KR102266975B1 - 수발아 저항성을 증진시키는 벼 유래 OsPHS5 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물의 수발아 저항성을 증진시키는 OsPHS5 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체, 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 벼 유래의 OsPHS5 유전자가 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 수발아 저항성이 증진되므로, 이를 이용하면 이상기후로 인해 수발아 피해 위험성이 높아진 불량환경 하에서도 강하게 자랄 수 있는 식물체 개발 및 작물의 생산성 증대에 효과적이며, 환경 스트레스 내성 작물 개발 플랫폼 구축에도 유용하게 활용될 수 있다.

Description

수발아 저항성을 증진시키는 벼 유래 OsPHS5 유전자 및 이의 용도{OsPHS5 Gene enhancing pre-harvest sprouting tolerance derived from Oryza sativa and uses thereof}

본 발명은 식물의 수발아 저항성을 증진시키는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체, 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

전 인류의 절반이 주식으로 삼고 있는 벼는 세계적으로 가장 중요한 식량 작물이다. 20세기 이후 종자 생산량 증대, 양질의 종자 생산, 수확 후 안정성 유지와 같은 농업형질 증진을 위해 관행 육종방법으로 수많은 벼 재배종들이 개발 되어졌다. 종자의 휴면성은 수분, 빛, 온도 등 적절한 환경적 조건에서도 종자 발아가 억제되는 생리형질이다. 일반적으로 종자가 발달하는 과정에서 정상적으로 생성되는 휴면성은 완숙 종자에서 일정기간 동안 유지되며, 시간이 지나면 휴면성이 타파된다. 종자의 휴면은 식물의 생존에 필요한 기본 형질로서, 예를 들어 휴면 종자는 발아하지 않은 상태로 보다 먼 지역까지 확산될 수 있는 기회를 얻게 되며 생존에 불리한 환경 조건에서 발아되지 않음으로서 극심한 환경스트레스 조건에서도 생명을 유지한 채로 좋은 환경이 될 때까지 기다릴 수 있다.

만약 종자의 휴면성이 없거나 매우 약하다면 비가 많이 와서 수분이 계속 높은 환경이 지속되면 수확전에 미성숙한 종자들이 이삭에 달린 채로 발아가 일어날 것이다. 이런 현상을 수발아(pre-harvest sprouting, PHS)라고 한다(Bewley and Black, Seeds, 1994; Finkelstein et al., Ann Rev Plant Biol., 59:387-415, 2008). 따라서 수확시기에 종자 휴면성은 벼, 밀, 옥수수 등 주요 곡물에서 중요한 농업형질이며, 전 세계적으로 곡물의 수발아에 의한 생산량 감소와 곡물 품질 저하 때문에 경제적 손실이 심각한 상황이다. 이와 반대로, 종자의 휴면성이 너무 심하면 경작지에서 발아가 균일하게 유지되지 못하기 때문에 적절한 수준의 휴면보유는 새로운 품종 개발에 매우 중요한 농업적 특성이다.

일반적으로 야생 벼의 종자휴면성이 강한데 비해 오랫동안 육종에 의해 개발된 자포니카형 벼 재배종들은 농사짓기 편하게 휴면성이 약화되었으며, 개발된 벼 재배종간에도 종자 휴면 정도가 매우 다양하다. 종자 발달과정에서 출수 후 약 1주일 이내에 배아의 분화가 완성되고 약 25일경에 배아의 성숙이 끝나면서 휴면성을 획득하게 되는데 이를 1차 휴면성(primary dormancy)라고 한다. 종자의 1차 휴면성은 수많은 내적 요인과 환경 인자에 의해 영향을 받는 유전적으로 복잡한 특성이다(Li and Foley, Trends Plant Sci., 2:384-389, 1997). 종자가 성숙하면 휴면성이 점진적으로 소실되어지거나 저온 또는 다른 환경적 자극에 의해 타파된다. 국내에서 개발된 벼 품종의 경우 휴면성이 유지되는 기간이 짧은 것으로 보고되어 있다(Suh and Kim, Korean J Crop Sci., 39;187-192, 1994; Park and Kim, Korean J Crop Sci., 54:241-248, 2009). 예를 들어 고품벼는 밥맛이 매우 뛰어난 품종으로 개발되었으나(최임수 등 작물과학연구논총 2005. 6:18~28: Sun et al. PLoS One. 2011. 6(4):e18385), 수발아저항성이 약한 단점을 가지고 있다.

