KR100350213B1

KR100350213B1 - 애기장대로부터 분리한 식물의 잎 수명 조절 유전자 및 그변이형 유전자

Info

Publication number: KR100350213B1
Application number: KR1020000078972A
Authority: KR
Inventors: 남홍길; 우혜련
Original assignee: (주)제노마인; 학교법인 포항공과대학교
Priority date: 2000-12-20
Filing date: 2000-12-20
Publication date: 2002-08-28
Also published as: AU2002217581A1; KR20010025365A; US20040123344A1; CN1481391A; EP1353943A4; EP1353943A1; WO2002050110A1

Abstract

본 발명은 애기장대 (Arabidopsis thaliana)에서 분리된 잎 수명 조절 유전자ORE9,상기 유전자의 돌연변이형으로서 식물의 노화와 관련된 각종 생리적, 생화학적 변화를 억제하여 식물의 수명을 연장하는 변이형 유전자ore9및 이들 유전자의 이용에 관한 것이다. 구체적으로, 잎 수명 조절 유전자ORE9은 693개의 아미노산으로 구성되는 ORE9 단백질을 암호화하는데, 상기 ORE9 단백질은 F-박스 모티프 (F-box motif)와 18개의 류신이 풍부한 반복 서열 (leucine-rich repeat)을 포함하며, F-박스 모티프를 통해 노화 개시에 관여하는 단백질의 상호 작용에 영향을 미침으로써 식물의 노화를 조절한다. 또한, 상기ORE9유전자의 변이형으로서 번역이 조기에 종료되어 야생형에 비해 류신 반복 서열이 짧은 단백질을 암호화하는 변이형 유전자ore9을 갖는 식물체는 야생형에 비해 잎이 수명이 평균 27% 이상 길고, 노화 촉진 호르몬을 처리한 후에도 수명이 연장된다. 따라서, 본 발명에서 제공되는 잎의 수명 조절 유전자 및 그 변이체를 이용하여 수명 연장을 통한 식물의 생산성 향상 및 저장 효율을 증대할 수 있으며, 식물의 수명 조절에 관련된 유전자 또는 식물 노화 억제 물질을 탐색하기 위한 생체 표지 개발에 상기 유전자들을 이용할 수 있다.

Description

애기장대로부터 분리한 식물의 잎 수명 조절 유전자 및 그 변이형 유전자 {Novel gene encoding an F-box protein which regulates leaf longevity in Arabidopsis thaliana and mutant genes thereof}

본 발명은 애기장대 (Arabidopsis thaliana)에서 분리된 잎 수명 조절 유전자ORE9,상기 유전자의 돌연변이형으로서 식물의 노화와 관련된 각종 생리적, 생화학적 변화를 감소시켜 식물의 수명을 연장하는 변이형 유전자ore9및 이들 유전자의 이용에 관한 것이다.

식물의 노화 억제는 그 자체로서의 학문적 중요성뿐만 아니라 작물의 생산성이나 수확 후 저장 효율에 있어서의 개량 가능성 때문에 산업적으로도 중요성이 높다. 이에 따라 식물 노화 현상을 밝히기 위한 유전학적, 분자 생물학적, 생리학적 및 생화학적 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 수명 연장 돌연변이를 이용한 유전자 탐색 및 기능에 대한 연구는 노화 진행 속도에 영향을 주는 신호전달 경로를 밝힐 뿐만 아니라 식물 생산성 향상 및 추수 전후의 과실의 저장 효율 증가와 같은 실용적 문제 해결에 중요한 실마리를 제공한다.

노화 (senescence)는 식물이 일생을 거치는 동안 겪게 되는 마지막 단계로 노화의 개시는 식물 발달 단계에 있어 급격한 전환점이라 할 수 있으며, 이 기간동안 세포들은 물질대사 및 세포구조에 있어서 극적인 변화를 거치게 된다. 이러한 식물체 변화에 있어서 시각적으로 나타나는 대표적인 현상으로는 엽록소가 파괴되고 다른 색소가 생성되면서 나타나는 단풍을 들 수 있다. 상기 단풍기간 동안 발생하는 엽록소 파괴는 엽록체 붕괴, 그리고 광합성이나 단백질 제조와 같은 동화작용 활성 (anabolic activity)의 감소와 함께 발생한다. 또 이와 반대로 이 기간동안 많은 수의 가수분해 효소가 유도되면서 핵산 분해 (nucleic acid breakdown)나 단백질 분해 (proteolysis)와 같은 이화작용 (catabolism)이 활성화된다 (Matile P.et al., In Crop Photosysthesis: Spartial and temporal Determinant, Elservier 413-440, 1992; Nooden L.D.et al., Senescence and aging in Plant, Academic press, 1988; Thiman K.V.et al., The senescence of leaves, CRC press, 85-115, 1980). 그러나, 식물 노화는 세포가 퇴화하는 과정인 동시에 겨울철에 성장기관의 양분을 생식기관으로 이동시키는 등, 진화 과정 동안 환경에 적응하기 위해 능동적으로 획득한 유전 형질이라고 생각되고 있다.

노화는 일련의 연속된 생화학적 생리학적 현상의 진행으로 결국 세포, 기관 및 전체 개체를 죽음으로 이끈다 (Matile P.et al., In Crop Photosysthesis:Spartial and temporal Determinant, Elservier 413-440, 1992; Nooden L.D.et al., Senescence and aging in Plant, Academic press, 1988; Thiman K.V.et al., The senescence of leaves, CRC press, 85-115, 1980; Thomas H.et al.,Annu. Rev. Plant Physiol. 123:193-219, 1993). 노화의 원인에 대해서는 유전자에 의해 예정된 프로그램에 따라 진행된다는 유전자설과, 생체내에서 반복적으로 발생하는 정보 전달 오류 또는 단백질 합성 과정에서의 오류 축적에 따른 것이라는 오류 축적설로 크게 대별되는데, 최근에는 노화가 유전자에 의해서 결정된다는 유전자설이 설득력을 얻고 있다. 따라서 식물 노화에 있어서 노화에 관련된 유전자의 클로닝 및 그 유전자 기능의 탐색은 노화 과정의 연구 및 이의 조절을 위해 매우 중요한 수단이 될 수 있다. 그러나, 이러한 학문적 그리고 실용적 중요성에도 불구하고 식물 노화에 대해서는 아직도 많은 부분이 밝혀지지 않은 상태이다. 지금까지 식물의 노화에 관련된 연구들은 주로 식물 호르몬에 관련된 보고가 주류를 이루고 있으며, 분자생물학적 연구가 시작된 것은 최근의 일이다.

식물 생장 호르몬 (싸이토키닌; Cytokinin)은 생리학적으로 노화를 지연시킬 수 있는 호르몬으로 알려져 있어, 노화 관련 유전자 조절을 통한 싸이토키닌의 분비를 조절하여 노화를 지연시키려는 연구가 진행되어 왔으나, 호르몬의 영향으로 식물의 다른 생리작용에 영향을 미치는 문제가 있었다. 최근에 이러한 문제점을 해결하여 노화 특이적인 SAG12 유전자의 프로모터에 IPT 유전자를 연결하여 특정 노화 단계에서 식물 생장 호르몬의 합성이 조절되게 함으로써, 노화의 진행을 지연시켜 50% 이상의 생산성 증가를 이루면서도, 개화시기나 다른 변화가 거의 없게 하는데 성공하였다 (Gan S.et al.,Science22:1986-1988, 1995). 이외에 현재까지 노화 지연 식물체의 개발은 주로 토마토의 과실 숙성을 대상으로 하여 노화에 중요한 역할을 하는 화학물질인 에틸렌 (ethylene)의 합성을 억제하거나, 세포내 에틸렌의 양을 줄이는 방법이 시도되어 왔다 (Kleeet al., Plant Cell, 3(11):1187-93, 1991; Oelleret al., Science, 18;254(5030):437-9, 1991; Pictonet al., Plant Physiol103(4): 1471-1472, 1993).

