KR101053039B1 - 식물 수명 조절 단백질, 그 유전자 및 이들의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물 수명 조절 단백질, 그 유전자 및 이들의 용도를 개시한다. 구체적으로, 본 발명은 식물의 수명 조절 단백질 ORE17, 이를 암호화하는 유전자 ORE17, 식물의 수명을 연장시키는 기능을 가지는 변이형 단백질 ore17, 이를 암호화하는 유전자 ore17, 및 이들의 용도를 개시한다.

식물 수명, 단백질, 유전자

Description

식물 수명 조절 단백질, 그 유전자 및 이들의 용도{Protein Regulating Longevity of Plant, Gene Thereof and Use Thereof}

도 1 은 애기장대 야생형 및 수명연장 변이형인 ore17에서 광합성 효율의 시간에 따른 변화를 나타낸 그래프이고 (광합성 활성은 PSⅡ의 광화학적 효율을 나타내는 Fv/Fm으로 나타냄),

●: 야생형 ▲: ore17

Fv : 최대 변형 형광도 (maximum variable fluorescence)

Fm : 형광도 최대치 (maximum yield of fluorescence)

도 2a 는 애기장대 야생형 및 수명연장 변이형인 ore17에 암 처리 (dark treatment)를 한 후 광합성 효율의 시간에 따른 변화를 나타낸 그래프이고,

●: 야생형 ▲: ore17

도 2b 는 애기장대 야생형 및 수명연장 변이형인 ore17에 암 처리 (dark treatment)를 한 후 엽록소 함량의 시간에 따른 변화를 나타낸 그래프이고 ,

●: 야생형 ▲: ore17

도 3a 는 애기장대 야생형 및 수명연장 변이형인 ore17에 노화의 시작 및 진행에 영향을 미치는 식물 호르몬인 MeJA (methyl jasmonate)을 처리한 후, 잎 수명 의 변화를 광합성 효율로 나타낸 그래프이고,

●: 야생형 ▲: ore17

도 3b 는 애기장대 야생형 및 수명연장 변이형인 ore17에 노화의 시작 및 진행에 영향을 미치는 식물 호르몬인 MeJA (methyl jasmonate)을 처리한 후, 잎 수명의 변화를 엽록소 함량으로 나타낸 그래프이고,

●: 야생형 ▲: ore17

도 4a 는 애기장대 야생형 및 수명연장 변이형인 ore17에 노화의 시작 및 진행에 영향을 미치는 식물 호르몬인 ABA (abscisic acid)를 처리한 후, 잎 수명의 변화를 광합성 효율로 나타낸 그래프이고,

●: 야생형 ▲: ore17

도 4b 는 애기장대 야생형 및 수명연장 변이형인 ore17에 노화의 시작 및 진행에 영향을 미치는 식물 호르몬인 ABA (abscisic acid)를 처리한 후, 잎 수명의 변화를 엽록소 함량으로 나타낸 그래프이고,

●: 야생형 ▲: ore17

도 5a 는 애기장대 야생형 및 수명연장 변이형인 ore17에 노화의 시작 및 진행에 영향을 미치는 요인 중 하나인 산화적 스트레스를 과산화수소 (H₂O₂)의 처리를 통해 가해준 후, 잎 수명의 변화를 광합성 효율로 나타낸 그래프이고,

●: 야생형 ▲: ore17

도 5b 는 애기장대 야생형 및 수명연장 변이형인 ore17에 노화의 시작 및 진 행에 영향을 미치는 요인 중 하나인 산화적 스트레스를 과산화수소 (H₂O₂)의 처리를 통해 가해준 후, 잎 수명의 변화를 엽록소 함량으로 나타낸 그래프이고,

●: 야생형 ▲: ore17

도 6 는 애기장대 게놈 내에서 ORE17 유전자 위치를 나타내는 유전자 지도이다.

도 7 은 애기장대 야생형 및 수명연장 변이형인 ore17-1과 Auxin response factor 유전자에 T-DNA 가 삽입된 ore17-2에서 광합성 효율의 시간에 따른 변화를 나타낸 그래프이다 (광합성 활성은 PSⅡ의 광화학적 효율을 나타내는 Fv/Fm으로 나타냄).

Fv : 최대 변형 형광도 (maximum variable fluorescence)

Fm : 형광도 최대치 (maximum yield of fluorescence)

본 발명은 식물 수명 조절 단백질, 그 유전자 및 이들의 용도에 관한 것으로 서, 식물의 수명 조절 단백질 ORE17, 이를 암호화하는 유전자 ORE17, 식물의 수명을 연장시키는 기능을 가지는 변이형 단백질 ore17, 이를 암호화하는 유전자 ore17, 및 이들의 용도에 관한 것이다.

식물의 노화 억제는 그 자체로서의 학문적 중요성뿐만 아니라 작물의 생산성이나 수확 후 저장 효율에 있어서의 개량 가능성 때문에 산업적으로도 중요성이 높다. 이에 따라 식물 노화 현상을 밝히기 위한 유전학적, 분자 생물학적, 생리학적 및 생화학적 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 수명 연장 돌연변이를 이용한 유전자 탐색 및 기능에 대한 연구는 노화 진행 속도에 영향을 주는 신호전달 경로를 밝힐 뿐만 아니라 식물 생산성 향상 및 추수 전후의 과실의 저장 효율 증가, 수확 후 잎채소 작물의 저장 효율 증가와 같은 실용적 문제 해결에 중요한 실마리를 제공한다. 뿐만 아니라 수명 연장 돌연변이들은 많은 경우 산화스트레스와 같은 환경스트레스에 저항성을 보인다 (Woo H.Y. et al., Plant Cell Physiol. 45, 923-932, 2004)

노화 (senescence)는 식물이 일생을 거치는 동안 겪게 되는 마지막 단계로 노화의 개시는 식물 발달 단계에 있어 급격한 전환점이라 할 수 있으며, 이 기간동안 세포들은 물질대사 및 세포구조에 있어서 극적인 변화를 거치게 된다. 이러한 식물체 변화에 있어서 시각적으로 나타나는 대표적인 현상으로는 엽록소가 파괴되고 다른 색소가 생성되면서 나타나는 단풍을 들 수 있다. 상기 단풍기간 동안 발생하는 엽록소 파괴는 엽록체 붕괴, 그리고 광합성이나 단백질 제조와 같은 동화작 용 활성 (anabolic activity)의 감소와 함께 발생한다. 또 이와 반대로 이 기간동안 많은 수의 가수분해 효소가 유도되면서 핵산 분해 (nucleic acid breakdown)나 단백질 분해 (proteolysis)와 같은 이화작용 (catabolism)이 활성화된다 (Matile P. et al., In Crop Photosysthesis: Spartial and temporal Determinant, Elservier 413-440, 1992; Nooden L.D. et al., Senescence and aging in Plant, Academic press, 1988; Thiman K.V. et al., The senescence of leaves, CRC press, 85-115, 1980). 그러나, 식물 노화는 세포가 퇴화하는 과정인 동시에 겨울철에 성장기관의 양분을 생식기관으로 이동시키는 등, 진화 과정 동안 환경에 적응하기 위해 능동적으로 획득한 유전 형질이라고 생각되고 있다.

노화는 일련의 연속된 생화학적 생리학적 현상의 진행으로 결국 세포, 기관 및 전체 개체를 죽음으로 이끈다 (Matile P. et al., In Crop Photosysthesis: Spartial and temporal Determinant, Elservier 413-440, 1992; Nooden L.D. et al., Senescence and aging in Plant, Academic press, 1988; Thiman K.V. et al., The senescence of leaves, CRC press, 85-115, 1980; Thomas H. et al., Annu. Rev. Plant Physiol. 123:193-219, 1993). 노화의 원인에 대해서는 유전자에 의해 예정된 프로그램에 따라 진행된다는 유전자설과, 생체내에서 반복적으로 발생하는 정보 전달 오류 또는 단백질 합성 과정에서의 오류 축적에 따른 것이라는 오류 축적설로 크게 대별되는데, 최근에는 노화가 유전자에 의해서 결정된다는 유전자설이 설득력을 얻고 있다.

따라서, 식물 노화에 있어서 노화에 관련된 유전자의 클로닝 및 그 유전자 기능의 탐색은 노화 과정의 연구 및 이의 조절을 위해 매우 중요한 수단이 될 수 있다. 그러나, 이러한 학문적 그리고 실용적 중요성에도 불구하고 식물 노화에 대해서는 아직도 많은 부분이 밝혀지지 않은 상태이다. 지금까지 식물의 노화에 관련된 연구들은 주로 노화의 생리생화학적 현상에 관련된 보고가 주류를 이루고 있으며, 분자생물학적 연구가 시작된 것은 최근의 일이다.

