KR102496830B1

KR102496830B1 - 수발아 저항성을 증진시키는 벼 유래 OsPHS6 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102496830B1
Application number: KR1020200069048A
Authority: KR
Inventors: 윤인선; 권혁진; 조미현; 김범기; 지현소; 송지선
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2020-06-08
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2023-02-08
Also published as: KR20210152620A

Abstract

본 발명은 식물의 수발아 저항성을 증진시키는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체, 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 벼 유래의 OsPHS6 유전자가 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 수발아 저항성이 증진되므로, 이를 이용하면 이상기후로 인해 수발아 피해 위험성이 높아진 불량환경 하에서도 종자의 품질을 안정적으로 유지할 수 있는 식물체 개발 및 작물의 생산성 증대에 효과적이며, 환경 스트레스 내성 작물 개발 플랫폼 구축에도 유용하게 활용될 수 있다.

Description

수발아 저항성을 증진시키는 벼 유래 OsPHS6 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도{Recombinant vector comprising OsPHS6 gene enhancing pre-harvest sprouting tolerance derived from Oryza sativa and uses thereof}

본 발명은 식물의 수발아 저항성을 증진시키는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체, 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

벼는 세계 인구의 반 이상에게 중요한 식량 자원이며, 곡물 중에서도 가장 많이 이용되는 편이다. 벼는 세계에서 옥수수와 밀에 이어 세 번째로 많은 수확고를 보인다. 아시아에서는 1920년대 후반에 인디카 (indica) 종과 자포니카 (japonica) 종 두 가지가 있는 것으로 알려졌으나, 1940년경 자바니카 (javanica or tropical japonica) 종이 발견되어 세 가지 아종으로 분류되었다. 20세기 이후 종자 생산량 증대, 양질의 종자 생산, 수확 후 안정성 유지와 같은 농업형질 증진을 위해 관행 육종방법으로 수많은 벼 재배종들이 개발되어졌다.

종자의 휴면성은 수분, 빛, 온도 등 적절한 환경적 조건에서도 종자 발아가 억제되는 생리형질이다. 일반적으로 종자가 발달하는 과정에서 정상적으로 생성되는 휴면성은 완숙 종자에서 일정기간 동안 유지되며, 시간이 지나면 휴면성이 타파된다. 종자의 휴면은 식물의 생존에 필요한 기본 형질이다. 예를 들어, 휴면 종자는 발아하지 않은 상태로 보다 먼 지역까지 확산될 수 있는 기회를 얻게 되며, 생존에 불리한 환경 조건에서 발아되지 않음으로써 극심한 환경스트레스 조건에서도 생명을 유지한 채로 좋은 환경이 될 때까지 기다릴 수 있다.

일반적으로 야생 벼의 종자 휴면성이 강한데 비해 오랫동안 육종에 의해 개발된 자포니카형 벼 재배종들은 농사짓기 편하게 휴면성이 약화되었으며, 개발된 벼 재배종간에도 종자 휴면 정도가 매우 다양하다. 종자 발달과정에서 출수 후 약 1주일 이내에 배아의 분화가 완성되고 약 25일경에 배아의 성숙이 끝나면서 휴면성을 획득하게 되는데 이를 1차 휴면성 (primary dormancy)이라고 한다. 종자의 1차 휴면성은 수많은 내적 요인과 환경 인자에 의해 영향을 받는 유전적으로 복잡한 특성이다. 종자가 성숙하면 휴면성이 점진적으로 소실되어지거나 저온 또는 다른 환경적 자극에 의해 타파된다. 국내에서 개발된 벼 품종의 경우, 예를 들어 고품벼는 밥맛이 매우 뛰어난 품종으로 개발되었으나, 수발아저항성이 약하다는 단점을 가지고 있다.

이에, 본 발명자들은 이상기후로 인해 수발아 피해 위험성이 높아진 불량환경 하에서도 적응할 수 있는 종자 또는 작물을 개발하기 위하여 노력한 결과, 등숙단계의 수발아 저항성을 향상시키는 벼 유래의 OsPHS6 유전자를 발굴하였으며, 이를 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시킨 식물체를 제조하고, 상기 형질전환된 식물체의 수발아 저항성이 증진되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허 제10-1902915호

