KR100475359B1

KR100475359B1 - 식물의 잎 수명 조절 유전자를 이용하여 식물의 노화를지연시키는 방법

Info

Publication number: KR100475359B1
Application number: KR10-2002-0053997A
Authority: KR
Inventors: 임평옥; 남홍길; 조성환
Original assignee: 제노마인(주); 학교법인 포항공과대학교
Priority date: 2002-09-07
Filing date: 2002-09-07
Publication date: 2005-03-10
Also published as: KR20040022472A

Abstract

본 발명은 식물의 잎 수명을 조절하는 유전자를 이용하여 식물의 노화를 지연시키는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 애기장대로부터 분리된, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 ORE8 유전자를 이용하여 식물체를 형질전환시킴으로써 식물의 노화를 지연시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법에 따라 ORE8 유전자를 이용하여 식물체를 형질전환시킴으로써 산화적 스트레스나 고농도의 염에 대한 식물의 저항성이 증진되고, 식물의 노화가 지연되어 식물의 생산성 향상 및 저장 효율 증대 등이 도모될 수 있다.

Description

식물의 잎 수명 조절 유전자를 이용하여 식물의 노화를 지연시키는 방법{Method for delaying senescence of plants using the gene regulating leaf longevity in plants}

본 발명은 식물의 잎 수명을 조절하는 유전자를 이용하여 식물의 노화를 지연시키는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 애기장대로부터 분리된, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 ORE8 유전자를 이용하여 식물체를 형질전환시킴으로써 식물의 노화를 지연시키는 방법에 관한 것이다.

식물의 노화는 식물발생의 마지막 단계로서 노화의 개시는 식물 발달 단계에 있어 급격한 전환점이라 할 수 있다. 노화가 진행됨에 따라 식물은 점차적으로 합성능력이 저하되고 세포 내 구조물과 거대분자들이 순차적으로 분해되면서 세포의 항상성을 잃게 되고, 결국 죽음에 이르게 된다(Matile P. et al., Elservier, 413-440, 1992; Nooden L.D. et al., Senescence and aging in Plant, Academic press, 1988; Thiman K.V. et al., CRC press, 85-115, 1980; Thomas H. et al., Annu. Rev. Plant Physiol., 123: 193-219, 1993). 이러한 식물의 노화는 일련의 연속된 생화학적 및 생리학적 현상으로서, 유전적으로 계획되어 있어 세포, 조직 및 기관의 수준에서 매우 정교하고, 능동적으로 진행된다. 식물의 노화는 세포가 퇴화하는 과정인 동시에 겨울철에 성장기관의 양분을 생식기관으로 이동시키는데 필요한 과정이며, 이는 식물의 진화과정 동안 환경에 적응하기 위해 능동적으로 획득한 유전형질이라고 생각되고 있다.

식물의 노화는 생물학적 중요성 뿐 아니라 작물의 생산성이나 수확 후 저장 효율에 있어서의 개량 가능성 때문에 산업적으로 중요성이 높다. 이에 따라 식물의 노화 현상을 밝히기 위한 유전학적, 분자 생물학적, 생리학적 및 생화학적 연구가 활발히 진행되고 있으나, 주로 식물 호르몬에 관련된 연구보고들이 주류를 이루고 있다. 식물 생장 호르몬인 싸이토키닌(cytokinin)은 생리학적으로 노화를 지연시킬 수 있는 호르몬으로 알려져 있어, 싸이토키닌의 합성을 조절하여 노화를 지연시키려는 연구가 진행되어 왔으나, 호르몬의 영향으로 식물의 다른 생리작용에 영향을 미치는 문제가 있었다. 그러나, 최근에 노화 특이적인 SAG12 유전자의 프로모터에 IPT 유전자를 연결하여 특정 노화 단계에서 특이적으로 싸이토키닌의 합성을 조절함으로써 노화의 진행을 지연시키는데 성공하였다. 이 방법으로 노화를 지연시킨 담배의 경우, 개화시기나 다른 기형을 유도하지 않으면서 50% 이상의 생산성 증가를 이룰 수 있었다(Gan S. et al., Science, 22: 1986-1988, 1995). 또한, 현재까지 노화 지연 식물체의 개발은 주로 토마토의 과일 숙성을 대상으로 하여 노화 촉진에 중요한 역할을 하는 식물 호르몬인 에틸렌(ethylene)의 합성을 억제하거나, 세포 내 에틸렌의 양을 줄이는 방법이 시도되어 왔다(Klee et al., Plant Cell, 3(11): 1187-1193, 1991; Picton et al., Plant Physiol., 103(4): 1471-1472, 1993).

그 외 노화를 지연시키고자 하는 연구는 주로 노화 과정에서 일어나는 생화학적 변화와 관련된 활성을 갖거나 또는 신호전달 체계에 관여하는 분해 관련 유전자의 조작에 있었다. 그 대표적인 예로는 안티센스 DNA(antisense DNA)를 이용하여 세포벽 분해와 관련된 폴리갈락투로나제(polygalacturonase) 유전자의 발현을 저해시킴으로써 토마토의 연화를 방지하여 운송성과 저장성을 증대시킨 플레브 세이브(Flavr savr)라고 하는, 상업화된 토마토가 있다(Giovannoni et al., Plant Cell, 1(1): 53-63, 1989). 또한, 지질 분해에 관련되는 인지질 분해효소 D(phospholipase D)를 안티센스로 하여 발현을 저해시킬 경우, 식물 호르몬에 의한 노화가 지연된다는 연구결과가 보고된 바 있으며(Fan et al., Plant Cell, 9(12): 2183-2196, 1997), 최근에는 SAG12 프로모터와 옥수수의 호메오박스(homeobox) 유전자인 kn1(knotted 1)이 발현되는 담배에서 잎의 노화가 지연된다는 연구결과가 보고되었다(Ori et al., Plant Cell, 11: 917-927, 1999).

한편, 빛의 광수용체 중 피토크롬(phytochrome)이 식물 노화에 영향을 줄 수 있다고 보고된 바 있다. 예컨대, 귀리의 PhyA 유전자를 과발현시킨 형질전환 담배가 엽록소 감소의 지연 및 총 세포 내 단백질 양의 감소의 지연 등의 노화 지연 표현형을 보임이 관찰되었다(Cherry et al.,Plant Physiology, 96: 775-785, 1991). 또한, 애기장대의 PhyB 유전자를 과발현시킨 감자의 잎에서 수명이 연장됨이 관찰되었으며, 이 경우 형질전환 감자의 잎에서 엽록소 감소의 시작 시기는 정상 감자와 같았으나 엽록소의 완전 분해 시기는 3~4주 정도 더 길어진 것으로 관찰되었다(Thiele et al., Plant physiology, 120: 73-81, 1999).

