KR100510960B1 - 식물의 잎의 수명을 조절하는 유전자 및 이를 이용한식물의 수명 조절 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물의 잎의 수명을 조절하는 유전자 및 이를 이용한 식물의 수명 조절 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 애기장대로부터 분리된 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 식물의 잎 수명 조절 유전자 ORE7 및 상기 유전자를 식물체내로 도입하여 과발현시킴으로써 식물의 노화를 지연시키는 수명 조절 방법에 관한 것이다. 본 발명의 식물의 잎 수명 조절 유전자 ORE7을 이용하여 식물체를 형질전환시킴으로써 식물의 수명을 연장시켜 생산성 향상 및 저장 효율 증대 등을 도모할 수 있다. 또한, 본 발명의 ORE7 유전자 및 상기 유전자로부터 발현되는 ORE7 단백질은 식물의 노화 기작 연구, 노화 관련 유전자 또는 노화 억제 물질의 탐색 등에 유용하게 쓰일 수 있다.

Description

식물의 잎의 수명을 조절하는 유전자 및 이를 이용한 식물의 수명 조절 방법{Gene controlling life span of leaves in plants and method for controlling life span of plants using the gene}

본 발명은 식물의 잎의 수명을 조절하는 유전자 및 이를 이용한 식물의 수명 조절 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 애기장대로부터 분리된 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 식물의 잎 수명 조절 유전자 ORE7 및 상기 유전자를 식물체내로 도입하여 과발현시킴으로써 식물의 노화를 지연시키는 수명 조절 방법에 관한 것이다.

식물의 노화는 식물발생의 마지막 단계로서 노화의 개시는 식물 발달 단계에 있어 급격한 전환점이라 할 수 있다. 노화가 진행됨에 따라 식물은 점차적으로 합성능력이 저하되고 세포 내 구조물과 거대분자들이 순차적으로 분해되면서 세포의 항상성을 잃게 되고, 결국 죽음에 이르게 된다(Matile P. et al., Elservier, 413-440, 1992; Nooden L.D. et al., Academic press, 1988; Thiman K.V. et al., CRC press, 85-115, 1980, Thomas H. et al., Annu. Rev. Plant Physiol. 123:193-219. 1993). 이러한 식물의 노화는 일련의 연속된 생화학적 및 생리학적 현상으로 유전적으로 계획되어 있어 세포, 조직 및 기관의 수준에서 매우 정교하고, 능동적으로 진행된다. 그러나, 식물의 노화는 세포가 퇴화하는 과정인 동시에 겨울철에 성장기관의 양분을 생식기관으로 이동시키는 등 진화과정 동안 환경에 적응하기 위해 능동적으로 획득한 유전형질이라고 생각되고 있다.

식물의 노화는 생물학적 중요성 뿐 아니라 작물의 생산성이나 수확 후 저장 효율에 있어서의 개량 가능성 때문에 산업적으로 중요성이 높다. 이에 따라 식물의 노화 현상을 밝히기 위한 유전학적, 분자 생물학적, 생리학적 및 생화학적 연구가 활발히 진행되고 있으나, 주로 식물 호르몬에 관련된 연구보고들이 주류를 이루고 있을 뿐, 노화 조절 유전자를 이용한 노화 조절 유도 등의 노화 조절에 관한 연구에 대해서는 아직 미흡한 상태이다.

식물 생장 호르몬인 싸이토키닌(cytokinin)은 생리학적으로 노화를 지연시킬 수 있는 호르몬으로 알려져 있어, 싸이토키닌의 합성을 조절하여 노화를 지연시키려는 연구가 진행되어 왔으나, 호르몬의 영향으로 식물의 다른 생리작용에 영향을 미치는 문제가 있었다. 그러나, 최근에 노화 특이적인 SAG12 유전자의 프로모터에 IPT 유전자를 연결하여 특정 노화 단계에서 특이적으로 싸이토키닌의 합성을 조절함으로써 노화의 진행을 지연시키는데 성공하였다. 이 방법으로 노화를 지연시킨 담배의 경우, 개화시기나 다른 기형을 유도하지 않으면서 50% 이상의 생산성 증가를 이룰 수 있었다((Gan S. et al., Science, 22:1986-1988, 1995). 또한, 현재까지 노화 지연 식물체의 개발은 주로 토마토의 과일 숙성을 대상으로 하여 노화 촉진에 중요한 역할을 하는 식물 호르몬인 에틸렌(ethylene)의 합성을 억제하거나, 세포 내 에틸렌의 양을 줄이는 방법이 시도되어 왔다(Klee et al., Plant Cell, 3(11):1187-93, 1991; Picton et al., Plant Physiol. 103(4): 1471-1472, 1993).

그 외 노화를 지연시키고자 하는 연구는 주로 노화 과정에서 일어나는 생화학적 변화와 관련된 활성을 갖거나 또는 신호전달 체계에 관여하는 분해 관련 유전자의 조작에 있었다. 그 대표적인 예로는 안티센스 DNA(antisense DNA)를 이용하여 세포벽 분해와 관련된 폴리갈락투로나제(polygalacturonase) 유전자의 발현을 저해시킴으로써 토마토의 연화를 방지하여 운송성과 저장성을 증대시킨 후레바 세이바(Flavr savr)라고 하는, 상업화된 토마토가 있다(Giovannoni et al., Plant Cell, 1(1):53-63, 1989). 또한, 지질 분해에 관련되는 인지질 분해효소 D(phospholipase D)를 안티센스로 하여 발현을 저해시킬 경우, 식물 호르몬에 의한 노화가 지연된다는 연구결과가 보고된 바 있으며(Fan et al., Plant Cell, 9(12):2183-96, 1997), 최근에는 SAG12 프로모터와 옥수수의 호메오박스(homeobox) 유전자인 knI(knotted 1)이 발현되는 담배에서 잎의 노화가 지연된다는 연구결과가 보고되었다(Ori et al., Plant Cell 11: 917-927, 1999).

