KR100877729B1

KR100877729B1 - 종실의 길이 신장과 종자 생산성에 관여하는 두 개의시토크롬 ｐ４５０ 유전자

Info

Publication number: KR100877729B1
Application number: KR1020070042279A
Authority: KR
Inventors: 김호방; 최상봉
Original assignee: 명지대학교 산학협력단
Priority date: 2007-05-01
Filing date: 2007-05-01
Publication date: 2009-01-08
Also published as: KR20080097271A

Abstract

본 발명은 종실의 길이 신장과 종자 생산성에 관여하는 두 개의 시토크롬 P450 유전자에 관한 것으로써, 더욱 상세하게 본 발명에서는 시토크롬 P450 CYP78A 유전자의 서브페밀리(subfamilies)에 속하는 CYP78A9와 염기서열에서 78.1%, 아미노산 서열에서 80%의 서열 상동성을 보이는 CYP78A6를 분리하였고, CYP78A6와 CYP78A9 유전자의 기능이 모두 상실된 이중 기능상실 돌연변이체를 이용하여 종실당 종자의 수는 야생형 및 단일 돌연변이체와 차이가 없었지만 종실 수의 증가로 인하여 식물체당 종자 생산성은 증가하는 것을 확인하였고, 조기 노쇠 현상이 있으며 야생형 및 단일 돌연변이체보다 엽록소의 함량도 현저히 줄어든 것을 확인하였다. 본 발명의 CYP78A6와 CYP78A9 유전자의 기능이 모두 상실된 이중 기능상실 돌연변이체는 종자수의 증가와 조기 숙성하는 특성 때문에 종자 산업에 유용하게 활용될 수 있다.

CYP78A6, CYP78A, 유전자, 종실, 종자, 이중돌연변이

Description

종실의 길이 신장과 종자 생산성에 관여하는 두 개의 시토크롬 Ｐ４５０ 유전자{Two Cytochrome P450 Genes Regulating Fruit Size and Seed Productivity}

도1의 (A)는 CYP78A 유전자의 아미노산 시퀀스를 이용한 neighbor-joining tree를 나타내는 그림이며, (B)는 애기장대의 서로 다른 조직들에서 CYP78A6와 CYP78A9의 발현 패턴을 RT-PCR을 이용하여 분석한 그림이다(Lf.; 로제트(rosette) 잎, Rt.; 뿌리, St.; 줄기, Fl.; 꽃, Fb.; 꽃눈, Ys.; 어린 열매, Ms.; 성숙한 열매).

도2의 (A)는 T-DNA 삽입의 모식도를 나타내고, (B)는 CYP78A6 또는 CYP78A9의 T-DNA 삽입에 의한 유전자 결실 돌연변이(knock-out mutations)를 확인하기 위한 RT-PCR 분석을 나타내는 그림이다.

도3은 CYP78A6와 CYP78A9 유전자의 기능상실(loss-of-function)에 대한 결과로 나타나는 형태를 관찰한 그림이다.

도4의 (A)는 야생형, 단일 돌연변이(cyp78A6 -1, cyp78A9 -2)와 이중 돌연변이(cyp78A6 -1/cyp78A9 -2)로부터 만들어진 종실의 형태를 관찰한 그림이고, (B-F)는 야생형, 단일 돌연변이(cyp78A6 -1, cyp78A9 -2)와 이중 돌연변이(cyp78A6 - 1/cyp78A9 -2)로부터 만들어진 종자의 크기와 모양을 나타내는 그림이다.

도5는 야생형, 단일 돌연변이(cyp78A6 -1, cyp78A9 -2)와 이중 돌연변이(cyp78A6 -1/cyp78A9-2)로부터 만들어진 잎이 자라면서 변화하는 형태를 관찰한 그림이다.

도6의 (A)는 야생형, 단일 돌연변이(cyp78A6 -1, cyp78A9 -2)와 이중 돌연변이(cyp78A6 -1/cyp78A9 -2)의 암처리에 의한 인위적인 잎의 노쇠 유도 실험 결과이고, (B)는 4일 동안 암처리 후 엽록소의 양을 측정한 결과를 나타내는 것이다.