그러나, 식물의 노화를 보다 직접적으로 조절할 수 있는 방법은 노화 관련 유전자의 돌연변이를 분리하여 돌연변이를 일으키는 유전자를 분석하는 것이다. 기존의 보고에 의하면 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 과일 숙성기 또는 꽃의 노화과정에서 에틸렌 수용체의 발현이 조절되고(Payton S. et al., Plant Mol., Biol. 31(6): 1227-1231, 1996), 잎의 노화과정에서 clp 유전자의 발현이 조절된다고 알려져 있다. 최근에는 잎 노화 과정에 관련된 유전자(Oh S.A. et. al., Plant Mol. Biol. 30(4): 739-754, 1996) 및 잎 노화 지연 표현형을 나타내는 애기장대 변이체들이 분리되어 보고된 바 있고(Oh S.A. et al., The Plant Journal, 12(3): 527-535, 1997), 이들 잎 노화 지연 변이체중 ore9의 경우 변이 유전자를 분리하는데 성공하였다(Woo H.R. et al., Plant Cell, 13: 1779-1790, 2001). 또한 노화관련 유전자인 sen1의 프로모터의 활성(Oh S.A. et al., Journal of Plant Physiology, 151: 339-345, 1997) 등이 보고된 바 있으나, 아직까지 식물의 노화를 조절하는 유전자 및 그의 기능, 그리고 상기 유전자를 이용한 식물의 수명 조절 방법에 관한 연구는 미흡한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 식물의 수명 조절에 관여하는 신규 유전자 및 이를 이용한 식물의 수명 조절 방법에 대해 계속 연구하던 중, 식물의 생식 기관 발달에 관여한다고 알려진 스테릴 아페탈라(Sterile apetala) 유전자(Marina V. Byzova et al., Genes Dev., 13(8): 1002-1014, 1999)가 식물의 잎 수명 조절에 관여하는 새로운 기능을 갖는다는 것과 상기 유전자를 이용하여 식물체를 형질전환시킴으로써 식물의 노화를 지연시킬 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 식물의 잎의 수명을 조절하는 유전자를 이용하여 식물의 수명을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 이용하여 식물체를 형질전환시킴으로써 식물의 노화를 지연시키는 방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명은 애기장대로부터 분리된, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 ORE8 유전자를 이용하여 식물체를 형질전환시킴으로써 식물의 노화를 지연시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서 "수명연장 변이체 ore8" 또는 "ore8 변이체"란, 엑티베이션 태깅 방법(activation tagging method)에 의해 ORE8 유전자가 활성화되어 노화 지연 표현형을 나타내는 돌연변이체를 의미하는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 식물체에서 수명 조절에 관여하는 유전자를 탐색하기 위하여, 수명이 연장된 형질을 나타내는 돌연변이체를 선별하였다. 이를 위해 식물의 유전학 및 분자생물학적 연구를 위한 재료로 많이 사용되는 애기장대를 실험 식물로 하였다. 현재까지 유전자의 기능을 밝히기 위해 일반적으로 사용되는 돌연변이 유도 방법에는 크게 세 가지 방법이 있다. 첫 번째는 화학적 방법으로 EMS(ethyl-methyl sulfonic acid) 등의 화학물질을 처리하는 방법이다. 두 번째는 X-선 또는 γ-선을 조사하여 돌연변이를 유도하는 것이고, 세 번째는 토양세균인 아그로박테리움(Agrobacterium)의 T-DNA를 이용하여 형질전환함으로써 돌연변이를 유도하는 방법이다. 상기 화학물질 처리, X-선 또는 γ-선 조사, 또는 T-DNA 삽입(insertion)에 의해 돌연변이를 유도하는 방법은 원래의 유전자의 일부 혹은 전부가 파괴되면서 유전자가 가지고 있는 고유의 기능이 상실되게 되므로, 이를 이용하여 그 유전자의 기능을 유추할 수 있다. 그러나, 이러한 방법에 의해 형성된 돌연변이는 대부분 열성변이이고 만일 파괴된 유전자와 유사한 기능을 지닌 다른 유전자가 게놈 내에 존재할 경우 표현형이 나타나지 않는다. 또한 생존에 필요한 중요한 유전자일 경우 식물의 치사(lethality)를 유발할 수 있는 단점이 있다.

이에 반해, 본 발명에서 사용한 액티베이션 태깅 방법은 T-DNA가 식물의 유전자의 염기서열을 파괴하지 않고 그 유전자의 발현을 인위적으로 활성화(activation)시키므로, 기능이 중복된 유전자가 애기장대 게놈의 다른 위치에 또 존재해도 표현형을 유도할 수 있는 장점을 가진 방법이다(Weigel et al., Plant Physiology, 122: 1003-1014, 2000). 구체적으로, 상기 엑티베이션 태깅 방법은 T-DNA와 경계를 이루고 있는 주변의 DNA를 쉽게 분리할 수 있도록 T-DNA 내에 선별 마커와 대장균에서 복제에 필요한 복제 기원(replication origin), 그리고 앰피실린 저항성 유전자를 가지고 있고, 그 T-DNA 오른쪽 경계면 내에 35S CaMV 인핸서(35S CaMV enhancer) 4개를 가지고 있는 엑티베이션 태깅 벡터를 사용한다. 따라서, T-DNA가 식물의 게놈 내로 도입되면, 삽입부위 주변의 유전자를 활성화시켜 변이체를 유도하게 된다(도 4 참조). 이 경우, 기능이 유사한 다른 유전자가 게놈 내에 존재해도 인핸서에 의해 활성화된 유전자에 의해 표현형이 나타날 수 있다. 따라서, 엑티베이션 태깅 방법을 노화조절 유전자를 찾는데 적용할 경우, 기능을 상실한 돌연변이("loss of function" mutation) 접근 방법으로 찾을 수 없는 새로운 노화 조절 유전자를 찾을 수 있는 가능성이 매우 크다. 뿐만 아니라, 엑티베이션 태깅 방법은 우성변이를 유발하여 돌연변이의 표현형이 한세대 일찍 관찰되는 장점을 지니고 있다. 따라서, 본 발명자들은 액티베이션 태깅 방법으로 생산된 애기장대 변이체들 중에서 잎의 수명이 연장되어 있는 변이체를 찾고, 이로부터 수명연장에 관계되는 유전자를 탐색하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 애기장대를 대상으로 잎 수명이 연장된 변이체를 선별하기 위해, 액티베이션 태깅 벡터 pSKI015를 이용하여 변이체를 생산한 후, 성장한 개체들 중에서 육안으로 잎의 황화 속도가 느린 개체를 선발하였다. 선발된 돌연변이체는 'ore8'이라 명명되었다. ore8 변이체는 야생형에 비해 잎이 더 진한 초록색을 나타내었다. 이후, ore8의 수명연장 형질을 확인하기 위해, 광합성 활성 및 엽록소 함유량의 변화를 조사하였다. 그 결과, 야생형의 경우 발아 후 40일(40 DAG; Days After Germination)이 지나면 광합성 활성 및 엽록소의 함량이 완전히 사라졌으나, 수명연장 변이체 ore8 에서는 이 시기에 약 90%의 광합성 활성과 50% 정도의 엽록소 함량을 나타내었다(도 1의 B 및 C 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 ore8 변이체의 잎 수명연장이 생리적 수준에서뿐만 아니라 분자 수준에서도 작용하는 것인지 확인하기 위해, 각종 노화관련 유전자들의 발현양상을 노던 블럿 분석(Northern blot analysis)을 통해 조사하였다. 그 결과, 노화단계에서 발현이 증가되는 유전자로 알려진 두 유전자, SEN4와 SAG12 유전자의 발현이 야생형에서는 노화진행에 따라 급격히 증가된 반면, ore8 변이체에서는 상기 노화관련 유전자들의 발현이 야생형에 비해 늦게 발현되는 것으로 나타났다. 이와 반대로 광합성과 같은 동화 작용에서 증가되는 엽록소 a/b 결합 단백질(chlorophyll a/b binding protein) 유전자 Cab의 발현은 노화진행에 비례하여 야생형에서 감소하는 반면, ore8 변이체에서는 계속 유지되었다(도 1의 D 참조).