본 발명은 식물의 수발아 저항성을 증진시키는, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 OsPHS6 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물의 수발아 저항성 증진용 형질전환 재조합 벡터 및 상기 형질전환 재조합 벡터로 형질전환된 식물체의 제공을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 OsPHS6 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법의 제공을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 OsPHS6 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물의 수발아 저항성 증진용 형질전환 재조합 벡터를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 OsPHS6 유전자인 것을 특징으로 하는, 형질전환 재조합 벡터를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류;로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 식물체를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 OsPHS6 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 수발아 저항성 증진용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 OsPHS6 유전자인 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 OsPHS6 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 OsPHS6 유전자인 것을 특징으로 하는, 제조방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 OsPHS6 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는 방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 OsPHS6 유전자인 것을 특징으로 하는, 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에 따르면, 벼 유래의 OsPHS6 유전자가 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 수발아 저항성이 증진되므로, 이를 이용하면 이상기후로 인해 수발아 피해 위험성이 높아진 불량환경 하에서도 종자의 품질을 안정적으로 유지할 수 있는 식물체 개발 및 작물의 생산성 증대에 효과적이며, 환경 스트레스 내성 작물 개발 플랫폼 구축에도 유용하게 활용될 수 있다. 특히 본 발명은 고품벼 등 품질은 우수하나 수발아 저항성이 약한 벼 품종의 수발아 저항성을 증진시키는데 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 종자 발달 단계에 따른 전사체 분석을 이용한 종자발현 유전자 선발을 나타낸다. 삼광벼 및 고품벼 (A), 고품벼의 종자발달 단계 (B), 선별된 OsPHS6 유전자의 종자 발달 단계에 따른 발현율 (C)을 나타낸다.
도 2는 OsPHS6 유전자의 조직발현 특이성 (A)과 ABA 유도성 (B)을 나타낸다.
도 3은 벼 원형질체에서 OsPHS6-GFP 단백질의 형광위치를 나타니며, 화살표는 핵의 위치를 표시한 것이다.
도 4는 pCAMBIA1300-OsPHS6 식물 발현 벡터 모식도를 나타낸다.
도 5는 OsPHS6 과발현 형질전환 벼의 RT-PCR 분석 결과이다. WT는 고품벼 (대조구)이고, T32, 33, 34 35는 OsPHS6 형질전환 벼를 나타낸다.
도 6은 OsPHS6 과발현 고품벼의 종자 발아율을 비교한 결과이다. (A)는 상대습도 100%, 28도 조건에서, 출수후 50일된 고품벼와 OsPHS6 과발현 벼 이삭의 침윤후 2일째 사진을 비교 결과이고, (B)는 고품벼와 OsPHS6 과발현 벼에서 출수후 35일, 40일, 50일째 이삭의 종자 발아율 비교 분석 결과이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 이상기후로 인해 수발아 피해 위험성이 높아진 불량환경 하에서도 적응할 수 있는 종자 또는 작물을 개발하기 위하여 노력한 결과, 등숙단계의 수발아 저항성을 향상시키는 벼 유래의 OsPHS6 유전자를 발굴하였으며, 이를 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시킨 식물체를 제조하고, 상기 형질전환된 식물체의 수발아 저항성이 증진되는 것을 확인함으로써 완성되었다.

본 발명은 일 관점에서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 OsPHS6 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물의 수발아 저항성 증진용 형질전환 재조합 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 OsPHS6 유전자인 것을 특징으로 하는, 형질전환 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "수발아 (pre-harvest sprouting, PHS)"는 생리적 성숙기에 도달한 이삭이 강우로 인하여 발생하는 습한 조건으로 수확 전 종실이 이삭에 달린 채로 발아하는 현상으로, 곡물에서 중요한 농업형질인 종자 휴면성 (seed dormancy)과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 용어 "종자 휴면성 (seed dormancy)"은 성숙한 종자에 적당한 발아 조건을 주어도 일정 기간 동안 발아하지 않는 현상으로, 종자의 휴면성이 없거나 매우 약하다면 비가 많이 와서 수분이 계속 높은 환경이 지속되면 수확 전에 미성숙한 종자들이 이삭에 달린 채로 발아가 일어나는 수발아 현상을 유발하게 된다.

