KR100510959B1 - 식물의 개화시기를 조절하는 유전자 및 이를 이용한식물의 개화시기 조절방법 - Google Patents
식물의 개화시기를 조절하는 유전자 및 이를 이용한식물의 개화시기 조절방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식물의 개화시기를 조절하는 유전자 및 이를 이용한 식물의 개화시기 조절방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 애기장대로부터 분리된, 서열번호 1로 표시되는 식물의 개화 조절 유전자 COG 및 상기 COG 유전자를 식물 형질전환용 벡터에 정방향 또는 역방향으로 삽입한 후, 상기 벡터로 형질전환된 식물체에서 COG 유전자를 과발현시켜 식물체의 개화시기를 지연시키거나, COG 유전자의 발현을 억제하여 식물체의 조기 개화를 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 COG 유전자 및 상기 유전자로부터 발현되는 COG 단백질은 식물의 개화관련 형질의 개선 및 타 식물체의 개화 조절 유전자의 탐색 등에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 상기 식물의 개화 조절 유전자 COG를 이용하여 식물체를 형질전환시킴으로써, 식물의 조기 개화 및 왜성 현상을 유도하여 생육 기간을 단축하고 작물 생산량을 증대시킬 수 있다.
Description
본 발명은 식물의 개화시기를 조절하는 유전자 및 이를 이용한 식물의 개화시기 조절방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 애기장대로부터 분리된, 서열번호 1로 표시되는 식물의 개화 조절 유전자 COG 및 상기 COG 유전자를 식물 형질전환용 벡터에 정방향 또는 역방향으로 삽입한 후, 상기 벡터로 형질전환된 식물체에서 COG 유전자를 과발현시켜 식물체의 개화시기를 지연시키거나, COG 유전자의 발현을 억제하여 식물체의 조기 개화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
식물에 있어 개화시기(flowering time)는 온도 또는 일장(the daily duration of light; photoperiod), 또는 두 조건 모두에 따라 크게 좌우된다. 일반적으로 일장의 길이에 따라 장일 조건에서 개화하는 장일 식물과 단일 조건에서 개화하는 단일 식물, 일장에 영향을 받지 않는 중일 식물로 크게 나뉘며, 이러한 개화 특성은 근원적으로 몇 개의 유전자의 조절 하에 놓여있다고 보고된 바 있다(Yaron Y. Levy and Caroline Dean(1998) The Plant Cell, 10: 1973-1989).
현재까지 식물의 개화시기에 영향을 미치는 다양한 종류의 돌연변이체, 유전자 또는 개화 조절 경로가 여러 연구를 통해 규명되었는데, 그 중 장일 조건에서 개화가 촉진되는 장일 식물인 애기장대에서 세 가지의 개화 조절 경로가 존재함이 밝혀졌다. 첫 번째 경로는 일장의 길이에 관계없이 개화를 조절하는 자동화 경로(autonomous pathway)로서, 이에 관여하는 유전자로 LD, PGM1, FY, FCA,
FPA, FLD 등이 규명되었다(Chentao Lin, Plant Physiology, 123: 39-50, 2000). 두 번째 경로는 일장의 길이를 감지하여 개화를 조절하는 경로(photoperiodic pathway)로서, ELF3, CAM1, GI, CO, FWA, FT, FE 등의 유전자가 이 경로에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Yaron Y. Levy and Caroline Dean(1998), The Plant Cell, 10: 1973-1989). 마지막 경로는 온도에 의한 개화조절 경로(vernalization pathway)로서, 식물이 일정기간 저온에 노출되었을 때 개화가 촉진되는 경로이며, 이에 관련된 유전자로서 VRN1, VRN2, FRI, FLC 등의 유전자가 분리되었다.
한편, 농작물에 있어서 개화시기는 중요한 의미를 갖는다. 상추, 시금치 및 미나리 등의 엽채류의 경우, 개화시기 후 엽류의 급속한 노화가 일어나 상품가치가 급속히 떨어진다. 또한, 곡류의 경우에는 파종 후 개화시기까지의 발달시간을 기준으로 하여 조생종, 중생종 및 만생종(late variety)의 세 가지 품종으로 나뉘어진다. 조생종 품종의 경우에는 식물이 성숙할 수 있는 기간이 짧아 수확량이 적으나, 일찍 수확 또는 출하할 수 있는 이점이 있다. 이러한 여러 이유로 농업에 있어서 개화시기는 고전적인 육종의 중요한 대상이 되어왔다.