식물 생장 호르몬 (싸이토키닌: Cytokinin)은 생리학적으로 노화를 지연시킬 수 있는 호르몬으로 알려져 있어, 노화 관련 유전자 조절을 통한 싸이토키닌의 분비를 조절하여 노화를 지연시키려는 연구가 진행되어 왔으나, 호르몬의 영향으로 식물의 다른 생리작용에 영향을 미치는 문제가 있었다. 최근에 이러한 문제점을 해결하여 노화 특이적인 SAG12 유전자의 프로모터에 IPT 유전자를 연결하여 특정 노화 단계에서 식물 생장 호르몬의 합성이 조절되게 함으로써, 노화의 진행을 지연시켜 50% 이상의 생산성 증가를 이루면서도, 개화시기나 다른 변화가 거의 없게 하는데 성공하였다 (Gan S. et al., Science 22:1986-1988, 1995). 이외에 현재까지 노화 지연 식물체의 개발은 주로 토마토의 과실 숙성을 대상으로 하여 노화에 중요한 역할을 하는 화학물질인 에틸렌 (ethylene)의 합성을 억제하거나, 세포내 에틸렌의 양을 줄이는 방법이 시도되어 왔다 (Klee et al., Plant Cell, 3(11):1187-93, 1991; Oeller et al., Science, 18;254(5030):437-9, 1991; Picton et al., Plant Physiol 103(4): 1471-1472, 1993).

그 외 노화를 지연시키고자 하는 연구는 주로 노화 과정에서 일어나는 생화 학적 변화와 관련된 활성을 갖거나 또는 신호전달 체계에 관여하는 분해 관련 유전자의 조작에 있었다. 그 대표적인 예로는 안티센스 DNA (antisense DNA)를 이용하여 세포벽 분해와 관련된 폴리갈락투로나제 (polygalacturonase) 유전자의 발현을 저해시킴으로써 토마토의 연화를 방지하여 운송성과 저장성을 증대시킨 후레바 세이바 (Flavr savr)라고 하는, 상업화된 토마토가 있다 (Giovannoni et al., Plant Cell, 1(1):53-63, 1989). 또한, 지질 분해에 관련되는 인지질 분해효소 D (phospholipase D)를 안티센스로 하여 발현을 저해시킬 경우, 식물 호르몬에 의한 노화가 지연된다는 연구결과가 보고된 바 있으며 (Fan et al., Plant Cell, 9(12):2183-96, 1997), 최근에는 SAG12 프로모터와 옥수수의 호메오박스 (homeobox) 유전자인 knI (knotted 1)이 발현되는 담배에서 잎의 노화가 지연된다는 연구결과가 보고되었다 (Ori et al., Plant Cell 11: 917-927, 1999).

그러나, 식물의 노화를 보다 직접적으로 조절할 수 있는 방법은 노화 관련 유전자의 돌연변이를 분리하여 돌연변이를 일으키는 유전자를 분석하는 것이다. 기존의 보고에 의하면 애기장대 (Arabidopsis thaliana)의 과일 숙성기 또는 꽃의 노화과정에서 에틸렌 수용체의 발현이 조절되고 (Payton S. et al., Plant Mol. Biol. 31(6):1227-1231, 1996), 잎의 노화과정에서 clp 유전자의 발현이 조절된다고 알려져 있다. 최근에는 애기장대 잎 노화 지연 변이체들이 분리되어 보고 된 바 있고 (Oh S.A. et al., The Plant Journal, 12(3):527-535, 1997; Woo H.R. et al., Plant Cell 13 : 1779-1790, 2001; Woo, H.R. et al., The Plant Journal, 31, 331-340; Yoshida, S. et al.,The plant Journal., 32, 129-137, 2002), 또한 관련 유전자도 분리하는데 성공하였다 (Woo H.R. et al., Plant Cell 13 : 1779-1790, 2001; Woo, H.R. et al., The Plant Journal, 31, 331-340; Yoshida, S. et al.,The plant Journal., 32, 129-137, 2002). 그러나 아직까지 잎의 노화를 조절하는 유전자에 관한 보고는 상당히 미미한 사태이고 또한 관련 분자학적 기작은 대부분 규명되지 않았다.

이에, 본 발명자들은 유전학적으로 장점이 많은 애기장대 중에서 잎의 수명이 연장되어 있는 변이체를 찾아 수명 연장에 관계되는 유전자를 탐색하고자 노력한 결과, 평균 잎의 수명이 야생형에 비해 39% 정도 증가된 돌연변이체를 찾아내고 이 변이체에 대해 유전자 지도에 기초하여 해당 유전자를 탐색함으로써, 상기 노화 관련 유전자가 애기장대의 5번 염색체 상에 LFY 위치로부터 오른쪽으로 0.07 cM 떨어진 위치, 보다 상세하게는 BAC MTG10에 위치하며, cDNA 서열 상 859개 아미노산을 암호화하는 2580개의 핵산으로 이루어진 유전자 (At5g62000)임을 확인하고 상기 유전자를 ORE17로 명명하였다. 또한 상기 유전자로 코딩된 ORE17 단백질은 B3 DNA 결합 도메인(binding domain), 옥신 반응성 전사 인자 도메인(auxin responsive transcription factor domain)과 Aux/IAA domain을 가지는 옥신 반응 인자 (auxin response factor) 중 하나로, 상기 유전자의 돌연변이형인 ore17의 경우 애기장대의 잎 수명을 크게 증가시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 식물의 수명 조절 단백질 ORE17를 제공하는 데 있 다.

본 발명의 다른 목적은 식물의 수명을 연장시키는 변이형 단백질 ore17를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물의 수명 조절 유전자 ORE17를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 식물의 수명을 연장시키는 변이형 유전자 ore17를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 유전자 ORE17 또는 ore17를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 식물의 생산성 또는 저장 효율을 증대시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 식물 수명 조절에 관여하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물 수명 조절에 관여하는 단백질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 (a), (b) 및 (c)의 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 식물의 수명 조절 단백질 ORE17를 제공한다: (a) 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩타이드; (b) 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩타이드; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩타이드와 실질적으로 유사한 폴리펩타이드.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 (a), (b) 및 (c)의 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 식물의 수명을 연장시키는 변이형 단백질 ore17를 제공한다: (a) 서열번호 3에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩타이드; (b) 서열번호 3에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩타이드; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩타이드와 실질적으로 유사한 폴리펩타이드.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 식물의 수명 조절 단백질 ORE17 단백질을 암호화하는 식물의 수명 조절 유전자 ORE17를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 식물의 수명을 연장시키는 변이형 단백질 ore17 단백질을 암호화하는 식물의 수명을 연장시키는 변이형 유전자 ore17를 제공한다.

본 발명은 식물의 유전학적 및 분자생물학적 연구를 위한 재료로 많이 사용되는 애기장대 (Arabidopsis thaliana)를 대상으로 하여 수명 조절에 관여하는 유전자를 탐색하는 것을 목적으로 한다. 애기장대는 전체 게놈의 염기서열이 완전히 분석되어 다양한 변이체를 가지고 있어, 유전 분석이 매우 용이하며, 일생이 짧은 반면 많은 씨앗을 생산하고, 경작 및 형질전환이 용이하다는 장점을 가져 식물의 유전학 모델 재료로 많이 이용된다 (http://www.arabidopsis.org).

본 발명자들은 유전학적으로 장점이 많은 애기장대 중에서 잎의 수명이 연장되어 있는 변이체를 찾아 수명 연장에 관계되는 유전자를 탐색하고자 노력하였고, 그 결과, 애기장대의 특정 지놈 위치에 있는 식물의 수명 조절 유전자를 찾아내었고, 이를 "ORE17"이라 명명하였다. 또한, ORE17에서 변이가 발생되어 식물의 수명을 연장시키는 표현형을 나타내는 데 기여하는 유전자를 규명하였고, 이 변이형 유전자를 "ore17"이라 명명하였다.

본 명세서에서, "ORE17"은 본 발명에서 규명된 식물의 수명 조절 유전자를 나타내고, "ORE17"은 ORE17에 의해 암호화되는 식물의 수명 조절 단백질을 나타내며, "ore17"은 ORE17의 변이형으로서 식물의 수명을 연장시키는 표현형을 나타내는 유전자를 나타내며, "ore17"은 ore17에 의해 암호화되는 식물의 수명을 연장시키는 단백질을 나타낸다.

본 명세서에서 용어 "수명 조절" 및 "노화 조절"은 동의어로서 실질적인 차이 없이 서로 혼용된다. 예를 들어, 수명을 연장하는 것은 노화를 지연하는 것과 실질적으로 동일한 것이다. 또한, 본 명세서에서 용어 "수명 연장"과 "노화 지연"은 동의어로서 실질적인 차이 없이 서로 혼용된다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 식물의 수명 조절 단백질 ORE17는 B3 DNA 결합 도메인 (binding domain), 옥신 반응성 전사인자 도메인 (auxin responsive transcription factor domain) 및 Aux/IAA 도메인을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 식물의 수명을 연장시키는 변이형 단백질 ore17는 B3 DNA 결합 도메인 (binding domain) 및 옥신 반응성 전사인자 도메인 (auxin responsive transcription factor domain)를 가지며, Aux/IAA 도메인은 결여되어 있다. 이와 같이 하나의 도메인이 결여된 형태는 다양한 변이 (mutation)방식을 통해 논센스 변이 (nonsense mutation) 결과에 의해 초래된다. 논센스 변이를 유발하는 변이 방식은 구체적으로 치환 (substitution)에 의한다. 구체적인 일 구현예에 따르면, 서열번호 2의 ORE17 염기서열에서 1673 번째 염기인 구아닌 (guanine: G)이 아데닌 (adenine: A)으로 치환되어 논센스 변이를 유발하고, 이는 조기 종결 (premature termination)을 일으키며, 결국 Aux/IAA 도메인이 결여된 변이형 단백질 ore17가 생성된다.