그러나, 식물의 노화를 보다 직접적으로 조절할 수 있는 방법은 노화 관련 유전자의 돌연변이를 분리하여 돌연변이를 일으키는 유전자를 분석하는 것이다. 기존의 보고에 의하면 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 과일 숙성기 또는 꽃의 노화과정에서 에틸렌 수용체의 발현이 조절되고(Payton S. et al., Plant Mol. Biol. 31(6):1227-1231, 1996), 잎의 노화과정에서 clp 유전자의 발현이 조절된다고 알려져 있다. 최근에는 잎 노화과정에 관련된 유전자 탐색(Oh S.A. et. al., Plant Mol. Biol. 30(4): 739-754, 1996) 및 애기장대에서 잎 노화 지연 변이체들의 분리(Oh S.A. et al., The Plant Journal, 12(3):527-535, 1997)에 관한 연구가 보고된 바 있으며, 상기 잎 노화 지연 변이체 중 ore9 변이체에서 변이 유전자를 분리하는 데 성공하였다(Woo H.R. et al., Plant Cell 13 : 1779-1790, 2001). 또한, 노화관련 유전자인 sen1의 프로모터의 활성(Oh S.A. et al., Journal of Plant Physiology, 151:339-345, 1997) 등이 보고된 바 있으나, 아직까지 직접적으로 노화를 조절하는 유전자 및 그 기능에 관한 연구는 미흡한 실정이다.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 식물의 잎의 수명을 조절하는 유전자를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 이용하여 식물의 수명을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 식물의 잎 수명 조절 유전자 ORE7을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 유전자를 식물체 내로 도입하여 상기 유전자를 과발현시킴으로써 식물의 노화를 지연시키는 수명 조절 방법을 제공한다.

본 발명에서 "수명연장 변이체 ore7" 또는 " ore7 변이체"란, 엑티베이션 태깅 방법(activation tagging method)에 의해 ORE7 유전자가 활성화되어 노화 지연 표현형을 나타내는 돌연변이체를 의미하는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 수명 조절에 관여하는 유전자를 탐색하기 위하여, 수명이 연장된 형질을 나타내는 돌연변이체를 선별하였다. 이를 위해 식물의 유전학 및 분자생물학적 연구를 위한 재료로 많이 사용되는 애기장대를 실험 식물로 하였다. 현재까지 유전자의 기능을 밝히기 위해 일반적으로 사용되는 돌연변이 유도 방법에는 크게 세 가지 방법이 있다. 첫 번째는 화학적 방법으로 EMS(ethyl-methyl sulfonic acid) 등의 화학물질을 처리하는 방법이다. 두 번째는 X-선 또는 감마선을 조사하여 돌연변이를 유도하는 것이고, 세 번째는 토양세균인 아그로박테리움(Agrobacterium)의 T-DNA를 이용하여 형질전환함으로써 돌연변이를 유도하는 방법이다. 상기 화학물질 처리, X-선 또는 감마선 조사, 또는 T-DNA 삽입(insertion)에 의해 돌연변이를 유도하는 방법은 원래의 유전자의 일부 혹은 전부가 파괴되면서 유전자가 가지고 있는 고유의 기능이 상실되게 되므로, 이를 이용하여 그 유전자의 기능을 유추할 수 있다. 그러나, 이러한 방법에 의해 형성된 돌연변이는 대부분 열성변이이고, 만일 파괴된 유전자와 유사한 기능을 지닌 다른 유전자가 게놈 내에 존재할 경우, 연관성을 띠는 다른 유전자의 존재에 의해 표현형이 나타나지 않는다. 또한, 파괴된 유전자가 중요한 유전자일 경우에는 식물의 치사(lethality)를 유발할 수 있는 단점이 있다.

이에 반해, 본 발명에서 사용한 액티베이션 태깅 방법은 T-DNA가 식물의 유전자의 염기서열을 파괴하지 않고, 그 유전자의 발현을 인위적으로 활성화(activation)시키므로, 기능이 중복된 유전자가 애기장대 게놈의 다른 위치에 존재하더라도 표현형을 유도할 수 있는 장점을 가진 방법이다(Weigel et al., Plant Physiology 122:1003-1014, 2000). 보다 구체적으로 말하면, 상기 엑티베이션 태깅 방법은 T-DNA와 경계를 이루고 있는 주변의 DNA를 쉽게 분리할 수 있도록 T-DNA 내에 선별 마커와 대장균에서 복제에 필요한 복제 기원(replication origin), 그리고 앰피실린 저항성 유전자를 가지고 있으며, 그 T-DNA 오른쪽 경계면내에 35S CaMV 인핸서(35S CaMV enhancer) 4개를 가지고 있는 엑티베이션 태깅 벡터를 사용한다. 따라서, T-DNA가 식물의 게놈 내로 도입되면, 삽입부위 주변의 유전자를 활성화시켜 변이체를 유도하게 된다(도 6 참조). 이 경우, 기능이 유사한 다른 유전자가 존재하더라도 인핸서에 의해 활성화된 유전자에 의해 표현형이 나타날 수 있다. 따라서, 엑티베이션 태깅 방법을 노화조절 유전자를 찾는데 적용할 경우, 기능을 상실한 돌연변이("loss of function" mutation) 접근 방법으로 찾을 수 없는 새로운 노화 조절 유전자를 찾을 수 있는 가능성이 매우 크다. 뿐만 아니라, 엑티베이션 태깅 방법은 우성변이를 유발하여 돌연변이의 표현형이 한세대 일찍 관찰되는 장점을 지니고 있다. 따라서, 본 발명자들은 액티베이션 태깅 방법으로 생산된 애기장대 변이체들 중에서 잎의 수명이 연장되어 있는 변이체를 찾아 수명연장에 관계되는 유전자를 탐색하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 애기장대를 대상으로 잎 수명이 연장된 변이체를 제조하기 위해, 액티베이션 태깅 벡터 pSKI015를 이용하여 변이체를 생산한 다음, 성장한 개체들 중에서 육안으로 잎의 황화 속도가 느린 개체를 선발하고, 선발된 개체를 'ore7 변이체'라 명명하였다. 이후, 상기 ore7 변이체의 수명연장 형질을 확인하기 위해, 광합성 활성 및 엽록소 함유량의 변화를 조사하였다. 그 결과, 야생종의 경우 발아 후 40일(40 DAG; Days after germination)이 지나면 광합성 활성 및 엽록소의 함량이 완전히 사라졌으나, 수명연장 변이체 ore7에서는 이 시기에 100%의 광합성 활성과 78% 정도의 엽록소 함량을 나타내었다(도 1의 B 및 C 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 ore7 변이체의 잎 수명연장이 생리적 수준에서뿐만 아니라 분자 수준에서도 작용하는 것인지 확인하기 위해, 각종 노화관련 유전자들의 발현양상을 노던 블럿 분석(northern blot analysis)을 통해 조사하였다. 이미 노화단계에서 발현이 증가되는 유전자로 알려진 두 유전자, 즉 SEN4와 SAG12 유전자의 발현이 야생종에서는 노화진행에 따라 급격히 증가된 반면, ore7 변이체에서는 상기 노화관련 유전자들의 발현이 거의 증가하지 않는 것으로 나타났다. 이와 반대로 광합성과 같은 동화 작용에서 증가되는 엽록소 a/b 결합 단백질(chlorophyll a/b binding protein) 유전자의 발현은 노화진행에 비례하여 야생종에서 크게 감소하였고, ore7 변이체에서는 상기 유전자의 발현에 거의 차이가 없었다(도 1의 D 참조).