고전 육종에 있어서 육종 방법은 대부분의 경우 교배 육종법을 사용한다. 그러나, 이 방법으로는 1~2개의 특정 유전자만을 원하는 작물로 도입시키는 것이 불가능하다. 따라서, 교배 후 원하는 유전자의 특성만을 남기기 위해 다시 필요 없는 유전자군을 제거하고 원하는 유전자를 고정시키는데, 보통 5년에서 20년 정도까지의 긴 시간과 노력이 요구되는 단점이 있다. 또한, 이렇게 고정한 품종에서도 육종과정에서 고려치 않았던 병원균에 대한 감수성이나 다른 약세형질이 나타날 수 있어, 보급 후 종종 문제를 일으키는 경우가 있다. 개화 시기의 육종도 기존의 재래 교배 육종 방법에 의해서 이루어지기 때문에, 장시간의 노력 및 품종의 불안정성 등의 문제가 여전히 남아있는 상태이다. 그러나, 최근에는 유전공학의 발달로 인해 개화시기 관련 유전자들을 분리하여 적절하게 유전자 조작의 단계를 거쳐 육종에 이용하는 것이 가능해짐으로써, 개화시기가 인위적으로 조정된 또는 조절가능한 새로운 품종이 만들어질 것으로 기대되고 있다(Ove Nilson and Detlef Weigle, Current Opinion in Biotechnolog, 8: 195-199, 1997). 이에 따라, 최근에 개화시기가 연장된 표현형을 보이는 돌연변이체로부터 변이를 유발시키는 유전자를 분리하고자 하는 연구들이 진행되고 있다. 예를 들면, 대한민국 공개특허공보 제 1999-0030639호에 개화 시기 조절 유전자인 OsMADS5~8, MdMADS3 및 MdMADS4가 개시되어 있고, 대한민국 공개특허공보 제2001-0029127호에 애기장대의 생체시계 및 개화시기 조절 유전자 자이겐티아(GIGANTEA)가 개시되어 있다. 그러나, 현재까지의 연구결과로 미루어보아 식물의 개화시기 조절은 상당히 복잡한 과정을 통해 일어나며, 다양한 유전자가 관여하는 것으로 생각되고 있기 때문에(Alon Samach and George, Coupland BioEssays, 22: 38-47, 2000), 식물의 개화 시기 조절에 관여하는 새로운 유전자 및 그 기능에 대한 연구가 요구되고 있다.
따라서, 본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 식물의 개화 시기를 조절하는 유전자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 이용하여 식물의 개화 시기를 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 식물의 개화 시기 조절 유전자 COG를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 COG 유전자를 식물 형질전환용 벡터에 정방향 또는 역방향으로 삽입한 후, 상기 벡터로 형질전환된 식물체에서 COG 유전자를 과발현시켜 식물체의 개화시기를 지연시키거나, COG 유전자의 발현을 억제하여 식물체의 조기 개화를 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 "개화지연 변이체 cog" 또는 " cog 변이체"란, 엑티베이션 태깅 방법(activation tagging method)에 의해 COG 유전자가 활성화되어 개화지연 표현형을 나타내는 돌연변이체를 의미하는 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 개화시기 조절에 관여하는 유전자를 탐색하기 위하여, 개화가 지연된 형질을 나타내는 돌연변이체를 선별하였다. 이를 위해 식물의 유전학 및 분자생물학적 연구를 위한 재료로 많이 사용되는 애기장대를 실험 식물로 하였다. 현재까지 유전자의 기능을 밝히기 위해 일반적으로 사용되는 돌연변이 유도 방법에는 크게 세 가지 방법이 있다. 첫 번째는 화학적 방법으로 EMS(ethyl-methyl sulfonic acid) 등의 화학물질을 처리하는 방법이다. 두 번째는 X-선 또는 감마선을 조사하여 돌연변이를 유도하는 것이고, 세 번째는 토양세균인 아그로박테리움(Agrobacterium)의 T-DNA를 이용하여 형질전환함으로써 돌연변이를 유도하는 방법이다. 상기 화학물질 처리, X-선 또는 감마선 조사, 또는 T-DNA 삽입(insertion)에 의해 돌연변이를 유도하는 방법은 원래의 유전자의 일부 혹은 전부가 파괴되면서 유전자가 가지고 있는 고유의 기능이 상실되게 되므로, 이를 이용하여 그 유전자의 기능을 유추할 수 있다. 그러나, 이러한 방법에 의해 형성된 돌연변이는 대부분 열성변이이고, 만일 파괴된 유전자와 유사한 기능을 지닌 다른 유전자가 게놈 내에 존재할 경우, 연관성을 띠는 다른 유전자의 존재에 의해 표현형이 나타나지 않는다. 또한, 파괴된 유전자가 중요한 유전자일 경우에는 식물의 치사(lethality)를 유발할 수 있는 단점이 있다.