본 발명은 종실의 길이 신장과 종자 생산성에 관여하는 두 개의 시토크롬 P450 유전자에 관한 것으로써, 더욱 상세하게 본 발명에서는 시토크롬 P450 CYP78A 유전자의 서브페밀리(subfamilies)에 속하는 CYP78A9와 염기서열에서 78.1%, 아미노산 서열에서 80%의 서열 상동성을 보이는 CYP78A6를 분리하였고, CYP78A6와 CYP78A9 유전자의 기능이 모두 상실된 이중 기능상실 돌연변이체를 이용하여 종실당 종자의 수는 야생형 및 단일 돌연변이체와 차이가 없었지만 종실 수의 증가로 인하여 식물체당 종자 생산성은 증가하는 것을 확인하였고, 조기 노쇠 현상이 있으며 야생형 및 단일 돌연변이체보다 엽록소의 함량도 현저히 줄어든 것을 확인하였다. 본 발명의 CYP78A6와 CYP78A9 유전자의 기능이 모두 상실된 이중 기능상실 돌연변이체는 종자 수의 증가와 조기 숙성하는 특성 때문에 종자 산업에 유용하게 활용될 수 있다.

세계 상업적 종자시장 규모는 300억불 정도이며, 국내 종자시장 규모는 5억 2천만불, 수출 17백만불, 수입 39백만불 정도이며, 자본력과 선진 육종기술을 가진 다국적 기업이 M&A를 통하여 세계 종자시장에 대한 지배력을 강화하고 있는 추세이다.

우리나라의 경우 고추, 배추, 무 등 일부 채소종자는 세계 최고 수준의 육종기술을 보유하고 있고, 화훼류 및 양파, 토마토 등 일부 채소류는 국내 개발 품종이 적어 로열티를 지불하거나 수입에 의존하는 형편이다.

종자산업은 자본과 기술집약적 산업으로 기술 수준이 높고 인적자원이 풍부한 우리 농업실정에 적합한 산업으로 종자는 농업생산의 기본 요소로 시장이 한번 잠식되면 지속적으로 종속될 수밖에 없는 특성이 있어, 장기적인 비전을 가지고 지속적으로 투자할 필요가 있다.

식물 유전자원은 각종의 유용한 특성을 발현할 수 있는 유전인자를 갖는 재배종 및 근연 야생종 또는 미개발 자원들로서 식물 육종의 근간이 될 뿐만 아니라 첨단 과학인 농업생명공학의 기본 토대가 되는 것이다. 그러나 근래 새롭고 좋은 신품종의 육성 보급으로 옛날부터 재배하여 오던 재래종은 빠른 속도로 없어졌고 자연 훼손 과 산업 발전에 따른 공해의 심화는 잦은 기상 이변과 함께 식물 유전자원의 소실을 가져오고 있다. 하나의 유전인자는 약 10억년 진화의 결과인 동시에 한번 소실되면 재생이 불가능하며 다시 찾을 수 없다. 그러므로 최근에는 선후진국을 막론하고 유전자원의 수집 평가 및 활용에 막대한 노력과 경비를 아끼지 않고 있으며 앞으로는 자원을 가장 많이 확보한 나라가 종자전쟁에서 이길 수 있다는 자원 무기화의 개념으로 발전되고 있다.

한편, 시토크롬 P450 CYP78A 유전자의 서브페밀리(subfamilies)의 일종인 CYP78A9를 애기장대에서 과발현시킴으로써 열매 크기가 커지고 모양이 변형된 표현형이 관찰되었다. 야생형의 애기장대 꽃에서 비교적 높게 발현되는 CYP78A9 mRNA는 발달된 난세포의 주병(珠柄, funiculus)에서 관찰되었고, 돌연변이 애기장대 라인에서는 심피벽(carpel wall), 특히 그 내부에서 높게 발현하는 것으로 관찰되었다(Plant Cell, Vol.12, 1541-1550. September 2000, Toshiro Ito and Elliot M. Meyerowitz). 비록 CYP78A 서브페밀리에 속하는 단백질들의 기능이 아직 정확하게 밝혀지지 않았지만 CYP78A 유전자의 전사체는 꽃이나 분열조직(meristem)에서 특이적으로 발현되는 것으로 밝혀졌다. 팔레놉시스의 CYP78A2와 옥수수의 CYP78A1은 화분관과 수꽃대 원기(tassel primordia)에서 각각 특이적으로 발현되었다(Larkin, 1994; Nadeau et al., 1996). 애기장대의 CYP78A5은 영양엽조 또는 재생엽조의 분열조직(vegetative and reproductive shoot meristems)의 표면에서 발현된다(Zondlo and Irish, 1999).