본 발명에서 서열번호 1로 표시되는 유전자인 "OsPHS6 (Oryza sativa pre-harvest sprouting 6)"은 벼 (Oryza sativa) 유래 Os01g02120 유전자이다. 또한 상기 유전자는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 OsPHS6 단백질을 코딩하는 유전자로, 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는데 기여한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 먼저 수발아 저항성이 약한 고품벼 종자의 유전자 발현분석을 통하여 수발아 저항성 관련 유전자를 동정하기 위해 고품벼에서 출수 후 종자발달 단계에 따라 RNA를 분리하여 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 그 후, 종자 휴면이 상실되는 등숙기인 25 DAH에서 40 DAH 사이에 유전자 발현이 10배 이상 증가하는 유전자 (Os01g02120)를 선발하였으며, 염기서열 분석 결과 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 확인하고 이를 OsPHS6로 명명하였다. 또한, 본 발명의 일실시예에서, OsPHS6 유전자의 과발현을 통해서 벼 종자의 수발아 저항성이 증진됨을 확인함으로써, 상기 유전자는 식물체의 수발아 저항성에 관여함을 확인하였다(도 6).

상기 OsPHS6 유전자는 벼 (Oryza sativa) 유래로, 구체적으로 고품벼 또는 동진벼 유래일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 OsPHS6 유전자는 서열번호 1의 염기서열에 한정되지 않으며, 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 염기서열을 포함한다. 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 염기서열은 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 구체적으로는 70%의 상동성, 보다 더 구체적으로는 80%의 상동성, 가장 구체적으로는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.

본 발명에서 용어 “재조합”은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서 "형질전환 재조합 벡터"란 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물로, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다.

본 발명의 "형질전환 재조합 벡터"는 상기 OsPHS6 유전자가 발현될 수 있도록, 발현조절 서열과 기능적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 벡터는 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 일실시예에서는, pCAMBIA1300 벡터의 CaMV35S 프로모터의 하류에 있는 BamH1 제한효소 위치에 OsPHS6 유전자를 연결하여 식물에서 항시 발현하는 형질전환 벡터 (pCAMBIA1300-OsPHS6)를 제작하였다.

본 발명에서 상기 재조합 벡터는 형질전환 재조합 벡터를 포함한다. 또한, 본 발명의 상기 재조합 벡터는 수발아 저항성을 증진시키는 재조합 벡터일 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 형질전환 재조합 벡터로 형질전환된 식물체에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은, 유전물질인 DNA를 다른 계통의 살아 있는 세포에 주입했을 때, DNA가 그 세포에 들어가 유전형질을 변화시키는 현상으로, 형질변환, 형전환, 또는 형변환이라고도 한다.

본 발명에서 상기 벡터로 식물체를 "형질전환"하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로는, 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법 (microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션 (electroporation), PEG-매개 융합법 (PEG-mediated fusion), 미세주입법 (microinjection), 리포좀 매개법 (liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법 (In planta transformation), 진공 침윤법 (Vacuum infiltration method), 화아침지법 (floral meristem dipping method) 또는 아그로박테리아 분사법 (Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법 또는 아그로박테리아 분사법 (Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "식물체"는, 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미이다.

본 발명에서 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며, 구체적으로는 벼 (Oryza sativa)이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 형질전환된 식물체는 OsPHS6 유전자 또는 이의 단백질을 발현하므로, 상기 OsPHS6 유전자 또는 OsPHS6 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 도입함으로써 식물체에 존재하는 OsPHS6의 발현을 증진시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, OsPHS6 유전자가 과발현된 벼의 형질전환체를 제작하기 위하여 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 사용하여, 고품벼의 형질전환체를 제작하였다. 대조구(고품벼)와 OsPHS6 형질전환 벼를 포장에서 육성한 후, 35일, 40일, 50째 이삭을 채취한 후 이삭에서 종자를 분리하여 페트리디쉬에 넣고 100% 상대습도, 30도, 암조건에서 5일간 종자 발아율을 측정하였다. 그 결과 대조구인 고품벼의 경우 수발아저항성이 매우 약해서 출수후 35일째 이삭의 종자가 적정발아조건에서 3일째에 40% 이상 발아하는데 비하여, OsPHS6 형질전환체의 종자는 10% 미만으로 고품벼에 비해 종자의 휴면성이 크게 증진되었음을 확인하였다 (도 6B). 또한, 종자가 등숙되는 과정에서 휴면성이 점차 상실되는데 출수후 40일째와 50일째 이삭의 경우에도, 대조구인 고품벼에 비교해서 OsPHS6 형질전환 고품벼가 종자 휴면성이 높은 상태가 지속된다는 것을 확인할 수 있었다 (도 6B).