노화를 지연시키고자 하는 분자생물학적 연구는 주로 노화 과정에서 일어나는 생화학적 변화와 관련된 활성을 갖거나 신호전달 체계에 관여하는 관련 유전자의 조작에 초점이 맞춰져 있다. 토마토의 경우, 안티센스 DNA (antisense DNA)를 이용해 세포벽 분해와 관련된 유전자 발현을 막아 토마토의 연화를 방지하여 토마토의 운송성과 저장성을 증가시키는 방법이 보고된 바 있으며 (Giovannoniet al.,Plant Cell1(1):53-63, 1989), 지질 분해에 관련되는 인지질 분해효소 D (phospholipase D)를 안티센스 DNA로 발현을 저해할 경우 식물 호르몬에 의한 노화가 지연된다는 보고도 있다 (Fanet al., Plant Cell9(12):2183-96, 1997).

그러나 식물 노화를 보다 직접적으로 조절할 수 있는 방법은 노화와 함께 발현이 변화하는 유전자 분석을 통한 분자생물학적 연구와 노화관련 돌연변이를 분리, 분석하는 유전학적 연구를 통해 얻을 수 있다.

기존의 보고에 의하면 애기장대 (Arabidopsis thaliana)의 과일 숙성기나 꽃의 노화과정에서 에틸렌 수용체의 발현이 조절되고 (Payton S.et al., Plant Mol.Biol., 31(6):1227-1231, 1996), 잎의 노화과정에서 clp 유전자 발현이 조절된다 (Nakabayashi K.et al., Plant Cell Physiol. 40(5):504-514, 1999)고 알려져 있다. 최근에는 애기장대 변이형을 이용한 잎 노화과정에 관련된 유전자 탐색 (Oh S.A.et al., Plant Mol. Biol. 30(4): 739-54, 1996) 및 이와 관련된 3군데 유전자 자리 (Oh S.A.et al., The Plant Journal, 12(3) : 527 - 535, 1997), 노화 관련 유전자인 sen1의 프로모터 활성 (Oh S.A.et al., Journal of Plant Physiology151: 339 - 345, 1997) 등이 보고된 바 있으나, 아직까지 직접적으로 노화를 조절하는 유전자 및 역할에 관한 분자생물학적 연구는 미흡한 실정이다.

이에 본 발명자들은 유전학적으로 장점이 많은 애기장대 중에서 잎의 수명이 연장되어 있는 변이체를 찾아 수명 연장에 관계되는 유전자를 탐색하고자 노력한 결과, 평균 잎의 수명이 야생형에 비해 27% 정도 긴 돌연변이체를 찾아내고 이 변이체에 대해 유전자 지도에 기초하여 해당 유전자를 탐색함으로써, 상기 노화 관련 유전자가 애기장대의 2번 염색체 상에 m429 위치로부터 4.8 ±0.5 cM 위치, 보다 상세하게는 BAC F14N22에 위치하며, cDNA 서열 상 693개 아미노산을 암호화하는 2082개의 핵산으로 이루어진 유전자임을 확인하고 상기 유전자를ORE9으로 명명하였다. 또한 상기 유전자로 코딩된 ORE9 단백질은 변형된 F-상자 모티프 및 18개의 류신이 풍부한 반복 서열을 가지고 있으면서 기존의 다른 F-상자 포함 단백질들과 비슷하게 단백질간의 결합을 조절하고, 상기 유전자의 돌연변이형인ore9의 경우 애기장대의 수명이 크게 증가함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 식물의 수명을 조절할 수 있는 유전자 및 수명이 연장된 형질을 나타내는 상기 유전자의 변이형 유전자를 제공하는 것이다. 구체적으로 본 발명은 노화 진행 속도에 영향을 주는 신호전달 경로를 밝힐 수 있을 뿐만 아니라 형질전환을 통해 식물 생산성 향상 및 추수전 후의 과실의 저장 효율 증가와 같은 실용적 문제를 해결할 수 있는 신규 노화 관련 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 애기장대 야생형 및 수명연장 변이형인 ore9에서 시간에 따른 잎 생존율 (%)을 나타낸 그래프이고 (잎이 총 엽록소의 80% 잃었을 때 죽은 것으로 하였고, 집단 크기는 각각 100개의 독립된 잎이다),

□: 야생형 ■: ore9

도 2a는 애기장대 야생형 및 수명연장 변이형인 ore9에서 엽록소 함량의 시간에 따른 변화를 나타낸 그래프이고,

□: 야생형 ■: ore9

도 2b는 애기장대 야생형 및 수명연장 변이형인 ore9에서 광합성 활성의 시간에 따른 변화를 나타낸 그래프이고 (광합성 활성은 PSⅡ의 광화학적 효율을 나타내는 Fv/Fm으로 나타냄),

□: 야생형 ■: ore9

Fv : 최대 변형 형광도 (maximum variable fluorescence)

Fm : 형광도 최대치 (maxium yield of fluorescence)

도 2c는 애기장대 야생형 및 수명연장 변이형인 ore9에서 막 이온 유출 정도의 시간에 따른 변화를 나타낸 그래프이고 (막 이온 유출 정도는 총 전도율에 대한 최초 전도율의 % 비율로 나타냄),

□: 야생형 ■: ore9

도 3은 애기장대 야생형 및 수명연장 변이형인 ore9에서 잎의 발생기간 동안 시간에 따른 노화 관련 유전자 (senescence associated genes; SAGs) 및 기타 광합성 관련 유전자들의 발현 양상을 노던 블럿 분석으로 확인한 결과이고,

CAB : 엽록소 a/b 결합 단백질 (chlorophyll a/b binding protein)

RPS17 : 엽록체 리보솜 단백질 S17 (chloroplast ribsomal protein S17)

RBCS : 리불로스 이인산 카르복시화효소 소단위체 (ribulose biphosphate carboxylase small subunit)

SEN4 : 노화 유전자 (Senescence-associated gene 4)

SEN5 : 노화 유전자 (Senescence-associated gene 5)

도 4a는 애기장대 야생형 및 수명연장 변이형인 ore9에 노화의 시작 및 진행에 영향을 미치는 식물 호르몬인 ABA (abscisic acid), MeJA (methyl jasmonate) 및 에틸렌 (ethylene)을 각각 처리한 후, 잎 수명의 변화를 광합성 효율로 나타낸 그래프이고,

검은 막대 : 식물 호르몬 미처리

흰 막대 : 식물 호르몬 처리

도 4b는 애기장대 야생형 및 수명연장 변이형인 ore9에 노화의 시작 및 진행에 영향을 미치는 식물 호르몬인 ABA (abscisic acid), MeJA (methyl jasmonate) 및 에틸렌 (ethylene)을 각각 처리한 후, 잎 수명의 변화를 엽록소 함량으로 나타낸 그래프이고,

검은 막대 : 식물 호르몬 미처리

흰 막대 : 식물 호르몬 처리

도 5a는 애기장대 게놈 내에서ORE9유전자 위치를 나타내는 유전자 지도이고,

사선 막대 :ore9돌연변이체의 보완 (complementation) 실험에 사용된 부분

도 5b는 ORE9 및 ore9 단백질의 예상 구조를 도식적으로 나타낸 그림이고,

F : F-박스 부위

흰 상자 : 류신이 풍부한 반복 서열 (Leucine Rich Repeat; LRR)

도 6은 ORE9와 F-박스 모티프를 가지고 있는 단백질간에 F-박스 부위의 아미노산 서열 상동성 비교 및 공통 서열을 나타낸 것이고,

a : 지방족 (aliphatic) 아미노산 잔기

도 7a는 효모 이중 혼성화 (yeast two hybrid) 실험에 사용한 ORE9, ORE9 유도체, ASK1 및 ASK2 단백질의 구조를 도식적 나타낸 그림이고,