동물의 경우 세포의 연령(age)이 높아짐에 따라 활성산소 등의 축적이 노화를 유도하는 직접적인 요인이 될 수 있다는 많은 보고들이 있다(Ashok et al., Exp. Gerontol., 34: 293-303, 1999; Rustin et al., Mech. Aging Dev., 114: 201-206, 2000). 환경 스트레스 관련 유전자들, 특히 산화적 스트레스(oxidative stress)에 관련된 유전자들의 노화과정 중의 발현양상을 고찰해 볼 때, 환경 스트레스는 노화에 직접 혹은 간접적으로 영향을 미치고 있음을 알 수 있다. 엘레강스(C. elegans)나 초파리(Drosophila)에서 수명이 연장된 돌연변이 종의 경우, 산화적 스트레스, 열, 자외선 등에 저항성을 보인다는 보고들이 있다(Fabrizio et al., Science, 292: 288-290, 2001; Lin et al., Science, 282: 943-946, 1998; Derry et al., Science 294: 591-595, 2001). 또한, 식물에서도 연령 의존적으로 산화적 스트레스의 정도가 높아지고 이것이 노화를 유도하는 하나의 요소가 될 수 있다는 보고가 최근에 밝혀졌다(Munne-Bosch et al., Planta, 210: 925-931, 2002). 따라서, ore8 변이체에서 산화적 스트레스 및 염(salt) 스트레스에 대한 반응을 조사해 보았다. 산화적 스트레스에 대한 노화 측정은 과산화수소를 처리한 후 잎의 황화정도와 광합성 활성을 측정함으로써 수행하였다. 그 결과, 야생형에서는 잎이 급속히 노화되고, 광합성 활성이 크게 감소하였으나, ore8 변이체에서는 잎의 황화정도가 야생형에 비해 적었고, 또한 광합성 활성의 감소 정도가 매우 미미하였다(도 2 참조). 뿐만 아니라 ore8 변이체에서는 고염처리를 하였을때도 야생형에 비해 저항성이 있음을 보였다(도 3 참조). 이는 ore8 변이체가 염- 및 산화적 스트레스에 대한 내성을 가지며, 또한 이를 통해 노화 지연 표현형을 나타내는 것으로 생각된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 ore8 변이체에서 식물의 수명연장에 관련된 유전자를 분리하기 위해, TAIL-PCR 방법(Liu et al., Plant J., 457-463, 1995)을 이용하여 T-DNA와 경계를 이루고 있는 DNA 조각을 분리하였고, 분리된 PCR 산물에 대해 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 애기장대 게놈 데이터 베이스(database)에서 탐색한 결과, 인핸서와 가장 근접하게 위치하고 있는 전사해독틀(open reading frame)을 찾아내었다. 분리된 유전자는 두 개의 엑손(exon)으로 되어 있었고, 446개의 아미노산을 암호화하는 1341개의 핵산으로 이루어진 유전자임을 확인하였다. 상기 유전자를 'ORE8'로 명명하였으며, 그 염기서열은 서열번호 1로 기재하였다. 본 발명에 따른 ORE8 유전자의 염기서열로부터 유추되는 펩타이드 서열을 데이터 베이스에서 탐색한 결과, ORE8 유전자로부터 발현되는 단백질은, 서열번호 2에 기재된 바와 같이, 세린-, 글리신- 풍부 모티프(serine and glycine-rich motif)를 포함하고 있음을 확인하였다. 상기 세린-, 글리신- 풍부 모티프는 동물과 식물의 전사조절자에서 많이 발견되는 것으로서, 이는 ORE8 유전자가 노화 관련 전사 조절자(transcription regulator)로서 작용할 수 있는 가능성을 시사하는 것이다.

또한, 본 발명의 ORE8 유전자의 염기서열을 진뱅크(GenBank) 데이터 베이스에서 탐색한 결과, 애기장대의 '스테릴 아페탈라(Sterile apetala)' 단백질을 암호화하는 유전자, 즉 At5g35770(등록번호: NM_122968) 및 SAP(등록번호: AJ223125)의 전체 염기서열과 각각 100% 및 99%의 상동성을 나타냄을 확인할 수 있었다(결과 미도시). 마리나 등의 문헌(Marina B. Byzova et al., Gene Dev., 13(8): 1002-1014, 1999)에 따르면, SAP 유전자의 기능이 상실된 sap 돌연변이체에서 생식기관의 발달이 저해되는 표현형이 나타났으며, 또한 SAP 유전자는 화서(infloresecene), 꽃(flower) 및 배주(ovule)의 발달을 조절하는 다기능 유전자인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이 유전자의 잎의 노화 관련 또는 잎 수명 조절 기능에 대해서는 현재까지 규명된 바 없다. 본 발명은 스테릴 아페탈라 단백질 및 이를 암호화하는 유전자의 새로운 기능, 즉 염- 또는 산화적 스트레스에 대한 저항 기작 및 이를 통한 식물의 수명 조절에 관여하는 기능에 대하여 최초로 규명한 것이다.