상기의 결과를 통해, 본 발명의 형질전환된 식물체는 수발아 저항성유전자인 OsPHS6 유전자의 세포 내 발현 수준을 증가시켜, 등숙 단계에서 문제가 되는 벼의 수발아 저항성을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 OsPHS6 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 수발아 저항성 증진용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 OsPHS6 유전자인 것을 특징으로 하는, 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 OsPHS6 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 식물체의 수발아 저항성을 증진시킬 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 OsPHS6 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환용 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 OsPHS6 유전자인 것을 특징으로 하는, 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 상기 수발아 저항성을 가지는 OsPHS6 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고, 이를 식물체에 형질전환시켜, 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조가 가능하다.

상기 식물체를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같으며, 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물체로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다 (Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 OsPHS6 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환용 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 OsPHS6 유전자인 것을 특징으로 하는, 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "유전자를 식물체에 도입하는 단계"는 특정 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제작하고, 그 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 의미한다.

본 발명에 의하면, 상기 OsPHS6 유전자의 발현이 증진되는 경우, 식물체의 수발아 저항성이 증진되므로, 식물체의 수발아 저항성을 증진시키기 위하여, 전술한 바와 같이 OsPHS6 유전자의 발현을 증진하는 형질전환용 벡터를 이용하여, 식물체를 형질전환하거나 또는 다른 인위적인 물질의 처리에 의해 상기 유전자의 발현을 증진시켜 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는 것도 가능하며, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[실시예 1] 벼 종자발달 전사체 분석과 Os01g02120 (OsPHS6) 유전자 선발

고품벼는 수발아 저항성이 매우 약한 품종이다. 고품벼에서 출수 후 종자발달 단계 (도 1B)에 따라 고품벼 출수 후 3~6일, 25일 40일째에 각각 종자를 채취한 후 total RNA를 분리하였다. 종자 발달 단계에 따른 유전자 발현양상의 변화를 분석하기 위하여 total RNA를 분리하여 마이크로어레이 (microarray) 분석을 수행하고, 종자 휴면이 상실되는 등숙기인 25 DAH에서 40 DAH 사이에 유전자 발현이 10배 이상 증가하는 유전자 (Os01g02120)를 선발하고 (도 1C), 이를 OsPHS6로 명명하였다.

[실시예 2] OsPHS6 유전자 및 단백질 발현 분석

1. OsPHS6 유전자 발현 분석

OsPHS6 유전자가 종자 휴면성과 연관되어 있을 가능성을 알아보기 위하여 공공데이터베이스 (RiceXPro https://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)를 이용하여 OsPHS6 유전자의 in silico 발현양상을 분석하였다.

그 결과, OsPHS6 유전자가 다양한 식물조직 중에서 특히 종자의 배에서 특이적으로 발현되며 (도 2A), 뿌리에서 스트레스 반응과 종자휴면을 조절하는 호르몬인 ABA에 의해 유전자 발현이 유도되는 특성을 가진다는 것을 확인할 수 있었다 (도 2B). 따라서 이런 결과는 OsPHS6가 종자 휴면성과 연관될 가능성이 높다는 것을 시사한다.

2. OsPHS6 단백질 발현 분석

OsPHS6의 단백질의 특성을 분석하기 위하여, OSPHS6 단백질의 C 말단에 GFP 형광단백질을 융합한 벡터를 제작하고, 벼의 원형질체에서 일시발현시킨 후 컨포칼 레이져주사현미경 (Leica TCS SP8)로 세포내 형광위치를 분석하였다.

그 결과, OsPHS6 단백질이 주로 핵과 세포막에 위치하고 있음을 확인할 수 있었다 (도 3). 이런 결과는 OsPHS6가 핵에서 발현되어 기능을 수행하는 단백질일 가능성을 제시한다.

[실시예 3] OsPHS6 유전자 분리 및 OsPHS6 과발현 벡터 제작

동진벼의 잎에서 RNA를 추출하여 cDNA를 작성하고 하기 표 1의 OsPHS6-F (서열번호 3) 및 OsPHS6-R (서열번호 4) 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 525 bp 길이의 OsPHS6 유전자의 ORF를 분리하고 염기서열을 분석하였다 (서열번호 1).

서열번호	프라이머 명칭	염기서열
서열번호 3	OsPHS6F	5’-GAGGATCCATGGCCCGTTTCGTGGATCC-3’
서열번호 4	OsPHS6R	5’-GTGGATCCTTAGCGGCGGCGGTTGGCGG-3’

그 결과, 염기서열이 Os01g02120 유전자와 100% 일치하는 것을 확인하였다. 표 2는 OsPHS6 유전자의 염기서열 (서열번호 1)과 상기 OsPHS6 단백질의 아미노산 서열 (서열번호 2)을 나타낸 것이다.