이에 반해, 본 발명에서 사용한 액티베이션 태깅 방법은 T-DNA가 식물의 유전자의 염기서열을 파괴하지 않고, 그 유전자의 발현을 인위적으로 활성화(activation)시키므로, 기능이 중복된 유전자가 애기장대 게놈의 다른 위치에 존재하더라도 표현형을 유도할 수 있는 장점을 가진 방법이다(Weigel et al., Plant Physiology 122:1003-1014, 2000). 보다 구체적으로 말하면, 상기 엑티베이션 태깅 방법은 T-DNA와 경계를 이루고 있는 주변의 DNA를 쉽게 분리할 수 있도록 T-DNA 내에 선별 마커와 대장균에서 복제에 필요한 복제 기원(replication origin), 그리고 앰피실린 저항성 유전자를 가지고 있으며, 그 T-DNA 오른쪽 경계면내에 35S CaMV 인핸서(35S CaMV enhancer) 4개를 가지고 있는 엑티베이션 태깅 벡터를 사용한다. 따라서, T-DNA가 식물의 게놈 내로 도입되면, 삽입부위 주변의 유전자를 활성화시켜 변이체를 유도하게 된다(도 2 참조). 이 경우, 기능이 유사한 다른 유전자가 존재하더라도 인핸서에 의해 활성화된 유전자에 의해 표현형이 나타날 수 있다. 따라서, 엑티베이션 태깅 방법을 개화조절 유전자를 찾는데 적용할 경우, 기능을 상실한 돌연변이("loss of function" mutation) 접근 방법으로 찾을 수 없는 새로운 개화조절 유전자를 찾을 수 있는 가능성이 매우 크다. 뿐만 아니라, 엑티베이션 태깅 방법은 우성변이를 유발하여 돌연변이의 표현형이 한세대 일찍 관찰되는 장점을 지니고 있다. 따라서, 본 발명자들은 액티베이션 태깅 방법으로 생산된 애기장대 변이체들 중에서 개화가 지연된 변이체를 찾아 개화시기 조절에 관계되는 유전자를 탐색하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 애기장대를 대상으로 개화가 지연된 변이체를 제조하기 위해, 액티베이션 태깅 벡터 pSK1015를 이용하여 변이체를 생산한 다음, 성장한 개체들 중에서 육안으로 개화가 지연되는 변이체를 선발하고, 선별된 변이체를 'cog 변이체'라 명명하였다. 이후, 상기 cog 변이체의 개화지연 형질을 확인하기 위해, 꽃대가 형성되어 꽃대의 길이가 약 3cm 가량 되었을 때(bolting time)의 본잎의 수를 개화기의 지표로 하여 개화시기를 조사하였다. 그 결과, 개화지연 변이체 cog는 야생형에 비해 개화가 촉진되는 장일 조건에서 본잎의 수가 증가함을 볼 수 있었다(도 1 참조). 이는 영양 생장기(vegetative growth)가 길어지면서 개화가 지연되는 것을 보여주는 것이다.
본 발명의 다른 실시예에서는 플라스미드 레스큐 방법(plasmid rescue method)(Weigel et al., Plant Physiology 122:1003-1014, 2000)을 이용하여 상기의 cog 변이체에서 식물의 개화시기 조절에 관련된 유전자를 분리하였다. 이후, 상기 플라스미드 레스큐 방법으로 분리된 T-DNA 삽입 부위 주변의 DNA 조각의 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 애기장대 게놈 데이터 베이스(database)에서 탐색한 결과, 인핸서와 가장 근접하게 위치하고 있는 전사해독틀(open reading frame)을 찾아내었다. 분리된 유전자는 하나의 엑손(single exon)으로 되어있고, 175개의 아미노산을 암호화하는 540bp 크기의 유전자임을 확인하였으며, 상기 유전자를 'COG'라 명명하였다. 상기 COG 유전자의 염기서열은 서열번호 1에 기재되어 있다.
상기 결정된 COG 유전자의 염기서열로부터 유추되는 펩타이드 서열을 데이터 베이스(database)에서 탐색한 결과, 상기 COG 유전자로부터 발현되는 단백질은, 서열번호 2에 기재된 바와 같이, 175개의 아미노산으로 구성되며 분자량은 19kDa임을 확인하였다. 또한, 상기 COG 단백질의 서열을 컴퓨터 구조예측 프로그램(PSORT; http://psort.nibb.ac.jp/)을 이용하여 분석한 결과, DOF(DNA binding with one finger) 도메인으로 알려져 있는, 전사 인자(transcription factor)들이 공유하는 아미노산 서열이 보존되어 있음을 확인할 수 있었다(도 3 참조). DOF 도메인을 포함하는 유전자들은 식물에서만 특이하게 존재하는 유전자 군으로서 세포 내에서 광합성관련 유전자의 활성화, 종자 저장단백질 유전자의 활성화, 식물 암 유전자(plant oncogene), 식물 호르몬에 의해 유도되는 유전자의 활성화 및 스트레스 유도 유전자의 활성화 등 다양한 생리현상에 관여하는 전사 인자로서 알려져 있다(Yanagisawa, Trends in Plant Science. 1:213-214, 1996).