본 발명의 단백질 ORE17 또는 ore17은 (ⅰ) 서열번호 2 또는 3에 기재된 아미노산과 100% 일치되는 것뿐만 아니라, (ⅱ) 서열번호 2 또는 3에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩타이드; 및 (ⅲ) 상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ)의 폴리펩타이드와 실질적으로 유사한 폴리펩타이드도 본 발명의 ORE15 또는 ore17단백질의 범위에 포함된다는 사실은, 당업계의 기술 수준을 고려하여 충분히 인식된다.

본 명세서에서, "서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩타이드"는 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 비교하였을 때 여전히 수명 조절 기능을 보유하고, B3 DNA 결합 도메인, 옥신 반응성 전사인자 도메인 및 Aux/IAA 도메인을 이루는 서열번호 2의 아미노산 서열의 일부분을 포함하는 폴리펩타이드로서 정의내릴 수 있다. 수명 조절 기능을 보유하고 B3 DNA 결합 도메인, 옥신 반응성 전사인자 도메인 및 Aux/IAA 도메인을 형성할 수 있으면 충분하므로, 상기 폴리펩타이드의 길이 그리고 그러한 폴리펩타이드가 가지는 활성의 정도는 특별히 문제되지는 않는다. 즉 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 비해 활성이 낮더라도, 여전히 수명 조절 기능을 보유하는 폴리펩타이드라면 그 길이에 불문하고 상기 "서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드"에 포함된다.

또한, 본 명세서에서, "서열번호 3에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩타이드"는 서열번호 3에 개시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 비교하였을 때 여전히 수명 연장 (즉, 노화 지연) 기능을 보유하고, B3 DNA 결합 도메인 및 옥신 반응성 전사인자 도메인은 형성하면서도 Aux/IAA 도메인은 결여된 서열번호 3의 아미노산 서열의 일부분을 포함하는 폴리펩타이드로서 정의내릴 수 있다. 노화 지연 기능을 보유하고 B3 DNA 결합 도메인 및 옥신 반응성 전사인자 도메인을 형성할 수 있으면 충분하므로, 상기 폴리펩타이드의 길이 그리고 그러한 폴리펩타이드가 가지는 활성의 정도는 특별히 문제되지는 않는다. 즉 서열번호 3에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 비해 활성이 낮더라도, 여전히 수명 연장 기능을 보유하는 폴리펩타이드라면 그 길이에 불문하고 상기 "서열번호 3에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드"에 포함된다.

통상의 당업자라면, 즉 본 출원시를 기준으로 공지된 관련 선행기술을 평균적으로 숙지하고 있는 자라면, 서열번호 2 또는 3에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에서 일부분이 결실되더라도 그러한 폴리펩타이드는 여전히 수명 조절 (또는 수명 연장 기능)을 가질 것이라고 기대할 것이다. 그러한 폴리펩타이드로서 서열번호 2 또는 3에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에서 N-말단 부분 또는 C-말단 부분이 결실된 폴리펩타이드가 있다. 일반적으로 N-말단 부분 또는 C-말단 부분이 결실되더라도 그러한 폴리펩타이드는 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 가진다고 당업계에 공지되어 있기 때문이다. 또한, N-말단 부분 또는 C-말단 부분뿐만 아니라 그 이외의 다른 부분이 결실되더라도 본래의 ORE17 또는 ore17 단백질이 가지는 기능을 여전히 가질 수 있다.

따라서, 본 발명에 있어서 상기 "서열번호 2 또는 3에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩타이드"는 상기 정의와 같이 본 명세서의 개시 내용에 기초하여 당업자가 그의 통상의 능력 범위 내에서 제조 가능한 수명 조절 (또는 수명 연장) 기능과 상술한 도메인을 가지는 결실된 형태의 모든 폴리펩타이드를 포함하는 의미로서 이해되어야 한다.

한편, "(ⅰ) 또는 (ⅱ)의 폴리펩타이드와 실질적으로 유사한 폴리펩타이드"란 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하지만, 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 가지는 기능, 즉 수명 조절 (또는 수명 연장) 기능을 여전히 보유하고 상술한 도메인을 가지는 폴리펩타이드를 말한다. 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드가 수명 조절 (또는 수명 연장) 기능을 여전히 보유하고 상술한 도메인을 형성하기만 한다면 그러한 폴리펩타이드가 가지는 활성의 정도나 아미노산이 치환된 비율은 문제되지 않는다. 즉, 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드가 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서 열을 포함하는 폴리펩타이드에 비해 그 활성이 아무리 낮더라도, 또한 많은 수의 치환된 아미노산을 포함하고 있다고 하더라도 그러한 폴리펩타이드가 잎 수명 조절 (또는 수명 연장) 기능을 보유하고 상술한 도메인을 형성하기만 한다면 본 발명에 포함된다는 것이다.

하나 이상의 아미노산이 치환되더라도 치환되기 전의 아미노산이 치환된 아미노산과 화학적으로 등가라면, 그러한 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드는 여전히 본래의 폴리펩타이드의 기능을 보유할 것이다. 예컨대, 소수성 아미노산인 알라닌이 다른 소수성의 아미노산, 예를 들면 글리신, 또는 보다 더 소수성인 아미노산, 예를 들면 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환되더라도 그러한 치환된 아미노산(들)을 가지는 폴리펩타이드는 활성은 낮더라도 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것이다. 마찬가지로, 음으로 하전된 아미노산 예컨대, 글루탐산이 다른 음으로 하전된 아미노산, 예컨대 아스파르산으로 치환되더라도 그러한 치환된 아미노산(들)을 가지는 폴리펩타이드도 활성은 낮더라도 본래의 폴리펩타이드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것이며, 또한 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 아르기닌이 다른 양으로 하전된 아미노산, 예컨대, 리신으로 치환되더라도 그러한 치환된 아미노산(들)을 가지는 폴리펩타이드 또한 활성은 낮더라도 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것이다. 또한 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 부분에서 치환된 아미노산(들)을 포함하는 폴리펩타이드도 본래의 폴리펩타이드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것이다.

당업계의 기술 수준을 고려하면, 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열에서 전 술한 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하면서도 수명 조절 (또는 수명 연장) 기능을 여전히 보유하고 상술한 도메인을 가지는 폴리펩타이드를 용이하게 제조할 수 있다.

상술한 바와 같이, "상기 (ⅰ) 또는 (ⅱ)의 폴리펩타이드와 실질적으로 유사한 폴리펩타이드"는 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하면서도 여전히 수명 조절 (또는 수명 연장) 기능을 가지고 상술한 도메인을 가지는 모든 폴리펩타이드를 포함하는 의미이지만, 그럼에도 활성의 정도라는 관점에서 봤을 때, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열과 서열 상동성이 높을수록 바람직하다. 상기 폴리펩타이드는 서열 상동성의 하한에 있어서 60% 이상의 서열 상동성을 지니는 것이 바람직한 반면, 서열 상동성의 상한에 있어서는 당연히 100%의 서열 상동성을 지니는 것이 바람직하다.

보다 더 구체적으로 위 서열 상동성은 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 순서대로 높아질수록 바람직하다.

본 발명의 식물 수명 조절 유전자 ORE17는 서열번호 2의 ORE17 단백질뿐만 아니라 그의 상술한 유사체를 암호화하는 모든 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 ORE17 유전자는 상술한 서열번호 2의 ORE17 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 의해 암호화되 는 단백질이 수명 조절 활성을 나타내고 B3 DNA 결합 도메인, 옥신 반응성 전사인자 도메인 및 Aux/IAA 도메인을 갖는 한, 본 발명의 범위에 속한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 ORE17 유전자는 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 포함한다.

또한, 본 발명의 식물 수명 연장 유전자 ore17는 서열번호 3의 ore17 단백질뿐만 아니라 그의 상술한 유사체를 암호화하는 모든 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 ore17 유전자는 상술한 서열번호 3의 ORE17 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 의해 암호화되는 단백질이 수명 조절 활성을 나타내고 B3 DNA 결합 도메인 및 옥신 반응성 전사인자 도메인을 갖는 한, 본 발명의 범위에 속한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 ORE17 유전자는 서열번호 2의 염기서열에서 1673 번째 염기인 구아닌 (guanine: G)이 아데닌 (adenine: A)으로 치환된 서열을 갖는다.

