KR100861330B1 - 식물 데옥시하이퓨신 신타제, 식물 진핵생물 개시 인자５ａ를 코딩하는 ｄｎａ, 트랜스제닉 식물 및 식물에서의노화 및 세포예정사멸 제어 방법 - Google Patents

식물 데옥시하이퓨신 신타제, 식물 진핵생물 개시 인자５ａ를 코딩하는 ｄｎａ, 트랜스제닉 식물 및 식물에서의노화 및 세포예정사멸 제어 방법 Download PDF

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Abstract

식물에 있어서, 노화를 포함한 세포예정사멸 발현의 조절은, 역방향의 노화-유도 데옥시하이퓨신 신타제, 노화-유도 eIF-5A 또는 이들 모두를 코딩하는 유전자 또는 유전자 프래그먼트를 식물 게놈 내로 통합시킴으로써 성취된다. 노화-유도 데옥시하이퓨신 신타제 및 노화-유도 eIF-5A를 코딩하는 식물 유전자를 동정하였으며, 단독 또는 조합의 각각의 뉴클레오티드 서열을 트랜스제닉 식물에서의 노화 변경에 사용하였다.
Figure R1020067019227
데옥시하이퓨신 신타제, 노화, 세포예정사멸, 뉴클레오티드, 안티센스, 트랜스제닉 식물

Description

식물 데옥시하이퓨신 신타제, 식물 진핵생물 개시 인자 ５Ａ를 코딩하는 ＤＮＡ, 트랜스제닉 식물 및 식물에서의 노화 및 세포예정사멸 제어 방법{DNA ENCODING A PLANT DEOXYHYPUSINE SYNTHASE, A PLANT EUKARYOTIC INITIATION FACTOR 5A, TRANSGENIC PLANTS AND A METHOD FOR CONTROLLING SENESCENCE AND PROGRAMMED CELL DEATH IN PLANTS}
도 1은 토마토 잎 cDNA 라이브러리로부터 수득되는 노화-유도 토마토 잎 DHS cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 1) 및 그로부터 유래되는 아미노산 서열 (서열 번호 2)을 나타낸다.
도 2A는 아라비돕시스 유전자 은행 (http://genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/)에서 토마토 DHS 서열과 미확인 게놈 서열을 정렬함으로써 수득되는 아라비돕시스 DHS 유전자의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 5)를 나타낸다. 아미노산 서열들 사이의 간격은 인트론으로 예측된다. 도 2B는 유래되는 아라비돕시스 DHS 아미노산 서열 (서열 번호 6)을 나타낸다. 도 2C는 PCR에 의해 수득되는 600 염기쌍의 노화-유도 아라비돕시스 DHS cDNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 도 2D는 유래되는 노화-유도 아라비돕시스 DHS cDNA 프래그먼트 아 미노산 서열을 나타낸다.
도 3은 유래되는 전장 토마토 잎 노화-유도 DHS 아미노산 서열 (서열 번호 2) 및 유래되는 전장 아라비돕시스 노화-유도 DHS 아미노산 서열을 인간, 효모, 진균류 및 원시세균의 DHS 단백질 서열과 정렬시킨 것이다. 3 또는 4개의 서열들 사이의 동일한 아미노산을 박스화하였다.
도 4는 토마토 DHS cDNA의 제한효소 지도이다.
도 5는 32P-dCTP로 라벨링한 전장 토마토 노화-유도 DHS cDNA로 프로빙한, 토마토 잎으로부터 단리한 게놈 DNA의 서던 블롯이다.
도 6은 상이한 발육 단계의 토마토 꽃으로부터 단리한 RNA의 노던 블롯이다. 도 6A는 전체 RNA의 에티듐 브로마이드 염색 겔이다. 각각의 레인은 10 ㎍의 RNA를 포함한다. 도 6B는 32P-dCTP로 라벨링한 전장 토마토 노화-유도 DHS cDNA로 프로빙한 노던 블롯의 오토라디오그래프이다.
도 7은 32P-dCTP로 라벨링한 전장 토마토 노화-유도 DHS cDNA로 프로빙한 다양한 원숙 단계의 토마토 열매로부터 단리한 RNA의 노던 블롯이다. 각각의 레인은 10 ㎍의 RNA를 포함한다.
도 8은 2 M 소르비톨을 사용한 6시간 동안의 처리에 의해 건조-스트레스를 받은 토마토 잎으로부터 단리한 RNA의 노던 블롯이다. 각각의 레인은 10 ㎍의 RNA를 포함한다. 블롯은 32P-dCTP로 라벨링한 전장 토마토 노화-유도 DHS cDNA로 프로 빙하였다.