서열번호 1

ATGGCCCGTTTCGTGGATCCGCTGGTGGTGGGACGGGTGATCGGGGAGGTGGTGGATTTGTTCGTTCCATCCATCTCCATGACCGCCGCCTACGGCGACAGGGACATCAGCAACGGCTGCCTCGTCCGCCCATCCGCCGCCGACTACCCTCCCCTCGTCCGCATCTCCGGCCGCCGCAACGACCTCTACACCCTGATCATGACGGACCCGGACGCACCTAGCCCTAGCGACCCATCCATGAGGGAGTTTCTCCACTGGATCGTGGTTAACATACCGGGGGGAACAGATGCATCTAAAGGTGAGGAGATGGTGGAGTACATGGGGCCACGGCCGACGGTGGGGATACACAGGTACGTGCTGGTGCTGTACGAGCAGAAGGCGCGCTTCGTGGACGGCGCGCTGATGCCGCCGGCGGACAGGCCCAACTTCAACACAAGAGCATTCGCGGCGTACCATCAGCTCGGCCTCCCCACCGCCGTCGTCCACTTCAACTCCCAGAGGGAGCCCGCCAACCGCCGCCGCTAA

서열번호 2

MARFVDPLVVGRVIGEVVDLFVPSISMTAAYGDRDISNGCLVRPSAADYPPLVRISGRRNDLYTLIMTDPDAPSPSDPSMREFLHWIVVNIPGGTDASKGEEMVEYMGPRPTVGIHRYVLVLYEQKARFVDGALMPPADRPNFNTRAFAAYHQLGLPTAVVHFNSQREPANRRR

또한, 벼 종자의 수발아저항성을 개량하기 위한 목적으로 OsPHS6 유전자를 활용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 표 1의 OsPHS6-F (서열번호 3) 및 OsPHS6-R (서열번호 4) 프라이머 세트를 이용하여 pCAMBIA1300 벡터의 CaMV35S 프로모터의 하류에 있는 BamH1 제한효소 위치에 OsPHS6 유전자를 연결하여 식물에서 항시 발현하는 형질전환 벡터 (pCAMBIA1300-OsPHS6)를 제작하였다 (도 4).

[실시예 3] OsPHS6 발현 벡터가 삽입된 벼 형질전환체 제작 및 도입 유전자 확인

고품벼의 종자로부터 유도한 캘루스에 상기 pCAMBIA1300-OspHS6 벡터를 포함하는 아그로박테리움 (Agrobacterium) LBA4404를 접종하고, 하이그로마이신 (hygromycin, 30 μg/ml) 포함 배지에서 형질전환 캘루스를 선발한 후 줄기와 뿌리를 유도하여 형질전환 벼를 생산하였다.

고품벼와 OsPHS6 형질전환 벼의 잎에서 각각 RNA를 분리하고 cDNA를 제작한 후 OsPHS6 유전자 특이적인 하기 표 3의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.

서열번호	프라이머 명칭	염기서열
서열번호 5	OsPHS6-1F	5’-ATGGCCCGTTTCGTGGAT-3’
서열번호 6	OsPHS6-238R	5’-CCAGTGGAGAAACTCCCTCAT-3’

그 결과, 대조구에 비해 형질전환 벼에서 도입한 유전자의 발현수준이 높다는 것을 확인하였다 (도 5). 따라서 OsPHS6 발현벡터가 도입된 형질전환 벼에서 도입된 유전자가 높게 발현되고 있음을 증명하였다.

[실시예 4] OsPHS6 과발현 형질전환 벼의 등숙 단계 수발아저항성 분석

대조구인 고품벼와 OsPHS6 형질전환 고품벼를 포장에서 육성 후, 출수후 35일, 40일, 50째 이삭을 채취한 후 이삭에서 종자를 분리하여 페트리디쉬에 넣고 100% 상대습도, 30도, 암조건에서 5일간 종자 발아율을 측정하였다. 대조구인 고품벼의 경우 수발아저항성이 매우 약해서 출수후 35일째 이삭의 종자가 적정발아조건에서 3일째에 40% 이상 발아하는데 비하여, OsPHS6 형질전환체의 종자는 10% 미만으로 고품벼에 비해 종자의 휴면성이 크게 증진되었음을 (p<0.001) 확인하였다 (도 6B).