검은 상자 : GAL4 DNA 결합 부분 (GAL4-BD)

사선 상자 : GAL4 전사 활성화 부분 (GAL4-AD)

도 7b는 ORE9 또는 ORE9 유도체와 ASK1 또는 ASK2 단백질로 효모 이중 혼성화 반응을 실시한 결과를 나타낸 사진이고,

좌측 상단 : 혼성화에 사용된 플라스미드 쌍 및 위치

우측 상단 : 트립토판 및 류신 결핍 SD 플레이트에서 배양한 결과

좌측 하단 : 트립토판, 류신 및 히스티딘이 결핍되어 있고, 2mM 3AT (3-amino-1,2,4-triazole)를 함유한 SD 플레이트에서 배양한 결과

우측 하단 : 형질변이체들의 β-갈락토시다제 활성

도 8은 ORE9 및 ORE9 유도체들과 GST 또는 GST-ASK1 융합 단백질을 이용하여 시험관내 결합 시험 (in vitrobinding assay)을 한 결과를 나타낸 겔 사진이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 야생형에 비해 현저히 잎의 수명이 연장된 변이형 애기장대 (Arabidopsis thaliana)로부터 탐색된, 노화 조절에 관여하는 유전자ORE9및 상기 유전자로부터 발현되는 ORE9 단백질을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 노화 조절 유전자 또는 단백질을 이용하여 식물체의 노화와 관련된 유전자 또는 노화를 억제할 수 있는 물질을 탐색하는 방법을 제공한다.

아울러 본 발명은ORE9유전자의 979 번째 염기인 C가 T로 전환되어 번역이 조기에 종료되는 변이형ore9유전자 및 상기 유전자로부터 발현되는 ore9 단백질을 제공한다. 상기 변이형ore9유전자는 식물의 수명을 연장시키는 형질을 나타내며, 이를 식물체에 형질전환 시킴으로써 수명을 연장시키는 방법도 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명에서 'ore'란 오래산다는 의미로 식물의 수명 조절에 관여하는 유전자, 단백질 또는 그로부터 발현되는 형질을 의미하기 위해 본 발명자에 의해 정의된 것이다. 구체적으로, 'ORE9유전자' 또는 'ORE9 단백질'은 각각 본 발명에서 탐색된 수명 조절 유전자 또는 단백질을 지칭하며, 'ore9유전자' 또는 'ore9 단백질'은 각각ORE9의 염기서열에 점변이가 발생하여 나타나는 애기장대의 변이형 유전자 또는 이로부터 발현된는 변이형 단백질을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 수명 조절에 관여하는 유전자를 탐색하기 위하여 먼저 수명이 연장된 형질을 나타내는 돌연변이체를 선별하였다. 이를 위해 식물의 유전학 및 분자생물학적 연구를 위한 재료로 많이 사용되는 애기장대를 실험 식물로 하였는데, 애기장대는 5개의 염색체내에 130∼140 Mbp 정도로 크기가 작고 거의 완전히 해독된 게놈을 가지고 있으며, 이에 대해 상세한 유전학적 및 물리적 지도가 완성되어 있고, 일생이 짧은 반면 많은 씨앗을 생산하고, 경작 및 형질전환이 용이하다는 장점을 가져 식물의 유전학 모델 재료로 많이 이용된다 (http://www. arabidopsis.org).

본 발명에서는 애기장대를 대상으로 잎 수명이 연장된 변이체를 선별하기 위해 EMS (ethyl-methyl sulfonic acid)를 처리하여 돌연변이를 유도한 다음, 성장한 개체들 중에서 육안으로 잎의 황화 속도가 느린 개체를 선발하고, 이들의 수명 연장 형질을 확인하기 위해 잎 생존율, 엽록소 함유량, 광합성 효율 및 이온 유출 속도 변화를 조사하였다. 상기에서 선발된 변이체를 'ore9변이체'로 명명하였으며, 이의 형질을 야생형과 비교한 결과, 변이형ore9은 평균 잎 수명이 잎이 나타난 후 31.4일 (DAE; days after emergence)로, 약 24.7 DAE의 평균 잎 수명을 나타내는 야생형에 비해 약 27.1%의 평균 수명 증가율을 나타낸다. 노화의 진행 속도에서도 24 DAE일 때 야생형은 약 50%의 엽록소가 사라졌으나,ore9변이체는 이 때 비로소 잎의 황화 현상이 시작되었다. 한편, 노화 진행의 또다른 지표인 광합성 활성 감소 및 막 이온 유출 정도에 있어서도,ore9변이체는 야생형에 비해 노화가 더디게 진행되었다.

일반적으로 잎의 노화는 유전자 내에 이미 예정되어 있는 것으로 받아들여 지고 있지만, 노화의 시작과 진행은 앱시스산 (abscicsic acid; ABA), 메틸 자스모네이트 (methyl jasmonate; MeJA) 및 에틸렌 (ethylene)과 같은 식물 호르몬에 의해 변화될 수 있다고 알려져 있다 (Henselet al., Plant Cell5:553, 1993). 따라서 이러한 식물 호르몬의 처리에 따른ore9변이체에서의 잎 수명 변화를 조사하기 위해 각각 ABA, MeJA 및 에틸렌을 처리한 후 노화의 진행을 엽록소 함량 및 광합성 활성 조사를 통해 확인하였다. 그 결과, 야생형에서는 엽록소 함량 및 광합성 활성 모두 상기 식물 호르몬을 처리하였을 때 크게 감소하여 노화가 촉진되었으나,ore9변이체에서는 그 영향이 크게 감소하여 노화 촉진 호르몬을 처리하더라도 수명이 연장될 수 있음을 보여주었다.

한편, 본 발명의 실시예에서는 상기ore9변이체에서 수명의 연장이 생리적 수준뿐만 아니라 분자 수준에서도 작용하는 것인지 확인하기 위하여, 각종 노화 관련 유전자들의 발현 양상을 노던 블럿 분석 (Northern blotting)을 통해 조사하였다. 예를 들어 광합성과 같은 동화 활성 (anabolic activity) 및 자가 유지 활성 (self-maintenance gene activity)은 잎 성장시에는 증가하다가 노화단계가 되면 감소하게 된다 (Namet al., Curr. Opin. Biotech. 8:200, 1997). 야생형의 경우 엽록소 a/b 결합 단백질 (chlorophyll a/b binding protein), 엽록체 리보솜 단백질 S17 (chloroplast ribosomal protein S17)과 같은 광합성 관련 유전자 발현과 리불로스 이인산 카르복시화효소 소단위체 (ribulose biphosphate carboxylase small subnit)와 같은 유전자의 발현은 노화 진행에 비례하여 감소하게 된다. 그러나 본 발명의ore9변이체에서는 이들 유전자의 발현에 거의 차이가 없었다. 이와 반대로 각종 노화 관련 유전자 SAG12, SEN4 및 SEN5 등의 발현은 야생형에서 노화의 진행에 따라 증가한다. 그러나 동일한 시간에ore9변이형에서는 상기 노화 관련 유전자들의 발현이 거의 증가하지 않은 것으로 확인되었다. 이러한 사실은ore9변이체의 수명 연장 효과가 생리적 수준은 물론 분자적 수준에서 나타나는 효과임을 의미한다.

상기와 같이 식물의 수명 조절에 관여하는 유전자를 찾기 위해 유전자 지도를 이용하여 해당 유전자를 탐색한 결과, 유전자 지도상에서ORE9은 애기장대 2번 염색체 상의 m429로부터 4.8 ±0.05 cM (centi Morgan) 위치, 보다 상세하게는 BAC F14N22에 위치한다. 이를 기초로 0.05 cM 및 0.1 cM 위치에 있는 두 개의 CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) 표지를 제작하여, 3개의 전사해독틀 (open reading frame)을 포함하는 10 kb 영역을 밝혔다. 이로부터ORE9유전자만을 포함하는 4.5 kb 절편을 서브클로닝하였으며, 상기 절편이ore9변이체를 보완 (complementation)하기에 충분함을 확인하였다.