본 발명의 또다른 실시예에서는, cog 변이체에서 나타나는 개화지연 표현형이 COG 유전자의 활성화에 의한 것인지 확인하기 위해, 상기 COG 유전자를 탐침으로 하여 노던 블럿 분석을 수행하였다. 그 결과, 야생형에서는 상기 COG 유전자의 발현이 관찰되지 않았으나, cog 변이체에서는 과발현되고 있음이 관찰되었다(도 4 참조). 또한, 상기 COG 유전자를 다시 야생형 애기장대에 과발현하도록 재도입시켜 개화지연 표현형이 재현되는지 조사하였다. 이를 위해, 상기 COG 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 제작하였으며, 이를 'pGTE-COG'라 명명하였다. 상기 재조합 벡터 pGTE-COG로 형질전환된 대장균 균주를 한국 유전자은행에 2001년 8월 8일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 10033BP). 이후, 상기 pGTE-COG를 이용하여 애기장대 야생형을 형질전환시킨 후, 개화지연 양상을 조사하였다. 그 결과, cog 변이체에서 나타났던 개화지연 표현형이 그대로 재현됨을 확인할 수 있었다. 이로부터, cog 변이체의 개화지연 표현형이 COG 유전자의 활성화를 통해 나타났음을 알 수 있고, 또한, 상기 COG 유전자를 활성화시킴으로써 식물체에서 개화지연을 유도할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 COG 유전자로부터 발현되는 단백질의 서열 분석 결과, 그 서열 내에 전사 인자에게서 발견되는 서열이 존재함을 확인할 수 있었다. 이를 통해 상기 COG 유전자로부터 발현되는 COG 단백질이 핵 속에서 유전자 발현을 조절하는 전사 인자로 추정되었다. 따라서, 본 발명자들은 COG 단백질이 핵으로 이동하는지 확인하기 위하여, 상기 COG 유전자를 녹색 형광 단백질(Green Fluorescence Protein; GFP) 유전자와 결합시킨 후, 이를 입자 충격법(particle bombardment)을 이용하여 양파의 표피세포에 도입시켰다. 이후, GFP-COG 융합단백질이 발현되는 장소를 형광 현미경을 이용하여 조사한 결과, GFP의 발현은 핵에서만 감지되었다. 이러한 결과는 상기 컴퓨터 구조 예측 프로그램에 의해 유추된 결과와 일치하였으며, 나아가 본 발명의 COG 유전자가 암호화하는 단백질이 전사 인자일 가능성이 높음을 제시하는 것이다(도 5 참조).
또한, 본 발명자들은 세포 내에서 COG 유전자의 발현을 인위적으로 억제시켰을 경우, 야생형에서보다 조기 개화가 일어나는지를 확인하기 위해, 상기 COG 유전자가 역방향으로 삽입된 재조합벡터를 제작하였다. 이후, 상기 재조합벡터를 이용하여 애기장대 야생형을 형질전환시킨 후, 개화시기를 조사하였다. 그 결과, 애기장대 야생형에서보다 COG 유전자의 발현을 인위적으로 억제시킨 형질전환체에서 조기 개화가 일어나는 것을 확인하였다(도 6 참조). 이는 본 발명의 COG 유전자의 발현을 억제시킴으로써, 식물체에서 조기 개화를 유도할 수 있음을 보여주는 것이다.
한편, 본 발명의 COG 유전자 및 COG 단백질은 식물의 개화관련 형질의 개선 및 타 식물체의 개화 조절 유전자의 탐색 등에 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명의 유전자와 결합하는 물질, 상기 COG 유전자의 발현을 억제 또는 활성화하는 물질을 탐색함으로써 식물의 개화 관련을 탐색하는 용도로 사용될 수도 있다. 구체적으로 일반적으로 사용되는 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응(PCR), 노던 블럿 분석, 서던 블럿 분석, 효소 면역 반응(ELISA), 2-D 겔 분석 등을 포함하는 다양한 방법으로 분석을 수행할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 개화가 조절될 수 있는 식물로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류가 모두 이용될 수 있으며, 특히 본 발명의 방법을 상추나 시금치와 같이 개화시기 후 엽류의 급속한 노화가 일어나 상품가치가 급속히 떨어지는 엽채류 식물 등에 적용할 경우, 경제적으로 활용가치가 크다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 에에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
애기장대(
Arabidopsis thaliana
)로부터 개화지연 돌연변이체의 선발
먼저, 애기장대에서 돌연변이를 유도하기 위하여, 엑티베이션 태깅 벡터인 pSK1015(Weigel et al., Plant Physiology 122:1003-1014, 2000)(미국 Weigel 실험실에서 분양받음)를 공지의 전기천공법(electroporation)으로 아그로박테리움 튜메파시엔스 ABI 균주(Agrobacterium tumefacience ABI strain)(미국 Amasino 실험실에서 분양받음)에 도입시킨 후, 카나마이신(kanamycin)과 카베니실린(carbenicillin)이 포함된 배지에서 pSK1015 벡터가 도입된 아그로박테리움 균주를 선발하였다. 이후, 선발된 아그로박테리움 균주로 플로랄 딥 방법(floral dip method)(Clough et al., Plant J., 16(6):735-743, 1998)에 따라 애기장대 야생형인 콜롬비아(Columbia)를 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 애기장대로부터 종자를 받아 제초제 저항성을 보이는 형질전환체를 선별하였다. 그리고 나서, 약 23℃로 온도가 조절되는 온실에서 5000개의 상기 T1 라인을 성장시켰으며, 개화가 지연되는 변이체를 육안으로 관찰하였다. 이후, 야생형에 비해 개화시기가 느린 변이체 1개의 라인을 선발하였으며, 상기 개화지연 돌연변이체를 'cog 변이체'라 명명하였다.