본 발명자들은 ORE8 유전자의 과다발현에 의해 ore8 변이체가 유도된 것인지 확인하기 위해, RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 야생형에서는 이 ORE8 유전자가 매우 약하게 발현되었으나, ore8 변이체에서는 과발현되었음을 확인할 수 있었다(도 5 참조).

또한, 본 발명자들은 ORE8 유전자를 야생형 애기장대에 재도입시켜 형질전환된 애기장대에서 노화 지연 표현형이 재현되는지 조사하였다. 이를 위해 ORE8 유전자를 PCR로 증폭하여 pGEMT 벡터로 삽입하였다. ORE8 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 'pGEMT-ORE8'로 명명하였으며, 상기 벡터로 형질전환된 대장균을 2002년 7월 29일자로 한국생명공학연구원 유전자센터 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하였다(기탁번호:KCTC 10317BP). 이후, pGEMT-ORE8 벡터에서 ORE8 유전자를 분리하여 이원벡터(binary vector)인 pCAMBIA 3301에 삽입하였다. ORE8 유전자가 삽입된 재조합 pCAMBIA3301 벡터를 아그로박테리움 튜메파시엔스 AGL1 균주(Agobacterium tumefacience AGL1 strain)에 도입시켰다. 이후, 형질전환된 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하여 플로랄 딥 방법(floral dip method)(Clough et al., Plant J., 16(6): 735-743, 1998)을 이용하여 애기장대 야생형 콜롬비아(Columbia)를 형질전환시켰다. 이와 같이 ORE8 유전자가 도입된 형질전환 애기장대에서 노화 지연 표현형을 조사한 결과, ore8 변이체에서 나타난 노화 지연 표현형이 재현됨을 확인하였다. 이로부터 상기 ORE8 유전자가 애기장대 노화 억제에 관련된, 잎 수명 조절 유전자임을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 ORE8 유전자는 노화 개시를 조절하는 전사 인자(transcription factor)를 억제하는 전사 억제자(transcription repressor)로 작용할 수도 있고, 또는 직접적으로 노화 개시 및 진행을 억제하는 음성 조절자(negative regulator)로서 작용할 수도 있다. 다른 가능성으로는, 본 발명의 ORE8 유전자가 노화억제 호르몬인 싸이토키닌(cytokinin)과 같은 호르몬을 증가시켜 간접적으로 노화를 억제하는 기능을 보일 수도 있다. 또한, ore8 변이체에서 염- 및 산화적 스트레스에 대해 강한 저항성을 나타냄을 볼 때, ORE8 유전자가 염- 및 산화적 스트레스에 대한 저항 기작에 관여하여 식물의 노화를 지연시키는 것으로 생각된다.

본 발명에 따른 식물의 노화 지연 방법은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자, 구체적으로는 애기장대로부터 분리된, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 ORE8 유전자를 이용하여 식물체를 형질전화시킨다는 점에 특징이 있다. 식물체로의 ORE8 유전자 도입은 공지의 식물체 형질전환방법을 이용할 수 있는데, 예를 들어 상기 ORE8 유전자를 도입한 식물 형질전환용 이원벡터를 이용하여 아그로박테리움(Agrobacterium)에 의해 매개되는 형질전환법을 이용할 수 있다. T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake) 등을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 식물의 노화 지연 방법에 적용될 수 있는 식물로는 상치, 배추, 감자, 무를 포함하는 대부분의 쌍자엽 식물(dicotyledonous plant) 또는 벼, 보리, 바나나 등의 단자엽 식물(monocotyledonous plant)이 모두 이용될 수 있다. 구체적으로, 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류가 모두 이용될 수 있다. 특히, 토마토와 같이 과피가 얇아 노화에 따른 품질 저하가 급격히 나타나는 식용 채소 또는 과일, 그리고 잎이 주된 상품으로 거래되는 식물 등에 본 발명에 따른 식물의 노화 지연 방법을 적용할 경우, 저장 효율을 높이는데 효과적이다.

나아가, 본 발명에 따른 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이를 암호화하는 유전자는 식물의 노화 관련 유전자나 노화 억제 물질의 탐색 또는 노화와 환경 스트레스간의 연계성 연구 등에 유용하게 이용될 수 있다. 이 외 ORE8 유전자와 결합하는 물질이나 ORE8 유전자의 발현을 억제 또는 활성화하는 물질을 탐색함으로써 노화 관련 물질을 탐색하는 용도로 사용될 수도 있다. 구체적으로 일반적으로 사용되는 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응(PCR), 노던 블럿 분석, 서던 블럿 분석, 웨스턴 블럿 분석, 효소 면역 반응(ELISA), 2-D 겔 분석, 효모 이중 혼성화 반응(yeast two hybrid system), 시험관 내 결합 어세이(in vitro binding assay) 등을 포함하는 다양한 방법으로 탐색을 수행할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

애기장대( Arabidopsis thaliana )로부터 수명연장 돌연변이체의 선발

먼저, 애기장대로부터 돌연변이를 유도하기 위하여, 엑티베이션 태깅 벡터인 pSKI015(Weigel et al., Plant Physiology, 122: 1003-1014, 2000)(미국 Weigel 실험실에서 분양받음)를 전기천공법(eletroporation)을 이용하여 아그로박테리움 튜메파시엔스 ABI 균주(Agrobacterium tumefacience ABI strain)(미국 Amasino 실험실에서 분양받음)에 도입시킨 후, 카나마이신(kanamycin)과 카베니실린(carbenicillin)이 포함된 배지에서 pSKI015 벡터가 삽입된 상기 아그로박테리움 균주를 선발하였다. 이후, 선발된 아그로박테리움 균주를 이용하여 플로랄 딥 방법(Clough et al., Plant J., 16(6): 735-743, 1998)에 따라 애기장대 야생형 콜롬비아(columbia)를 형질전환시켰다. 형질전환 애기장대로부터 종자를 받아 제초제에 저항성이 있는 형질전환체를 선별하였다. 그리고 나서, 약 23℃로 온도가 조절되는 온실에서 5000개의 T1 라인을 성장시켰으며, 연령 의존적인 식물노화에 따른 엽록소의 감소로 인해 잎이 황화되는 정도를 육안으로 관찰하였다. 이후, 야생형에 비해 잎의 황화 속도가 느린 변이체 1개의 라인을 선발하였으며, 상기 변이체를 'ore8'이라 명명하였다. 도 1의 A에 야생형 애기장대 및 수명연장 변이체 ore8에서 시간에 따른 잎의 노화를 보여주는 양상을 도시하였다.