도 9는 냉각 온도에 노출시킨 토마토 잎으로부터 단리한 RNA의 노던 블롯이다. 도 9A는 전체 RNA의 에티듐 브로마이드 염색 겔이다. 각각의 레인은 10 ㎍의 RNA를 포함한다. 도 9B는 32P-dCTP로 라벨링한 전장 토마토 노화-유도 DHS cDNA로 프로빙한 노던 블롯의 오토라디오그래프이다. 도 9C는 잎 투석물의 전도도로서 측정한 상응하는 누출 데이터를 나타낸다.
도 10은 폴리A 테일 및 5' 말단 비-코딩 영역을 포함하지 않는 카네이션의 전장 DHS (1384 염기쌍) cDNA 클론 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 9)이다. 유래되는 아미노산 서열을 뉴클레오티드 서열 하부에 나타내었다 (373개의 아미노산) (서열 번호 10).
도 11은 32P-dCTP 라벨링 아라비돕시스 노화-유도 DHS cDNA로 프로빙한 노화하는 아라비돕시스 잎으로부터의 전체 RNA의 노던 블롯이다. 오토라디오그래프는 상부의 것이며, 에티듐 염색 겔은 하부의 것이다.
도 12는 여러 단계의 카네이션 꽃잎으로부터 단리한 전체 RNA의 노던 블롯이다. 블롯은 32P-dCTP로 라벨링한 전장 카네이션 노화-유도 DHS cDNA로 프로빙하였다. 오토라디오그래프는 상부의 것이며, 에티듐 염색 겔은 하부의 것이다.
도 13은 토마토 열매 노화-유도 eIF-5A 유전자의 뉴클레오티드 서열 (상부) (서열 번호 11) 및 유래되는 아미노산 서열 (하부) (서열 번호 12)이다.
도 14는 카네이션 노화-유도 eIF-5A 유전자의 뉴클레오티드 서열 (상부) (서 열 번호 13) 및 유래되는 아미노산 서열 (하부) (서열 번호 14)이다.
도 15는 아라비돕시스 노화-유도 eIF-5A 유전자의 뉴클레오티드 서열 (상부) (서열 번호 15) 및 유래되는 아미노산 서열 (하부) (서열 번호 16)이다.
도 16은 여러 발육 단계의 아라비돕시스 식물의 잎으로부터 단리한 전체 RNA의 노던 블롯이다. 블롯은 32P-dCTP로 라벨링한 아라비돕시스 전장 노화-유도 DHS cDNA 및 전장 노화-유도 eIF-5A로 프로빙하였다. 오토라디오그래프는 상부의 것이며, 에티듐 염색 겔은 하부의 것이다.
도 17은 브레이커 (breaker) (BK), 적색-견고 (red-firm, RF), 및 적색-연성 (red-soft, RS) 발육 단계의 토마토 열매로부터 단리한 전체 RNA의 노던 블롯이다. 블롯은 32P-dCTP로 라벨링한 전장 노화-유도 DHS cDNA 및 전장 노화-유도 eIF-5A로 프로빙하였다. DHS 및 eIF-5A는, 적색-연성 열매에 있어서 열매 완숙과 동시에 상향-조절된다. 오토라디오그래프는 상부의 것이며, 에티듐 염색 겔은 하부의 것이다.
도 18은 소르비톨로 처리하여 건조 스트레스를 유도한 토마토의 잎으로부터 단리한 전체 RNA의 노던 블롯이다. C는 대조이며; S는 소르비톨로 처리한 것이다. 블롯은 32P-dCTP로 라벨링한 전장 노화-유도 DHS cDNA 및 전장 노화-유도 eIF-5A로 프로빙하였다. eIF-5A 및 DHS 모두는 건조 스트레스에 응답하여 상향-조절된다. 오토라디오그래프는 상부의 것이며, 에티듐 염색 겔은 하부의 것이다.
도 19는 토마토 식물의 꽃봉오리 및 노화하는 개화된 꽃으로부터 단리한 전 체 RNA의 노던 블롯이다. 블롯은 32P-dCTP로 라벨링한 전장 노화-유도 DHS cDNA 및 전장 노화-유도 eIF-5A로 프로빙하였다. eIF-5A 및 DHS 모두는 개화/노화 꽃에서 상향-조절된다. 오토라디오그래프는 상부의 것이며, 에티듐 염색 겔은 하부의 것이다.