한편, 일반적으로 잎의 노화는 유전자 내에 이미 예정되어 있는 것으로 받아들여지고 있지만, 노화의 진행은 암 처리(dark treatment)에 의해 가속시킬 수 있다(Oh et al., Plant J. 12: 527-535, 1997). 따라서, 본 발명자들은 암 처리에 따른 ore7 변이체의 잎 수명 변화를 광합성 활성 및 엽록소 함량 변화 측정을 통해 조사하였다. 암 처리에 의한 노화진행정도를 비교한 결과, 야생종의 경우 암 처리 5일 정도에 엽록소 및 광합성 활성이 크게 감소되었으나, ore7 변이체의 경우 각각 3%와 22% 정도만이 감소되었다(도 2의 B 및 C 참조). 나아가, 노화분자 지표인 SEN4 유전자의 발현을 분석한 결과, ore7 변이체와 비교해 볼 때, 야생종에서 SEN4의 발현이 크게 증가된 것을 볼 수 있었다(도 2의 D 참조).

또한, 잎의 노화는 앱시스산(abscisic acid; ABA), 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate; MeJA) 및 에틸렌(ethylene)과 같은 식물 호르몬에 의해서도 촉진된다고 알려져 있다(Hensel et al., Plant Cell 5:553-564, 1993). 따라서, 상기 식물 호르몬의 처리에 따른 ore7 변이체에서의 잎 수명의 변화를 조사하기 위해, 각각 상기 ABA, MeJA 및 에틸렌을 처리한 후, 노화의 진행을 엽록소 함량 및 광합성 활성 조사를 통해 확인하였다. 그 결과, 야생종에서는 엽록소 함량 및 광합성 활성 모두 상기 식물 호르몬을 처리하였을 때 크게 감소하여 노화가 촉진되었으나, ore7 변이체에서는 그 영향이 크게 감소하여 노화 촉진 호르몬을 처리하더라도 수명이 연장될 수 있음을 보여주었다(도 3 및 도 4 참조). 나아가, 노화분자 지표인 SEN4 유전자의 발현을 분석한 결과, ore7 변이체와 비교해서 야생종에서 SEN4의 발현이 크게 증가된 것을 볼 수 있었다(도 5 참조). 이는 수명지연 효과가 생리적 수준 및 분자적 수준에서 나타나는 효과임을 의미하는 것이다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기의 ore7 변이체에서 식물의 수명연장에 관련된 유전자를 플라스미드 레스큐 방법(plasmid rescue method)(Weigel et al., Plant Physiology 122:1003-1014, 2000)을 이용하여 분리하였다. 이후, 상기 플라스미드 레스큐 방법으로 분리된 T-DNA 삽입 부위 주변의 DNA 조각의 염기서열을 결정하였다.

결정된 염기서열을 애기장대 게놈 데이터 베이스(database)에서 탐색한 결과, 인핸서와 가장 근접하게 위치하고 있는 전사해독틀(open reading frame)을 찾아내었다. 분리된 유전자는 하나의 엑손(single exon)으로 되어있고, 311개의 아미노산을 암호화하는 936개의 핵산으로 이루어진 유전자임을 확인하였으며, 상기 유전자를 'ORE7'이라 명명하였다. 상기 ORE7 유전자의 염기서열은 서열번호 1에 기재되어 있다. 상기 결정된 ORE7 유전자의 염기서열로부터 유추되는 펩타이드 서열을 데이터 베이스(database)에서 탐색한 결과, ORE7 유전자로부터 발현되는 단백질은, 서열번호 2에 기재된 바와 같이, 311개의 아미노산으로 구성되었으며, AT-고리 모티프(AT-hook motif)를 포함하고 있음을 확인하였다. AT-고리 모티프는 목적유전자(target gene)의 프로모터의 AT-풍부 부위(AT-rich region)에 결합하여 직접 전사 인자(transcription factor)로 존재하거나 전사 인자가 프로모터에 근접하게 갈 수 있도록 도와주는 전사 조절자(transcription regulator)로서 작용하기도 하고, 또는 히스톤(histone)과 같이 염색체 구성(chromosome architecture)에 관여하기도 하는 것으로 알려져 있다(Aravind et al., Nucleic Acids Res. 26(19): 4413-4421, 1998). 또한, 상기 ORE7 단백질은 전사 조절자들에서 많이 발견되는 글리신-, 히스티딘-, 글루타민- 및 글루탐산-풍부 모티프(glycine-, histidine-, glutamine-, and glutamic acid-rich motif)(Abraham et al., Gene 255:389-400, 2000; Fujimoto et al., Biochem Biophys Res Commun. 280(1):164-71, 2001)를 가지고 있음을 확인하였다.

ore7 변이체의 노화지연 표현형이 상기 ORE7 유전자의 과발현에 의한 것인지 확인을 하기 위해, 상기 ORE7 유전자를 탐침으로 하여 노던 블럿 분석을 수행하였다. 그 결과, 야생종에서는 상기 ORE7 유전자의 발현이 관찰되지 않았으나, ore7 변이체에서는 과다발현되고 있음이 관찰되었다(도 7 참조). 또한, 상기 ORE7 유전자를 다시 야생종 애기장대에 과발현하도록 재도입시켜 잎 노화 지연 표현형이 재현되는지 조사하였다. 이 때, 사용되는 벡터로는 공지의 식물 형질전환용 벡터라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 보다 바람직하게는 pCAMBIA3301 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 사용되는 형질전환 숙주로는 아그로박테리움 속 미생물이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜메파시엔스 AGL1 균주(Agrobacterium tumefacience AGL1 strain)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주를 'pAT-ORE7'이라 명명하였으며, 이를 2001년 8월 8일자로 한국 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하였다(기탁번호:KCTC 10032BP).