<실시예 2>

수명연장 변이체 ore8 의 형질 발현 조사

ore8 변이체의 수명연장 형질을 확인하기 위하여, T2 세대에서 20 DAG 이후부터 3번 좌엽(rosette leaf)을 매 5일마다 육안관찰, 잎 엽록소 함량, 광합성 활성을 측정하여 야생형 애기장대와 비교하였다. 이 때 사용한 시료 집단은 각 개체로부터 획득한 25개의 독립된 잎이다.

2-1) 광합성 활성 측정

오 등의 방법(Oh et al., Plant Mol. Biol., 30: 939, 1996)을 이용하여 광합성 활성을 측정하였다. 우선 각 DAG의 잎을 15분간 암 처리한 후, 식물 효율 분석기(plant efficiency analyzer, Hansatech)를 이용하여 엽록소의 형광을 측정하였다. 광합성 활성은 엽록소의 형광도 특성을 이용한 PSⅡ(photosystemⅡ)의 광화학적 효율(photochemical efficiency)로 나타내었으며, 광화학적 효율은 형광도 최대치(maximum value of fluorescence; Fm)에 대한 최대 변형 형광도(maximum variable fluorescence; Fv)의 비율(Fv/Fm)로 계산하였다. 상기 Fv/Fm 비율이 높을수록 광합성 활성이 우수함을 나타낸다. 그 결과, 도 1의 B에 도시된 바와 같이, 야생형은 25 DAG 이후 급격히 감소하기 시작해 40 DAG 이후에는 활성이 대부분 사라졌으나, ore8 변이체의 경우 30 DAG 이후에 활성이 감소하기 시작했고 노화 진행정도도 매우 느려 45 DAG에도 60% 이상의 광합성 활성이 유지됨을 확인할 수 있었다.

2-2) 엽록소 함량 측정

엽록소의 함량 측정을 위해 각 시료 잎을 80℃, 95% 에탄올로 끓여 엽록소를 추출하였다. 엽록소 함량은 648nm와 664nm의 흡광도로 측정하였으며, 잎의 중량 (fresh weight)에 대한 엽록소 농도로 표시하였다(Vermon et al., Anal. Chem., 32: 1142-1150, 1960). 그 결과, 도 1의 C에 도시된 바와 같이, 야생형의 경우, 엽록소 함량이 25 DAG 이후부터 급격한 감소를 보이다가 40 DAG에는 0%가 되었으나, ore8의 경우, 40 DAG에도 초기의 50% 정도의 엽록소 함량을 유지함을 확인할 수 있었다.

상기 결과들로부터, ore8 변이체는 일반 야생형에 비해 잎의 수명이 훨씬 긴 표현형을 갖는 것으로 나타났으며, 이러한 수명연장의 효과는 엽록소 함량 및 광합성 활성의 감소로 표현되는 노화에 따른 생화학적 변화가 야생형에 비해 늦게 나타나는 것으로부터 확인할 수 있다.

<실시예 3>

ore8 변이체에서 노화 관련 유전자의 발현 조사

야생형과 ore8 변이체에서 노화 관련 유전자(senescence associated gene; SAG)들의 발현을 비교하기 위해, 잎 발생(development)과정 동안 시간 경과에 따른 각 SAG 유전자들의 발현양상을 노던 블럿 분석을 통해 확인하였다. 트리-시약(Tri-reagent, Sigma)을 이용하여 26, 30, 34 및 38 DAG의 각 잎에서 추출한 전체 RNA를 시료로 사용하여 분석을 수행하였다(Woo H.R. et al., Plant Cell, 13: 1779-1790, 2001). 각 레인 별로 10 ㎍의 RNA를 로딩하였으며, 탐침(probe)으로는 SAG12 유전자(진뱅크 등록번호: AF370131), SEN4 유전자(진뱅크 등록번호: AF035384) 및 Cab 유전자(진뱅크 등록번호: X56062)를 이용하였다.

그 결과, 도 1의 D에 도시된 바와 같이, 야생형의 경우, 엽록소 a/b 결합 단백질(chlorophyll a/b binding protein; Cab)과 같은 광합성에 관련된 유전자의 발현은 시간이 지날수록 노화진행에 비례하여 점차 감소하였다. 그러나, ore8 변이체에서는 Cab 유전자의 발현 감소 정도가 야생형에 비해 훨씬 적었다. 한편, SAG12 및 SEN4와 같은 노화 관련 유전자들의 발현도는 야생형에서 시간이 지날수록 증가하는데 반해, ore8 변이체에서는 동일한 시간에 발현이 아주 미미하게 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 사실은 ore8 변이체가 생리적 현상뿐만 아니라 분자 수준에서도 노화의 시작 및 진행을 억제하여 잎의 수명을 연장시킨다는 것을 의미한다. 또한, 본 실험의 결과는 광합성과 같은 동화 활성(anabolic activity) 및 자가 유지 유전자 활성(self-maintenance gene activity)이 잎 성장시 증가하다가 노화 단계에서는 감소하는 것으로 보고된 연구결과와도 일치하는 것이다(H.G. Nam, Curr. Opin. Biotech., 8: 200, 1997).

<실시예 4>

환경 스트레스에 대한 ore8 변이체의 저항성 조사

4-1) 산화적 스트레스에 대한 ore8 변이체의 저항성 조사

수명연장 돌연변이체 ore8에서 산화적 스트레스에 대한 저항성을 광합성 활성 변화 측정을 통해 조사하였다. 먼저, 산화적 스트레스를 주기 위해 20 DAG에 있는 야생형 애기장대 및 ore8 변이체로부터 24개의 독립된 3번 좌엽을 20mM H₂O₂이 포함된 3mM 2-[N-모폴리노]-에탄술폰산완충액(2-[N-morpholino]-ethanesulfonic acid, pH 5.8; 이하 'MES 완충용액'이라 한다) 2㎖에 부유시켰다. 이 때 음성 대조구로는 H₂O₂가 포함되지 않은 MES 완충용액만을 처리하였다. H₂O₂처리는 계속적으로 빛을 쬐어주는 상태로 22℃에서 5일간 수행하였다. 이후, 광합성 활성을 상기 실시예 2-1)과 동일한 방법에 따라 측정하였다.