본 발명에서 제공하는ORE9유전자의 염기서열 및 ORE9 단백질의 아미노산 서열은 각각서열번호 1및서열번호 2에 나타나 있다.ORE9의 변이형인ore9의 염기서열은 상기 서열번호 1의 염기서열에서 979 번째 염기인 싸이토신 (cytosine; C)이 티민 (thymine; T)로 치환되어 있다. 상기 변이형ore9유전자로부터 발현되는 ore9 단백질은 번역 (translation)이 조기에 종료됨으로써 18개의 류신 풍부 반복 서열 (leucine-rich repeats; LRR)을 갖는 정상적인 ORE9 단백질에 비해 8개의 LRR로 짧은 아미노산 서열을 가지며, 상기 단백질의 아미노산 서열은서열번호 3에 기재되어 있다.

게놈 DNA 블럿 분석 결과에 따르면,ORE9유전자는 애기장대 게놈 내에서 하나의 사본 수 (copy number)로 존재하며, cDNA와 gDNA를 비교하였을 때 6개의 엑손 (exon)으로 구성된다. 상기 유전자로부터 발현되는 ORE9 단백질은 693개의 아미노산으로 구성되는데, N-말단 부위에 F-박스 모티프 (F-box motif)를 포함하고 있으며, 18개의 류신 풍부 반복 서열을 갖는다. 상기 아미노산 서열을 데이터베이스로 검색한 결과, 옥신 (auxin) 반응에 관여하는 애기장대 TIR1과 48.4%, 인간의 CUL1 및 FBL2와 각각 46.6% 및 37.8%, 그리고 효모의 CDC4와 47.8%의 상동성을 나타내는 등, 류신 풍부 반복 서열을 포함하는 F-박스 단백질들과 관련 있는 것으로 확인되었다.

F-박스 모티프는 변성 정도가 큰 소수성 서열로서 40개의 아미노산으로 이루어진 영역 (domain)으로, 유비퀴틴화 (ubiquitination) 및 단계적 단백질 분해를 위해 유비퀴틴 접합효소 복합체의 중심부 (core)로 기질을 모으는 역할을 하는 단백질에서 발견된다 (Craiget al., Prog. Biophys. Mol. Biol. 72:299, 1999). 구체적으로, F-박스 단백질은 유비퀴틴-프로테오좀 (ubiquitine-proteosome) 경로에서 Skp1 및 Cdc53 단백질과 상호작용하여 SCF (Skp1-Cdc53-F-box)라 불리는 E3 유비퀴틴 접합효소 복합체 (E3 ubiquitine lagase complex)를 형성한다. 이러한 F-박스 단백질은 효모의 Cdc4 및 Grr1, 인간의 Skp2 및 CUL1 유사 단백질 등과 같이 척추동물 및 효모의 조절 단백질 (regulatory protein)에서 다양하게 발견된다. 최근에는 다양한 식물에서 F-박스 단백질이 확인되었고, 이들 단백질이 꽃 기관 동일성 (floral organ identity; UFO) 조절, 자스민산에 의해 조절되는 방어기작 (JA-regulated defense; Col1), 옥신 반응 (auxin response; TIR1) 및 생체시계 (circadian clock) 조절 (ZTL, FKF1) 등에도 작용하는 것으로 보고된 바 있다 (Xinet al., Science280:1091, 1998; Rueggeret al., Genes dev. 12:198, 1998; Samachet al., Plant J.20:433, 1999;Sommers et al.,Cell101:319, 2000; Nelsonet al., Cell101:331, 2000).

상기와 같이 다양한 F-박스 단백질들과 서열 상동성을 보이는 ORE9 단백질이 실제로 F-박스 단백질 활성을 나타내는지 확인하기 위해, F-박스 단백질과 결합하는 Skp1의 유사 단백질인 ASK1 및 ASK2와 ORE9 단백질이 상호작용을 할 수 있는지 효모 이중 혼성화 실험 (yeast two hybid)을 통해 조사하였다. ORE9의 F-박스 부위만을 포함하는 단편 (1-49 a.a.)과 F-박스 부위가 제거된 단편 (50-693 a.a.) 각각이 GAL4의 DNA 결합부분 (GAL4-BD)과 융합 단백질로 발현되도록 하는 플라스미드와 ASK1 또는 ASK2와 GAL4 전사 활성화 부분 (GAL4-AD)의 융합 단백질을 발현하는 플라스미드를 제작한 다음, 각 쌍의 조합을 달리 하여 효모를 형질전환 시킨 후 배양한 결과, F-박스 부위를 포함하는 ORE9과 ASK1 플라스미드를 포함하는 효모만이 히스티딘 결핍 배지에서 생장할 뿐 아니라, 이들만이 β-갈락토시다제 (β-galactosidase) 활성을 나타내었다. 반면, F-박스 부위가 제거된 ORE9 유도체는 ASK1과 결합하지 못하는 것으로 확인되었다. 또한, ASK2와 ORE9은 결합하지 않는 것으로 나타났는데, 이는 ORE9의 F-박스 부위와 ASK 단백질들 간의 결합에 특이성이 존재함을 의미한다. 결론적으로 ORE9의 F-박스 부위는 ASK1과의 결합에 필요 충분한 조건으로, 이는 ORE9이 일반적인 F-박스 단백질들과 비슷한 기능을 수행할 수 있음을 보여주는 것이다.

한편, ORE9 단백질과 ASK1과의 결합은 시험관내 실험을 통해서도 확인되었는데, 방사성 표지된 ORE9 및 그 유도체를 GST-ASK1 융합 단백질과 시험관 내에서 결합시킨 결과, ore9 변이체 단백질은 물론, F-박스 부위를 포함하는 ORE9 유도체들은 GST-ASK1과 동시 침전되었다. 이는 이들 단백질이 ASK1과 직접 결합한다는 것을 의미한다.

본 발명의 ORE9 단백질이 애기장대의 잎 수명에 영향을 미치는 기작은 두 가지 정도로 추정할 수 있다. 한 가지 가능성은 ORE9 단백질이 잎 노화 개시에 있어 음성 조절자 (negative regulator)로 작용하여 노화의 개시에 필요한 유전자의 전사를 억제하는 인자 (transcriptional repressor)를 모으는 역할을 하는 것이다.다른 가능성은 ORE9이 자가 조절 단백질의 선택적 분해에 필요한 수용체로서 작용하는 것이다. 즉, F-박스 단백질들은 유비퀴틴을 경유하는 단백질 분해 과정에 중요한 역할을 하기 때문에, ORE9이 다른 F-박스 단백질들과 마찬가지로 단백질간의 결합에 중요한 기능을 담당함으로써 자가 조절 단백질의 유비퀴틴 경로를 통한 분해를 거쳐 노화 현상을 나타내게 되는 것으로 설명할 수 있다. 이 경우ore9변이체에서 수명 연장 형질이 나타나는 것은 ore9 단백질이 야생형 ORE9에 비해 C-말단에 존재하는 WD 반복 서열 (WD repeat) 또는 LRR이 제거되어 있음으로 인해 상기 단백질들간의 결합이 약화되기 때문이라고 설명할 수 있다.

그러나, 본 발명에 의한ORE9유전자 및 단백질과ore9유전자 및 단백질에 의한 수명 조절 효과 또는 수명 연장 효과는 상기와 같은 이론에 의해 그 기작이 설명될 수 있지만, 상기 이론에 의해 구속되거나 이에 한정되어 의존하고자 하는 것은 아니다.