본 발명에서는 시토크롬 P450 CYP78A 유전자의 서브페밀리(subfamilies)에 속하는 CYP78A9와 염기서열에서 78.1%, 아미노산 서열에서 80%의 서열 상동성을 보이는 CYP78A6가 분리되었다. 본 발명의 CYP78A6와 CYP78A9 유전자에 대한 단일 기능상실(loss-of-function) 돌연변이체의 경우 각각의 야생형과 형태적 차이를 관찰할 수 없었으나 이중 기능상실 돌연변이체의 경우 종실당 종자의 수는 야생형 및 단일 돌연변이체와 차이가 없었지만 종실 수의 증가로 인하여 식물체당 종자 생산성은 증가하였다. 이중 돌연변이체의 경우 조기 노쇠 현상이 있고, 이는 암처리에 의한 인위적인 노쇠 유도 실험에서도 동일하게 관찰되었으며 야생형 및 단일 돌연변이체보다 엽록소의 함량도 현저히 줄어든 것을 확인하였다. 이러한 CYP78A6와 CYP78A9 이중 기능상실(loss-of-function) 돌연변이체의 표현형을 관찰함으로써 CYP78A6 유전자는 CYP78A9와 그 기능이 보충될 수 있는 것을 확인하였고, CYP78A6와 CYP78A9 이중 돌연변이체의 경우 조기 숙성을 나타내면서 식물체당 종자 생산성은 증가하므로 이 식물체는 종자 산업에 유용하게 활용될 수 있어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 종자수의 증가와 식물체의 조기 숙성에 관여하는 애기장대 유래의 CYP78A6 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 서열번호 2의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는 CYP78A6 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CYP78A6 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 CYP78A6 단백질 코딩 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 애기장대 CYP78A6와 CYP78A9 유전자에 T-DNA가 삽입된 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CYP78A6와 CYP78A9 유전자를 식물체에서 파쇄시킴으로써 종자수의 증가와 식물체의 조기 숙성 유발방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 식물체로서 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립 을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 방법에 의한 식물의 종자수의 증가와 조기 숙성된 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 식물체의 종자를 제공하는 것이다.

본 발명은 종실의 길이 신장과 종자 생산성에 관여하는 두 개의 시토크롬 P450 유전자에 관한 것이다.

본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 종자수의 증가와 식물체의 조기 숙성에 관여하는 애기장대 유래의 CYP78A6 단백질을 포함한다.

본 발명은 상기의 서열번호 2의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는 CYP78A6 단백질을 포함한다.

본 발명은 CYP78A6 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다.

본 발명은 서열번호 1의 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 CYP78A6 단백질 코딩 유전자를 포함한다.

본 발명은 애기장대 CYP78A6와 CYP78A9 유전자에 T-DNA가 삽입된 식물체를 포함한다.

본 발명은 CYP78A6와 CYP78A9 유전자를 식물체에서 파쇄시킴으로써 종자수의 증가와 식물체의 조기 숙성 유발방법을 포함한다.

본 발명은 상기 식물체로서 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법을 포함한다.

본 발명은 상기의 방법에 의한 식물의 종자수의 증가와 조기 숙성된 식물체를 포함한다.

본 발명은 상기의 식물체의 종자를 포함한다.

본 발명에 따른 CYP78A6 단백질의 범위는 담배로부터 분리된 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 종자수의 증가와 식물체의 조기 숙성에 관여하는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 CYP78A6 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 CYP78A6 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다.

1. CYP78A6, CYP78A9 유전자의 서열 유사도 및 조직별 발현 양상

CYP78A6와 CYP78A9 유전자의 암호화 부위는 서로간에 염기서열에서 78.1%, 아미노산 서열에서80%의 서열 상동성을 보인다(도 1A).