그 결과, 도 2의 A에 도시된 바와 같이, 야생형의 경우 H₂O₂처리에 의해 잎이 노화되고 괴사되는 것이 관찰된 반면, ore8 변이체는 이러한 황화 현상이 매우 미약하게 일어났다. 또한 도 2의 B에 도시된 바와 같이, H₂O₂처리 후 야생형의 광합성 활성은 60% 정도 감소하였으나, ore8 변이체는 음성 대조구와 유사한 정도의 광합성 활성도를 보였다. 뿐만 아니라, 식물에 직접 100mM H₂O₂ 용액을 분사하였을 때 야생형의 경우 분사 7일 후에는 잎에서 강한 황화현상이 관찰된 반면, ore8 변이체에서는 그 정도가 매우 약한 것으로 관찰되었다(미도시). 이 결과들은 ore8 변이체가 산화적 스트레스에 대한 강한 저항성이 있음을 보여주는 것이다. 또한, 산화적 스트레스가 노화의 개시 및 진행에 직접적으로 영향을 미치는 매우 중요한 요소임을 볼 때(Munne-Bosch et al., Planta, 214: 608-615, 2002), 이 결과들은 ore8 변이체가 산화적 스트레스에 대해 저항성을 나타냄으로써 노화의 진행을 억제하고, 식물의 수명을 연장시킨다는 것을 보여주는 것이다.

4-2) 염에 대한 ore8 변이체의 저항성 조사

산화적 스트레스의 원인이 되는 활성 산소족들은 가뭄, 제초제 처리, 저온 또는 염 스트레스에 의해서 생성된다(Tsugane et al., The Plant Cell, 11: 1195-1206, 1999). 따라서, 본 발명자들은 산화적 스트레스에 의해 저항성을 보였던 ore8 변이체가 염 스트레스에 대해서도 저항성을 보이는지 조사하였다.

18 DAG의 야생형 애기장대 및 ore8 변이체를 화분채로 600mM NaCl 용액에 2시간 동안 침수시킨 후(Kasuga et al., Nature Biotechnology, 17, 287-291, 1999), 2주 동안 정상적인 상태에서 배양하면서 잎의 황화정도를 비교·관찰하였다. 그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 야생형의 경우 강한 황화현상과 함께 모든 식물체가 괴사한 것을 관찰할 수 있었으나, ore8 변이체에서는 60% 이상의 식물이 생존하였다. 이 결과로부터 ore8 변이체가 노화 지연 표현형 뿐 아니라 염 스트레스에 대한 저항성도 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다. 수명연장 변이체 ore8이 염- 및 산화적 스트레스에 대해 저항성을 나타낸다는 상기 결과들은 식물의 노화와 환경간의 연계성에 새로운 단서를 제공한 결과로서 식물의 노화현상 연구에 크게 이바지 할 것으로 기대된다.

<실시예 5>

ORE8 유전자의 클로닝 및 서열 분석

ore8 변이체로부터 인핸서에 의해 활성화된 T-DNA 주변의 유전자를 탐색하기 위해, TAIL-PCR 방법에 따라 유전자를 분리하였다. 이를 위해 일차적으로 ore8 변이체로부터 델라포르타 등의 방법(Dellaporta et al., Plant Mol. Biol. Rep., 1: 19-21, 1983)에 따라 전체 게노믹 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 주형으로 하여 리우 등의 방법(Liu et al., The Plant Journal, 8: 457-463, 1995)에 따라 TAIL-PCR을 수행하였다. TAIL-PCR에 사용한 1,2 및 3차 프라이머 서열은 각각 서열번호 3 내지 5에 기재하였다. 증폭된 PCR 산물은 pGEM-T 벡터(Promega)에 삽입한 후, 벡터 내에 존재하는 T7 및 SP6 프라이머를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 애기장대 게놈 데이터 베이스에서 탐색한 결과, pSKI1015 인핸서에서 가장 가까운 전사해독틀을 찾아내었다(도 4 참조). 상기 전사해독틀을 'ORE8'라 명명하였으며, 그 염기서열은 서열번호 1에 기재되어 있다. 상기 ORE8 유전자로부터 발현되는 단백질은, 서열번호 2에 기재된 바와 같이, 446개의 아미노산으로 구성되었으며, 서열번호 2의 아미노산 서열의 2-17 부분에 세린-, 글리신-풍부 모티프가 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 본 발명의 ORE8 유전자의 염기서열을 진뱅크 데이터 베이스에서 검색한 결과, 스테릴 아페탈라 유전자들과 각각 100% 및 99%의 상동성을 나타냄을 확인할 수 있었다(결과 미도시). 상기 두 유전자 중의 하나인 SAP 유전자가 꽃의 발달 과정에 관여하고, 상기 유전자로부터 암호화되는 SAP 단백질은, 그 아미노산 서열 중 전사 조절자들에게서 발견되는 서열이 존재함을 볼 때, 전사수준에서 꽃의 발달 과정을 조절하는 것으로 마리나 등에 의해 보고되었다(Marina V. Byzova et al., Genes Dev., 13(8): 1002-1014, 1999).

이후, 상기 ORE8 유전자가 ore8 변이체에서 과발현되는지를 조사하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 야생형과 ore8 변이체로부터 트리-시약(Tri-reagent, Sigma)을 이용하여 우 등의 방법(Woo H.R. et al., Plant Cell, 13: 1779-1790, 2001)에 따라 전체 RNA를 추출하였다. 이후, 분리된 RNA를 주형으로 하고, 1차 cDNA 합성 키트(Roche, Catalog No.: 1 483 188)를 이용하여 역전사 반응을 수행한 후, ORE8 유전자를 증폭할 수 있는 서열번호 6 및 7로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이 때 PCR은 95℃에서 5분 동안 전변성화(pre-denaturation)시킨 후, 95℃에서 1분, 48℃에서 1분, 그리고 72℃에서 1분 동안 15회 반복 수행하였다. PCR 산물을 0.9% 아가로스 전기영동으로 분리한 후, 나일론 막으로 옮겼다. 3×SSC로 5분간 세척하여 여분의 아가로즈를 제거한 후, DNA를 나일론 막에 고정시키기 위해 자외선(254nm, 0.18 J/Sq.cm2)을 조사하였다. 이후, 박 등의 방법(Park et al., Plant Mol. Biol., 26: 1725-1735, 1994)에 따라 전혼성화 및 혼성화 반응을 수행하였다. 이 때 탐침으로는 ORE8 유전자를 방사성 동위원소로 표지하여 이용하였다. 그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 야생형에서 비해 ore8 변이체에서 ORE8 유전자가 현저히 높은 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 7>