한편, 본 발명의ORE9유전자 및 ORE9 단백질은 식물의 노화 관련 유전자 또는 노화 억제 물질을 탐색하는 데에 유용하게 이용될 수 있다. 예를 들어,ORE9유전자와 염기 서열 등을 비교하여 높은 서열 상동성을 가진 유전자를 탐색하거나, 일부분을 탐침으로 하여, 노화물질을 처리한 식물체로부터 추출한 RNA 또는 mRNA를 주형으로 하여 제조한 cDNA와 혼성화 반응을 수행함으로써 유사 유전자를 탐색할 수 있다. 또한 직접적으로 본 발명의 유전자와 결합하는 물질, 본 유전자의 발현을 억제 또는 활성화하는 물질을 탐색하거나, 또는 ORE9 단백질과의 결합 양상을분석함으로써 노화 억제 물질을 탐색하는 용도로 사용될 수도 있다. 구체적인 방법으로는 일반적으로 사용되는 방법에 따라 DNA 칩, 중합효소 연쇄반응 (PCR) 및 노던 블럿 등을 포함하는 다양한 방법으로 분석을 수행할 수 있다.

또한, ORE9 단백질을 이용할 때는 효소면역측정 (ELISA), 단백질 칩 및 2-D 겔 분석 등을 포함하는 그룹으로부터 선택된 방법으로 ORE9 단백질 발현양상을 확인함으로써 분석을 수행할 수 있다.

한편, 본 발명은ore9변이형 유전자로 식물체를 형질전환시킴으로써 식물의 수명을 연장시키는 방법을 제공한다. 상기 변이형 유전자로 형질전환된 식물체를 제조하는 방법은 공지의 식물체 형질전환 방법을 이용할 수 있는데, 예를 들어 상기 변이형ore9유전자를 도입한 식물 형질전환용 이원벡터를 이용하여 아그로박테리움 (Agrobacterium)에 의해 매개되는 형질전환법을 이용하거나, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우 전기천공법 (electroporation), 입자충격법 (microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법 (polyethylene glycol-mediated uptake) 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 수명이 연장될 수 있는 식물로는 상치, 배추, 감자, 무를 포함하는 대부분의 쌍자엽 식물 (dicotyledonous plant) 또는 벼, 보리, 바나나 등의 단자엽 식물 (monocotyledonous plant)이 모두 이용될 수 있으며, 특히 토마토와 같이 과피가 얇아 노화에 따른 품질 저하가 급격히 나타나는 식용 채소 또는 과일 그리고 잎이 주된 상품으로 거래되는 식물 등에 적용할 경우 저장 효율을 높이는 데 효과적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 애기장대 ( Arabidopsis thaliana )로부터 수명 연장 돌연변이체의 선발

애기장대 야생형인 Col-O의 종자 (M1) 약 40,000개에 0.33% EMS (ethyl-methyl sulfonic acid) 용액을 8시간 동안 처리한 다음, 상기 M1 식물체로부터 자가수분에 의해 2세대 종자 (M2)를 얻었다. 식물체들은 약 23℃로 온도가 조절되는 온실에서 성장시켰으며, 연령 의존적인 식물 노화에 따른 엽록소의 감소로 인해 잎이 황화되는 정도를 육안으로 관찰하여 야생형에 비해 잎의 황화 속도가 느린 6개의 개체를 선발하여, 상기 변이체를 '오래 산다'는 의미로 oresara로 명명하였다 (ore1, ore2, ore3, ore9, ore10, ore11). 이들에 대해 잎의 노화 정도를 측정하기 위한 생체표지 (biomarker)로 사용되고 있는 생화학적 분석 (엽록소의 함량 분석, 광화학적 효율 분석, RNase와 peroxidase) 결과로부터 실제로 이들 돌연변이 식물들이 기능상의 노화지연 식물 (functional stay-green) 임을 확인하였다. 상기에서 선발된 수명 연장 변이체 및 대조군으로 사용될 야생형 개체들은 이후의 실험에 사용하기에 앞서 22℃, 16시간 명조건/8시간 암조건으로 환경이 조절되는 생장실 (growth room, Korea Instrument Inc.)에서 생장시켰으며, 실험에는 3번 또는 4번 좌엽을 사용하였다.

<실시예 2> 수명 연장 변이체 ore9 의 형질 발현 조사

ore9변이체의 수명 연장 형질을 확인하기 위하여ore9의 잎 엽록소 함량, 광합성 활성 및 막 이온 유출 정도를 측정하여 야생형 애기장대의 것과 비교하였다.

2-1) 잎 생존율 및 엽록소 함유량 측정

잎의 수명은 잎이 나온 후 경과 일수 (days after emergence; DAE) 중 50% 생존율을 나타내는 DAE로 하였다. 잎의 수명은 3번 및 4번 좌엽 (rosette leaf)이 완전히 자라는 12 DAE 이후부터 매 4일마다 엽록소 함유량으로 측정하였으며, 총 엽록소의 80% 이상을 잃었을 때 죽은 것으로 판단하였다. 이 때 사용한 시료 집단은 각 개체로부터 획득한 100개의 독립된 잎이다.

엽록소의 함량 측정을 위해 각 시료 잎을 80℃, 95% 에탄올로 끓여 엽록소를 추출하였다. 엽록소 함량은 648nm와 664nm의 흡광도로 측정하였으며, 잎의 중량 (fresh weight)에 대한 엽록소 농도로 표시하였다 (Vermonet al., Anal. Chem. 32:1142-1150, 1960).

그 결과도 1에 나타난 바와 같이, 야생형의 평균 수명은 약 24.7 DAE인데 반해 수명 연장 변이체인ore9잎의 평균 수명은 31.4 DAE로서 약 27.1% 증가하였다. 또한도 2a에 나타난 바와 같이, 24 DAE에서 야생형은 약 50%의 엽록소가 소실되었으나,ore9변이형의 경우 동일한 시간에 황화 현상이 시작되어 32 DAE까지도 50% 엽록소가 유지되었다.

2-2) 광합성 활성

광합성 활성을 측정하기 위하여 오 등의 방법 (Oh S.A.et al.,Plant Mol. Biol. 30: 939, 1996)을 이용하였다. 우선 각 DAE의 잎을 15분간 암처리한 후 식물 효율 분석기 (Plant Efficiency Analyzer)를 이용하여 엽록소의 형광을 측정하였다. 광합성 활성은 엽록소의 형광도 특성을 이용한 PSⅡ (photosystemⅡ)의 광화학적 효율 (photochemical efficiency)로 나타내었는데, 형광도 최대치 (maximum value of fluorescence; Fm)에 대한 최대 변형 형광도 (maximum variable fluorescence; Fv)의 비율 (Fv/Fm)로 나타내었다. 상기 수치가 높을수록 광합성 효율이 좋음을 나타낸다.

그 결과, 광합성 활성 변화 역시 엽록소 함량과 유사하게 나타나, 야생형은 20 DAE 이후 급격히 낮아 졌으나ore9의 경우 28 DAE 이후에 활성이 감소하기 시작하였다 (도 2b참조).

2-3) 막 이온 유출 정도 조사

막 이온 유출 정도는 잎으로부터 유출된 전해질을 측정함으로써 결정하였다. 애기장대 한 개체 당 2개의 잎을 채취하여 400mM 만니톨 (mannitol) 3ml에 담그고 22℃에서 3 시간동안 가볍게 흔들어 준 뒤, 전도율 측정기 (conductivity meter SC-170)을 이용해 최초 전도율 (initial conductivity)을 측정하였다. 상기 시료를 10분 동안 끊인 후 총 전도율 (total conductivity)을 측정하였고, 전도율은 총전도율에 대한 최초 전도율의 비율 (%)로 나타냈다.