조직별 발현 양상을 분석하기 위하여, 다양한 조직으로부터 전체 RNA를 분리하여 RT-PCR을 수행한 결과, 두 유전자는 조사된 모든 조직에서 발현됨을 확인하였다(도 1B).

2. CYP78A6와 CYP78A9 유전자에 대한 기능 상실 돌연변이체의 표현형

식물 생장과 발달 과정에서 CYP78A6와 CYP78A9 유전자의 역할을 이해하기 위하여 두 유전자에 대한 T-DNA 삽입 돌연변이체를 분리하였다(도 2A). T-DNA 삽입이 유전 자의 발현을 차단하는지의 여부를 확인하기 위하여 유식물로부터 전체 RNA를 분리하여 RT-PCR을 수행한 결과, T-DNA 삽입이 해당 유전자의 발현을 차단함을 확인하였다(도 2B).

CYP78A6와 CYP78A9 유전자에 대한 단일 돌연변이체의 경우 각각의 야생형과 형태적 차이를 관찰할 수 없었다(도 3A-D). 두 유전자는 아미노산 서열 상동성이 80%로 매우 높으며(도 1A), 조직별 발현 양상 또한 매우 유사하였다(도 1B). 따라서 두 유전자 중 한 유전자의 기능이 소실되더라도 나머지 다른 유전자에 의해 그 기능이 보충될 수 있다고 판단하여, 두 유전자에 대한 이중 돌연변이체를 제작하였다. 이중 돌연변이체의 경우 야생형 및 단일 돌연변이체에 비해 식물체의 키는 변하지 않았으나 가지의 숫자가 많아지며, 종실의 길이가 짧아짐을 관찰할 수 있었다(도 3과 표 1). 이중 돌연변이체 종실의 길이는 야생형과 단일 돌연변이체에 비해 약 40% 정도 감소하나 종실당 종자의 수는 야생형 및 단일 돌연변이체와 차이가 없었다(도 4와 표 1). 다만 이중 돌연변이체 종자의 길이는 야생형 및 단일 돌연변이체에 비해 약 20% 정도 감소하였으나, 종자의 폭은 차이가 없었다(도4와 표 1). 이중 돌연변이체에서 종자 크기의 감소는 종실 크기의 감소로 인한 공간적 제약으로 인한 것으로 사료된다. 이중 돌연변이체는 야생형 및 단일 돌연변이체에 비해 종실 및 종자 크기가 감소하였으나, 식물체당 종실의 수 및 1차 꽃대 당 종실의 수는 각각 2.1-2.6 배, 1.3-1.5 배 증가하였다(표 1). 이중 돌연변이체의 경우 식물체당 종자 생산성이 야생형이나 단일 돌연변이체에 비해 1.5-1.9 배 정도 증가하였는데(표 1), 이는 종실 수의 증가에 기인하는 것으로 판단된다.

표1. 야생형, 78A6-1, 78A9-2와 78A6-1/78A9-2 식물체의 형태상의 비교

Phenotypic traits	Col -0	Ws -2	78A6-1 (in Col)	78A9-2 (in Ws-2)	78A6/78A9 (in Col)
Height¹ (cm)	34.35±1.76	34.95±1.37	35.65±1.55	34.75±1.75	36.92±2.26
Intersiliques² (cm)	1.39±0.33	1.50±0.42	1.55±0.17	1.44±0.48	1.15±0.48
No. of branches	3.10±0.32	2.20±0.42	2.20±0.63	3.10±0.99	3.56±0.78
No. of rosette leaves	11.0±0.94	5.8±0.42	9.7±0.67	5.4±0.70	10.5±1.42
Fertility (mg seeds/plant)	33.54±4.75	40.82±5.38	39.67±5.81	41.59±8.67	62.70±8.02
Siliques1³	53.4±5.5	66.8±7.96	66.5±8.75	64.3±16.9	140.4±14.88
Siliques2⁴	29.0±1.67	26.6±3.01	31.6±2.37	28.4±2.76	40.6±4.86
Silique length (mm)	13.15±0.61	12.18±0.77	11.38±0.80	11.30±0.75	7.28±0.63
Silique width (mm)	1.06±0.05	1.16±0.08	1.10±0.06	1.03±0.05	1.02±0.05
Seed No. per silique	42.75±5.09	39.33±3.42	44.53±7.02	37.65±5.77	41.63±4.60
Seed length (mm)	0.47±0.02	0.52±0.02	0.47±0.02	0.47±0.02	0.38±0.01
Seed width (mm)	0.28±0.02	0.29±0.01	0.29±0.01	0.27±0.01	0.29±0.01

¹Plant height at 6 weeks-old age (N>10 for wild types, 78A6-1 and 78A9-2. N>18 for 78A6-1/78A9-2).