이후, 상기 아그로박테리움 pAT-ORE7을 이용하여 플로랄 딥 방법(floral dip method)(Clough et al., Plant J., 16(6):735-743, 1998)에 따라 애기장대 야생종 콜롬비아(Columbia)를 형질전환하였으며, 형질전환된 애기장대에서 수명연장 표현형이 재현됨을 확인함으로써, 본 발명에 따른 ORE7 유전자가 애기장대의 잎 노화를 억제하는 유전자임을 알 수 있었다.

본 발명의 ORE7 유전자로부터 발현되는 단백질의 서열 분석 결과, 그 서열 내에 전사 인자나 전사조절자들에게서 발견되는 서열이 존재함을 확인할 수 있었다. 이를 통해 상기 ORE7 유전자로부터 발현되는 ORE7 단백질이 핵 속에서 유전자 발현을 조절하는 전사 인자 또는 전사 조절자로 추정되었다. 따라서, 본 발명자들은 상기 ORE7 유전자가 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein; GFP)과 융합단백질(fusion protein)로 발현되도록 카인 등의 방법(Kain et al., Biotechniques 19(4): 650-655, 1995)에 따라 재조합 플라스미드를 제작하고, 이를 양파의 표피세포에 도입하여 GFP-ORE7 융합단백질이 발현되는 장소를 형광 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, GFP의 발현이 핵에서 나타남을 확인할 수 있었다(도 8 참조). 이는 ORE7 단백질이 핵으로 이동되어 핵 속에서 기능을 수행한다는 것을 보여주는 것이다.

본 발명의 ORE7 유전자는 잎 노화 개시를 조절하는 전사 인자(transcription factor)를 억제하는 전사 억제자(transcription repressor)로 작용할 수도 있고, 또는 직접적으로 노화 개시 및 진행을 억제하는 음성 조절자(negative regulator)로서 작용할 수도 있다. 다른 가능성으로는, 본 발명의 ORE7 유전자가 노화억제 호르몬인 싸이토키닌(cytokinin)이나 옥신(auxin)과 같은 호르몬을 증가시켜 간접적으로 노화를 억제하는 기능을 보일 수도 있다.

한편, 본 발명은 ORE7 유전자가 과발현하도록 제작된 벡터를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물의 수명을 연장시키는 방법을 제공한다. 상기 ORE7 유전자가 과발현되는 형질전환 식물체를 제조하는 방법은 공지의 식물체 형질전환 방법을 이용할 수 있는데, 예를 들어 상기 ORE7 유전자를 도입한 식물 형질전환용 이원벡터를 이용하여 아그로박테리움(Agrobacterium)에 의해 매개되는 형질전환법을 이용할 수 있다. 또한, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake) 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 수명이 연장될 수 있는 식물로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화,백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류가 모두 이용될 수 있으며, 특히 토마토와 같이 과피가 얇아 노화에 따른 품질 저하가 급격히 나타나는 식용 채소 또는 과일, 그리고 잎이 주된 상품으로 거래되는 식물 등에 적용할 경우, 저장 효율을 높이는데 효과적이다.

또한, 본 발명의 ORE7 유전자 및 ORE7 단백질은 식물의 노화 관련 유전자 또는 노화 억제 물질을 탐색하는 데에 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명의 유전자와 결합하는 물질, 상기 ORE7 유전자의 발현을 억제 또는 활성화하는 물질을 탐색함으로써 노화 억제 물질을 탐색하는 용도로 사용될 수도 있다. 구체적으로 일반적으로 사용되는 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응(PCR), 노던 블럿 분석, 서던 블럿 분석(southern blot analysis), 효소 면역 반응(ELISA), 2-D 겔 분석 등을 포함하는 다양한 방법으로 분석을 수행할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

애기장대( Arabidopsis thaliana )로부터 수명연장 돌연변이체의 선발

먼저, 애기장대로부터 돌연변이를 유도하기 위하여, 엑티베이션 태깅 벡터인 pSKI015(Weigel et al., Plant Physiology 122:1003-1014, 2000)(미국 Weigel 실험실에서 분양받음)를 공지의 전기천공법(eletroporation)을 이용하여 아그로박테리움 튜메파시엔스 ABI 균주(Agrobacterium tumefacience ABI strain)(미국 Amasino 실험실에서 분양받음)에 도입시킨 후, 카나마이신(kanamycin)과 카베니실린(carbenicillin)이 포함된 배지에서 형질전환체를 선발하였다. 이후, pSKI015 벡터가 도입된 아그로박테리움 균주로 플로랄 딥 방법(Clough et al., Plant J., 16(6):735-743, 1998)에 따라 애기장대 야생종 콜롬비아(columbia)를 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 애기장대로부터 종자를 받아 제초제에 저항성이 있는 형질전환체를 선별하였다. 그리고 나서, 약 23℃로 온도가 조절되는 온실에서 5000개의 T1 라인을 성장시켰으며, 연령 의존적인 식물노화에 따른 엽록소의 감소로 인해 잎이 황화되는 정도를 육안으로 관찰하였다. 이후, 야생종에 비해 잎의 황화 속도가 느린 변이체 1개의 라인을 선발하였으며, 상기 변이체를 'ore7'이라 명명하였다. 도 1의 A에 애기장대 야생종 및 수명연장 변이체 ore7에서 시간에 따른 잎의 노화를 보여주는 양상을 나타내었다.

<실시예 2>

수명연장 변이체 ore7 의 형질 발현 조사

ore7 변이체의 노화지연 형질을 확인하기 위하여, T2 세대에서 20 DAG 이후부터 3번 좌엽(rosette leaf)을 매 5일마다 육안관찰, 잎 엽록소 함량, 광합성 활성을 측정하여 야생종 애기장대와 비교하였다. 이 때 사용한 시료 집단은 각 개체로부터 획득한 25개의 독립된 잎이다.

2-1) 엽록소 함유량 측정

엽록소의 함량 측정을 위해 각 시료 잎을 80℃, 95% 에탄올로 끓여 엽록소를 추출하였다. 엽록소 함량은 648nm와 664nm의 흡광도로 측정하였으며, 잎의 중량 (fresh weight)에 대한 엽록소 농도로 표시하였다(Vermon et al., Anal. Chem. 32:1142-1150, 1960). 그 결과, 도 1의 B에 도시된 바와 같이, 엽록소 함량 야생종의 경우, 25 DAG 이후 급격한 감소를 보이며 40 DAG에는 엽록소의 함량이 0%가 되었으나, ore7 변이체의 경우, 40 DAG에도 초기의 70% 이상의 엽록소 함량을 보임을 확인할 수 있었다.