막 이온의 유출은 야생형의 경우 24 DAE 이후 급격히 증가하였으며, ore9의 경우 36 DAE 이후 급격히 증가하는 양상을 나타냈다 (도 2c참조).

이상의 결과들을 종합할 때, ore9 변이형은 일반 야생형에 비해 잎의 수명이 훨씬 긴 표현형을 갖는 것으로 나타났으며, 이러한 수명 연장의 효과는 엽록소 함량 감소, 광합성 활성감소 및 막이온 유출 등으로 표현되는 노화에 따른 생화학적 변화가 야생형에 비해 늦게 나타나는 것으로부터 확인할 수 있다.

<실시예 3> ore9 변이체에서 노화 관련 유전자 발현

ore9이 노화 관련 유전자 (senescence associated genes; SAGs) 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 잎 발생 (development) 과정 동안 시간 경과에 따른 각 SAG 단백질들의 발현양상을 노던 블럿 (northern blot)을 통해 확인하였다. 시료는 야생형 잎을 기준으로 각각 완전 성숙, 10% 이하 엽록소 소실, 약 50% 엽록소 소실 시기인 12, 20, 24 DAE에서 전체 RNA를 추출하여 조사하였다. 각 레인 별로 10 ㎍의 RNA를 로딩하였으며 탐침으로는 전장 (full-length)ORE9유전자를 사용하였다.

광합성과 같은 동화 활성 (anabolic activity) 및 자가 유지 유전자 활성 (self-maintenance gene activity)은 잎 성장시 증가하다가 노화 단계에서는 감소하는 것으로 알려져 있다 (H.G. Nam,Curr. Opin. Biotech.8:200, 1997). 본 실험 결과에서도 이에 일치하는 결과가 확인되었는데, 야생형의 경우, 엽록소 a/b 결합 단백질 (chlorophyll a/b binding protein; CAB), 엽록체 리보솜 단백질 S17 (chloroplast ribsomal protein S27; RPS17)과 같이 광합성에 관련된 유전자 발현 및 리불로스 이인산 카복시화효소의 소단위체 (ribulose biphosphate carboxylase small subunit; RBCS) 유전자의 발현은 시간이 지날수록 노화에 비례하여 감소하였다. 그러나,ore9변이체에서는 이들 유전자의 발현 양상에 약간의 변화만 있을뿐 거의 변하지 않았다. 한편, SAG12, SEN4 및 SEN5 등과 같은 노화 관련 유전자들의 발현도는 야생형이 시간이 지날수록 증가하는데 비해, 변이형에서는 동일한 시간에 발현 양상이 약간 증가하거나 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 이러한 사실은ore9변이가 생리적 현상뿐만 아니라 분자 수준에서도 노화의 시작을 연기시켜 잎의 수명을 연장시킨다는 것을 의미한다.

<실시예 4> 식물 호르몬 처리에 따른 ore9 변이체의 잎 수명변화

잎의 노화는 발생학적으로 예정되어 있는 것이라고 알려져 있지만, 또한 노화의 시작과 진행은 일정한 농도의 식물 생장 억제 물질인 앱시스산 (abscisic acid; ABA), 메틸 자스모네이트 (methyl jasmonate; MeJA) 및 에틸렌 (ethylene)과 같은 식물 호르몬 (phytohormone)에 의해 변화될 수 있다 (Henselet al., Plant Cell5:553, 1993; Weidhaseet al., Physiol. Plant69:161, 1987; Zeevaartet al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.39:439, 1988). 따라서 본 실험에서는 식물 호르몬 처리에 따른ore9변이체의 잎 수명 변화를 광합성 활성 및엽록소 함량 변화 측정을 통해 조사하였다. 분리한 잎에 빛을 계속 쬐어주면서 50μM ABA 또는 50μM MeJA을 포함하는 3 mM 2-[N-몰포리노]-에탄술폰산 완충액 (2-[N-morpholino]-ethanesulfonic acid; MES buffer, pH 5.8)에 부유시켰다. 에틸렌 처리는 4.5 μM 에틸렌 가스를 포함하는 유리 상자 안에서 배양함으로써 수행하였다. 상기와 같은 식물 호르몬 처리는 계속적으로 빛을 쬐어주는 상태로 22℃에서 3일간 수행하였다. 이때 시료는 12 DAE에 있는 12개의 독립된 잎을 이용하였으며, 엽록소 함량 및 광합성 활성은 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였다.

그 결과, ABA, MeJA 및 에틸렌 처리 후 야생형의 광합성 활성은 각각 65%, 38%, 54%로 감소하였으나,ore9변이체는 각각 93%, 70%, 82%로 유지하였으며 (도 4a), 엽록소 함량 감소는 광합성 활성과 비슷하게ore9변이체에서 감소 양상이 둔화됨을 확인하였다 (도 4b). 이러한 결과들은ore9변이체가 노화 촉진 호르몬에 대하여 민감성이 낮고, 이들에 의한 노화의 진행을 억제함으로써 식물의 수명을 연장시킬 수 있음을 보여주는 것이다.

<실시예 5> 유전자 지도에 기초한 ORE9 유전자 클로닝 및 서열 분석

ore9에 대한 정확한 유전학적 정보를 얻기 위하여 CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) 표지를 이용하여 유전자 지도를 작성하였다.

유전자 지도 작성 (mapping) 결과ORE9는 2번 염색체 상의 m429 위치로부터 4.8 ±0.5 cM (centi Morgan) 위치에 있으며, 보다 상세하게는 BAC F14N22에 위치한다는 것을 알 수 있었다 (도 5a참조).

ORE9로부터 984 개체 당 각각 1개와 2개의 재조합체를 얻을 수 있는 위치인 0.05cM 과 0.1cM 위치에 있는 두 개의 CAPS 표지, F14N22.6과 F14N22.13을 개발하였다. 상기 CAPS 표지 중 F14N22.6은서열번호 4및5로 기재되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 통해 증폭된 1.2 kb크기의 산물로 Col에서 유래한 2개의DraI 절단 부위와 Ler에서 유래한 3개의DraI 절단 부위를 갖는다. F14N22.13은서열번호 6및7로 기재되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 통해 증폭된 1.2 kb 크기의 산물로서 Col에서 유래한 1개 및 Ler에서 유래한 2개의HinfI 절단 부위를 포함한다. 상기 CAPS 표지를 이용하여 지도 작성 (mapping)한 결과,ORE9유전자를 포함할 것으로 예상되는 10 kb 영역이 3개의 전사해독틀 (ORFs)을 포함함을 알 수 있었다. 이들 3개의 전사해독틀의 염기서열을 변이형과 비교한 결과,ore9변이체에서는 전사해독틀 중 한군데에서 하나의 염기가 C에서 T로 치환되어 있었고, 이로 인해 결국 번역 (translation)이 조기에 종료되어 야생형보다 짧은 단백질을 생성함을 알 수 있다 (도 5b참조).

상기ORE9유전자만을 포함하는 4.5 kb 절편을서열번호 8및서열번호 9로 기재되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 통해 GEM T easy 벡터 (Promega, 미국)에 서브클로닝 하였으며, 상기 재조합 벡터 pGTE-ORE9으로 형질전환된 대장균을 2000년 10월 31일자로 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다 (기탁번호 : KCTC 0881BP).

잠재적ORE9유전자가ore9변이체에 있어서 수명조절을 보완할 수 있는지확인하기 위하여, 상기 재조합 벡터에 삽입되어 있는ORE9유전자를 포함한 4.5 kb 절편을 pCAMBIA1300 (MRC, 미국) 벡터의BamHⅠ 위치로 서브클로닝하고ore9개체에 형질전환하여 보완실험을 수행하였다. 형질전환된 개체들을 T2 세대에서 항생제 저항성 및 표현형을 관찰한 결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이ORE9유전자를 포함하는 4.5 kb 절편이 변이체ore9을 보완할 수 있음을 확인하였다.