또한, 종자가 등숙되는 과정에서 휴면성이 점차 상실되는데 출수후 40일째와 50일째 이삭의 경우에도, 대조구인 고품벼에 비교해서 OsPHS6 형질전환 고품벼가 종자 휴면성이 높은 상태가 지속된다는 것을 확인할 수 있었다 (도 6B). 50일째 고품벼 이삭의 종자가 침윤후 3일째에 80% 이상 발아한 반면, OsPHS6 형질전환벼 이삭의 종자발아율은 40% 이하로 유지되었다 (P<0.05).

이런 결과를 통해 OsPHS6 유전자가 등숙기 종자의 휴면성을 높이는 기능을 한다는 것을 확인하고, OsPHS6 유전자의 과발현 방법을 이용하여 등숙단계에서 수발아저항성이 약한 고품벼의 종자형질을 개량할 수 있음을 증명하였다.

<110> Republic of Korea <120> Recombinant vector comprising OsPHS6 gene enhancing pre-harvest sprouting tolerance derived from Oryza sativa and uses thereof <130> DP20200046 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 525 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS6 gene <400> 1 atggcccgtt tcgtggatcc gctggtggtg ggacgggtga tcggggaggt ggtggatttg 60 ttcgttccat ccatctccat gaccgccgcc tacggcgaca gggacatcag caacggctgc 120 ctcgtccgcc catccgccgc cgactaccct cccctcgtcc gcatctccgg ccgccgcaac 180 gacctctaca ccctgatcat gacggacccg gacgcaccta gccctagcga cccatccatg 240 agggagtttc tccactggat cgtggttaac ataccggggg gaacagatgc atctaaaggt 300 gaggagatgg tggagtacat ggggccacgg ccgacggtgg ggatacacag gtacgtgctg 360 gtgctgtacg agcagaaggc gcgcttcgtg gacggcgcgc tgatgccgcc ggcggacagg 420 cccaacttca acacaagagc attcgcggcg taccatcagc tcggcctccc caccgccgtc 480 gtccacttca actcccagag ggagcccgcc aaccgccgcc gctaa 525 <210> 2 <211> 174 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS6 protein <400> 2 Met Ala Arg Phe Val Asp Pro Leu Val Val Gly Arg Val Ile Gly Glu 1 5 10 15 Val Val Asp Leu Phe Val Pro Ser Ile Ser Met Thr Ala Ala Tyr Gly 20 25 30 Asp Arg Asp Ile Ser Asn Gly Cys Leu Val Arg Pro Ser Ala Ala Asp 35 40 45 Tyr Pro Pro Leu Val Arg Ile Ser Gly Arg Arg Asn Asp Leu Tyr Thr 50 55 60 Leu Ile Met Thr Asp Pro Asp Ala Pro Ser Pro Ser Asp Pro Ser Met 65 70 75 80 Arg Glu Phe Leu His Trp Ile Val Val Asn Ile Pro Gly Gly Thr Asp 85 90 95 Ala Ser Lys Gly Glu Glu Met Val Glu Tyr Met Gly Pro Arg Pro Thr 100 105 110 Val Gly Ile His Arg Tyr Val Leu Val Leu Tyr Glu Gln Lys Ala Arg 115 120 125 Phe Val Asp Gly Ala Leu Met Pro Pro Ala Asp Arg Pro Asn Phe Asn 130 135 140 Thr Arg Ala Phe Ala Ala Tyr His Gln Leu Gly Leu Pro Thr Ala Val 145 150 155 160 Val His Phe Asn Ser Gln Arg Glu Pro Ala Asn Arg Arg Arg 165 170 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS6-F <400> 3 gaggatccat ggcccgtttc gtggatcc 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS6-R <400> 4 gtggatcctt agcggcggcg gttggcgg 28 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS6-1F <400> 5 atggcccgtt tcgtggat 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS6-238R <400> 6 ccagtggaga aactccctca t 21

Claims

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 OsPHS6 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 고품벼의 수발아 저항성 증진용 재조합 벡터.
제1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 OsPHS6 유전자인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 고품벼.
삭제
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 OsPHS6 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는, 고품벼의 수발아 저항성 증진용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 OsPHS6 유전자인 것을 특징으로 하는, 조성물.
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 OsPHS6 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및
상기 벡터를 고품벼에 도입하여 형질전환시키는 단계를 포함하는,
수발아 저항성이 증진된 형질전환 고품벼의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 OsPHS6 유전자인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 OsPHS6 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 고품벼에 도입하는 단계를 포함하는, 고품벼의 수발아 저항성을 증진시키는 방법.
제9항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 OsPHS6 유전자인 것을 특징으로 하는, 방법.