2-2) 광합성 활성 측정

오 등의 방법(Oh et al., Plant Mol. Biol. 30: 939, 1996)을 이용하여 광합성 활성을 측정하였다. 우선 각 DAG의 잎을 15분간 암 처리한 후, 식물 효율 분석기(Plant Efficiency Analyzer)(Hansatech)를 이용하여 엽록소의 형광을 측정하였다. 광합성 활성은 엽록소의 형광도 특성을 이용한 PSⅡ(photosystemⅡ)의 광화학적 효율(photochemical efficiency)로 나타내었는데, 형광도 최대치(maximum value of fluorescence; Fm)에 대한 최대 변형 형광도(maximum variable fluorescence; Fv)의 비율(Fv/Fm)로 나타내었다. 상기 수치가 높을수록 광합성 활성이 우수함을 나타낸다. 그 결과, 도 1의 C에 도시된 바와 같이, 야생종은 30 DAG 이후 급격히 감소하기 시작해 40 DAG에는 활성이 대부분 사라졌으나, ore7 변이체의 경우 40 DAG 이후에 활성이 감소하기 시작했고, 진행정도도 매우 느려 70 DAG에도 60% 정도의 광합성 활성이 유지됨을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, ore7 변이체는 일반 야생종에 비해 잎의 수명이 훨씬 긴 표현형을 갖는 것으로 나타났으며, 이러한 수명연장의 효과는 엽록소 함량 감소 및 광합성 활성 감소로 표현되는 노화에 따른 생화학적 변화가 야생종에 비해 늦게 나타나는 것으로부터 확인할 수 있다.

<실시예 3>

ore7 변이체에서 노화 관련 유전자의 발현 조사

야생종과 ore7 변이체에서 노화 관련 유전자(senescence associated gene; SAG)들의 발현을 비교하기 위해, 잎 발생(development)과정 동안 시간 경과에 따른 각 SAG 유전자들의 발현양상을 노던 블럿 분석을 통해 확인하였다. 트리-시약(Tri-reagent, Sigma)을 이용하여 22, 26, 30, 34 및 38 DAG의 각 잎에서전체 RNA를 추출한 후, 이들을 시료로 사용하여 분석을 수행하였다(Woo H. R. et al., Plant Cell 13:1779-1790, 2001). 각 레인 별로 10 ㎍의 RNA를 로딩하였으며, 탐침(probe)으로는 SAG12, SEN4 및 Cab 유전자를 사용하였다.

그 결과, 도 1의 D에 도시된 바와 같이, 야생종의 경우, 엽록소 a/b 결합 단백질(chlorophyll a/b binding protein; CAB)과 같은 광합성에 관련된 유전자의 발현은 시간이 지날수록 노화에 비례하여 감소하였다. 그러나, ore7 변이체에서는 이들 유전자의 발현 양상이 약간의 변화만 있을 뿐 거의 변하지 않았다. 한편, SAG12 및 SEN4와 같은 노화 관련 유전자들의 발현도는 야생종에서 시간이 지날수록 증가하는데 비해, ore7 변이체에서는 동일한 시간에 발현 양상이 약간 증가하였으나, 거의 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 이러한 사실은 ore7 변이체가 생리적 현상뿐만 아니라 분자 수준에서도 노화의 시작을 연기시켜 잎의 수명을 연장시킨다는 것을 의미한다. 또한, 상기 실험의 결과는 광합성과 같은 동화 활성(anabolic activity) 및 자가 유지 유전자 활성(self-maintenance gene activity)은 잎 성장시 증가하다가 노화 단계에서는 감소하는 것으로 보고된 연구결과와도 일치하는 것이다(H.G. Nam, Curr. Opin. Biotech. 8:200, 1997).

<실시예 4>

암 처리에 따른 ore7 변이체의 잎 수명 변화 조사

노화를 촉진한다고 알려진 암 처리에 따른 ore7 변이체의 잎 수명 변화를 광합성 활성 및 엽록소 함량 변화 측정을 통해 조사하였다.

애기장대 야생종 및 ore7 변이체로부터 25 DAG에 있는 12개의 독립된 잎을 분리하여 이를 3mM 2-[N-모폴리노]-에탄술폰산완충액(2-[N-morpholino]-ethanesulfonic acid, pH 5.8; 이하 'MES 완충용액'이라 한다) 2㎖에 부유시킨 후, 빛이 새지 않는 박스에 넣고 22℃에서 두면서 매일 25개의 독립된 잎에 대해 광합성 활성 및 엽록소 함량을 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과, 도 2의 B에 도시된 바와 같이, 암 처리 후 5일째 야생종의 광합성 활성은 60%로 감소하였으나, ore7 변이체는 97%의 활성을 유지하는 것을 확인하였다. 또한, 도 2의 C에 도시된 바와 같이, 엽록소 함량도 광합성 활성과 비슷하게 ore7 변이체에서는 감소 양상이 둔화되어, 암 처리 5일 후 야생종은 25%의 엽록소 함량을 나타내는데 비해, ore7 변이체는 이의 3배인 75%의 엽록소 함량을 나타내는 것을 확인하였다.

또한, 노화분자 지표인 SEN4 유전자의 발현을 상기 실시예 3과 동일한 방법에 따라 조사하였다. 그 결과, 도 2의 D에 도시된 바와 같이, ore7 변이체에 비해 야생종에서 SEN4의 발현이 크게 증가된 것을 볼 수 있었다.

<실시예 5>

식물 호르몬 처리에 따른 ore7 변이체의 잎 수명 변화 조사

또한, 본 발명에서는 노화 조절에 관여하는 ABA, MeJA 및 에틸렌과 같은 식물 호르몬 처리에 따른 ore7 변이체의 잎 수명 변화를 광합성 활성 및 엽록소 함량 변화 측정을 통해 조사하였다. 25 DAG에 있는 12개의 독립된 잎을 50μM ABA 또는 50μM MeJA을 포함하는 MES 완충용액 2㎖에 부유시켰다. 에틸렌 처리는 애기장대를 4.5μM 에틸렌 가스를 포함하는 유리 상자 안에서 배양함으로써 수행했다. 또한, 음성대조구는 ABA 또는 MeJA를 첨가하지 않은 MES 완충용액을 이용하였다. 상기와 같은 식물 호르몬 처리는 계속적으로 빛을 쬐어주는 상태로 22℃에서 3일간 수행했다. 이후, 엽록소 함량 및 광합성 활성을 상기 실시예 2와 동일한 방법에 따라 측정하였다.