유전자 도입(transgenes)에 의한ore9변이체 보완 (complementation) 실험

유전형	하이그로마이신 저항성	χ²	표 현 형	χ²
유전형	Hyg^r	χ²	Hyg^s	χ²	+	-
야생형	-	-	-	25	0	-
ore9	-	-	-	0	25	-
ore9/ORE9-a	215	68	0.143 (p>0.5)	56	19	0.004 (p>0.9)
ore9/ORE9-b	231	73	0.158 (p>0.5)	53	18	0.005 (p>0.9)
ore9/ORE9-c	276	14	1.001 (p>0.1)	67	6	0.483 (p>0.1)

* X²값은 자손들이 나타낼 것이라고 예상되는 표현형 비율인 3:1 또는 15:1 (Hyg^R:Hyg^S또는 +:-)에 대한 것이다.

* Hyg^R: 하이그로마이신 저항성, Hyg^S: 하이그로마이신 민감성

+ : 야생형, - : 수명 연장형.

ore9/ORE9-a, b, c: ore9 개체에 4.5 kb 절편이 형질전환된 독립적인 3개의 T2 식물체

한편, 게놈 DNA 블럿 분석 (genomic DNA blot analysis) 결과,ORE9는 애기장대 게놈에 단일 사본 수 (single copy)로 존재하였으며 (결과는 보이지 않음),ORE9의 cDNA와 게놈 서열을 비교하였을 때ORE9는 6개의 엑손으로 이루어져 있음이 밝혀졌다.ORE9의 cDNA 서열은 693개 아미노산을 암호화하고 있는 2082개의 염기로서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는다. 상기 유전자에 의해 암호화되는 ORE9 단백질은 변형된 (degenerated) F-상자 모티프와 18개의 불완전한 LRR를 가지고 있다 (도 5b참조).

<실시예 6> SCF 복합체에서 F-상자 단백질로서의 ORE9 기능 확인

실시예 5에서 밝혀진ORE9유전자 염기 서열로부터 유추되는 폴리펩타이드 서열을 데이터베이스로 탐색한 결과 ORE9 단백질은 옥신 (auxin) 반응에 관여하는 애기장대 TIR1 (48.4%) 뿐만 아니라 인간의 CUL1 (46.6%), FBL2 (37.8%) 및 효모의 CDC4 (47.8%)와 같이 류신 풍부 반복 서열을 포함하는 F-박스 단백질 (F-box protein)들과 관련이 있는 것으로 확인되었다. F-박스 단백질은 유비퀴틴-프로테오좀 (ubiquitine-proteosome) 경로에서 Skp1 및 Cdc53 단백질과 상호작용하여 SCF (Skp1-Cdc53-F-box)라 불리는 E3 유비퀴틴 접합효소 복합체 (E3 ubiquitin ligase complex)를 형성한다 (Craiget al., Prog. Biophys. Mol. Biol. 72:299, 1999). 이에 본 실험에서는 ORE9 단백질이 SCF 복합체를 형성하는 F-박스 단백질로서 기능을 갖고 있는지 확인하기 위하여 효모 이중 혼성화 반응 (yeast two hybid) 및 시험관내 결합 실험 (in vitrobinding assay)을 통해 ORE9 단백질이 Skp1 유사 단백질과 상호작용하는지 여부를 확인하였다. 구체적으로 Skp1 유사 단백질로는 전사 인자 중 하나인 ASK1 (Arabidopsis SKP1 homolog 1) 및 ASK2를 이용하였다.

6-1) 효모 이중 혼성화를 위한 발현벡터의 제작

GAL4 DNA 결합 부분 (GAL4-BD)와 ORE9 융합 단백질을 발현하는 발현벡터로는, 각각 ORE9의 F-박스 부분인 N-말단 1-49번째 아미노산을 포함하는 부위와 상기 F-박스 부위가 제거된 50-693번째 아미노산으로 구성된 ORE9 단편을 발현하는 플라스미드 pGBT9-ORE9(1~49)[1]와 pGBT9-ORE9(50~693)[2]을 제작하였다.

먼저, ORE9 (1-49) 절편을 암호화하는 유전자를서열번호 10및서열번호 11의 프라이머를 이용한 PCR로 증폭한 다음, 4-BD 유전자 및 트립토판 영양요구성 선별 표지 유전자 (TRP1)를 포함하는 pGBT9 (Clontech, 미국)의BamHI과PstI 제한효소 자리에 삽입하여 플라스미드 pGBT9-ORE9(1-49)을 제작하였다. 마찬가지 방법으로 ORE9 (50-693) 절편과 GAL4-BD 융합 단백질을 발현하는 플라스미드 pGBT9-ORE9(50-693)를 제작하였는데, 이 때 ORE9 (50-693) 절편을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머로는서열번호 12및서열번호 13의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.

한편, 결합여부를 확인하기 위한 ASK1 (1-160) 및 ASK2 (1-172) 단백질은 각각 GAL4 전사 활성화 부분 (GAL4-AD)과 융합 단백질 형태로 발현되도록 pGAD424-ASK1(1-160)과 pGAD424-ASK2(1-172)을 제작하였다. ASK1(1-160) 유전자를 포함하는 pGTE-ASK1(1-160)을BamHI과PstI 으로 절단한 후, GAL4-AD 유전자와 류신 영양요구성 선별 표지 유전자 (LEU2)를 포함하는 pGAD424 (Clontech, 미국)에 삽입하여 ASK1과 GAL4-AD 융합 단백질을 발현하는 플라스미드 pGAD424-ASK1(1-160)[3]을 제작하였으며, ASK2는 상기와 마찬가지 방법으로 pGTE-ASK2(1-172)의BamHI/PstI 절편을 pGAD424에 삽입하여 플라스미드 pGAD424-ASK2(1-172)[4]를 제작하였다.

상기에서 제작한 플라스미드들로부터 발현되는 융합단백질의 구조를 도 7a에 개략적으로 나타내었다.

6-2) 효모 이중 혼성화 반응 (yeast two hybrid)

실험에 이용될 효모 균주 HF7c는 YPD (yeast extract, peptone, dextrose) 배지 또는 2% 덱스트로즈 (dextrose)를 포함하는 합성 최소 배지 (synthetic minimal medium; SD)에서 배양하였다.

배양액에서 자라고 있는 HF7c 효모 균주에 상기 6-1)에서 제작한 벡터를 각각 [1+3], [2+3] 및 [1+4]의 조합 (도 7b좌측상단 참조)으로 두 종류씩 리튬 아세테이트법 (lithium acetate) (Feilotter 외, 1994)으로 형질전환시켰으며, 형질전환체는 2% 덱스트로즈를 포함하는 합성 최소 배지에서 선별하였다. 상기 형질전환체들을 트립토판과 류신을 제거한 SD 배지 (도 7b우측상단) 및 트립토판, 류신 및 히스티딘을 제거하고 2mM 3AT (3-amino-1,2,4-triazole)을 포함하는 SD 배지 (도 7b좌측하단)에서 배양한 결과, F-박스 부위를 포함하는 벡터 1 [BD-ORE9 (1-49)] 및 ASK1 (1-160)을 발현하는 벡터 3 [AD-ASK1 (1-160)]으로 형질전환된 효모들만이히스티딘 결핍 배지에서 성장하였다.

그러나, F-박스 부위가 제거된 ORE9 유도체 [ORE9 (50∼693)]는 ASK1와 결합하지 않는 것으로 나타났다 (도 7b). 이러한 사실은 ORE9의 F-박스 부위가 ASK1과의 결합에 필요충분 조건임을 나타낸다. 한편 효모 이중 혼성화 실험결과 ORE9은 ASK2와 결합하지 않는 것으로 나타났는데, 이것은 ORE9의 F-박스 부위와 ASK 단백질들 사이의 결합에 특이성이 존재함을 암시한다. 그러나, 완전한 ORE9 (1-693)은 효모 이중 혼성화 실험에서 ASK1과의 결합 양성 신호를 보이지 않았다 (결과는 보이지 않음). 이는 융합 단백질의 접힘이 제대로 일어나지 않거나 (misfolding) 또는 핵으로부터 단백질의 이탈 등이 원인인 것으로 여겨진다.