한편, 하기의 실시예에 구체적으로 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 ORE17 유전자가 ARF-유사 인자 유전자임을 최종 확인하였다. 옥신은 식물의 성장 및 발달을 조절하는 중요 호르몬 중의 하나로서 현재까지 많은 연구가 수행되어져 왔음에도 불구하고 아직까지도 옥신에 관련된 분자생물학적 기작은 잘 알려져 있지 않다. 옥신을 처리하면 관련된 특정 유전자 (Auxin responsive genes)들의 발현이 증가하는데 이때 ARF 전사유전자들은 옥신 유도 유전자들의 프로모터에 결합하여 이들 유전자들의 발현 조절에 관여한다 (Ulmasov T. et al., Science, 276,1865-1868, 1997; Guilfoyle T.J. et al., Cell. Mol. Life. Sci. 54, 619-627, 1998; Tiwari S.B.T. et al., The Plant Cell 15, 533-543, 2003). ARF 유전자는 유전자 패밀리로 존재하는 유전자로서 일부 ARF 유전자에 대해서는 기능 연구가 부분적으로 되어왔다. 예를 들어 ARF5의 경우 이 유전자의 기능이 상실된 변이체의 경우 배축 형성과 관 발달에 이상을 일으키게 되고 (Hardtke C.S. et al., The EMBO J. 17, 1405-1411, 1998) 또한 ARF7 유전자의 기능이 상실될 경우 주광성 (phototropic response)을 포함하여 성장 및 발달 과정의 여러 부분에 이상을 가져오게 된다 (Harper R.M. et al., The Plant Cell 12, 757-770, 2000). 그러나 현재까지 잎의 수명과 관련하여 보고된 ARF 유전자는 밝혀진 바 없다. 식물 노화는 발달 과정의 마지막 단계로서 이 과정에 연관된 옥신 반응 유전자들의 발현조절에 본 발명의 ORE17 유전자가 관여할 것으로 판단된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 식물의 수명 조절 유전자 ORE17를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 식물의 수명을 연장시키는 변이형 유전자 ore17를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 (a) 식물 수명 조절 단백질 ORE17 또는 식물 수명 연장 단백질 ore17을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 상기 뉴클레오타이드에 작동적으로 결합된 (operably linked) 프로모터를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이 의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 유전자는 식물에서 분리되었고, 식물체의 수명을 연장하는 작용을 할 수 있으므로, 식물에 대하여 가장 바람직한 유용성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 벡터는 (ⅰ) 식물 수명 조절 단백질 ORE17 또는 식물 수명 연장 단백질 ore17을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 식물발현용 벡터를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머 라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위는 아그로박테리움 튜머페이션스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (nos 3' end) (Bevan et al., Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분 및 CaMV 35S 터미네이터를 포함한다.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptⅡ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 변이형 유전자 ore17로 식물체를 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 생산성 또는 저장 효율을 증대시키는 방법을 제공한다.

변이형 유전자 ore17은 식물의 수명을 연장 (또는 노화 지연)시켜 식물의 생산성 또는 저장 효율을 크게 증가시키게 된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이형 유전자 ore17는 서열번호 2의 염기서열에서 1673 번째 염기인 구아닌 (guanine: G)이 아데닌 (adenine: A)으로 치환된 서열을 갖는다.

이와 같이 ore17 유전자에 의한 형질전환을 통해 얻어진 식물 형질전환체는 식물 수명이 연장된 사실을 나타내는 다양한 지표 (예컨대, 엽록소 함유량의 감소 지연 및 광합성 활성의 감소 지연)로 확인 가능하며, 또한 성장이 증대되는 사실을 나타내는 다양한 지표 (예컨대, 잎의 중량 및 크기 증가 비율의 증대)로 확인 가능하다.

본 발명의 방법에 있어서, 용어 "식물(체)"는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직, 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물체는 특별하게 제한되지 않는다. 본 발명의 방법에 의해 수명이 연장될 수 있는 식물로는 상치, 배추, 감자 및 무를 포함하는 대부분의 쌍자엽 식물 (dicotyledonous plant) 또는 벼, 보리, 바나나 등의 단자엽 식물 (monocotyledonous plant)을 모두 이용될 수 있으며, 특히 토마토와 같이 과피가 얇아 노화에 따른 품질 저하가 급격히 나타나는 식용 채소 또는 과일 그리고 잎이 주된 상품으로 거래되는 식물 등에 적용할 경우 저장 효율을 높이는 데 효과적이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 식물체에 적용된다.

한편, 외래성 폴리뉴클레오티드, 즉 ore17 유전자를 식물체에 도입시키는 방법은 당업계에 일반적으로 공지된 방법 (Methods of Enzymology, Vol. 153, 1987, Wu and Grossman 편집, Academic Press; 그 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다)에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton 등, 1977, Cell 11:263:271; 그 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다 (Lorz 등, 1985, Mol. Genet. 199:178-182; 그 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다). 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake)을 이용할 수 있다.

일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 아그로박테리움 투메페이시언스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법이다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호). 당업자는 공지된 적절한 조건하에서 형질전환된 식물 세포나 종자를 배양 또는 재배하여 식물로 발육시킬 수 있다.

한편, 상기에서 형질전환 식물을 만드는 단계는, 노화 지연 기능을 가지는 ore17 유전자를 조절 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터에 삽입시켜 재조합 발현벡터를 제작하는 단계, 및 이러한 재조합 벡터를 식물에 도입하여 형질전환 식물을 만드는 단계를 포함하여 이루어지는 것이 바람직하다.

더 바람직하게는, 노화 지연 기능을 가지는 ore17 유전자를 조절 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터에 삽입시켜 재조합 발현벡터를 제작하는 단계, 이러한 재조합 발현벡터를 아그로박테리움 박테리아에 형질전환시키는 단계, 및 이러한 형질전환된 아그로박테리움 박테리아로 식물을 형질전환시키는 단계를 포함하여 이루어지는 것이 바람직하다. 특히, 상기 형질전환된 아그로박테리움 박테리아는 형질전환된 아그로박테리움 투메페이시언스인 것이 바람직하다.

상기 "조절 뉴클레오티드 서열"이란 그 존재가 그에 연결된 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 모든 서열을 포함하는 의미로서 이해된다. 이러한 조절 뉴클레오티드 서열은 리더 서열, 인핸서 서열, 프로모터 서열을 모두 포함하지만, 프로모터 서열인 것이 바람직하다. 프로모터의 상세한 설명은 전술한 바와 같다.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제 (예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물 세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전 자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

식물 원형질 또는 다양한 익스플랜드로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다 (참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 식물 수명 조절에 관여하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다: (a) 스크리닝 대상의 물질을 식물 세포에 처리하는 단계; 및 (b) 상기 식물 세포에서 상기 ore17 유전자의 발현량을 조사하는 단계.

본 발명의 방법에 따르면, 스크리닝 대상의 시료의 처리에 의해 ore17 유전자의 발현량이 증가하게 되면, 식물 수명을 연장(노화 지연)할 수 있는 물질로서 분류하게 된다.

ORE17 유전자의 발현량을 조사하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시될 수 있다. 크게는, 유전자 수준에서의 조사 및 단백질 수준에서의 조사로 구별될 수 있다. 유전자 수준에서의 조사는 본 발명자에 의해 규명된 ore17 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 제작된 프라이머를 이용한 PCR 또는 프로브를 이용한 혼성화 반응 (이 경우, DNA 마이크로어레이를 제작하여 사용하면 편리하다)을 통하여 실시할 수 있으며, 또는 노던 블럿 기술 (참조: Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press)을 이용하여 실시할 수도 있다. 단백질 수준에서의 조사는 ore17 유전자에 의해 암호화되는 단백질에 대한 항체를 이용하여 면역분석(immunoassay, 예컨대, 방사능 면역분석 방법, 방사능 면역-침전 방법, 효소-결합 면역흡착 방법 (ELISA), 도트 블롯 분석, 웨스턴 블롯, 억제 또는 경쟁 분석 및 샌스위치 분석)를 통하여 정량적으로 또는 정성적으로 실시될 수 있다 (참조: Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; 및 Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 식물 수명 조절에 관여하는 단백질을 스크리닝하는 방법을 제공한다: (a) 스크리닝 대상의 단백질을 식물 세포에서 발현시키는 단계; 및 (b) 상기 발현된 단백질이 상기 ore17 단백질과 결합하는 지 여부를 확인하는 단계.

ore17 단백질과 결합하는 단백질의 탐색은 예를 들어, 이스트 투 하이브리드 시스템 (Causier B. Mass Spectrometry Reviews, 23:350-367 (2004)) 또는 HA-tag 서열 (Aviezer-Hagai et al., J. Exp. Biol. 206:3227-3237 (2003))을 이용하여 스크리닝 대상의 단백질을 식물 세포에서 발현시켜 ore17 단백질과 결합하는 지 여부를 공동면역침전 (coimmunuprecipitation) 등의 방법을 이용하여 확인하여 실시된다 (Bevan et al., Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 애기장대 ( Arabidopsis thaliana )로부터 수명 연장 돌연변이체의 선발