²Length between 1st and 2nd siliques at 6 weeks-old age.

³Number of total siliques per plant measured at 6 weeks-old age.

⁴Number of siliques on primary inflorescence at 6 weeks-old age.

이중 돌연변이체의 경우 잎의 노쇠(in planta senescence)가 야생형이나 단일 돌연변이체에 비해 빠르게 일어남을 관찰할 수 있었다(도 5). 이중 돌연변이체의 조기 노쇠 현상은 암처리에 의한 인위적인 노쇠 유도 실험에서도 동일하게 관찰되었다 (도 6A와 B).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

<실시예1. 식물체와 생장조건>

애기장대(Arabidopsis thaliana)의 생태형인 Ws-2와 Col-0은 야생형으로 사용하였다. 종자의 표면을 멸균하고 4℃에서 2일 동안 서늘하게 보관한 후, 발아시켜 1% 수크로스(pH 5.8, KOH로 적정)를 첨가한 1xMS 염 배지[Murashige and Skoog (1962)]가 포함된 0.8% 아가 고체배지에서 명16시간(22~24℃)/암8시간(18~20℃)의 광주기로 키운다.

<실시예2. CYP78A6와 CYP78A9 유전자의 염기서열과 아미노산 서열 상동성>

CYP78A6와 CYP78A9 유전자의 염기서열과 아미노산 서열 상동성은 LALIGN 프로그램을 사용하여 분석하였다(URL http://kr.expasy.org). 식물 CYP78A 유전자 그룹에 대한 계통 분석은 PHYLIP 프로그램을 사용하여 수행하였다. 계통수는 Dayhoff PAM matrix를 이용하여 neighbor-joining 방법으로 작성하였다.

<실시예3. PCR을 이용한 기능 상실 돌연변이체 분리 및 이중 돌연변이체 제작>

애기장대 CYP78A6와 CYP78A9 유전자에 T-DNA가 삽입된 돌연변이체는 80,000 개의 T-DNA 삽입 돌연변이 집단(80,000 라인 x 식물체당 평균 1.5 T-DNA 사본=약 120,000 T-DNA 삽입)으로부터 역방향 유전학을 통해 분리하였다. 본 연구에 사용된 T-DNA 삽입 돌연변이 집단은 다음과 같다: Feldmann 라인(6,000 라인; Winkler et al., 1998. Plant Physiol 118: 743-749), Thomas Jack 라인 (6,000 라인; Campisi et al., 1999. Plant J 17: 699-707), Wisconsin 라인(Arabidopsis Knockout facility in Biotechnology Center of University of Wisconsin, 60,480 라인; Krysan et al., 1999. Plant Cell 11: 2283-2290). PCR을 이용한 역방향 유전학은 기본적으로 Winkler 등(1998. Plant Physiol 118: 743-749)과 Krysan 등(1999. Plant Cell 11: 2283-2290)의 방법에 따라 수행하였다. 상기 T-DNA 삽입 돌연변이 집단의 DNA 풀로부터 CYP78A6와 CYP78A9 유전자에 T-DNA가 삽입된 돌연변이체를 분리하기 위하여 T-DNA border 프라이머와 각 유전자 특이 프라이머의 조합을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 다음과 같다; 96°C, 5분(초기 변성):94°C, 15초-65°C, 30분-72°C, 2분(36사이클): 72°C, 5분(마지막신장단계). PCR 산물은 1% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 이를 나일론 막으로 전이시키고, 특이적 증폭을 확인하기 위하여 각 유전자 절편을 방사성 동위원소(³²P)로 표지하여 Southern 혼성화 반응을 수행하였다. 혼성화 반응이 일어난 절편에 해당하는 PCR 산물에 대해 시퀀싱을 수행하여 각 유전자상의 T-DNA 삽입 위치를 결정하였다. DNA 풀에 상응하는 해당번호의 종자를 발아시키고, 잎 절편으로부터 게놈 DNA를 추출한 후 T-DNA 삽입 이 확인된 프라이머 조합으로 PCR을 수행하여 T-DNA가 삽입된 돌연변이체를 분리하였다. 분리된 돌연변이체가 이형 접합체인지 상동 접합체인지의 여부를 확인하기 위하여 T-DNA border와 유전자 특이 프라이머 및 정방향과 역방향 유전자 특이 프라이머 조합으로 PCR을 수행하였다.