<실시예 2>
애기장대 야생형과 개화지연 돌연변이체에서의 개화시기 조사
상기 실시예 1에서 선발된 cog 변이체의 개화시기를 애기장대 야생형과 비교하여 조사하였으며, 꽃대가 형성되어 꽃대의 길이가 약 3cm 가량 되었을 때의(bolting time) 본잎의 수를 개화기의 지표로 삼았다. 우선, 애기장대 야생형과 cog 변이체의 종자를 4℃에서 약 3~5일간 춘화처리하여 종자 내 배아의 세포 분열 주기(cell cycles)를 일정하게 맞춤으로써 모든 종자가 일정한 시기에 발아하도록 하였다. 이후, 상기 춘화처리한 종자를 화분에 일정한 간격으로 파종하고, 파종 후 약 7일간은 종자의 발아를 돕기 위해 화분에 랩을 씌워 다습한 상태를 유지하였다. 종자가 발아하면 화분을 16시간 낮/8시간 밤의 장일 조건 및 8시간 낮/16시간 밤의 단일 조건으로 옮겨 꽃대가 약 3cm정도 자랄 때까지 키운 후, 본잎의 수를 조사하였다. 그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 상기 cog 변이체는 야생형에 비해 개화가 촉진되는 장일 조건 하에서 본잎의 수가 증가함을 볼 수 있었고, 장일 조건 하에서 만추대성을 나타냄을 볼 수 있었다. 이러한 만추대성은 단일 조건에서도 장일 조건과 비슷한 정도의 개화를 보였다. 이는 cog 변이체가 야생형에 비해 영양생장기가 길어지면서 개화가 지연된다는 것을 보여주는 것이다.
<실시예 3>
COG
유전자의 클로닝 및 서열 분석
cog 변이체로부터 인핸서에 의해 활성화된 T-DNA 주변의 유전자를 탐색하기 위해, 플라스미드 레스큐 방법(Weigel et al., Plant Physiology 122:1003-1014, 2000)에 따라 유전자를 분리하였다. 도 2에 엑티베이션 태깅 벡터 pSKI015가 수명연장 변이체 cog 게놈 내로 삽입된 모식도를 도시하였다. 먼저, cog 변이체로부터 델라포타 등의 방법(Dellaporta et al., Plant Mol. Biol. Rep. 1:19-21, 1983)에 따라 전체 게놈을 분리하였다. 이후, 5㎍의 게놈 DNA를 EcoRⅠ제한효소로 절단하고 에탄올 침전(ethanol precipitation)을 시킨 후 건조하였다. 상기 절단된 DNA를 자가 연결(self-ligation)시킨 후, 이를 이용하여 DH5α를 형질전환시켰다. 그리고 나서, 앰피실린에 저항성을 지니는 콜로니를 선발하였다. 상기 선발된 콜로니로부터 공지의 방법으로 플라스미드를 분리한 후, 플라스미드 레스큐 방법에 사용하였던 EcoRⅠ 부위 하류(EcoRⅠ site downstream)에 있는 염기서열을 참조하여 제작한 올리고머(oligomer)를 이용하여 T-DNA 오른쪽 경계면 4.0 kb 떨어진 부위의 염기서열을 결정하고 분석하였다. 결정된 염기서열을 애기장대 게놈 데이터 베이스에서 탐색하여 인핸서에서 가장 가까운 전사해독틀을 찾아내었다. 상기 분리된 전사해독틀을 'COG 유전자'라 명명하였으며, 그 염기서열을 서열번호 1로 기재하였다. 상기 COG 유전자로부터 발현되는 단백질은 서열번호 2에 기재된 바와 같이, 175개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 분자량은 19kDa이었다. 컴퓨터 구조 예측 프로그램(PSORT; http://psort.nibb.ac.jp/)을 이용하여 상기 단백질의 서열을 분석한 결과, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열의 64~121 부분에 DOF 도메인이 존재함을 알 수 있었다. 도 3에 본 발명의 COG 유전자의 아미노산 서열에서 보존된 DOF 도메인 서열을 DOF 도메인을 포함하는 다른 종의 단백질들의 DOF 도메인 서열과 비교하여 도시하였다.
<실시예 4>
애기장대 야생형 및
cog
변이체에서
COG
유전자의 발현 조사
상기 실시예 3에서 분리된 COG 유전자가 실제로 cog 변이체내에서 애기장대 야생형보다 과발현되는지를 확인하기 위해, 상기 COG 유전자를 탐침으로 하여 노던 블럿 분석을 수행하였다. Tri-reagent(Sigma)를 이용하여 우 등의 방법(Woo H. R. et al., Plant Cell 13:1779-1790, 2001)에 따라 애기장대 야생형과 cog 변이체로부터 각각 RNA를 분리하였다. 각 레인(lane)별로 10 ㎍의 RNA를 1.2% 아가로스/ 포름알데하이드 겔에 로딩하여 분리하였고, 이후 나일론 막으로 옮겼다. 그리고 나서, 3X SSC로 5분간 세척하여 여분의 아가로즈를 제거한 후, RNA를 나일론 막에 고정시키기 위해 자외선(254nm, 0.18 J/Sq.cm2)을 조사하였다. 나일론 막으로 옮겨진 블럿은 박 등의 방법(Park et al., Plant Mol. Biol. 26:1725-1735, 1994)에 따라 전혼성화 및 혼성화 반응을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 야생형의 COG 유전자 발현은 거의 없는 반면 cog 변이체에서의 COG 유전자의 전사체 농도는 상당히 높은 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 5>
애기장대 야생형으로의
COG
유전자의 도입
cog 변이체에서 나타나는 개화지연 표현형이 상기 COG 유전자의 활성화에 의한 것인지 최종 확인하기 위해, 애기장대 야생형에서 상기 COG 유전자가 과발현하도록 재조합 벡터를 하기의 방법으로 제작하였다.