도 20은 냉각-손상 토마토 잎으로부터 단리한 전체 RNA의 노던 블롯이다. 블롯은 32P-dCTP로 라벨링한 전장 노화-유도 DHS cDNA 및 전장 노화-유도 eIF-5A로 프로빙하였다. eIF-5A 및 DHS 모두는, 재가온 동안 냉각 손상 전개에 따라 상향-조절된다. 오토라디오그래프는 상부의 것이며, 에티듐 염색 겔은 하부의 것이다.
도 21은 3.1주령의 아라비돕시스 야생형 (좌측), 및 안티센스 방향의 노화 DHS 유전자의 3'-말단 (도 36에 나타낸 서열)을 발현하여 증가된 잎 크기를 나타내는 트랜스제닉 식물의 사진이다.
도 22는 4.6주령의 아라비돕시스 야생형 (좌측), 안티센스 방향의 노화 DHS 유전자의 3'-말단 (도 36에 나타낸 서열)을 발현하여 증가된 잎 크기를 나타내는 트랜스제닉 식물의 사진이다.
도 23은 5.6주령의 아라비돕시스 야생형 (좌측), 및 안티센스 방향의 노화 DHS 유전자의 3'-말단 (도 36에 나타낸 서열)을 발현하여 증가된 잎 크기를 나타내는 트랜스제닉 식물의 사진이다.
도 24는 6.1주령의 아라비돕시스 야생형 (좌측), 및 안티센스 방향의 노화 DHS 유전자의 3'-말단 (도 36에 나타낸 서열)을 발현하여 증가된 잎 크기를 나타내 는 트랜스제닉 식물의 사진이다.
도 25는 안티센스 방향의 노화-유도 DHS 유전자를 발현하는 3종의 T1 트랜스제닉 아라비돕시스 식물주로부터의 종자 수율 증가를 나타내는 그래프이다. 종자 수율은 종자의 부피로서 표현된다. n=30에 있어서의 SE를 야생형 식물에 대하여 나타내었다.
도 26은, 트랜스제닉 식물에 있어서, 증가된 잎 크기 및 증가된 식물 크기를 나타내는, 안티센스 방향의 노화 DHS 유전자의 3'-말단 (도 36에 나타낸 서열)을 발현하는 트랜스제닉 토마토 식물 (좌측) 및 야생형 식물 (우측)의 사진이다. 사진은 모종을 토양으로 이전시킨지 18일 후에 찍었다.
도 27은, 트랜스제닉 식물에 있어서, 증가된 잎 크기 및 증가된 식물 크기를 나타내는, 안티센스 방향의 노화 DHS 유전자의 3'-말단 (도 36에 나타낸 서열)을 발현하는 트랜스제닉 토마토 식물 (좌측) 및 야생형 식물 (우측)의 사진이다. 사진은 모종을 토양으로 이전시킨지 32일 후에 찍었다.
도 28 내지 35는, 야생형의 토마토 열매 (상부 패널) 및 안티센스 방향의 전장 노화 DHS 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물 (하부 패널)의 사진이다. 열매는 브레이커 발육 단계에서 수확하여 생장 챔버에서 원숙해지도록 하였다. 수확 후의 일자를 각각의 패널의 상부 좌측 코너에 나타내었다.
도 36은 식물을 형질전환시키기 위하여 안티센스 방향으로 사용된 아라비돕시스 노화-유도 DHS 유전자의 3' 말단의 뉴클레오티드 서열 (상부) (서열 번호 30) 및 유래되는 아미노산 서열 (하부)이다.
도 37은 식물을 형질전환시키기 위하여 안티센스 방향으로 사용된 토마토 노화-유도 DHS 유전자의 3' 말단의 뉴클레오티드 서열 (상부) (서열 번호 31) 및 유래되는 아미노산 서열 (하부)이다.
도 38은 전장 아라비돕시스 유전자를 단리하기 위하여 사용된 600 염기쌍의 아라비돕시스 노화-유도 DHS 프로브의 뉴클레오티드 서열 (상부) (서열 번호 26) 및 유래되는 아미노산 서열 (하부)이다.
도 39는 전장 카네이션 유전자를 단리하기 위하여 사용된 483 염기쌍의 카네이션 노화-유도 DHS 프로브의 뉴클레오티드 서열 (상부) (서열 번호 27) 및 유래되는 아미노산 서열 (하부)이다.
본 출원은, 1999년 7월 6일에 출원된 일련 번호 제09/348,675호의 부분 연속 출원이다.
