT GTG T
attB1 (서열번호 5)	ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T
attB2 (서열번호 6)	ACC CAG CTT TCT TGT ACA AAG TGG T

배추 유래 BrCRY3 (Bra009798) 유전자의 과발현 벡터 제작을 위해, CaMV35S 프로모터를 이용하였으며, 선별마커(selection marker)로는 하이그로마이신(hygromycin) 저항성 유전자(hpt)를 사용하였다 (도 3).

제작된 BrCRY3 (Bra009798) 유전자의 과발현 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobactrium tumefaciens) GV3101 도입하기 위해, 열충격 방법을 사용하여 형질전환 하였다. 구체적으로, 상기 과발현 벡터를 아그로박테리움 투메페시안스 GV3101과 함께 섞어준 뒤 액체질소에 5분 동안 동결한 후 37 ℃ 배양기에서 5분 동안 해동(freeze and thaw)하는 열충격 방법에 의해 형질전환하여 카나마이신(kanamycin) 항생제 50mg/L이 포함된 LB 배지(Duchefa Biochemie, Haarlem,Netherlands)에서 배양하여 콜로니를 확인하였다(도 4).

2. 배추 저발현 형질전환용 벡터

배추 유래 BrCRY3 (Bra009798) 유전자의 저발현 벡터 제작을 위해, 특이적으로 BrCRY3-S1 염기서열 (서열번호 7) 및 BrCRY3-S2 (서열번호 8) 염기서열을 선택하였다 (표 2).

명칭(서열번호)	염기서열
BrCRY3-S1 (서열번호 7)	CTAAGGAGGACCATTGTGTCTTGAACGTCTCCCGCTGTGATTCCCTCTGAAACCACCACCACTAGACTTCGACCCTCGAGACGTTTGAGCATTACCACCACCACCACCATGATGACCATGCTTCAATGGCACAACCGTGTCCATATACATCAATCTCCCTGGCCAATGCCTCTTCTCTTTTGGAAGCCGTCGCAGCTG
BrCRY3-S2 (서열번호 8)	CAGCTGCGACGGCTTCCAAAAGAGAAGAGGCATTGGCCAGGGAGATTGATGTATATGGACACGGTTGTGCCATTGAAGCATGGTCATCATGGTGGTGGTGGTGGTAATGCTCAAACGTCTCGAGGGTCGAAGTCTAGTGGTGGTGGTTTCAGAGGGAATCACAGCGGGAGACGTTCAAGACACAATGGTCCTCCTTAG

3. 배추 형질전환 및 형질전환체 선발

구축된 벡터가 도입된 Agrobacteria (GV3101)를 이용하여 배추(DB)에 형질전환 하였다. 재분화된 T0 식물들은 하이그로마이신 (25μg/ml)을 포함하는 MS배지에서 선별(selection)한 후 흙으로 옮겨 심었으며, 온실에서 2주간 배양한 후 종자 결실을 위해 약 40일간 저온처리 하였다.

4. 형질전환체 이용 유전자 삽입 분석

형질전환체 Genomic DNA를 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 잎으로부터 추출한 후, 유전자의 삽입확인을 위해 어댑터(adapter)를 이용한 T-DNA 인접서열 시퀀싱 방법을 이용하였다.

그 결과, 도 5를 살펴보면, BrCRY3 유전자가 형질전환체 중 pLSI66-6, pLSI66-10, pLSI72-1, pLSI72-3 개체에서 염색체 내에 삽입된 것을 확인할 수 있었으며, 대조구(DB)에서는 밴드가 보이지 않았고, 형질전환체에서는 유전자가 모두 발현되다. 즉, 유전가가 대조구 염색체 내에는 삽입되지 않았고, 형질전환 배추의 genomic DNA에 삽입된 것을 확인하였다.

5. 형질전환체를 이용한 도입 유전자의 발현 분석

교배하여 종자를 수확한 배추 형질전환체(T1 세대)의 잎에서 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 RNA를 분리한 후 1μg의 RNA를 사용하여 cDNA (PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit, Takara)를 합성하였다. 이 때 사용한 qRT-PCR용 프라이머는 하기 표 3의 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 서열을 사용하였으며, qRT-PCR 조건은 95℃ 5분간 변성시킨 후, 95℃ 15초, 60℃ 30초의 과정으로 45사이클을 반복 수행하였다.

명칭 (서열번호)	염기서열
BrCRY3-F (서열번호 9)	TGATCCAGAAGGGGAATACG
BrCRY3-R (서열번호 10)	CCATGATGACCATGCTTCAG

그 결과, 도 6을 살펴보면, BrCRY3 발현 배추 형질전환체(T1 세대) 중 pLSI66-6 SI66-10 개체에서 100 배 이상의 강하게 과발현되고 있는 것을 확인하였다. 또한, 도 7을 살펴보면, BrCRY3 저발현 배추 형질전환체(T1 세대) 중 pLSI72-1, pLSI72-3 개체에서 DB(control)에 비해 낮게 발현(62∼99%)되고 있음을 확인하였다.