분리된 T-DNA 삽입 돌연변이체는 야생형으로의 역교배를 통해 각 유전자에만 T-DNA가 삽입된 순계를 확보하여 이중 돌연변이체 제작에 사용하였다. 이중 돌연변이체를 제작하기 위하여 CYP78A6 상동접합 돌연변이체와 CYP78A9 상동접합 돌연변이체를 교배하여 F1 종자를 얻었다. F1 종자를 파종하여 자가수분 시키고 이로부터 F2 종자를 얻었다. F2 종자를 발아시켜 얻은 F2 식물체들로부터 잎 조직을 취하고, 이로부터 게놈 DNA를 분리하여 유전형 결정을 위한 PCR을 수행하여 이중 돌연변이체를 확보하였다. 사용한 PCR 프라이머 시퀀스들은 표 2에 정리하였다.

표2. 본 발명에 사용된 프라이머 시퀀스

Gene	Primer	Primer sequences	Remarks
CYP78A6	78A6F1(서열번호3)	5’-gccccacaggccaaaagacactct-3’	Genotyping
	78A6R1(서열번호4)	5’-cactctcctctcagactcacaagtt-3’	Genotyping
	78A6RTF(서열번호5)	5’-atgaatctgacttggcttcacttcc-3’	RT-PCR
	78A6RTR(서열번호6)	5’-cactctcctctcagactacaagtt-3’	RT-PCR
CYP78A9	78A9F1(서열번호7)	5'-ctttcgtcttaaaccccacagcaaaaag-3'	Genotyping
	78A9R1(서열번호8)	5'-tatttgcttgtaatcggggctttgtttg-3'	Genotyping
	78A9RTF(서열번호9)	5’-aaacccgaacgttttgtagccaag-3’	RT-PCR
	78A9RTR(서열번호10)	5’-attttccttcgctttagttaccac-3’	RT-PCR
Actin-2	ACT2RTF(서열번호11)	5'-agtgtgtcttgtcttatctggttcg-3'	RT-PCR
	ACT2RTR(서열번호12)	5'-aatagctgcattgtcacccgatact-3'	RT-PCR
T-DNA border	JL-202(서열번호13)	5’-cattttataataacgctgcggacatctac-3’	Genotyping

<실시예4. RT-PCR(Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction)>

식물 조직으로부터 추출한 전체 RNA는 TRIzol 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 정제하였다. 식물 조직을 액체 질소로 곱게 마쇄한 후 식물 조직 100 mg 당 1 ml의 TRIzol 용액을 첨가하여 실온에서 5 분간 진탕하였다. 0.2 ml의 chloroform을 첨가한 후 실온에서 5 분간 진탕하였다. 4℃, 15,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 상등액을 새 튜브로 옮기고 0.5 ml의 2-propanol을 첨가하여 10분간 상온에 방치하였다. 15분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨 후 70% EtOH로 세척하고, 상온에서 RNA를 건조시킨 후 멸균 증류수에 녹였다. 5 ㎍의 정제된 전체 RNA는 MMLV-역전사효소(Invitrogen)를 이용하여 첫 번째 가닥의 cDNA를 합성하였다. CYP78A6와 CYP78A9 유전자의 발현을 확인하기 위하여 각각 78A6RTF/78A6RTR, 78A9RTF/78A9RTR 프라이 머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였으며(표 2), PCR 조건은 다음과 같다; 96°C, 5분(초기 변성): 94°C, 15초; 55°C, 30초; 72°C, 1분(27사이클): 72°C, 5분(마지막신장단계). 액틴-2(actin-2)를 암호화하는 전사체를 양성 대조구로 사용하였다. 사용한 PCR 프라이머 시퀀스들은 표 2에 정리하였다.