본 발명은 노화-유도 발현을 나타내는 식물 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 안티센스 방향의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스제닉 식물, 및 식물에 있어서 노화를 포함하여 세포예정사멸 (programmed cell death)을 제어하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 노화를 포함하여 세포예정사멸의 개시에 의해 발현이 유도되는 노화 유도 식물 데옥시하이퓨신 신타제 유전자 및 노화-유도 eIF-5A 유전자, 그리고 단독 또는 조합의 데옥시하이퓨신 신타제 유전자 및 eIF-5A 유전자의 식물에 있어서의 세포예정사멸 및 노화의 제어를 위한 용도에 관한 것이다.
노화는, 식물 생명에 있어서 최종적인 생물학적 발육기이다. 노화는 사멸의 전조이며, 전 식물, 기관, 꽃 및 열매, 조직 및 개개의 세포를 포함하여 여러 수준의 생물학적 기구에서 발생한다.
노화의 개시는 상이한 내적 및 외적 인자 모두에 의해 유발될 수 있다. 노화는 식물 생명 또는 식물 조직, 예를 들어 열매, 꽃 및 잎에서 고도로 조절되는 복잡한 발육 단계이다. 노화에 의해 세포막 및 세포 거대분자의 통합적인 분해, 및 식물의 다른 부분으로의 대사산물의 후속적인 유동이 일어난다.
정상적인 식물 발육 동안 일어나는 예정된 (programmed) 노화 외에도, 세포 및 조직의 사멸 및 계속되는 대사산물의 재유동이 외적 환경 인자에 대한 통합 응답으로서 일어난다. 괴사 (necrosis) 또는 아폽토시스 (apoptosis)로도 칭해지는 조기 노화 개시를 유발하는 외적 인자는 환경 스트레스, 예를 들어 온도, 건조 (drought), 열악한 광 또는 영양 공급과, 병원체 공격을 포함한다. 또한, 환경 스트레스에 노출된 식물 조직은, 일반적으로 스트레스 에틸렌으로 알려진 에틸렌도 생성한다 (Buchanan-Wollaston, V., 1997, J. Exp. Botany, 48:181-199; Wright, M., 1974, Plant, 120:63-69). 에틸렌은 몇몇 식물에서 노화를 야기하는 것으로 알려져 있다.
노화는 수동적인 공정이 아니라 오히려 특정 유전자의 통합 발현을 포함하는 능동적으로 조절되는 공정이다. 노화 동안, 전체 RNA의 수준은 감소하며, 다수의 유전자의 발현이 스위치 오프된다 (switched off) (Bate 등, 1991, J. Exper. Botany, 42, 801-11; Hensel 등, 1993, The Plant Cell, 5, 553-64). 그러나 노화 공정은 핵 유전자의 드 노보 (de novo) 전사에 의존적이라는 증거가 증가하고 있다. 예를 들어, 노화는 세포핵 제거와 단백질 합성 및 mRNA의 저해제에 의해 차단된다. 시험관내 번역 실험에 있어서 노화하는 잎 및 녹색 잎으로부터의 mRNA를 사용한 분자 연구에 의하면 노화하는 잎에서의 변화된 잎 단백질 생성물 패턴이 나타났다 (Thomas 등, 1992, J. Plant Physiol., 139, 403-12). 차등 스크리닝법 (differential screening) 및 서브트랙티브 (subtractive) 혼성화 기술을 이용하여, 단자엽식물 및 쌍자엽식물 모두를 포함하여 일련의 상이한 식물, 예를 들어 아라비돕시스 (Arabidopsis), 옥수수, 오이, 아스파라거스, 토마토, 벼 및 감자로부터 노화-유도 유전자를 대표하는 다수의 cDNA 클론이 동정되었다. 노화 동안 특이적으로 발현되는 유전자의 동정은 노화에 있어서의 드 노보 전사의 진행을 위한 요건의 확실한 증거이다.
노화 동안 일어나는 사건은 괴사 및 사멸이 일어나기 전에 세포 성분이 최대한 사용되도록 고도로 통합되어 있는 것으로 나타났다. 특정 시그널의 식별 및 유 전자 발현 캐스케이드의 유도를 포함하는 복잡한 상호작용이 상기 공정을 조절하기 위하여 발생해야 한다. 노화 관련 단백질을 코딩하는 유전자의 발현은 대개는 일반적인 활성화 단백질 (activator protein)을 통하여 조절되는데, 활성화 단백질은 다시 호르몬 시그널에 의해 직접적으로, 또는 간접적으로 활성화된다. 상기 공정의 초기 시그널링 또는 후속 공동-작용 (co-ordination)에 연루된 메카니즘에 관해서는 거의 알려져 있지 않다.