우선, COG 전체 유전자를 포함하는 부분을 PCR을 이용하여 분리하였다. 용이한 클로닝을 위해, 정방향 프라이머에는 NcoⅠ부위를, 역방향 프라이머에는 BstEⅡ 부위를 삽입하여 각 프라이머를 제작하였다. 이후, 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 사용하고, 애기장대 야생형의 게놈 DNA를 주형(template)으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분간 가열하여 변성시킨 다음, 94℃에서 0.5분, 그리고 55℃에서 0.5분의 조건으로 72℃에서 1분간 증폭시켜 35회 반복 수행한 후, 반응을 종결하였다. 상기 PCR 반응으로 얻은 0.54kb 크기의 DNA 조각을 아가로스 젤 전기영동으로 분리한 다음, GEM T easy vector(Promega, 미국)에 클로닝하였으며, 이를 'pGTE-COG'라 명명하였다. 상기 pGTE-COG 벡터를 이용하여 대장균 DH5α를 형질전환하였으며, 형질전환된 대장균을 한국 유전자 은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2001년 8월 8일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 10033BP).
이후, NcoⅠ과 BstEⅡ를 이용하여 상기 재조합 벡터로부터 본 발명의 COG 유전자를 분리하여 다시 식물형질전환용 벡터 pCAMBIA3301 벡터(MRC, 미국)에 삽입시켰으며, 이를 'pCOG-3301'이라 명명하였다. 이후, 상기 pCOG-3301을 이용하여 애기장대 야생형을 플로랄 딥 방법(Clough et al., Plant J., 16(6):735-743, 1998)에 따라 형질전환시켰다.
그리고 나서, 상기 형질전환된 애기장대로부터 종자를 받은 후, 제초제 저항성을 나타내는 형질전환체를 선별하였다. 이후, 상기 형질전환된 애기장대를 생장실에서 배양하며 개화지연 양상을 조사한 결과, cog 변이체에서 나타났던 개화지연 표현형이 그대로 재현됨을 확인할 수 있었다. 이로부터, cog 변이체의 개화지연 표현형이 COG 유전자의 활성화를 통해 나타났음을 알 수 있고, 또한, 상기 COG 유전자를 활성화시킴으로써 식물체에서 개화지연을 유도할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 6>
양파 표피세포에서 GFP-COG 융합 단백질의 발현 조사
상기 실시예 3에서 결정된 COG 유전자의 염기서열로부터 유추되는 폴리펩타이드 서열을 데이터베이스로 탐색한 결과, 폴리펩타이드 서열 내에 DOF 도메인 서열이 존재하고 있음을 확인할 수 있었다. 상기 DOF 도메인은 핵에서 다른 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자에서 발견되는 도메인이다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명의 COG 단백질이 핵으로 이동하는지 여부를 확인하였다.
먼저, COG 단백질 전체를 암호화하는 유전자를 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 PCR을 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 수행하였다. 상기 PCR로 증폭된 DNA를 GFP를 포함하는 326 GFP-3G 플라스미드(포항공대 황인환 교수님 실험실에서 분양받음)의 SmaⅠ과 HindⅢ 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 플라스미드를 제작하였으며, 이를 'pGFP-COG'라 명명하였다. 이후, 바라고나 등의 방법(Varagona et al., Plant Cell 4:1213-1227, 1992)에 따라 양파 표피세포에서 GFP-COG 융합단백질이 발현되는 장소를 조사하였다. 우선, 텅스텐 입자들을 DNA로 코팅시키기 위해, GFP-COG 융합 단백질 발현 플라스미드를 퀴아겐 컬럼(Qiagen column)으로 정제한 후, 2㎍의 플라스미드를 50㎕의 2.5M CaCl2와 20㎕의 0.1M 스퍼미딘(spermidine)을 포함하고 있는 용액(Sigma)에서 텅스텐 입자(tungsten particle)와 함께 침전시켰다. 상기 침전물을 70% 에탄올로 세척한 후, 100% 에탄올 36㎕로 재현탁(resuspension)시켰다. 양파의 안쪽 표피세포 껍질이 위로 오도록 1/2 B5 배지 위에 놓은 후, 상기 pGFP-COG DNA로 코팅된 M-25 텅스텐 입자(M-25 tungsten particle)(Bio-Rad; Sanford et al., Methods Enzymol. 217:483-509, 1993)를 입자 충격법으로 양파의 표피세포에 도입하였다. 이 때 입자충격법은 1350 p. s. i.(Biorad)를 이용하여 수행하였다. 이후, 상기 배지를 포함하는 페트리디쉬를 파라필름(parafilm)으로 봉한 뒤, 22℃ 인큐베이터(incubator)에서 18시간 동안 방치하였다. 18시간 경과 후, 형광현미경을 이용하여 GFP의 발현을 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, GFP-COG의 발현이 핵 속에서 나타남을 확인할 수 있었다. 이는 COG 단백질이 핵으로 이동되어 핵 속에서 기능을 수행한다는 것을 보여주는 것이다.