그 결과, 도 3의 A 및 도 4의 A에 도시된 바와 같이, 음성대조구의 경우(ABA 또는 MeJA를 첨가하지 않은 MES 완충용액만을 처리했을 때의 경우), 야생종 및 ore7 변이체의 광합성 활성 및 엽록소 함량에 아무런 변화가 없었다. 그러나, 도 3의 B 내지 D에 도시된 바와 같이, ABA, MeJA 및 에틸렌 처리 후 야생종의 광합성 활성은 처리 2일 후부터 급격히 감소하였으나, ore7 변이체는 감소정도가 상당히 작았다. 또한, 도 4의 B 내지 D에 도시된 바와 같이, 엽록소 함량 감소도 광합성 활성과 비슷하게 ore7 변이체에서 감소 양상이 둔화됨을 확인하였다. 이러한 결과들은 ore7 변이체가 노화 촉진 호르몬에 대하여 민감성이 낮고, 이들에 의한 노화의 진행을 억제함으로써 식물의 수명을 연장시킬 수 있음을 보여주는 것이다.

<실시예 6>

ORE7 유전자의 클로닝 및 서열 분석

ore7 변이체로부터 인핸서에 의해 활성화된 T-DNA 주변의 유전자를 탐색하기 위해, 플라스미드 레스큐 방법(Weigel et al., Plant Physiology 122:1003-1014, 2000)에 따라 유전자를 분리하였다. 도 6에 엑티베이션 태깅 벡터 pSKI015가 수명연장 변이체 ore7 게놈 내로 삽입된 모식도를 도시하였다. 먼저, ore7 변이체로부터 델라포타 등의 방법(Dellaporta et al., Plant Mol. Biol. Rep. 1:19-21, 1983)에 따라 전체 게놈을 분리하였다. 이후, 5㎍의 게놈 DNA를 EcoRⅠ 제한효소로 절단하고 에탄올 침전(ethanol precipitation)을 시킨 후 건조하였다. 절단된 DNA를 자가 연결(self-ligation)하여, 이를 이용하여 DH5α를 형질전환시킨 후, 엠피실린에 저항성을 지니는 콜로니를 선발하였다. 상기 선발된 콜로니로부터 플라스미드를 분리하여 플라스미드 레스큐 방법에 사용하였던 EcoRⅠ 부위 하류(EcoRⅠ site downstream)에 있는 염기서열을 참조하여 제작한 올리고머(oligomer)를 이용하여 T-DNA 오른쪽 경계면 4.0 kb 떨어진 부위의 염기서열을 결정하고 분석하였다. 결정된 염기서열을 애기장대 게놈 데이터 베이스에서 탐색하여 인핸서에서 가장 가까운 전사해독틀을 찾아내었다. 상기 분리된 전사해독틀을 'ORE7 유전자'라 명명하였으며, 그 염기서열을 서열번호 1로 기재하였다. 상기 ORE7 유전자로부터 발현되는 단백질은 서열번호 2에 기재된 바와 같이, 311개의 아미노산으로 구성되었으며, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열의 83~94 부분에 AT-고리 모티프를 가지고 있음을 알 수 있었고, 또한 38~52 및 245~261 부분에 글리신-, 히스티딘-, 글루타민- 및 글루탐산-풍부 모티프가 존재함을 알 수 있었다.

이후, 상기 ORE7 유전자를 탐침으로 하여 노던 블럿 분석을 수행하였다. 트리-시약(Sigma)를 이용하여 우 등의 방법(Woo H. R. et al., Plant Cell 13:1779-1790, 2001)에 따라 야생종과 ore7 변이체로부터 각각 전체 RNA를 추출하였다. 각 레인(lane)별로 10 ㎍의 RNA를 1.2% 아가로스/ 포름알데하이드 겔에 로딩하여 분리하였고, 이후 나일론 막으로 옮겼다. 그리고 나서, 3X SSC로 5분간 세척하여 여분의 아가로즈를 제거한 후, RNA를 나일론 막에 고정시키기 위해 자외선(254nm, 0.18 J/Sq.cm2)을 조사하였다. 나일론 막으로 옮겨진 블럿은 박 등의 방법(Park et al., Plant Mol. Biol. 26:1725-1735, 1994)에 따라 전혼성화 및 혼성화 반응을 수행하였다.

그 결과, 도 7에 도시된 바와 같이, 야생종의 ORE7 유전자 발현은 극히 낮거나 거의 없는 반면, ore7 변이체에서의 ORE7 유전자의 전사체 농도는 상당히 높은 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 7>

애기장대 야생종으로의 ORE7 유전자의 도입

ore7 변이체에서 나타나는 노화지연 표현형이 ORE7 유전자의 활성화(activation)에 의한 것인지 최종 확인하기 위해, 인핸서와 ORE7 유전자를 포함하는 5.4Kb 크기의 DNA 조각을 야생종 애기장대로 도입하는 실험을 수행하였다.

이를 위해, 플라스미드 레스큐 방법으로부터 얻어진 플라스미드를 BamHI과 EcoRI으로 절단하여 인핸서와 ORE7 유전자를 포함하는 DNA 조각을 분리하였다. 상기 분리된 DNA 조각을 EcoRI과 BamHI으로 절단된 pCAMBIA3301 벡터(MRC, 미국)에 삽입시켰으며, 이를 'pORE7/3301'이라 명명하였다. 이후, 상기 재조합 벡터 pORE7/3301을 이용하여 아그로박테리움 튜메파시엔스 AGL1 균주(Lazo G.R. et al., Biotechnology 9: 963-967,1991)(ATCC BAA-101)를 형질전환하였다. 상기 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스 AGL1 균주를 'pAT-ORE7'이라 명명하였으며, 이를 한국 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2001년 8월 8일자로 기탁하였다(기탁번호:KCTC 10032BP). 이후, 플로랄 딥 방법(Clough et al., Plant J., 16(6):735-743, 1998)에 따라 상기 pAT-ORE7로 애기장대 야생종 콜롬비아를 형질전환시켰다. 그리고 나서, 상기 형질전환된 애기장대로부터 종자를 받은 후, 제초제 저항성을 나타내는 형질전환체를 선발하였다. 이후, 상기 형질전환된 애기장대를 생장실에서 배양하며 노화지연 양상을 조사한 결과, ore7 변이체에서 나타났던 노화지연 표현형이 그대로 재현됨을 확인할 수 있었다. 이로부터, 노화지연 표현형이 ORE7 유전자의 활성화를 통해 나타났음을 알 수 있고, 또한, 상기 ORE7 유전자를 활성화시킴으로써 식물체에서 노화지연을 유도할 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 8>