야생형 애기장대으로의 ore8 유전자의 도입

ore8 변이체에서 나타나는 노화 지연 표현형이 ORE8 유전자의 활성화에 의한 것인지 재확인하기 위해, ORE8 유전자를 야생형 애기장대로 도입하는 실험을 수행하였다. 먼저, 애기장대로부터 분리한 cDNA를 주형으로 하고, 서열번호 6 및 7로 표시되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이 때 PCR은 95℃에서 5분 동안 전변성화시킨 후, 95℃에서 1분, 48℃에서 1분, 그리고 72℃에서 1분 동안 35회 반복 수행하였다. 이후, PCR을 통해 얻어진 ORE8 유전자를 포함하는 DNA 절편을 pGEMT 벡터(Promega)에 삽입하였다. 제조된 재조합 벡터를 'pGEMT-ORE8'로 명명하고, 상기 벡터로 형질전환된 대장균을 2002년 7월 29일자로 한국 생명공학연구원 유전자센터 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 10317BP). 상기 pGEMT-ORE8 벡터를 NcoI과 SpeI으로 절단하여 ORE8 유전자를 분리한 후, 이를 식물 형질전환용 벡터인 pCAMBIA3301 벡터(MRC, 미국)에 삽입시켰다. 이후, 제조된 재조합 벡터를 아그로박테리움 튜메파시엔스 AGL1 균주(Agrobacterium tumefacience AGL1 strain)에 도입시켰다. 그리고 나서, 플로랄 딥 방법(Clough et al., Plant J., 16(6): 735-743, 1998)에 따라 상기 형질전환된 아그로박테리움 균주로 애기장대 야생형 콜롬비아를 형질전환시켰다. 이후, 형질전환된 애기장대로부터 종자를 받은 후, 제초제 저항성을 나타내는 형질전환체를 선발하였다. 선발된 애기장대를 생장실에서 생장시키면서 노화지연 양상을 조사하였다. 그 결과, ore8 변이체에서 나타났던 노화 지연 표현형이 ORE8 유전자가 도입된 애기장대에서 그대로 재현됨을 확인할 수 있었다. 이로부터, 노화 지연 표현형이 ORE8 유전자의 활성화를 통해 나타났음을 알 수 있었다. 또한, 이는 본 발명의 ORE8 유전자가 애기장대의 스테릴 아페탈라 유전자와 99% 이상의 염기서열 상동성을 보임을 볼 때, 스테릴 아페텔라 유전자가 꽃의 발달 과정 뿐 아니라 잎의 수명 조절에도 관여하는 새로운 기능이 있음을 나타내는 것이다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 ore8 변이체의 노화 지연 표현형이 ORE8 유전자의 활성화를 통해 나타났음을 확인하였고, 식물체 내에서 상기 ORE8 유전자를 활성화시킴으로써 식물의 노화 지연을 유도하고, 염- 및 산화적 스트레스에 대한 저항성의 증진시킬 수 있음을 확인하였다. 본 발명에 따른 방법에 따라 ORE8 유전자를 이용하여 식물체를 형질전환시킴으로써 산화적 스트레스나 고농도의 염에 대한 식물의 저항성이 증진되고, 식물의 노화가 지연되어 식물의 생산성 향상 및 저장 효율 증대 등이 도모될 수 있다.

도 1은 애기장대 야생형(Col)과 수명연장 변이체 ore8 에서 발아 후 성장기간(DAG: Days After Germination)에 따른 잎의 노화를 보여주는 사진(A), 광합성 활성의 변화(B), 엽록소 함량의 변화(C) 및 노화관련 유전자와 광합성 관련 유전자의 발현양상을 나타내는 노던 블럿 분석결과(D)를 나타낸 것이다.

SAG12 : 노화 유전자(senescence-associated gene)

SEN4 : 노화 유전자

Cab : 엽록소 a/b 결합 단백질(chlorophyll a/b binding protein)의 유전자

도 2는 20 mM 과산화수소(H₂O₂) 처리 5일 후 애기장대 야생형(Col)과 수명연장 변이체 ore8에서 잎의 노화(A) 및 광합성 활성의 변화(B)를 나타낸 것이다.

도 3은 600 mM NaCl 처리 후, 애기장대 야생형(Col)과 수명연장 변이체(ore8)에서 염 스트레스에 대한 저항성 정도의 차이를 보여주는 사진이다.

도 4는 액티베이션 태깅 벡터 pSKI015가 수명연장 변이체 ore8의 게놈 내로 삽입된 모식도이다.

E : 인핸서(enhancer)

BAR : 제초제 저항성 유전자

pBS : E. coli 복제 기원(replication origin)과 앰피실린 저항성 유전자를 가지고 있는 부위

1, 2, 3 : TAIL-PCR 분석에 사용되었던 프라이머 위치

도 5는 애기장대 야생형(Col)과 수명연장 변이체 ore8에서 ORE8 유전자의 발현 정도의 차이를 조사한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.