<실시예5. 암처리에 의한 인위적인 노쇠 유도 실험과 엽록소 함량 측정>

로제트 잎(5^th와 6^th)은 토양에서 4주간 자란 식물체로부터 채취하였다. 잎들은 암조건에서 4일 동안 3 mM MES 버퍼(pH 5.8)에서 배양하였다. 엽록소는 암조건에서 95%(v/v) EtOH로 80℃에서 25분 동안 가열하여 추출한 후, 4℃, 15,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 상등액을 새 튜브로 옮겼다. 흡광도 664 nm와 648 nm에서 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 생중량[fresh weight (g)]당 엽록소의 양을 구한 식은 다음과 같다: Chl.A = 13.36 x A₆₆₄ 5.19 x A₆₄₈, Chl.B = 27.43 x A₆₄₈ 8.12 x A₆₆₄.

본 발명의 CYP78A6와 CYP78A9 유전자의 기능이 모두 상실된 이중 기능상실 돌연변이체는 종자수의 증가와 조기 숙성하는 특성 때문에 종자 산업에 유용하게 활용되어 농업 생산성을 증가시키고 농가소득을 증대시키기 위한 우수한 작물 품종의 개발 및 보급에 이용될 수 있다.

<110> Myongi University Industry and Academia Cooperation Foundation <120> Two cytochrome P450 genes regulating fruit size and seed productivity <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1593 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atggctacga aactcgaaag ctccttaatc tttgcccttt tgtccaaatg cagcgttcta 60 agccaaacca accttgcctt ctccctcctc gccgtcacaa tcatctggct cgccatatct 120 ctcttcttat ggacctatcc cggtggacct gcttggggga aatacctctt cggccggtta 180 atatccggtt catacaaaac cggaaacgtt attcccggtc caaaaggctt ccctttggtt 240 ggaagcatgt cactcatgtc aagcactcta gctcaccgac gaatcgctga tgcagctgag 300 aaattcggag ccaagaggct catggctttc agcttaggag agactcgcgt gatcgtcacg 360 tgcaatcccg acgtagcgaa agagattctg aatagcccgg tttttgctga tcgaccggtt 420 aaagaatcgg cttactcact gatgtttaac agagcaattg gttttgcacc acacggtgtt 480 tactggcgaa cgcttcgccg tatcgcttcg aaccatctct ttagtacaaa acaaatcaga 540 agagccgaga cgcaacgacg agtgatctca agccagatgg ttgagtttct tgaaaaacag 600 agtagtaacg aaccctgttt tgttcgtgag ttgcttaaaa cggcgtcgct 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1500 gatggtaacg gcgttgactt atctgagaaa ctgaggcttt cttgcgagat ggctaatcct 1560 cttcctgcta aattgcgccg taggcgcagt taa 1593 <210> 2 <211> 530 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Ala Thr Lys Leu Glu Ser Ser Leu Ile Phe Ala Leu Leu Ser Lys 1 5 10 15 Cys Ser Val Leu Ser Gln Thr Asn Leu Ala Phe Ser Leu Leu Ala Val 20 25 30 Thr Ile Ile Trp Leu Ala Ile Ser Leu Phe Leu Trp Thr Tyr Pro Gly 35 40 45 Gly Pro Ala Trp Gly Lys Tyr Leu Phe Gly Arg Leu Ile Ser Gly Ser 50 55 60 Tyr Lys Thr Gly Asn Val Ile Pro Gly Pro Lys Gly Phe Pro Leu Val 65 70 75 80 Gly Ser Met Ser Leu Met Ser Ser Thr Leu Ala His Arg Arg Ile Ala 85 90 95 Asp Ala Ala Glu Lys Phe Gly Ala Lys Arg Leu Met Ala Phe Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Thr Arg Val Ile Val Thr Cys Asn Pro Asp Val Ala Lys Glu 115 120 125 Ile Leu Asn Ser Pro Val Phe Ala Asp Arg Pro Val Lys Glu Ser Ala 130 135 140 Tyr Ser Leu Met Phe Asn Arg Ala Ile Gly Phe Ala Pro His Gly Val 145 150 155 160 Tyr Trp Arg Thr Leu Arg Arg Ile Ala Ser Asn His Leu Phe Ser Thr 165 170 175 Lys Gln Ile Arg Arg Ala Glu Thr Gln Arg Arg Val Ile Ser Ser Gln 180 185 190 Met Val Glu Phe Leu Glu Lys Gln Ser Ser Asn Glu Pro Cys Phe Val 195 200 