양파 표피세포에서 GFP-ORE7 융합 단백질의 발현 조사

상기 실시예 6에서 결정된 ORE7 유전자 염기서열로부터 유추되는 폴리펩타이드 서열을 데이터베이스로 탐색한 결과, AT-고리 모티프를 가지고 있고, 글리신-, 히스티딘-, 글루타민- 및 글루탐산- 풍부 모티프를 가지고 있음이 관찰되었다. 이런 모티프들은 핵에서 다른 유전자의 발현을 조절하는 전사 조절자 또는 전사 인자에서 발견되는 모티프들이다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명의 ORE7 단백질이 핵으로 이동하는지 여부를 확인하였다.

먼저, ORE7 단백질 전체를 암호화하는 유전자를 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 PCR 반응은 95℃에서 2분간 가열하여 변성시킨 다음, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 그리고 72℃에서 1분간의 조건으로 35회 반복 수행한 후, 72℃에서 10분간 최종 증폭시켜 반응을 종결하였다. 상기 PCR 반응으로 얻은 0.95kb 크기의 DNA 조각을 아가로스 젤 전기영동으로 분리한 다음, GFP(green fluorescence protein)을 포함하는 326 GFP-3G 플라스미드(포항공대 황인환 교수님 실험실에서 분양받음)의 SmaⅠ 및 HindⅢ 제한효소 자리에 삽입하여 재조합 플라스미드 pGFP-ORE7을 제작하였다. 이후, 양파의 표피세포에서 GFP-ORE7 융합단백질의 발현 장소를 바라고나 등의 방법(Varagona et al, Plant Cell 4:1213-1227, 1992)에 따라 조사하였다. 텅스텐 입자들을 DNA로 코팅시키기 위해, 우선 GFP-ORE7 융합 단백질 발현 플라스미드를 퀴아겐 컬럼(Qiagen column)으로 정제시킨 후, 2㎍의 플라스미드를 50㎕의 2.5M CaCl₂와 20㎕의 0.1M 스퍼미딘(spermidine)을 포함하고 있는 용액(Sigma)에서 텅스텐 입자(tungsten particle)와 함께 침전시켰다. 상기 침전물을 70% 에탄올로 세척한 후, 100% 에탄올 36㎕로 재현탁(resuspension)시켰다. 그리고 나서, 양파의 안쪽 표피세포 껍질이 위로 오도록 1/2 B5 배지 위에 놓은 후, 상기 플라스미드 DNA로 코팅된 M-25 텅스텐 입자를 입자 충격법(particle bombardment)으로 양파의 표피세포에 도입시켰다. 이 때 입자 충격법은 1350 p.s.i.(Biorad)를 이용하여 수행하였다. 이후, 상기 배지를 포함하는 페트리디쉬를 파라필름(parafilm)으로 봉한 뒤, 22℃ 인큐베이터(incubator)에서 18시간 동안 방치하였다. 18시간 경과 후, 형광현미경을 이용하여 GFP의 발현을 관찰하였다.

그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, GFP-ORE7의 발현이 핵 속에서 나타남을 확인할 수 있었다. 이는 ORE7 단백질이 핵으로 이동되어 핵 속에서 기능을 수행한다는 것을 보여주는 것이다.

이상 살펴본 바와 같이, ore7 변이체의 노화지연 표현형이 ORE7 유전자의 활성화를 통해 나타났음을 확인하였고, 또한, 상기 ORE7 유전자를 활성화시킴으로써 식물체에서 노화지연을 유도할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 식물의 잎 수명 조절 유전자 ORE7을 이용하여 식물체를 형질전환시킴으로써 식물의 수명을 연장시켜 생산성 향상 및 저장 효율 증대 등을 도모할 수 있다. 또한, 본 발명의 ORE7 유전자 및 상기 유전자로부터 발현되는 ORE7 단백질은 식물의 노화 기작 연구, 노화 관련 유전자 또는 노화 억제 물질의 탐색 등에 유용하게 쓰일 수 있다.

도 1은 애기장대 야생종(Col)과 수명연장 변이체 ore7에서 시간에 따른 잎의 노화를 보여주는 사진(A), 광합성 활성의 변화(B), 엽록소 함량의 변화(C) 및 노화관련 유전자와 광합성 관련 유전자의 발현양상을 나타내는 노던 블럿 분석결과(D)를 나타낸 것이다.

SAG12 : 노화 유전자(senescence-associated gene)

SEN4 : 노화 유전자

CAB : 엽록소 a/b 결합 단백질(chlorophyll a/b binding protein)

도 2는 애기장대 야생종(Col)과 수명연장 변이체 ore7에서 암 처리 후 시간에 따른 잎의 노화를 보여주는 사진(A), 광합성 활성의 변화(B), 엽록소 함량의 변화(C) 및 노화관련 유전자(SEN4)의 발현양상을 나타내는 노던 블럿 분석결과(D)를 나타낸 것이다.

0D: 암 처리 전

4D: 암 처리 후 4일째

도 3은 애기장대 야생종(Col)과 수명연장 변이체 ore7에서 MES 완충용액(음성대조구)(A)과 노화 촉진 식물 호르몬인 MeJA(B), ABA(C) 및 에틸렌(D)의 처리 후 시간에 따른 광합성 활성의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 4는 애기장대 야생종(Col) 및 수명연장 변이체 ore7에서 MES 완충용액(음성대조구)(A)과 노화 촉진 식물 호르몬인 MeJA(B), ABA(C) 및 에틸렌(D) 처리 후 시간에 따른 엽록소 함량의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 5는 애기장대 야생종(Col)과 수명연장 변이체 ore7에서 노화 촉진 식물호르몬인 MeJA, ABA 및 에틸렌 처리 후, 0, 3, 4 및 5일째의 시간에 따른 노화관련 유전자(SEN4)의 발현양상을 나타내는 노던 블럿 분석결과를 나타낸 것이다.