<실시예 7>
COG
유전자를 이용하여 애기장대 야생형의 조기 개화 유도
상기 실시예 5에서 COG 유전자가 과발현되는 형질전환체가 cog 변이체와 유사한 개화시기를 보인다는 것을 확인함으로써, 돌연변이체의 만추대성이 형질전환의 효과가 아니라 COG 유전자의 과발현때문에 일어나는 현상이라는 것을 증명하였다. 따라서, COG 유전자를 역방향으로 발현시켜 세포 내에서 COG 유전자의 발현을 인위적으로 억제시켰을 경우, 야생형에서보다 조기 개화가 일어나는지를 확인하기 위해, 상기 COG 유전자가 역방향으로 삽입된 재조합벡터를 제작하였다. 먼저, COG 유전자를 분리하기 위해, 상기 COG 유전자가 삽입된 재조합벡터 pGTE-COG 벡터를 NotI으로 자른 후, 이를 pNB96(포항공대. Planta, 2001, in press)의 NotI 부위에 삽입시켜 재조합 벡터를 만들었다. 그리고 나서, COG 유전자가 역방향으로 들어간 재조합 벡터를 선발하였으며, 이를 'pCOG/AS-NB96'이라 명명하였다. 상기 pCOG/AS-NB96을 이용하여 상기 실시예 5와 동일한 방법에 따라 애기장대 야생형을 형질전환시켰다. 이후, 상기 실시예 2와 동일한 장일 조건에서 상기 형질전환체의 개화시기를 조사하였다.
그 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 애기장대 야생형에서는 본잎이 13-14장 일 때 꽃대가 형성되었으나, COG 유전자의 발현을 인위적으로 억제시킨 형질전환체에서는 본잎이 9-10장 일 때 꽃대가 형성되는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 COG 유전자의 발현을 억제시킴으로써, 식물체에서 조기 개화를 유도할 수 있음을 보여주는 것이다.
이상 살펴본 바와 같이, cog 변이체의 개화지연 표현형이 본 발명에 따른 COG 유전자의 활성화를 통해 나타났음을 확인하였으며, 상기 COG 유전자를 식물체내로 도입하여 과발현시킴으로써 식물체의 개화지연을 유도할 수 있을 뿐 아니라, 반대로 COG 유전자의 발현을 억제시킴으로써 식물체에서 조기 개화를 유도할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 COG 유전자 및 상기 유전자로부터 발현되는 COG 단백질은 식물의 개화관련 형질의 개선 및 타 식물체의 개화 조절 유전자의 탐색 등에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 상기 식물의 개화 조절 유전자 COG를 이용하여 식물체를 형질전환시킴으로써, 식물의 조기 개화 및 왜성 현상을 유도하여 생육 기간을 단축하고 작물 생산량을 증대시킬 수 있다.
도 1은 애기장대 야생형과 개화지연 변이체 cog에서 장일 조건과 단일 조건에서의 개화시기를 나타낸 것으로서, 꽃대가 형성되어 꽃대의 길이가 약 3cm 가량 되었을 때(bolting time)의 본잎의 수를 개화기의 지표로 삼은 것이다.
도 2는 개화지연 변이체 cog의 게놈 내로 삽입된 액티베이션 태깅 벡터 pSKI015의 모식도이다.
E : 인핸서(enhancer)
BAR : 제초제 저항성 유전자
pBS : E. coli 복제 기원(replication origin)과 앰피실린 저항성 유전자를 가지고 있는 부위
도 3은 본 발명의 COG 단백질의 아미노산 서열에서 보존된 DOF 도메인 서열과 DOF 도메인을 포함하는 다른 종의 단백질들의 DOF 도메인 서열을 비교하여 나타낸 것이다.
1, 10:옥수수에서 발견된 단백질들의 DOF 도메인 서열
2, 4, 6~9, 12~18: 애기장대에서 발견된 단백질의 DOF 도메인 서열
3: 본 발명의 COG 단백질의 DOF 도메인 서열
5 : 오이에서 발견된 단백질의 DOF 도메인 서열
도 4는 애기장대 야생형과 개화지연 변이체 cog에서 COG 유전자의 발현을 노던 블럿 분석으로 조사한 결과이며, BGB는 대조구(internal control)이다.
도 5는 양파의 표피세포에서 GFP-COG 융합단백질의 핵으로의 이동을 보여주는 사진이다.