애기장대 콜롬비아 야생형인 Col-O의 종자 (M1) 약 40,000개에 0.33% EMS (ethyl-methyl sulfonic acid) 용액을 8시간 동안 처리한 다음, 상기 M1 식물체로부터 자가수분에 의해 2세대 종자 (M2)를 얻었다. 식물체들은 약 23℃로 온도가 조절되는 온실에서 성장시켰으며, 연령 의존적인 식물 노화에 따른 엽록소의 감소로 인해 잎이 황화되는 정도를 육안으로 관찰하여 야생형에 비해 잎의 황화 속도가 느린 개체를 선발하여, 상기 변이체를 ore17 이라 명명하였다. 이들에 대해 잎의 노화 정도를 측정하기 위한 생체표지 (biomarker)로 사용되고 있는 광합성 효율 분석 결과로부터 실제로 이들 돌연변이 식물들이 기능상의 노화지연 식물 (functional stay-green) 임을 확인하였다. 상기에서 선발된 수명 연장 변이체 및 대조군으로 사용될 야생형 개체들은 이후의 실험에 사용하기에 앞서 22℃, 16시간 명조건/8시간 암조건으로 환경이 조절되는 생장실 (growth room, Korea Instrument Inc.)에서 생장시켰으며, 실험에는 3번 또는 4번 좌엽을 사용하였다.

<실시예 2> 수명 연장 변이체 ore17 의 연령별 광합성 효율 분석

ore17 변이체의 수명 연장 형질을 확인하기 위하여 ore17 의 잎 광합성 활성 을 측정하여 야생형 애기장대의 것과 비교하였다.

잎의 수명은 잎이 나온 후 경과 일수 (days after emergence; DAE) 후 광합성 능력이 완전히 상실되는 DAE로 하였다. 잎의 수명은 3번 및 4번 좌엽 (rosette leaf)이 완전히 자라는 12 DAE 이후부터 매 4일마다 광합성 효율을 측정하였으며, 이 때 사용한 시료 집단은 각 개체로부터 획득한 100개의 독립된 잎이다.

광합성 활성을 측정하기 위하여 오 등의 방법 (Oh S.A. et al., Plant Mol. Biol. 30: 939, 1996)을 이용하였다. 우선 각 DAE의 잎을 15분간 암처리한 후 식물 효율 분석기 (Plant Efficiency Analyzer, Hansatech Instruments, Morfolk, England)를 이용하여 엽록소의 형광을 측정하였다. 광합성 활성은 엽록소의 형광도 특성을 이용한 PSⅡ (photosystemⅡ)의 광화학적 효율 (photochemical efficiency)로 나타내었는데, 형광도 최대치 (maximum value of fluorescence; Fm)에 대한 최대 변형 형광도 (maximum variable fluorescence; Fv)의 비율 (Fv/Fm)로 나타내었다. 상기 수치가 높을수록 광합성 효율이 좋음을 나타낸다.

그 결과, 야생형은 20 DAE 이후 급격히 낮아 졌고 36 DAE 에는 모든 잎이 완전히 죽어으나 ore17의 경우 32 DAE 이후에 활성이 감소하기 시작하였고 전체 잎이 완전히 죽는데 약 50일 정도 걸렸다. 즉 변이체에서 잎의 수명이 39% 정도 연장되었음을 알 수 있었다 (도 1 참조).

이상의 결과들을 종합할 때, ore17 변이형은 일반 야생형에 비해 잎의 수명이 훨씬 긴 표현형을 갖는 것으로 나타났으며, 이러한 수명 연장의 효과는 광합성 활성감소 등으로 표현되는 노화에 따른 생화학적 변화가 야생형에 비해 늦게 나타나는 것으로부터 확인할 수 있다.

<실시예 3> 암 처리에 따른 ore17 변이체의 잎 수명 변화 조사

노화를 촉진한다고 알려진 암 처리에 따른 ore17 변이체의 잎 수명 변화를 광합성 활성 및 엽록소 함량 변화 측정을 통해 조사하였다.

애기장대 야생형 및 ore17 변이체로부터 분리한 잎(12DAE)을 3mM 2-[N-모폴리노]-에탄술폰산완충액(2-[N-morpholino]-ethanesulfonic acid, pH 5.8; 이하 'MES 완충용액'이라 한다) 20㎖에 부유시킨 후, 빛이 새지 않는 박스에 넣고 22℃에서 두면서 이틀 간격으로 25개의 독립된 잎에 대해 광합성 활성을 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였다.

또한 엽록소 함량도 측정하였다. 엽록소의 함량 측정을 위해 각 시료 잎을 80℃, 95% 에탄올로 끓여 엽록소를 추출하였다. 엽록소 함량은 648nm와 664nm의 흡광도로 측정하였으며, 잎의 중량 (fresh weight)에 대한 엽록소 농도로 표시하였다 (Vermon et al., Anal. Chem. 32:1142-1150, 1960).

그 결과, 도 2a에 도시된 바와 같이, 암 처리 후 6일째 야생형의 광합성 활성은 약 28.7%로 감소하였으나, ore17 변이체는 84.5%의 활성을 유지하는 것을 확인하였다. 또한, 도 2b에 도시된 바와 같이, 엽록소 함량도 광합성 활성과 비슷하게 ore17 변이체에서는 감소 양상이 둔화되어, 암 처리 6일 후 야생형은 약 20%의 엽록소 함량을 나타내는데 비해, ore17 변이체는 이의 약 3.5배인 69%의 엽록소 함량을 나타내는 것을 확인하였다.

<실시예 3> 식물 호르몬, 그리고 산화적 스트레스 처리에 따른 ore17 변이체의 잎 수명변화

잎의 노화는 발생학적으로 예정되어 있는 것이라고 알려져 있지만, 또한 노화의 시작과 진행은 일정한 농도의 식물 생장 억제 물질인 앱시스산 (abscisic acid; ABA), 메틸 자스모네이트 (methyl jasmonate; MeJA) 및 에틸렌 (ethylene)과 같은 식물 호르몬 (phytohormone)과 그리고 산화적 스트레스 (oxidative stress)에 의해 변화될 수 있다 (Hensel et al., Plant Cell 5:553, 1993; Weidhase et al., Physiol. Plant 69:161, 1987; Zeevaart et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 39:439, 1988). 따라서 본 실험에서는 식물 호르몬 (50 μM ABA 및 50 μM MeJA)과 산화적 스트레스 (15mM H₂O₂)의 처리에 따른 ore17 변이체의 잎 수명 변화를 광합성 활성 및 엽록소 함량 변화 측정을 통해 조사하였다.

분리한 잎에 빛을 계속 쬐어주면서 50μM MeJA, 50μM ABA, 혹은 15mM H₂O₂을 포함하는 3 mM 2-[N-몰포리노]-에탄술폰산완충액 (2-[N-morpholino]- ethanesulfonic acid; MES buffer, pH 5.8)에 부유시켰다. 이때 시료는 12 DAE에 있는 12개의 독립된 잎을 이용하였으며, 엽록소 함량 및 광합성 활성은 처리 후 2일부터 측정하였으며 측정방법은 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였다.

그 결과, MeJA, ABA, 및 과산화수소 처리 5일 후 야생형의 광합성 활성은 각 각 50%, 46%, 66%로 감소하였으나, ore17 변이체는 각각 92%, 96%, 93%로 유지하였다 (도 3a, 4a 및 5a). 또한 엽록소 함량 감소도 광합성 활성과 비슷하게 야생형의 경우 9%, 18%, 33%로 급격히 감소한 반면, ore17 변이체에서 감소 양상이 84%. 95%, 79%로 현격히 둔화됨을 확인하였다 (도 3b, 4b 및 5b). 이러한 결과들은 ore17 변이체가 노화 촉진 호르몬에 대하여 민감성이 낮고, 이들에 의한 노화의 진행을 억제함으로써 식물의 수명을 연장시킬 수 있음을 보여주는 것이다.

<실시예 4> 유전자 지도에 기초한 ORE17 유전자 클로닝 및 서열 분석

ore17에 대한 정확한 유전학적 정보를 얻기 위하여 CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) 표지를 이용하여 유전자 지도를 작성하였다.

유전자 지도 작성 (mapping) 결과 ORE17은 5번 염색체 상의 LFY 위치로부터 오른쪽으로 0.07 cM (centi Morgan) 떨어진 위치에 있으며, 보다 상세하게는 BAC MTG10에 위치한다는 것을 알 수 있었다 (도 6 참조).