또한, 식물호르몬인 ABA(abscisic acid)는 종자의 휴면성을 획득하고 유지하는 과정에 관여하는 중요 조절자로 알려져 있다(Gubler et al., Curr Op in Plant Biol., 8:183-187, 2005; Kermode, J Plant Growth Regulation., 24:319-344, 2005). ABA의 생합성과 ABA 반응성은 벼, 옥수수와 같은 주요 곡물의 종자 휴면성에 영향을 주는 인자이다. 벼 종자의 휴면성은 ABA 뿐만 아니라 종자 성숙기의 환경조건, 수확 후 종자보관 온도, 수분함량, 산소, 질소, 이산화탄소 등 다양한 조건에 의해 영향을 받는다(Roberts, J Exp Botany, 13:75-94, 1962; Ikehashi, Jap J Breeding, 22:209-216, 1972). 또한 벼 종자의 휴면은 종피의 물리적 특성이나 종피가 포함하는 화학적 물질에 따라서 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Bewley and Black, Seeds, 1994). 종자의 휴면성이 여러 가지 다양한 유전자에 의해 조절된다고 알려져 있음에도 불구하고 종자 휴면의 유전적 근원에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.

대한민국공개특허 제10-2016-0149573호

본 발명의 하나의 목적은 식물의 수발아 저항성을 증진시키는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsPHS5 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 OsPHS5 유전자를 포함하는, 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 OsPHS5 유전자 또는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 OsPHS5 유전자 또는 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 수발아 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 이상기후로 인해 수발아 피해 위험성이 높아진 불량환경 하에서도 적응할 수 있는 종자 또는 작물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 등숙단계의 수발아 저항성을 향상시키는 벼 유래의 OsPHS5 유전자를 발굴하였으며, 이를 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시킨 식물체를 제조하고, 상기 형질전환된 식물체 또는 이로부터 수득한 종자의 수발아 저항성이 야생형식물체 또는 종자와 비교하여 증진되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. 특히 본 발명을 통해 품질은 우수하나 수발아 저항성이 약한 벼 품종의 수발아저항성을 증진시키는데 이용할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 식물의 수발아 저항성을 증진시키는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsPHS5 유전자를 제공한다.

본 발명에서 용어 "수발아(pre-harvest sprouting, PHS)"는 생리적 성숙기에 도달한 이삭이 강우로 인하여 발생하는 습한 조건으로 수확 전 종실이 이삭에 달린 채로 발아하는 현상으로, 곡물에서 중요한 농업형질인 종자 휴면성(seed dormancy)과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 용어 "종자 휴면성(seed dormancy)"은 성숙한 종자에 적당한 발아 조건을 주어도 일정 기간 동안 발아하지 않는 현상으로, 종자의 휴면성이 없거나 매우 약하다면 비가 많이 와서 수분이 계속 높은 환경이 지속되면 수확 전에 미성숙한 종자들이 이삭에 달린 채로 발아가 일어나는 수발아 현상을 유발하게 된다.

본 발명에서 서열번호 1로 표시되는 유전자인 "OsPHS5(Oryza sativa pre-harvest sprouting 5)"은 벼(Oryza sativa) 유래 유전자로, 염색체 4번(chromosome 4)에 위치한 Os04g20270 유전자이며, 상기 유전자가 인코딩하는 단백질의 아미노산 서열은 히스톤 수식화를 조절하는 Histone deacethylase 단백질과 유사성이 높다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 먼저 수발아 저항성이 약한 고품벼 종자의 유전자 발현분석을 통하여 수발아 저항성 관련 유전자를 동정하기 위해 고품벼에서 출수 후 종자발달 단계에 따라 RNA를 분리하여 microarray 분석을 수행하고, 종자 휴면이 상실되는 등숙기인 25 DAH에서 40 DAH 사이에 유전자 발현이 2배 이상 증가하는 유전자(Os04g20270)를 선발하였으며, 염기서열 분석 결과 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 확인하고 이를 OsPHS5로 명명하였다. 또한, 본 발명의 일실시예에 있어서, OsPHS5 유전자의 과발현을 통해서 벼 종자의 수발아 저항성이 증진됨을 확인하여, 상기 유전자는 식물체의 수발아 저항성에 관여함을 확인하였다(도 5).