A : 양성 대조구인 35S-GFP의 광학현미경 하에서 관찰되는 사진
B : 35S-GFP-COG의 광학현미경 하에서 관찰되는 사진
C : 양성 대조구인 35S-GFP의 형광현미경 하에서 관찰되는 사진
D : 35S-GFP-COG의 형광현미경 하에서 관찰되는 사진
도 6은 본 발명의 COG 유전자를 과발현시키거나 발현억제시킨 형질전환체에서의 개화시기를 나타낸 것으로서, 꽃대가 형성되어 꽃대의 길이가 약 3cm 가량 되었을 때(bolting time)의 본잎의 수를 개화기의 지표로 삼은 것이다.
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flowering time in plants using the gene
<130> NPF2530
<160> 6
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 540
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 1
ttttaatggc gacccaagat tctcaaggga ttaaactctt tggcaaaacc ataacattca 60
acgccaacat cacacagacg ataaaaaaag aagagcagca acaacaacaa cagccagagc 120
tacaagcaac aacagccgtt agatcaccct catcggatct gacggctgag aagcgtccag 180
acaagatcat accatgtccg agatgcaaga gcatggagac taagttttgt tacttcaaca 240
actacaacgt taatcaacca agacacttct gcaaaggttg tcaacgttac tggaccgccg 300
gtggagctct ccggaatgtt cccgtcggtg ccggtcgtcg gaagtcaaaa cctcccggac 360
gtgtcggtgg gttcgctgag ttgcttggag ctgcgactgg agctgttgat caggtcgagc 420
tagatgcttt gctagtggaa gagtggagag ctgctacggc gtctcacggt ggtttccggc 480
atgattttcc ggtgaagagg ctccgttgtt acaccgatgg tcaatcttgt taattatttt 540
540
<210> 2
<211> 175
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 2
Met Ala Thr Gln Asp Ser Gln Gly Ile Lys Leu Phe Gly Lys Thr Ile
1 5 10 15
Thr Phe Asn Ala Asn Ile Thr Gln Thr Ile Lys Lys Glu Glu Gln Gln
20 25 30
Gln Gln Gln Gln Pro Glu Leu Gln Ala Thr Thr Ala Val Arg Ser Pro
35 40 45
Ser Ser Asp Leu Thr Ala Glu Lys Arg Pro Asp Lys Ile Ile Pro Cys
50 55 60
Pro Arg Cys Lys Ser Met Glu Thr Lys Phe Cys Tyr Phe Asn Asn Tyr
65 70 75 80
Asn Val Asn Gln Pro Arg His Phe Cys Lys Gly Cys Gln Arg Tyr Trp
85 90 95
Thr Ala Gly Gly Ala Leu Arg Asn Val Pro Val Gly Ala Gly Arg Arg
100 105 110
Lys Ser Lys Pro Pro Gly Arg Val Gly Gly Phe Ala Glu Leu Leu Gly
115 120 125
Ala Ala Thr Gly Ala Val Asp Gln Val Glu Leu Asp Ala Leu Leu Val
130 135 140
Glu Glu Trp Arg Ala Ala Thr Ala Ser His Gly Gly Phe Arg His Asp
145 150 155 160
Phe Pro Val Lys Arg Leu Arg Cys Tyr Thr Asp Gly Gln Ser Cys
165 170 175
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer for PCR of COG gene
<400> 3
atttccatgg cgacccaaga ttctcaaggg a 31
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' primer for PCR of COG gene
<400> 4
tcggggtgac cttaacaaga ttgaccatcg 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 5
tacccgggca atggcgaccc aagattctca 30
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' primer for PCR of COG gene
<400> 6
cgtagtcgac ttaacaagat tgaccatcgg tgta 34
Claims (15)
- 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 식물의 개화조절 단백질 COG.
- 제 1항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열의 64~121 부분에 DOF 도메인을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 식물의 개화조절 단백질 COG.
- 제 1항의 COG 단백질을 암호화하는 식물의 개화조절 유전자.
- 제 3항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 식물의 개화조절 유전자 COG.
- 제 3항의 식물의 개화조절 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
- 제 5항에 있어서, 제 4항의 COG 유전자가 정방향으로 삽입된 재조합 벡터 pGTE-COG.
- 제 6항의 재조합 벡터 pGTE-COG로 형질전환된 대장균(E. coli)(기탁번호: KCTC 10033BP).
- 제 5항에 있어서, 제 4항의 COG 유전자가 역방향으로 삽입된 재조합 벡터 pCOG/AS-NB96.
- 제 3항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시킴으로써 식물체의 개화시기를 조절하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 제 3항의 유전자가 정방향으로 삽입된 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시킴으로써 식물체의 개화시기를 지연시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 제 3항의 유전자가 역방향으로 삽입된 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시킴으로써 식물체의 조기 개화를 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항의 COG 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 이용하여 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응(PCR), 노던 블럿 분석, 서던 블럿 분석, 효소 면역 반응(ELISA) 및 2-D 겔 분석으로 이루어진 군에서 선택되는 하나를 수행함으로써 식물의 개화 조절 단백질 또는 유전자를 탐색하는 방법.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 애기장대로부터 분리된 것을 특징으로 하는 식물의 개화조절 단백질 COG.
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