상기 노화 관련 유전자가 애기장대의 5번 염색체 상에 LFY 위치로부터 오른쪽으로 0.07 cM 떨어진 위치, 보다 상세하게는 BAC MTG10에 위치하며, cDNA 서열 상 859개 아미노산을 암호화하는 2580개의 핵산으로 이루어진 유전자 (At5g62000)임을 확인하고 상기 유전자를 ORE17로 명명하였다.

ore17 로부터 1391 개체 당 각각 1개와 2개의 재조합체를 얻을 수 있는 위치인 0.03cM 과 0.7cM 위치에 있는 두 개의 CAPS 표지, MTG10-M과 K22G18-A를 발굴하였다. 상기 CAPS 표지 중 MTG10-M은 서열번호 4 및 5로 기재되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 통해 증폭된 0.5kb크기의 산물로 Col에서 유래될 경우 1개의 MseI 절단 부위를 지니지만 Ler에서 유래될 경우 MseI 절단 부위를 포함하고 있지 않아 0.5kb 크기를 그대로 유지한다. K22G18-A는 서열번호 6 및 7로 기재되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 통해 증폭된 0.7 kb 크기의 산물로서 Col에서 유래될 경우 1개의 AclI 절단 부위를 지니지만 Ler에서 유래될 경우 AclI 절단 부위를 포함하고 있지 않아 0.7kb 크기를 그대로 유지한다. 상기 CAPS 표지를 이용하여 유전자지도 작성한 결과, ORE17 유전자를 포함할 것으로 예상되는 17 kb 영역이 3개의 전사해독틀 (ORFs)을 포함함을 알 수 있었다. 이들 3개의 전사해독틀의 염기서열을 변이형과 비교한 결과, ore17 변이체에서는 전사해독틀 중 ARF-유사 인자 (Auxin response factor-like transcription factor)를 암호화하는 전사해독틀에서 하나의 염기가 G에서 A로 치환되어 있었고, 이로 인해 결국 번역 (translation)이 조기에 종료되어 야생형보다 짧은 단백질을 생성함을 알 수 있었다.

ORE17의 cDNA와 게놈 서열을 비교하였을 때 ORE17은 6개의 엑손으로 이루어져 있음이 밝혀졌다. ORE17의 cDNA 서열은 859개 아미노산을 암호화하고 있는 2580개의 염기로 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는다. 상기 유전자에 의해 암호화되는 ORE17 단백질은 B3 DNA 결합 도메인 (binding domain), 옥신 반응성 전사인자 도메인 (auxin responsive transcription factor domain), 그리고 Aux/IAA 도메인을 가지고 있다.

<실시예 5> 변이형 유전자 ore17에 의한 노화지연 효과 확인

옥신 반응성 전사인자 (Auxin responsive transcription factor; At62000) 유전자의 변이형에 의해 노화가 지연됨을 재확인하기 위해 이 전사해독틀에 T-DNA 가 삽입된 변이체 (salk_041372 변이체; / 참조)를 미국의 ABRC stock center 로부터 분양 받았다. 이 변이체를 대상으로 노화 지연 표현형을 조사하였다. 야생종 Col 와 기존 분리된 ore12 변이체를 대조군으로 넣어 상기와 같은 방법으로 광합성 효율을 측정하였다. 실험 결과, ARF-유사 인자 유전자에 T-DNA가 삽입되어 해당 유전자의 기능이 상실된 변이체에서 본 발명의 변이체와 동일한 표현형이 관찰되었다. 따라서, ORE17 유전자는 ARF-유사 인자를 암호화하는 유전자임을 최종 확인할 수 있었다 (도 7) 도 7에서 원래의 ore12 변이체는 ore12-1로, 상기의 T-DNA line은 ore12-2로 표시되었다.

본 발명의 신규 노화 조절 유전자 ORE17 및 상기 유전자로부터 발현되는 ORE17 단백질은 식물의 노화기작 연구, 노화 관련 유전자 또는 노화 억제 물질의 탐색 등에 유용하게 쓰일 수 있다. 또한 상기 유전자의 변이형인 ore17 유전자로 식물체를 형질전환 함으로써 식물의 수명을 연장시켜 생산성 향상 및 저장 효율 증대 등을 이룰 수 있다.