상기 OsPHS5 유전자는 벼(Oryza sativa) 유래로, 구체적으로 동진벼 또는 고품벼 유래일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 OsPHS5 유전자는 서열번호 1의 염기서열에 한정되지 않으며, 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 염기서열을 포함한다. 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 염기서열은 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 구체적으로는 70%의 상동성, 보다 더 구체적으로는 80%의 상동성, 가장 구체적으로는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 OsPHS5 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 상기 재조합 벡터는 형질전환용 재조합 벡터를 포함한다. 또한, 본 발명의 상기 재조합 벡터는 수발아 저항성을 증진시키는 재조합 벡터일 수 있다.

본 발명에서 용어 “재조합”은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서 "형질전환용 재조합 벡터"란 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물로, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다.

본 발명의 "형질전환용 재조합 벡터"는 상기 OsPHS5 유전자가 발현될 수 있도록, 발현조절 서열과 기능적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 벡터는 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 일실시예에서는, pGA2897-3X 계열 벡터의 maize ubiquitin 프로모터의 하류에 OsPHS5 유전자를 연결하고, OsPHS5 단백질의 C 말단에 HA epitope를 연결하여 식물에서 항시 발현하는 pGA2897-OsPHS5-3XHA 재조합 벡터를 제조하였다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 유전자 또는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은, 유전물질인 DNA를 다른 계통의 살아 있는 세포에 주입했을 때, DNA가 그 세포에 들어가 유전형질(遺傳形質)을 변화시키는 현상으로, 형질변환, 형전환, 또는 형변환이라고도 한다.

본 발명에서 상기 벡터로 식물체를 "형질전환"하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로는, 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method) 또는 아그로박테리아 분사법(Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법 또는 아그로박테리아 분사법(Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "식물체"는, 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미이다.

본 발명에서 상기 식물체는 특별히 제한되지 않으며, 일례로서 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이며, 구체적으로는 벼이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 형질전환된 식물체는 OsPHS5 유전자 또는 이의 단백질을 발현하므로, 상기 OsPHS5 유전자 또는 OsPHS5 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 도입함으로써 식물체에 존재하는 OsPHS5의 발현을 증진시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 고품벼에서 선발된 OsPHS5 유전자를 동진벼에서 분리한 후, 아그로박테리움(Agrobacterium)을 사용하여 동진벼에 도입하여, OsPHS5 유전자 발현이 증진된 동진벼의 형질전환체를 제작하였다.

대조구(동진벼)와 동진벼 기반의 OsPHS5 형질전환 벼를 포장에서 육성한 후, 출수후 41 일째의 이삭을 채취한 후 이삭에서 종자를 분리하여 페트리디쉬에 넣고 100% 상대습도, 30도, 암조건에서 5일간 종자 발아율을 측정하였다. 그 결과 야생형인 동진벼의 경우 출수 후 41 일째 이삭의 종자가 적정발아조건에서 3일째에 80% 이상 발아하는데 비하여, OsPHS5 형질전환체의 종자는 30% 미만으로 종자의 휴면성이 크게 증진되었음을 확인하였으며(도 5A), 출수후 50일째 이삭에서도 야생형인 동진벼에 비해 종자 발아율이 현저하게 낮아서, 종자의 휴면성이 증진되는 것을 확인하였다(도 5B).

상기의 결과를 통해, 본 발명의 형질전환된 식물체는 수발아 저항성유전자인 OsPHS5 유전자의 세포 내 발현 수준을 증가시켜, 등숙 단계에서 문제가 되는 벼의 수발아 저항성을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 OsPHS5 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 "OsPHS5 유전자", "재조합 벡터", "식물체", "수발아 저항성"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명은 상기 수발아 저항성을 가지는 OsPHS5 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고, 이를 식물체에 형질전환시켜, 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조가 가능하다.

상기 식물체를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같으며, 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물체로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 OsPHS5 유전자 또는 상기 OsPHS5 유전자를 포함하는, 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "OsPHS5 유전자", "재조합 벡터", "식물체", "수발아 저항성"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "유전자를 식물체에 도입하는 단계"는 특정 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제작하고, 그 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 의미한다.