<110> Genomine Inc. Postech foundation <120> Method for delaying senescence of plants using the gene regulating leaf longevity in plants <130> NP02-1086 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1341 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atgtctacct cctcctcttc ttccgacaac ggagccggtg gaagcggcgg cgttttcgag 60 gccccatctc catcccgccc tcgccgcgga gccaacgatg tttggccgga gccttttctt 120 gaatctctcg ccgttcaagt tgccgttaac gcttccacat ccgccggcct cctcgccgca 180 gctccggctc ttgccaacgt ttttcgggtt tgcaccacgt ggcacgctgt ctctcgctcc 240 gaccatctat ggcaactact atctcgccaa gtttgggcaa gaacacattt gatgcacgac 300 acgtggcggg acgagttcat ctaccgtcat cggacggcta gaaacttccg gacgcgtact 360 cacacctact tcactctcca atttgacccg tctgatgtgg acgagcctga tagtctctct 420 tgccgttgtc tcaccctctc agacctctac ttagccgcag ggttcgccga cggaaccgtc 480 cggctttttc ttttaaacaa ccgactccac gtcaggacct tacggccacc tctacgtgac 540 cgctttggta gattctcacg agccgtctca ggcattgtta tctccgactc aaggctcacg 600 ttcgctacga tggacggaga catccacgtg gcggaaatag acggtgttgg tcacacacgc 660 acggcttacg caggagatat agttaacgac ggtgcgttgg tagatttcac tggctgtgga 720 cgttggtggg tcggtctttt cgcgggtgtg ccaggtcgtg cctttcacat atgggactgt 780 aacagcgaag agacaacatt cgtcggtggt acactcaccg accctgaagc tgtcatggga 840 tggcacacgt taacagagct aacaacgtcc cttggccgtc tcagaatctc cggtaacgag 900 acggcggtag catgcacgag atggagaatc atggtgatcg atctaagaaa ccaaggagtg 960 atcatcggag aagacgaaga gcaacgtaga ggactaatag tgacaggctt cgatgccaac 1020 gacgaagcgt acgttagatt ggacagtaga ggaaacgcta gcgtgcgaag ggtgaacacg 1080 caacaaacgg tgtgtgagtt ccgtgttagt ggagcggcgc agagaagagt aatgggttgt 1140 gttaatagac tgcacgcgct aatgtgcgca ggtggtataa tgcgcgtgtg ggaggtagag 1200 agaggagagt atctgtacag tattagggag agagtaggag aagttgacgc cattgttgcc 1260 gatgatagac atgtggcggt tgcgtcagct tcatcaacgg ctcagagtat tatacatcta 1320 tgggatttcg gtgcactgta g 1341 <210> 2 <211> 446 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Asp Asn Gly Ala Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Val Phe Glu Ala Pro Ser Pro Ser Arg Pro Arg Arg Gly Ala Asn 20 25 30 Asp Val Trp Pro Glu Pro Phe Leu Glu Ser Leu Ala Val Gln Val Ala 35 40 45 Val Asn Ala Ser Thr Ser Ala Gly Leu Leu Ala Ala Ala Pro Ala Leu 50 55 60 Ala Asn Val Phe Arg Val Cys Thr Thr Trp His Ala Val Ser Arg Ser 65 70 75 80 Asp His Leu Trp Gln Leu Leu Ser Arg Gln Val Trp Ala Arg Thr His 85 90 95 Leu Met His Asp Thr Trp Arg Asp Glu Phe Ile Tyr Arg His Arg Thr 100 105 110 Ala Arg Asn Phe Arg Thr Arg Thr His Thr Tyr Phe Thr Leu Gln Phe 115 120 125 Asp Pro Ser Asp Val Asp Glu Pro Asp Ser Leu Ser Cys Arg Cys Leu 130 135 140 Thr Leu Ser Asp Leu Tyr Leu Ala Ala Gly Phe Ala Asp Gly Thr Val 145 150 155 160 Arg Leu Phe Leu Leu Asn Asn Arg Leu His Val Arg Thr Leu Arg Pro 165 170 175 Pro Leu Arg Asp Arg Phe Gly Arg Phe Ser Arg Ala Val Ser Gly Ile 180 185 190 Val Ile Ser Asp Ser Arg Leu Thr Phe Ala Thr Met Asp Gly Asp Ile 195 200 205 His Val Ala Glu Ile Asp Gly Val Gly His Thr Arg Thr Ala Tyr Ala 210 215 220 Gly Asp Ile Val Asn Asp Gly Ala Leu Val Asp Phe Thr Gly Cys Gly 225 230 235 240 Arg Trp Trp Val Gly Leu Phe Ala Gly Val Pro Gly Arg Ala Phe His 245 250 255 Ile Trp Asp Cys Asn Ser Glu Glu Thr Thr Phe Val Gly Gly Thr Leu 260 265 270 Thr Asp Pro Glu Ala Val Met Gly Trp His Thr Leu Thr Glu Leu Thr 275 280 285 Thr Ser Leu Gly Arg Leu Arg Ile Ser Gly Asn Glu Thr Ala Val Ala 290 295 300 Cys Thr Arg Trp Arg Ile Met Val Ile Asp Leu Arg Asn Gln Gly Val 305 310 315 320 Ile Ile Gly Glu Asp Glu Glu Gln Arg Arg Gly Leu Ile Val Thr Gly 325 330 335 Phe Asp Ala Asn Asp Glu Ala Tyr Val Arg Leu Asp Ser Arg Gly Asn 340 345 350 Ala Ser Val Arg Arg Val Asn Thr Gln Gln Thr Val Cys Glu Phe Arg 355 360 365 Val Ser Gly Ala Ala Gln Arg Arg Val Met Gly Cys Val Asn Arg Leu 370 375 380 His Ala Leu Met Cys Ala Gly Gly Ile Met Arg Val Trp Glu Val Glu 385 390 395 400 Arg Gly Glu Tyr Leu Tyr Ser Ile Arg Glu Arg Val Gly Glu Val Asp 405 410 415 Ala Ile Val Ala Asp Asp Arg His Val Ala Val Ala Ser Ala Ser Ser 420 425 430 Thr Ala Gln Ser Ile Ile His Leu Trp Asp Phe Gly Ala Leu 435 440 445 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st primer for TAIL PCR <400> 3 ccgagcggcg aactaataac gt 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd primer for TAIL PCR <400> 4 ccgaaagtta cgggcaccat tcaa 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3rd primer for TAIL PCR <400> 5 gaagtgcagg tcaaaccttg ac 22 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 6 cctctcgtcc catggctacc tcctcctctt 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 7 tctggtacgc tacagtgcac cgaaatccca 30

Claims

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 이용하여 식물의 노화를 지연시키는 방법.
제 1항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 ORE8 유전자로 식물체를 형질전환시킴으로써 식물의 노화를 지연시키는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 유전자는 애기장대로부터 분리된 것을 특징으로 하는 식물의 노화를 지연시키는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 유전자가 염- 또는 산화적 스트레스에 대한 식물체의 저항성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 식물의 노화를 지연시키는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식물의 노화를 지연시키는 방법.
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자와 결합하는 물질 또는 상기 단백질의 발현을 억제 또는 활성화하는 물질을 탐색하는 단계를 포함하는 식물의 노화 관련물질을 탐색하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 단계는 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응(PCR), 노던 블럿 분석, 서던 블럿 분석, 웨스턴 블럿 분석, 효소 면역 반응(ELISA), 2-D 겔 분석, 효모 이중 혼성화 반응(yeast two hybrid system) 및 시험관 내 결합 어세이(invitrobinding assay)로 구성된 군에서 선택된 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 식물의 노화 관련물질을 탐색하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식물의 노화 관련 물질을 탐색하는 방법.