한편, 형질전환체들을 합성 최소 배양 배지로 옮겨 배양한 후 자라난 효모 군체를 여과지로 옮겨 갈락토시다제 활성을 조사하였다. 여과지는 액체질소에 30초간 방치하고 0.82mM X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase)이 들어있는 Z 완충액 (60mM Na₂HPO₄, 40mM NaH₂PO₄, 10mM KCl, 1mM MgSO₄)에서 배양하였다. 여과지는 30℃를 유지하였으며, β-갈락토시다제 활성을 나타내는 색 변화가 나타나는지 관찰하였다.

그 결과, 히스티딘 결핍 배지에서 유일하게 성장 능력을 나타내었던, ORE9의 F-박스 영역을 포함하는 ORE9 [ORE9 (1-49)]과 ASK1 (1-160) 플라스미드를 포함하고 있는 효모만이 β-갈락토시다제 (β-galactosidase) 활성을 나타냈다.

6-3) 시험관내 결합 실험 ( in vitro binding assay)

ORE9 단백질 또는 그 유도체들이 ASK1과 직접적으로 결합하는지 확인하기 위하여 GST-ASK1 융합 단백질 (fusion protein)과 시험관내 번역 (in vitrotranslation)을 통해 제조한³⁵S로 표지된 ORE9 단백질에 대해 시험관내 결합 실험을 실시하였다. GST (glutathione S-transferase) 단백질 및 GST-ASK1 융합 단백질을 얻기 위해 상기 단백질 각각을 발현하는 벡터 pGEX (APBiotech 사)와 pGEX-ASK1를 제작하였다. ASK1 절편을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머로는서열번호 14및서열번호 15의 인공서열을 사용하였다. PCR 산물을EcoRI과NcoI 제한효소로 절단하여 pGEX 벡터의 상기 제한효소 자리에 삽입하였다. 이 두 벡터를 대장균 BL21(DE3) pLysS를 형질전환시키고 GST 및 GST-ASK1 융합 단백질을 발현시켰다. GST 또는 GST-ASK1 융합 단백질은 글루타치온 세파로오즈 (glutathione-Sepharose) 4B 비드 (APBiotech 사)를 이용한 크로마토그래피로 정제하였고, 정제된 단백질의 양은 SDS-폴리아크릴아마이드 (polyacrylamide) 겔로 전기영동한 다음, 쿠마시 블루 (Coomassie blue)로 염색하여 측정하였다. 동일한 양의 GST 및 GST-ASK1 융합 단백질을 미리 10배 부피 B 완충액 (20mM 염화-인산염, pH 7.6, 150mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 0.5% NP-40, 1mM DTT)으로 세 차례 씻어놓은 글루타치온 비드에 첨가한 후, 4℃에서 1시간 동안 회전 혼합기 (rotating mixer)를 이용하여 흡착시켰다. 준비된 비드는 1mL B 완충액으로 3회 세척한 후, B 완충액에 대한 슬러리의 비율이 50%가 되게 하여 보관하였다.

한편, 방사성 표지된 ORE9 (1-693), 변이형 ore9 및 ORE9 유도체들 (1-327 및 50-693)은 시험관내 전사 및 번역 시스템 (in vitrotranscription/translation system; Promega, 미국) 및 [³⁵S]-메티오닌 (DuPont NEN, 미국)을 이용하여 제조하였다. SDS-PAGE 및 BAS 방사능 분석 이미지 시스템 (radioanalytic imaging System, 일본)으로 단백질들을 정량한 후, 동일한 양의³⁵S-표지 번역 생성물 각각을 1ml GB 완충액 (최종 농도: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15% NP-40, 150mM NaCl, 1mM EDTA)에 들어있는 60㎕의 GST가 흡착된 비드 (beads) 또는 GST-ASK1 융합 단백질이 흡착된 비드와 혼합하였다. 회전 혼합기로 4℃에서 2시간 동안 배양한 후, 1ml GB 완충액으로 상기 비드를 4회 세척하고 30㎕의 2×SDS 샘플 완충액을 첨가하여 3분간 끊인 다음, SDS-PAGE로 분리하였다. 상기 겔을 완전히 건조시킨 후 X-선 필름에 감광시켰다.

그 결과, 상기 효모 이중 혼성화 실험 결과와는 달리 완전한 ORE9 (1∼693)도 ASK1과 직접 결합하는 것으로 나타났다. 또한 변이형 ore9 및 F-박스 부위를 포함하고 있는 ORE9 일부분 (1∼327)은 모두 GST-ASK1 융합 단백질과 동시 침전 (co-precipitation)되었으나, 음성대조구인 GST 단백질과는 동시 침전되지 않았다 (도 8참조). 한편 F-박스 부위가 제거된 ORE9 (50-693)은 GST-ASK1과 결합하지 않았다. 상기 결과들은 ORE9이 ASK1과 직접 결합함을 보여주는 것이다.

본 발명의 신규 노화 조절 유전자ORE9및 상기 유전자로부터 발현되는 ORE9 단백질은 식물의 노화기작 연구, 노화 관련 유전자 또는 노화 억제 물질의 탐색 등에 유용하게 쓰일 수 있다. 또한 상기 유전자의 변이형인ore9유전자로 식물체를 형질전환 함으로써 식물의 수명을 연장시켜 생산성 향상 및 저장 효율 증대 등을 이룰 수 있다.

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 식물의 수명 조절 단백질 ORE9.
제 1항에 있어서, 상기 단백질은 애기장대 (Arabidopsis thali1ana)로부터 분리한 것을 특징으로 하는, 식물의 수명 조절 단백질 ORE9.
제 1항에 있어서, N-말단에 F-박스 모티프 (F-box motif)를 가지며, 18개의 류신 풍부 반복 서열 (leucine rich repeats)을 갖는 것을 특징으로 하는 식물의 수명 조절 단백질 ORE9.
제 1항의 ORE9 단백질을 암호화하는 유전자.
제 4항에 있어서,서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는ORE9유전자.
제 4항의 식물의 수명 연장 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제 6항에 있어서,ORE9유전자를 포함하는 pGTE-ORE9 (기탁번호 : KCTC 0881BP).
서열번호 1의 염기서열에서 979 번째 염기인 싸이토신 (cytosine; C)이 티민 (thymine; T)으로 치환된, 식물의 수명을 연장시키는 변이형 유전자ore9.
제 8항의ore9유전자로부터 발현되며, F-박스 모티프와 8개의 류신 풍부 반복 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 ore9 단백질.
ORE9유전자, ORE9 단백질,ore9유전자, ore9 단백질, 이들의 절편 또는 유도체를 이용하여 식물의 노화 조절 유전자 또는 단백질을 탐색하는 방법.
제 10항에 있어서, DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응, 노던 블럿 분석,서던 블럿 분석, 효소 면역 반응 (ELISA), 2-D 겔 분석을 포함하는 방법에 의해 유전자의 서열 상동성, 혼성화 반응 또는 단백질의 결합 반응을 조사하는 것을 특징으로 하는, 식물의 노화 조절 유전자 또는 단백질을 탐색하는 방법.
ORE9 유전자의 변이형 유전자로 식물을 형질전환시켜 수명을 연장시킴으로써 식물의 생산성 및 저장 효율을 증대시키는 방법.
제 12항에 있어서, 변이형 유전자는서열번호 2의 염기서열에서 979 번째 염기인 싸이토신 (cytosine; C)이 티민 (thymine; T)으로 치환된ore9유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.