구체적으로 본 발명에서는, OsPHS5 유전자를 삽입하여 형질전환용 재조합 벡터 pGA2897-OsPHS5-3XHA를 제작하고, 아그로박테리움(Agrobacterium)을 사용하여, 동진벼의 형질전환체를 제작하였으며, 상기 OsPHS5 유전자 도입에 의해 식물체의 수발아 저항성이 증진되는 것을 확인하였다.

본 발명에 의하면, 상기 OsPHS5 유전자의 발현이 증진되는 경우, 식물체의 수발아 저항성이 증진되므로, 식물체의 수발아 저항성을 증진시키기 위하여, 전술한 바와 같이 OsPHS5 유전자의 발현을 증진하는 형질전환용 벡터를 이용하여, 식물체를 형질전환하거나 또는 다른 인위적인 물질의 처리에 의해 상기 유전자의 발현을 증진시켜 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는 것도 가능하며, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 OsPHS5 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 수발아 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 OsPHS5 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 식물체의 수발아 저항성을 증진시킬 수 있다.

본 발명에 따르면, 벼 유래의 OsPHS5 유전자가 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 수발아 저항성이 증진되므로, 이를 이용하면 이상기후로 인해 수발아 피해 위험성이 높아진 불량환경 하에서도 강하게 자랄 수 있는 식물체 개발 및 작물의 생산성 증대에 효과적이며, 환경 스트레스 내성 작물 개발 플랫폼 구축에도 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 등숙기 종자 휴면과 Os04g20270 유전자의 발현양상을 나타낸 도이다: (A) 고품벼 종자의 등숙기 휴면성 변화, (B) 선별된 OsPHS5 유전자의 발현 양상, (C) 닛폰바레 종자 등숙시기별 OsPHS5 유전자 발형 양상
도 2는 pGA2897-OsPHS5-3XHA 식물 발현 벡터 모식도를 나타낸다.
도 3은 OsPHS5 과발현 형질전환 벼의 RT-PCR 분석 결과이다: DJ, 동진벼 (대조구); T82, 83, 84, 85 (OsPHS5 형질전환 벼).
도 4는 OsPHS5 과발현 형질전환 벼의 Western 분석 결과이다: DJ, 동진벼 (대조구); T82, 83, 84, 85 (OsPHS5 형질전환 벼).
도 5는 OsPHS5 과발현 동진벼의 종자 발아율 비교 결과이다: (A) 출수 후 41일된 동진벼와 OsPHS5 과발현 동진벼 이삭에서 분리한 종자의 발아율 비교 분석, (B) 수확 후 50일된 동진벼와 OsPHS5 과발현 동진벼 성숙 종자의 발아율 비교 분석.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

<실시예 1> 벼 종자발달 전사체 분석과 등숙기 차등발현 Os04g20270(OsPHS5) 유전자 선발

벼 종자의 휴면성은 종자가 등숙하면서 크게 변화하는 특성을 보인다 (도 1A). 수발아저항성이 매우 약한 품종인 고품벼에서 출수 후 종자발달 단계에 따라 RNA를 분리하여 microarray 분석을 수행하고, 종자 휴면이 상실되는 등숙기인 25 DAH에서 40 DAH 사이에 유전자 발현이 2배 이상 증가하는 유전자 (Os04g20270)를 선발하여 이를 OsPHS5로 명명하였다(도 1B).

또한, 닛폰바레 종자에서 분리한 RNA를 이용한 qRT-PCR 분석을 통해 종자가 등숙하는 과정에서 OsPHS5 유전자 발현이 증가한다는 것을 확인하였다(도 1C)

<실시예 2> OsPHS5 유전자 분리 및 OsPHS5 과발현 벡터 제작

동진벼의 잎에서 RNA를 추출하여 cDNA를 작성하고 하기 OsPHS5-F 및 OsPHS5-R 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 OsPHS5 유전자를 분리하고 염기서열을 분석하였다(서열번호 1). 그 결과 염기서열이 Os04g20270 유전자와 100 % 일치하는 것을 확인하였다.