C: 노화촉진 호르몬을 처리하지 않은 대조구(control)

T: 노화촉진 호르몬 처리구

도 6은 액티베이션 태깅 벡터 pSKI015가 수명연장 변이체 ore7의 게놈 내로 삽입된 모식도이다.

E : 인핸서(enhancer)

BAR : 제초제 저항성 유전자

pBS : E. coli 복제 기원(replication origin)과 앰피실린 저항성 유전자를 가지고 있는 부위

도 7은 애기장대 야생종(Col)과 수명연장 변이체 ore7에서 ORE7 유전자의 발현을 나타내는 노던 블럿 분석의 결과를 나타낸 것이며, 28S는 대조구이다.

도 8은 양파의 표피세포에서 GFP-ORE7 융합단백질의 핵으로의 이동을 보여주는 사진이다.

A : 양성 대조구인 35S-GFP의 형광현미경 하에서 관찰되는 사진

B : 35S-ORE7-GFP의 형광현미경 하에서 관찰되는 사진

C : 양성 대조구인 35S-GFP의 광학현미경 하에서 관찰되는 사진

D: 35S-ORE7-GFP의 광학현미경 하에서 관찰되는 사진

<110> GENOMINE INC. <120> Gene controlling life span of leaves in plants and method for controlling life span of plants using the gene <130> NPF2531 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 936 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atggaaggcg gttacgagca aggcggtgga gcttctagat acttccataa cctctttaga 60 ccggagattc accaccaaca gcttcaaccg cagggcggga tcaatcttat cgaccagcat 120 catcatcagc accagcaaca tcaacaacaa caacaaccgt cggatgattc aagagaatct 180 gaccattcaa acaaagatca tcatcaacag ggtcgacccg attcagaccc gaatacatca 240 agctcagcac cgggaaaacg tccacgtgga cgtccaccag gatctaagaa caaagccaag 300 ccaccgatca tagtaactcg tgatagcccc aacgcgctta gatctcacgt tcttgaagta 360 tctcctggag ctgacatagt tgagagtgtt tccacgtacg ctaggaggag agggagaggc 420 gtctccgttt taggaggaaa cggcaccgta tctaacgtca ctctccgtca gccagtcact 480 cctggaaatg gcggtggtgt gtccggagga ggaggagttg tgactttaca tggaaggttt 540 gagattcttt cgctaacggg gactgttttg ccacctcctg caccgcctgg tgccggtggt 600 ttgtctatat ttttagccgg agggcaaggt caggtggtcg gaggaagcgt tgtggctccc 660 cttattgcat cagctccggt tatactaatg gcggcttcgt tctcaaatgc ggttttcgag 720 agactaccga ttgaggagga ggaagaagaa ggtggtggtg gcggaggagg aggaggagga 780 gggccaccgc agatgcaaca agctccatca gcatctccgc cgtctggagt gaccggtcag 840 ggacagttag gaggtaatgt gggtggttat gggttttctg gtgatcctca tttgcttgga 900 tggggagctg gaacaccttc aagaccacct ttttaa 936 <210> 2 <211> 311 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Glu Gly Gly Tyr Glu Gln Gly Gly Gly Ala Ser Arg Tyr Phe His 1 5 10 15 Asn Leu Phe Arg Pro Glu Ile His His Gln Gln Leu Gln Pro Gln Gly 20 25 30 Gly Ile Asn Leu Ile Asp Gln His His His Gln His Gln Gln His Gln 35 40 45 Gln Gln Gln Gln Pro Ser Asp Asp Ser Arg Glu Ser Asp His Ser Asn 50 55 60 Lys Asp His His Gln Gln Gly Arg Pro Asp Ser Asp Pro Asn Thr Ser 65 70 75 80 Ser Ser Ala Pro Gly Lys Arg Pro Arg Gly Arg Pro Pro Gly Ser Lys 85 90 95 Asn Lys Ala Lys Pro Pro Ile Ile Val Thr Arg Asp Ser Pro Asn Ala 100 105 110 Leu Arg Ser His Val Leu Glu Val Ser Pro Gly Ala Asp Ile Val Glu 115 120 125 Ser Val Ser Thr Tyr Ala Arg Arg Arg Gly Arg Gly Val Ser Val Leu 130 135 140 Gly Gly Asn Gly Thr Val Ser Asn Val Thr Leu Arg Gln Pro Val Thr 145 150 155 160 Pro Gly Asn Gly Gly Gly Val Ser Gly Gly Gly Gly Val Val Thr Leu 165 170 175 His Gly Arg Phe Glu Ile Leu Ser Leu Thr Gly Thr Val Leu Pro Pro 180 185 190 Pro Ala Pro Pro Gly Ala Gly Gly Leu Ser Ile Phe Leu Ala Gly Gly 195 200 205 Gln Gly Gln Val Val Gly Gly Ser Val Val Ala Pro Leu Ile Ala Ser 210 215 220 Ala Pro Val Ile Leu Met Ala Ala Ser Phe Ser Asn Ala Val Phe Glu 225 230 235 240 Arg Leu Pro Ile Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly 245 250 255 Gly Gly Gly Gly Gly Pro Pro Gln Met Gln Gln Ala Pro Ser Ala Ser 260 265 270 Pro Pro Ser Gly Val Thr Gly Gln Gly Gln Leu Gly Gly Asn Val Gly 275 280 285 Gly Tyr Gly Phe Ser Gly Asp Pro His Leu Leu Gly Trp Gly Ala Gly 290 295 300 Thr Pro Ser Arg Pro Pro Phe 305 310 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer for PCR of ORE7 gene <400> 3 tacccgggca atggaaggcg gttacgagca a 31 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer for PCR of ORE7 gene <400> 4 cccaagcttt taaaaaggtg gtcttgaagg tgt 33

Claims (14)

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9. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 유전자를 식물체 내로 도입하여 과발현시킴으로써 식물의 노화를 지연시키는 것을 특징으로 하는 식물의 수명을 조절하는 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 9항에 있어서, 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 이용하여 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응(PCR), 노던 블럿 분석, 서던 블럿 분석, 효소 면역 반응(ELISA) 및 2-D 겔 분석으로 이루어진 군에서 선택되는 하나를 수행함으로써 식물의 노화 조절 단백질 또는 유전자를 탐색하는 방법.
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