<110> GENOMINE INC. <120> Protein Regulating Longevity of Plant, Gene Thereof and Use Thereof <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3498 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (502)..(3078) <400> 1 gagttttgac tacctctggt taagcccatt ggtcgcctca tacccagaaa aacaaaagga 60 taggaaagac gaagaaataa aaagagagag aatgttagag agacaaactc tgagagacaa 120 aacaagagaa aatcgctcgt cgtcggtatt caagcgtctg tgactccgat aaagcctaga 180 ctagcgagga cggcgagaga gagagagaga gagctttgga gttgtcgtat ctctaaatcg 240 gaggcaattt gaggtgaaat tggtggtttt atcgtttgat tctagggttt atcttctctg 300 atagttttat cgagtaatgt caaggagcta aactagtggt gattgtgttt gttagtgaga 360 taaagacaaa ggaaggaatc aagtggacta ccgaagcgag ttttgagctt tttcagagac 420 ggatttggag atttcttgtt gatatcgtct gcttagaggc ttatttggta ccagatgaaa 480 cagatctgag cttcggaagg t atg gcg agt tcg gag gtt tca atg 525 Met Ala Ser Ser Glu Val Ser Met 1 5 aaa ggt aat cgt gga gga gat aac ttc tcc tcc tct ggt ttt agt gac 573 Lys Gly Asn Arg Gly Gly Asp Asn Phe Ser Ser Ser Gly Phe Ser Asp 10 15 20 cct aag gag act aga aat gtc tcc gtc gcc ggc gag ggg caa aaa agt 621 Pro Lys Glu Thr Arg Asn Val Ser Val Ala Gly Glu Gly Gln Lys Ser 25 30 35 40 aat tct acc cga tcc gct gcg gct gag cgt gct ttg gac cct gag gct 669 Asn Ser Thr Arg Ser Ala Ala Ala Glu Arg Ala Leu Asp Pro Glu Ala 45 50 55 gct ctt tac aga gag cta tgg cac gct tgt gct ggt ccg ctt gtg acg 717 Ala Leu Tyr Arg Glu Leu Trp His Ala Cys Ala Gly Pro Leu Val Thr 60 65 70 gtt cct aga caa gac gac cga gtc ttc tat ttt cct caa gga cac atc 765 Val Pro Arg Gln Asp Asp Arg Val Phe Tyr Phe Pro Gln Gly His Ile 75 80 85 gag cag gtg gag gct tcg acg aac cag gcg gca gaa caa cag atg cct 813 Glu Gln Val Glu Ala Ser Thr Asn Gln Ala Ala Glu Gln Gln Met Pro 90 95 100 ctc tat gat ctt ccg tca aag ctt ctc tgt cga gtt att aat gta gat 861 Leu Tyr Asp Leu Pro Ser Lys Leu Leu Cys Arg Val Ile Asn Val Asp 105 110 115 120 tta aag gca gag gca gat aca gat gaa gtt tat gcg cag att act ctt 909 Leu Lys Ala Glu Ala Asp Thr Asp Glu Val Tyr Ala Gln 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Arg Leu Val Ala Gly Asp Ala Phe 235 240 245 ata ttt cta agg ggc gag aat gga gaa tta aga gtt ggt gta agg cgt 1293 Ile Phe Leu Arg Gly Glu Asn Gly Glu Leu Arg Val Gly Val Arg Arg 250 255 260 gcg atg cga caa caa gga aac gtg ccg tct tct gtt ata tct agc cat 1341 Ala Met Arg Gln Gln Gly Asn Val Pro Ser Ser Val Ile Ser Ser His 265 270 275 280 agc atg cat ctt gga gta ctg gcc acc gca tgg cat gcc att tca aca 1389 Ser Met His Leu Gly Val Leu Ala Thr Ala Trp His Ala Ile Ser Thr 285 290 295 ggg act atg ttt aca gtc tac tac aaa ccc agg acg agc cca tct gag 1437 Gly Thr Met Phe Thr Val Tyr Tyr Lys Pro Arg Thr Ser Pro Ser Glu 300 305 310 ttt att gtt ccg ttc gat cag tat atg gag tct gtt aag aat aac tac 1485 Phe Ile Val Pro Phe Asp Gln Tyr Met Glu Ser Val Lys Asn Asn Tyr 315 320 325 tct att ggc atg aga ttc aaa atg aga ttt gaa ggc gaa gag gct cct 1533 Ser Ile Gly Met Arg Phe Lys Met Arg Phe Glu Gly Glu Glu Ala Pro 330 335 340 gag cag agg ttt act ggc aca atc gtt ggg att gaa gag tct gat cct 1581 Glu Gln Arg Phe Thr Gly Thr Ile Val Gly Ile Glu Glu Ser Asp Pro 345 350 355 360 act agg tgg cca aaa tca aag tgg aga tcc ctc aag gtg aga tgg gat 1629 Thr Arg Trp Pro Lys Ser Lys Trp Arg Ser Leu Lys Val Arg Trp Asp 365 370 375 gag act tct agt att cct cga cct gat aga gta tct ccg tgg aga gta 1677 Glu Thr Ser Ser Ile Pro Arg Pro Asp Arg Val Ser Pro Trp Arg Val 380 385 390 gag cca gct ctt gct cct cct gct ttg agt cct gtt cca atg cct agg 1725 Glu Pro Ala Leu Ala Pro Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Met Pro Arg 395 400 405 cct aag agg ccc aga tca aat ata gca cct tca tct cct gac tct tcg 1773 Pro Lys Arg Pro Arg Ser Asn Ile Ala Pro Ser Ser Pro Asp Ser Ser 410 415 420 atg ctt acc aga gaa ggt aca act aag gca aac atg gac cct tta cca 1821 Met Leu Thr Arg Glu Gly Thr Thr Lys Ala Asn Met Asp Pro Leu Pro 425 430 435 440 gca agc gga ctt tca agg gtc ttg caa ggt caa gaa tac tcg acc ttg 1869 Ala Ser Gly Leu Ser Arg Val Leu Gln Gly Gln Glu Tyr Ser Thr Leu 445 450 455 agg acg aaa cat act gag agt gta gag tgt gat gct cct gag 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gca act gat gcg tct ctc caa 2253 Leu His Glu Ser Pro Lys Val Pro Ala Ala Thr Asp Ala Ser Leu Gln 570 575 580 ggg cga tgc aat gtt aaa tac agc gaa tat cct gtt ctt aat ggt cta 2301 Gly Arg Cys Asn Val Lys Tyr Ser Glu Tyr Pro Val Leu Asn Gly Leu 585 590 595 600 tcg act gag aat gct ggt ggt aac tgg cca ata cgt cca cgt gct ttg 2349 Ser Thr Glu Asn Ala Gly Gly Asn Trp Pro Ile Arg Pro Arg Ala Leu 605 610 615 aat tat tat gag gaa gtg gtc aat gct caa gcg caa gct cag gct agg 2397 Asn Tyr Tyr Glu Glu Val Val Asn Ala Gln Ala Gln Ala Gln Ala Arg 620 625 630 gag caa gta aca aaa caa ccc ttc acg ata caa gag gag aca gca aag 2445 Glu Gln Val Thr Lys Gln Pro Phe Thr Ile Gln Glu Glu Thr Ala Lys 635 640 645 tca aga gaa ggg aac tgc agg ctc ttt ggc att cct ctg acc aac aac 2493 Ser Arg Glu Gly Asn Cys Arg Leu Phe Gly Ile Pro Leu Thr Asn Asn 650 655 660 atg aat ggg aca gac tca acc atg tct cag aga aac aac ttg aat gat 2541 Met Asn Gly Thr Asp Ser Thr Met Ser Gln Arg Asn Asn Leu Asn Asp 665 670 675 680 gct gcg ggg 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795 800 Gln Glu Phe Cys Cys Met Val Arg Lys Ile Phe Ile Tyr Thr Lys Glu 805 810 815 Glu Val Arg Lys Met Asn Pro Gly Thr Leu Ser Cys Arg Ser Glu Glu 820 825 830 Glu Ala Val Val Gly Glu Gly Ser Asp Ala Lys Asp Ala Lys Ser Ala 835 840 845 Ser Asn Pro Ser Leu Ser Ser Ala Gly Asn Ser 850 855 <210> 3 <211> 859 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 3 Met Ala Ser Ser Glu Val Ser Met Lys Gly Asn Arg Gly Gly Asp Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Ser Gly Phe Ser Asp Pro Lys Glu Thr Arg Asn Val Ser 20 25 30 Val Ala Gly Glu Gly Gln Lys Ser Asn Ser Thr Arg Ser Ala Ala Ala 35 40 45 Glu Arg Ala Leu Asp Pro Glu Ala Ala Leu Tyr Arg Glu Leu Trp His 50 55 60 Ala Cys Ala Gly Pro Leu Val Thr Val Pro Arg Gln Asp Asp Arg Val 65 70 75 80 Phe Tyr Phe Pro Gln Gly His Ile Glu Gln Val Glu Ala Ser Thr Asn 85 90 95 Gln Ala Ala Glu Gln Gln Met Pro Leu Tyr Asp Leu Pro Ser Lys Leu 100 105 110 Leu Cys Arg Val Ile Asn Val Asp Leu Lys Ala Glu Ala Asp Thr Asp 115 120 125 Glu Val Tyr Ala Gln Ile Thr Leu Leu Pro Glu Ala Asn Gln Asp Glu 130 135 140 Asn Ala Ile Glu Lys Glu Ala Pro Leu Pro Pro Pro Pro Arg Phe Gln 145 150 155 160 Val His Ser Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ala Ser Asp Thr Ser Thr His 165 170 175 Gly Gly Phe Ser Val Leu Arg Arg His Ala Asp Glu Cys Leu Pro Pro 180 185 190 Leu Asp Met Ser Arg Gln Pro Pro Thr Gln Glu Leu Val Ala Lys Asp 195 200 205 Leu His Ala Asn Glu Trp Arg Phe Arg His Ile Phe Arg Gly Gln Pro 210 215 220 Arg Arg His Leu Leu Gln Ser Gly Trp Ser Val Phe Val Ser Ser Lys 225 230 235 240 Arg Leu Val Ala Gly Asp Ala Phe Ile Phe Leu Arg Gly Glu Asn Gly 245 250 255 Glu Leu Arg Val Gly Val Arg Arg Ala Met Arg Gln Gln Gly Asn Val 260 265 270 Pro Ser Ser Val Ile Ser Ser His Ser Met His Leu Gly Val Leu Ala 275 280 285 Thr Ala Trp His Ala Ile Ser Thr Gly Thr Met Phe Thr Val Tyr Tyr 290 295 300 Lys Pro Arg Thr Ser Pro Ser Glu Phe Ile Val Pro Phe Asp Gln Tyr 305 310 315 320 Met Glu Ser Val Lys Asn Asn Tyr Ser Ile Gly Met Arg Phe Lys Met 325 330 335 Arg Phe Glu Gly Glu Glu Ala Pro Glu Gln Arg Phe Thr Gly Thr Ile 340 345 350 Val Gly Ile Glu Glu Ser Asp Pro Thr Arg Trp Pro Lys Ser Lys Trp 355 360 365 Arg Ser Leu Lys Val Arg Trp Asp Glu Thr Ser Ser Ile Pro Arg Pro 370 375 380 Asp Arg Val Ser Pro Trp Lys Val Glu Pro Ala Leu Ala Pro Pro Ala 385 390 395 400 Leu Ser Pro Val Pro Met Pro Arg Pro Lys Arg Pro Arg Ser Asn Ile 405 410 415 Ala Pro Ser Ser Pro Asp Ser Ser Met Leu Thr Arg Glu Gly Thr Thr 420 425 430 Lys Ala Asn Met Asp Pro Leu Pro Ala Ser Gly Leu Ser Arg Val Leu 435 440 445 Gln Gly Gln Glu Tyr Ser Thr Leu Arg Thr Lys His Thr Glu Ser Val 450 455 460 Glu Cys Asp Ala Pro Glu Asn Ser Val Val Trp Gln Ser Ser Ala Asp 465 470 475 480 Asp Asp Lys Val Asp Val Val Ser Gly Ser Arg Arg Tyr Gly Ser Glu 485 490 495 Asn Trp Met Ser Ser Ala Arg His Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Leu Leu 500 505 510 Ser Gly Phe Gly Thr Asn Ile Asp Pro Ser His Gly Gln Arg Ile Pro 515 520 525 Phe Tyr Asp His Ser Ser Ser Pro Ser Met Pro Ala Lys Arg Ile Leu 530 535 540 Ser Asp Ser Glu Gly Lys Phe Asp Tyr Leu Ala Asn Gln Trp Gln Met 545 550 555 560 Ile His Ser Gly Leu Ser Leu Lys Leu His Glu Ser Pro Lys Val Pro 565 570 575 Ala Ala Thr Asp Ala Ser Leu Gln Gly Arg Cys Asn Val Lys Tyr Ser 580 585 590 Glu Tyr Pro Val Leu Asn Gly Leu Ser Thr Glu Asn Ala Gly Gly Asn 595 600 605 Trp Pro Ile Arg Pro Arg Ala Leu Asn Tyr Tyr Glu Glu Val Val Asn 610 615 620 Ala Gln Ala Gln Ala Gln Ala Arg Glu Gln Val Thr Lys Gln Pro Phe 625 630 635 640 Thr Ile Gln Glu Glu Thr Ala Lys Ser Arg Glu Gly Asn Cys Arg Leu 645 650 655 Phe Gly Ile Pro Leu Thr Asn Asn Met Asn Gly Thr Asp Ser Thr Met 660 665 670 Ser Gln Arg Asn Asn Leu Asn Asp Ala Ala Gly Leu Thr Gln Ile Ala 675 680 685 Ser Pro Lys Val Gln Asp Leu Ser Asp Gln Ser Lys Gly Ser Lys Ser 690 695 700 Thr Asn Asp His Arg Glu Gln Gly Arg Pro Phe Gln Thr Asn Asn Pro 705 710 715 720 His Pro Lys Asp Ala Gln Thr Lys Thr Asn Ser Ser Arg Ser Cys Thr 725 730 735 Lys Val His Lys Gln Gly Ile Ala Leu Gly Arg Ser Val Asp Leu Ser 740 745 750 Lys Phe Gln Asn Tyr Glu Glu Leu Val Ala Glu Leu Asp Arg Leu Phe 755 760 765 Glu Phe Asn Gly Glu Leu Met Ala Pro Lys Lys Asp Trp Leu Ile Val 770 775 780 Tyr Thr Asp Glu Glu Asn Asp Met Met Leu Val Gly Asp Asp Pro Trp 785 790 795 800 Gln Glu Phe Cys Cys Met Val Arg Lys Ile Phe Ile Tyr Thr Lys Glu 805 810 815 Glu Val Arg Lys Met Asn Pro Gly Thr Leu Ser Cys Arg Ser Glu Glu 820 825 830 Glu Ala Val Val Gly Glu Gly Ser Asp Ala Lys Asp Ala Lys Ser Ala 835 840 845 Ser Asn Pro Ser Leu Ser Ser Ala Gly Asn Ser 850 855 <210> 4 <211> 557 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 4 Met Ala Ser Ser Glu Val Ser Met Lys Gly Asn Arg Gly Gly Asp Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Ser Gly Phe Ser Asp Pro Lys Glu Thr Arg Asn Val Ser 20 25 30 Val Ala Gly Glu Gly Gln Lys Ser Asn Ser Thr Arg Ser Ala Ala Ala 35 40 45 Glu Arg Ala Leu Asp Pro Glu Ala Ala Leu Tyr Arg Glu Leu Trp His 50 55 60 Ala Cys Ala Gly Pro Leu Val Thr Val Pro Arg Gln Asp Asp Arg Val 65 70 75 80 Phe Tyr Phe Pro Gln Gly His Ile Glu Gln Val Glu Ala Ser Thr Asn 85 90 95 Gln Ala Ala Glu Gln Gln Met Pro Leu Tyr Asp Leu Pro Ser Lys Leu 100 105 110 Leu Cys Arg Val Ile Asn Val Asp Leu Lys Ala Glu Ala Asp Thr Asp 115 120 125 Glu Val Tyr Ala Gln Ile Thr Leu Leu Pro Glu Ala Asn Gln Asp Glu 130 135 140 Asn Ala Ile Glu Lys Glu Ala Pro Leu Pro Pro Pro Pro Arg Phe Gln 145 150 155 160 Val His Ser Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ala Ser Asp Thr Ser Thr His 165 170 175 Gly Gly Phe Ser Val Leu Arg Arg His Ala Asp Glu Cys Leu Pro Pro 180 185 190 Leu Asp Met Ser Arg Gln Pro Pro Thr Gln Glu Leu Val Ala Lys Asp 195 200 205 Leu His Ala Asn Glu Trp Arg Phe Arg His Ile Phe Arg Gly Gln Pro 210 215 220 Arg Arg His Leu Leu Gln Ser Gly Trp Ser Val Phe Val Ser Ser Lys 225 230 235 240 Arg Leu Val Ala Gly Asp Ala Phe Ile Phe Leu Arg Gly Glu Asn Gly 245 250 255 Glu Leu Arg Val Gly Val Arg Arg Ala Met Arg Gln Gln Gly Asn Val 260 265 270 Pro Ser Ser Val Ile Ser Ser His Ser Met His Leu Gly Val Leu Ala 275 280 285 Thr Ala Trp His Ala Ile Ser Thr Gly Thr Met Phe Thr Val Tyr Tyr 290 295 300 Lys Pro Arg Thr Ser Pro Ser Glu Phe Ile Val Pro Phe Asp Gln Tyr 305 310 315 320 Met Glu Ser Val Lys Asn Asn Tyr Ser Ile Gly Met Arg Phe Lys Met 325 330 335 Arg Phe Glu Gly Glu Glu Ala Pro Glu Gln Arg Phe Thr Gly Thr Ile 340 345 350 Val Gly Ile Glu Glu Ser Asp Pro Thr Arg Trp Pro Lys Ser Lys Trp 355 360 365 Arg Ser Leu Lys Val Arg Trp Asp Glu Thr Ser Ser Ile Pro Arg Pro 370 375 380 Asp Arg Val Ser Pro Trp Lys Val Glu Pro Ala Leu Ala Pro Pro Ala 385 390 395 400 Leu Ser Pro Val Pro Met Pro Arg Pro Lys Arg Pro Arg Ser Asn Ile 405 410 415 Ala Pro Ser Ser Pro Asp Ser Ser Met Leu Thr Arg Glu Gly Thr Thr 420 425 430 Lys Ala Asn Met Asp Pro Leu Pro Ala Ser Gly Leu Ser Arg Val Leu 435 440 445 Gln Gly Gln Glu Tyr Ser Thr Leu Arg Thr Lys His Thr Glu Ser Val 450 455 460 Glu Cys Asp Ala Pro Glu Asn Ser Val Val Trp Gln Ser Ser Ala Asp 465 470 475 480 Asp Asp Lys Val Asp Val Val Ser Gly Ser Arg Arg Tyr Gly Ser Glu 485 490 495 Asn Trp Met Ser Ser Ala Arg His Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Leu Leu 500 505 510 Ser Gly Phe Gly Thr Asn Ile Asp Pro Ser His Gly Gln Arg Ile Pro 515 520 525 Phe Tyr Asp His Ser Ser Ser Pro Ser Met Pro Ala Lys Arg Ile Leu 530 535 540 Ser Asp Ser Glu Gly Lys Phe Asp Tyr Leu Ala Asn Gln 545 550 555 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Primer <400> 5 ttacttggca tttgccgctg a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Primer <400> 6 aagtgggtcc aatcggtaag t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Primer <400> 7 ggaaatgcat tcacgtagct a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Primer <400> 8 gttgtgacta gttggattga t 21