OsPHS5-F 프라이머(서열번호 2): 5'-CCATGTCCTATGTTAGATCC-3'

OsPHS5-R 프라이머(서열번호 3): 5'-GACAACTAGAACAAACAGCC-3'

벼 종자의 수발아저항성을 개량하기 위한 목적으로 OsPHS5 유전자를 활용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 하기 OsPHS5-entF 및 OsPHS5-entR 프라이머 세트를 이용하여 entry vector(pENTR)에 도입한 후 gateway system을 이용하여 pGA2897-3X 계열 벡터의 옥수수 유비퀴틴(maize ubiquitin) 프로모터의 하류에 OsPHS5 유전자를 연결하고, OsPHS5 단백질의 C 말단에 HA epitope를 연결하여 식물에서 항시 발현하는 형질전환 벡터 (pGA2897-OsPHS5-3XHA)를 제작하였다(도 2).

OsPHS5-entF 프라이머(서열번호 4): 5'-GCCGCCCCCTTCACCATGTCACTTGGCTATGCCG-3'

OsPHS5-entR 프라이머(서열번호 5): 5'-TCGGCGCGCCCACCCTTAACTTTCTGAGTAGCAGGGTTC-3'

<실시예 3> OsPHS5 발현 벡터가 삽입된 벼 형질전환체 제작 및 도입 유전자와 단백질 발현 확인

동진벼의 종자로부터 유도한 캘루스에 상기 pGA2897-OsPHS5 벡터를 포함하는 아그로박테리움(Agrobacterium)을 접종하고, hygromycin (30 ㎍/ml)을 포함하는 배지에서 형질전환 캘루스를 선발한 후 줄기와 뿌리를 유도하여 형질전환 벼를 생산하였다.

동진벼와 OsPHS5 형질전환 벼의 잎에서 각각 RNA를 분리하고 cDNA를 제작한 후 OsPHS5 유전자 특이적인 하기 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.

OsPHS5-102F 프라이머(서열번호 6): 5'-GAGCTTGCAGTCATGGTGCGAGAG-3'

OsPHS5-905R 프라이머(서열번호 7): 5'-GCTCCTTGGCAGCATCCATCTCC-3'

그 결과 대조구에 비해 OsPHS5 형질전환 벼에서 도입한 OsPHS5 유전자의 발현수준이 높은 것을 확인하였다(도 3).

또한 OsPHS5 단백질의 C-말단에 표지된 HA epitope에 대한 항체를 이용하여, OsPHS5 형질전환벼에서 OsPHS5 단백질이 제대로 발현되고 있는지를 western 분석을 통해 확인하였다. 이를 위하여 동진벼와 OsPHS5 형질전환 벼의 잎에서 각각 분리한 단백질 분획을 SDS-PAGE로 전개하여 나일론막으로 옮긴 후 anti-HA 항체를 이용하여 단백질 발현을 분석하였다. 그 결과 OsPHS5 형질전환벼에서만 도입된 OsPHS5 단백질이 발현되고 있음을 확인하였다(도 4). 한편 내재 단백질 대조구인 히스톤 H3 단백질은 동진벼와 형질전환벼에서 모두 정상적으로 발현되었다. 따라서 OsPHS5 발현벡터가 도입된 형질전환 벼에서 도입된 OsPHS5 유전자 및 OsPHS5 단백질이 높게 발현되고 있음을 증명하였다.

<실시예 4> OsPHS5 과발현 형질전환 벼의 등숙 단계 수발아저항성 분석

대조구 (동진벼)와 동진벼 기반의 OsPHS5 형질전환 벼를 포장에서 육성후, 출수후 41 일째 및 50 일째 이삭을 채취한 후 이삭에서 종자를 분리하여 페트리디쉬에 넣고 100% 상대습도, 30도, 암조건에서 5일간 종자 발아율을 측정하였다. 그 결과 야생형인 동진벼의 경우 출수후 41 일째 이삭의 종자가 적정발아조건에서 3일째에 80% 이상 발아하는데 비하여, OsPHS5 형질전환체의 종자는 30% 미만으로 종자의 휴면성이 크게 증진되었음을 확인하였다(도 5).