[실시예 3] 배추 형질전환체를 이용한 비타민C 함량 분석

BrCRY3 유전자 과발현 및 저발현 배추 형질전환체를 이용하여 비타민 C 함량 분석하였다. 교배하여 종자를 수확한 배추 형질전환체(T1 세대)를 hygromycin (25μg/ml)을 포함하는 MS배지에서 선별한 후 흙으로 옮겨 심었으며, 잎을 채취하여 비타민 C 함량 분석에 사용하였다.

그 결과, 도 8을 살펴보면, pLSI66-6 및 pLSI66-10 개체에서 비타민 C 함량의 증대(19∼144%)를 확인하였으며, pLSI72-1, pLSI72(2)-3 개체에서 비타민 C의 함량이 현저히 감소(62∼68%)되었음을 확인하였다.

<110> Republic of Korea <120> Photoreceptor gene derived from Brassica rapa for increasing vitamin C content and uses thereof} <130> DP20200281 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1602 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrCRY3 gene <400> 1 atgaacggac atatacaccg tgttcctgcc ctcgaggaag aggagatgga atcagtcgcc 60 gggaaaacgt ttgagagata cgcgttgcct tcttcagcga agagaaacgg caaaggaacc 120 gcgattctct ggtttaggaa cgatcttaga gtgcttgaca acgaagcatt gtacagagct 180 tggtcttcct ctgataccct tttgcctgtt tactgtcttg atccacgtct ctttcacaca 240 actcactact tccccttccc taaaaccggt gctttgagag gtgcttttct gatggagtgt 300 ttggctgatt tgagaaagaa tctgatgaaa agaggagtca atcttcttat tcggagtggt 360 aaaccagaag acattcttcc ctctcttgct aaagattttg gagctcactc agtgttcggt 420 cataaagaaa cgtgcagcga ggagctacag gttgaaagac ttgtgggtca agctttgaaa 480 ggggctggaa atggaactaa gcttaagctt atctggggaa gcacaatgta ccacaaagat 540 gatcttccat ttgatgttct tgatttgcct gatatgtaca cccagtttcg taagtcggtg 600 gaagccaagt gtagaatcag aagctccact cggattccaa tttctctagg gccaacacct 660 tctgttgata actggggaga tgttccaact cttggtcaac ttggaatcga gccacaagag 720 gtgaccagag gaatgagatt tgtaggtggt gaaagtgctg gagtaggcag agtttttgag 780 tacttctgga agaaggatct tttaaaagta tataaagaga caaggaacgg aatgttggga 840 cctgattact cgacgaagtt ctctccatgg cttgcctttg ggtgtatctc tcctcgcttt 900 atctacgaag aggttcaaaa atatgaaaaa gagagagtag taaacaactc aacatactgg 960 gtgttgtttg agttaatatg gagggattac tttaggtttc tttcaatcaa gtgtggcaat 1020 tccttgttcc acctaggtgg tccaaggaat gttcaaggtg aacggagtca agataagaag 1080 ctgtttgagt cttggagaga tggcaagacc gggtatccta ttatagatgc aaacatgaag 1140 gagttatcta caacaggttt catgtcaaat cgaggccggc agattgtttg ttcgtttctg 1200 gtgagggaca tggggttgga ctggcggatg ggtgcagaat ggtttgagac atgtcttttg 1260 gactatgatc cttgttctaa ctacggaaac tggacctatg gagcaggagt tggaaatgat 1320 cctagagaag atcggtactt cagcattccc aagcaagcac agaactatga tccagaaggg 1380 gaatacgtag cgtattgggt gcagcagctg cgacggcttc caaaagagaa gaggcattgg 1440 ccagggagat tgatgtatat ggacacggtt gtgccattga agcatggtca tcatggtggt 1500 ggtggtggta atgctcaaac gtctcgaggg tcgaagtcta gtggtggtgg tttcagaggg 1560 aatcacagcg ggagacgttc aagacacaat ggtcctcctt ag 1602 <210> 2 <211> 533 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BrCRY3 protein <400> 2 Met Asn Gly His Ile His Arg Val Pro Ala Leu Glu Glu Glu Glu Met 1 5 10 15 Glu Ser Val Ala Gly Lys Thr Phe Glu Arg Tyr Ala Leu Pro Ser Ser 20 25 30 Ala Lys Arg Asn Gly Lys Gly Thr Ala Ile Leu Trp Phe Arg Asn Asp 35 40 45 Leu Arg Val Leu Asp Asn Glu Ala Leu Tyr Arg Ala Trp Ser Ser Ser 50 55 60 Asp Thr Leu Leu Pro Val Tyr Cys Leu Asp Pro Arg Leu Phe His Thr 65 70 75 80 Thr His Tyr Phe Pro Phe Pro Lys Thr Gly Ala Leu Arg Gly Ala Phe 85 90 95 Leu Met Glu Cys Leu Ala Asp Leu Arg Lys Asn Leu Met Lys Arg Gly 100 105 110 Val Asn Leu Leu Ile Arg Ser Gly Lys Pro Glu Asp Ile Leu Pro Ser 115 120 125 Leu Ala Lys Asp Phe Gly Ala His Ser Val Phe Gly His Lys Glu Thr 130 135 140 Cys Ser Glu Glu Leu Gln Val Glu Arg Leu Val Gly Gln Ala Leu Lys 145 150 155 160 Gly Ala Gly Asn Gly Thr Lys Leu Lys Leu Ile Trp Gly Ser Thr Met 165 170 175 Tyr His Lys Asp Asp Leu Pro Phe Asp Val Leu Asp Leu Pro Asp Met 180 185 190 Tyr Thr Gln Phe Arg Lys Ser Val Glu Ala Lys Cys Arg Ile Arg Ser 195 200 205 Ser Thr Arg Ile Pro Ile Ser Leu Gly Pro Thr