Claims (17)

1. 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 식물의 수명 조절 단백질 ORE17:
2. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질 ORE17는 B3 DNA 결합 도메인 (binding domain), 옥신 반응성 전사인자 도메인 (auxin responsive transcription factor domain) 및 Aux/IAA 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는 식물의 수명 조절 단백질 ORE17.
3. 서열번호 3에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 식물의 수명을 연장시키는 변이형 단백질 ore17:
4. 제 3 항에 있어서, 상기 변이형 단백질 ore17는 B3 DNA 결합 도메인 (binding domain) 및 옥신 반응성 전사인자 도메인 (auxin responsive transcription factor domain)를 가지며, Aux/IAA 도메인은 결여된 것을 특징으로 하는 식물의 수명을 연장시키는 변이형 단백질 ore17.
5. 상기 제 1 항 또는 제 2 항의 ORE17 단백질을 암호화하는 식물의 수명 조절 유전자 ORE17.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 유전자 ORE17는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 식물의 수명 조절 유전자 ORE17.
7. 상기 제 3 항 또는 제 4 항의 변이형 단백질 ore17 단백질을 암호화하는 식물의 수명을 연장시키는 변이형 유전자 ore17.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 변이형 유전자 ore17는 서열번호 1의 염기서열에서 1673 번째 염기인 구아닌 (guanine: G)이 아데닌 (adenine: A)으로 치환된 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 식물의 수명을 연장시키는 변이형 유전자 ore17.
9. 상기 제 5 항의 식물의 수명 조절 유전자 ORE17를 포함하는 재조합 벡터.
10. 상기 제 6 항의 식물의 수명 조절 유전자 ORE17를 포함하는 재조합 벡터.
11. 상기 제 7 항의 식물의 수명을 연장시키는 변이형 유전자 ore17를 포함하는 재조합 벡터.
12. 상기 제 8 항의 식물의 수명을 연장시키는 변이형 유전자 ore17를 포함하는 재조합 벡터.
13. 상기 제 7 항의 변이형 유전자 ore17로 식물체를 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 생산성 또는 저장 효율을 증대시키는 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 변이형 유전자 ore17는 서열번호 2의 염기서열에서 1673 번째 염기인 구아닌 (guanine: G)이 아데닌 (adenine: A)으로 치환된 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 식물의 생산성 또는 저장 효율을 증대시키는 방법.
15. 제 13 항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식물의 생산성 또는 저장 효율을 증대시키는 방법.
16. 다음의 단계를 포함하는 식물 수명 조절에 관여하는 물질을 스크리닝하는 방법:

    (a) 스크리닝 대상의 물질을 식물 세포에 처리하는 단계; 및

    (b) 상기 식물 세포에서 상기 제 7 항의 ore17 유전자의 발현량을 조사하는 단계.
17. 다음의 단계를 포함하는 식물 수명 조절에 관여하는 단백질을 스크리닝하는 방법:

    (a) 스크리닝 대상의 단백질을 식물 세포에서 발현시키는 단계; 및

    (b) 상기 발현된 단백질이 상기 제 3 항의 ore17 단백질과 결합하는 지 여부를 확인하는 단계.

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