또한, 출수후 50 일째 동진벼의 종자가 90% 이상 발아하는 조건(침윤후 2일째)에서도 OsPHS5 형질전환벼 종자의 발아율은 40~70% 사이로 현저하게 낮았다(도 5B). 따라서 OsPHS5 유전자가 종자 휴면을 유지시키는 기능이 있으며, OsPHS5 유전자의 과발현을 통해서 등숙단계에서 문제가 되는 벼의 수발아저항성을 증진시킬 수 있음을 증명하였다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> OsPHS5 Gene enhancing pre harvest sprouting tolerance derived from Oryza sativa and uses thereof <130> DP20190299 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1452 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS5 gene <400> 1 atgtcacttg gctatgccga gaagctatcc taccgagagg atgtgggaaa tgtcggcatg 60 cctgagatct tcgactctcc tgaactcctc cacaagaaga tagaagagct tgcagtcatg 120 gtgcgagaga gtaagcattt ggtggtgttt actggagcag gcatatcaac ttcatcaggc 180 atacctgact tccgagggcc caaaggcgtg tggacactgc agcgttcagg aaaaggtgtt 240 cctggtgcat cactgccgtt tcaccgagct gttccaacct tgactcatat ggcactggtt 300 gaattggaaa aaacaggacg attaaagttt gtcataagcc agaatgttga tagcttacat 360 ctccgctctg gcctcccaag ggagaagctg gctgaattgc atggaaattc tttcaaggag 420 atctgcccaa gctgtaaaaa ggagtacctt cgtgattttg aaattgagac gataggactg 480 aaggatactc caaggcgttg ttctgataag aactgtggag ctagattaaa agacacagtt 540 cttgattggg aggatgcttt accccctgag gagatggatg ctgccaagga gcagtgtcaa 600 aaagctgatc ttgtcctatg tttaggaact agtctgcaga ttactcctgc ttgtaatatg 660 cctctgttgt cactgaagaa tggggggagg gtggctattg taaatcttca ggcaactccg 720 aaggataaaa aggcaagcct tgtcattcat ggacttgtgg ataaggtcat tgctggggtt 780 atgtatatga tgaatctgcg tatccctcca tatattcgta ctgactttgt tcaaattagt 840 ctccggaact cggtcaaaaa aaaatgcgtg agatggactc tccgagtaac aagcattcat 900 ggcttgcgag cacctttgcc atttcttcga tcagttgagg tttcctttcc tgaaagacct 960 gacatgaagc ctgtagtact aaaggagcaa ccattttctt tgcagagaga aacatcaatg 1020 aatagaccgt ttgtcatgct attgacattc aactttagtg atggttgcgg ctgttcgagc 1080 tcttccattg aatggcctgt tgattttctg aagcaaaaag acagctttgt cagggataga 1140 agtctagtcc tgcaagagtt gcaacatgct gcagagcatc gatcacgtgc agggcagcat 1200 gcaattctgg agagggaggg tgtgccaaga gctgaaacgt caattcatgc acttgtgacc 1260 aacatcgtca ggtatgatac tgaagatagc aaggcggcag ttcccatggc tacatggatg 1320 aacagcaacg gcagcctttc gaaacggcat atggatgcca ttggttgcaa cccagcatcg 1380 tcaaaaaagc agaagttggt tgctactcgt catcggcgaa agggcttgaa ccctgctact 1440 cagaaagttt ga 1452 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS5 Forward primer <400> 2 ccatgtccta tgttagatcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS5 reverse primer <400> 3 gacaactaga acaaacagcc 20 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS5 entforward primer <400> 4 gccgccccct tcaccatgtc acttggctat gccg 34 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS5 entreverse primer <400> 5 tcggcgcgcc cacccttaac tttctgagta gcagggttc 39 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS5 entforward primer <400> 6 gagcttgcag tcatggtgcg agag 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS5 entreverse primer <400> 7 gctccttggc agcatccatc tcc 23

Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 식물의 수발아 저항성을 증진시키는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsPHS5 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및
   상기 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는,
   수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법.
6. 식물의 수발아 저항성을 증진시키는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsPHS5 유전자 또는 상기 OsPHS5 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는 방법.
7. 식물의 수발아 저항성을 증진시키는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsPHS5 유전자 또는 상기 OsPHS5 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 수발아 저항성 증진용 조성물.

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