Pro Ser Val Asp Asn 210 215 220 Trp Gly Asp Val Pro Thr Leu Gly Gln Leu Gly Ile Glu Pro Gln Glu 225 230 235 240 Val Thr Arg Gly Met Arg Phe Val Gly Gly Glu Ser Ala Gly Val Gly 245 250 255 Arg Val Phe Glu Tyr Phe Trp Lys Lys Asp Leu Leu Lys Val Tyr Lys 260 265 270 Glu Thr Arg Asn Gly Met Leu Gly Pro Asp Tyr Ser Thr Lys Phe Ser 275 280 285 Pro Trp Leu Ala Phe Gly Cys Ile Ser Pro Arg Phe Ile Tyr Glu Glu 290 295 300 Val Gln Lys Tyr Glu Lys Glu Arg Val Val Asn Asn Ser Thr Tyr Trp 305 310 315 320 Val Leu Phe Glu Leu Ile Trp Arg Asp Tyr Phe Arg Phe Leu Ser Ile 325 330 335 Lys Cys Gly Asn Ser Leu Phe His Leu Gly Gly Pro Arg Asn Val Gln 340 345 350 Gly Glu Arg Ser Gln Asp Lys Lys Leu Phe Glu Ser Trp Arg Asp Gly 355 360 365 Lys Thr Gly Tyr Pro Ile Ile Asp Ala Asn Met Lys Glu Leu Ser Thr 370 375 380 Thr Gly Phe Met Ser Asn Arg Gly Arg Gln Ile Val Cys Ser Phe Leu 385 390 395 400 Val Arg Asp Met Gly Leu Asp Trp Arg Met Gly Ala Glu Trp Phe Glu 405 410 415 Thr Cys Leu Leu Asp Tyr Asp Pro Cys Ser Asn Tyr Gly Asn Trp Thr 420 425 430 Tyr Gly Ala Gly Val Gly Asn Asp Pro Arg Glu Asp Arg Tyr Phe Ser 435 440 445 Ile Pro Lys Gln Ala Gln Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Glu Tyr Val Ala 450 455 460 Tyr Trp Val Gln Gln Leu Arg Arg Leu Pro Lys Glu Lys Arg His Trp 465 470 475 480 Pro Gly Arg Leu Met Tyr Met Asp Thr Val Val Pro Leu Lys His Gly 485 490 495 His His Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ala Gln Thr Ser Arg Gly Ser Lys 500 505 510 Ser Ser Gly Gly Gly Phe Arg Gly Asn His Ser Gly Arg Arg Ser Arg 515 520 525 His Asn Gly Pro Pro 530 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bra009798_F_B1 <400> 3 aaaaagcagg ctatgaacgg acatatacac c 31 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bra009798_R_B2 <400> 4 agaaagctgg gtctaaggag gaacattgtg t 31 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB1 <400> 5 acaagtttgt acaaaaaagc aggct 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB2 <400> 6 acccagcttt cttgtacaaa gtggt 25 <210> 7 <211> 198 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrCRY3-S1 <400> 7 ctaaggagga ccattgtgtc ttgaacgtct cccgctgtga ttccctctga aaccaccacc 60 actagacttc gaccctcgag acgtttgagc attaccacca ccaccaccat gatgaccatg 120 cttcaatggc acaaccgtgt ccatatacat caatctccct ggccaatgcc tcttctcttt 180 tggaagccgt cgcagctg 198 <210> 8 <211> 198 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrCRY3-S2 <400> 8 cagctgcgac ggcttccaaa agagaagagg cattggccag ggagattgat gtatatggac 60 acggttgtgc cattgaagca tggtcatcat ggtggtggtg gtggtaatgc tcaaacgtct 120 cgagggtcga agtctagtgg tggtggtttc agagggaatc acagcgggag acgttcaaga 180 cacaatggtc ctccttag 198 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrCRY3-F <400> 9 tgatccagaa ggggaatacg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrCRY3-R <400> 10 ccatgatgac catgcttcag 20

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 BrCRY3 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 비타민 C 함량 증진용 재조합 벡터.
제1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
삭제
제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체.
제4항에 있어서, 상기 식물체는 배추, 무, 애기장대, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 식물체.
서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 BrCRY3 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 비타민 C 함량 증진용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 BrCRY3 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및
상기 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는,
비타민 C 함량이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 BrCRY3 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 식물체의 비타민 C 함량을 증진시키는 방법.