205 Arg Glu Leu Leu Lys Thr Ala Ser Leu Asn Asn Met Met Cys Ser Val 210 215 220 Phe Gly Gln Glu Tyr Glu Leu Glu Lys Asn His Val Glu Leu Arg Glu 225 230 235 240 Met Val Glu Glu Gly Tyr Asp Leu Leu Gly Thr Leu Asn Trp Thr Asp 245 250 255 His Leu Pro Trp Leu Ser Glu Phe Asp Pro Gln Arg Leu Arg Ser Arg 260 265 270 Cys Ser Thr Leu Val Pro Lys Val Asn Arg Phe Val Ser Arg Ile Ile 275 280 285 Ser Glu His Arg Asn Gln Thr Gly Asp Leu Pro Arg Asp Phe Val Asp 290 295 300 Val Leu Leu Ser Leu His Gly Ser Asp Lys Leu Ser Asp Pro Asp Ile 305 310 315 320 Ile Ala Val Leu Trp Glu Met Ile Phe Arg Gly Thr Asp Thr Val Ala 325 330 335 Val Leu Ile Glu Trp Ile Leu Ala Arg Met Val Leu His Pro Asp Met 340 345 350 Gln Ser Thr Val Gln Asn Glu Leu Asp Gln Val Val Gly Lys Ser Arg 355 360 365 Ala Leu Asp Glu Ser Asp Leu Ala Ser Leu Pro Tyr Leu Thr Ala Val 370 375 380 Val Lys Glu Val Leu Arg Leu His Pro Pro Gly Pro Leu Leu Ser Trp 385 390 395 400 Ala Arg Leu Ala Ile Thr Asp Thr Ile Val Asp Gly Arg Leu Val Pro 405 410 415 Ala Gly Thr Thr Ala Met Val Asn Met Trp Ala Val Ser His Asp Pro 420 425 430 His Val Trp Val Asp Pro Leu Glu Phe Lys Pro Glu Arg Phe Val Ala 435 440 445 Lys Glu Gly Glu Val Glu Phe Ser Val Leu Gly Ser Asp Leu Arg Leu 450 455 460 Ala Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ile Cys Pro Gly Lys Asn Leu Gly 465 470 475 480 Phe Thr Thr Val Met Phe Trp Thr Ala Met Met Leu His Glu Phe Glu 485 490 495 Trp Gly Pro Ser Asp Gly Asn Gly Val Asp Leu Ser Glu Lys Leu Arg 500 505 510 Leu Ser Cys Glu Met Ala Asn Pro Leu Pro Ala Lys Leu Arg Arg Arg 515 520 525 Arg Ser 530 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gccccacagg ccaaaagaca ctct 24 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cactctcctc tcagactcac aagtt 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atgaatctga cttggcttca cttcc 25 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cactctcctc tcagactaca agtt 24 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctttcgtctt aaaccccaca gcaaaaag 28 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tatttgcttg taatcggggc tttgtttg 28 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aaacccgaac gttttgtagc caag 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 attttccttc gctttagtta ccac 24 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 agtgtgtctt gtcttatctg gttcg 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 aatagctgca ttgtcacccg atact 25 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cattttataa taacgctgcg gacatctac 29

Claims

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애기장대 CYP78A6 또는 CYP78A9 유전자에 T-DNA 삽입으로 단일 기능상실 상동접합 돌연변이체를 제조하는 단계 및 상기 단일 상동접합 돌연변이체를 교배하여 78A6/78A9 이중 돌연변이체를 선발하는 단계를 포함하는, 종자수의 증가와 식물체의 조기 숙성 유발방법.
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제6항의 방법에 의해 종자수의 증가와 조기 숙성된 식물체.
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