통합된 유전자 발현은 개시 인자를 포함하여 전사 및 번역에 연루되는 인자를 필요로 한다. 번역 개시 인자 유전자가 식물을 포함하여 다양한 유기체에서 단리 및 특성화되었다. 진핵생물 번역 개시 인자 5A (eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF-5A))는 크기가 대략 17 KDa인 필수 단백질 인자로서, 진핵 세포 단백질 합성의 개시에 연루되어 있다. 상기 인자의 특징은, 단지 eIF-5A에만 존재한다고 알려진 독특한 변형 아미노산인 하이퓨신 [N-(4-아미노-2-히드록시부틸)라이신]이 존재한다는 것이다. 하이퓨신은, eIF-5A의 특정 라이신 잔기의 측쇄 아미노기로의 폴리아민인 스퍼미딘으로부터의 부틸아미노기의 이전 및 히드록실화를 통하여 번역-후 (post-translationally) 형성된다. eIF-5A의 활성화는 스퍼미딘의 부틸아민 잔기를 eIF-5A의 라이신으로 이전시켜 하이퓨신을 형성하고 eIF-5A를 활성화시키는 것을 포함한다. 진핵생물에 있어서, 데옥시하이퓨신 신타제(deoxyhypusine synthase, DHS)는 eIF-5A에 있어서 번역-후 하이퓨신 합성을 매개한다. 상응하는 DHS 유전자는 식물에서 동정되지 않았지만, 식물 eIF-5A가 하이퓨신을 포함한다는 것이 알려져 있다. 하이퓨신 변형은 메티오닐-푸로마이신 분석 법을 사용하는 시험관내 분석에서 eIF-5A 활성에 필수적인 것으로 나타났다.
하이퓨신은 eIF-5A에 특유하게 존재하며 모든 진핵생물, 몇몇 원시세균 (archaebacteria) (진핵생물에 연관된 것으로 나타남)에서 발견되지만, 유박테리아 (eubacteria)에서는 발견되지 않는다. 또한, eIF-5A의 아미노산 서열은, 특히 하이퓨신 잔기 주변의 영역에서 고도로 보존되어 있는데, 이는 eIF-5A 및 그의 활성화 단백질인 데옥시하이퓨신 신타제가 진핵 세포 생리학에서 근본적으로 중요한 단계를 수행한다는 것을 암시한다 (Joe 등, JBC, 270:22386-22392, 1995). eIF-5A는 인간, 자주개자리 (alfalfa), 점균류 (slime mold), 뉴로스포라 크로싸 (Neurospora crassa), 담배 및 효모로부터 클로닝되었다. eIF-5A는 처음에는 토끼 망상적혈구 용해물의 리보좀으로부터의 그의 단리, 및 메티오닌-푸로마이신 합성을 촉진하는데 있어서의 그의 시험관내 활성을 기초로 일반 번역 개시 인자로 동정되었다. 그러나, 보다 최근의 데이터에 의하면, eIF-5A는 광범한 단백질 합성을 위한 번역 개시 인자가 아니라, mRAN 집단의 특정 서브세트의 번역을 돕는 기능을 하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 동물 세포 및 효모를 사용한 실험으로부터, 하나이상의 eIF-5A 이소형이 세포 증식에 연루된 mRNA의 서브세트의 번역 매개에서 중요한 역할을 한다는 유력한 증거가 존재한다. 효모에는 2종의 이소형이 존재하며, 두 유전자 모두가 사일런싱될 (silenced) 경우 세포는 분열할 수 없다 (Park 등, Biol. Signals, 6:115-123, 1997). 이와 유사하게, eIF-5A를 활성화시키는 효모 데옥시하이퓨신 신타제의 발현을 사일런싱시키면 세포 분열이 차단된다. 사실, 과다증식증의 치료에 중요할 것 같은 데옥시하이퓨신 신타제 저해제가 개발되어 왔다 (Wolff 등, JBC, 272:15865-15871, 1997). 다른 연구에 의하면, eIF-5A의 다른 이소형이 HIV-1 복제에 있어서의 Rev 기능, 또는 HTLV V 복제에 있어서의 Rex 기능에 필수적이라는 것이 나타났다 (Park 등, Biol. Signals, 6:115-123, 1997). 담배에서도 2종 이상의 발현 eIF-5A 유전자가 존재한다. 유전자-특이적 프로브에 의하면, 상기 유전자는 조사된 모든 조직에서 둘 모두 발현되지만, 각각의 유전자는 독특한 발현 패턴을 가져, 아마도 특정 전사체의 번역을 조절하는 것으로 나타났다 (Chamot 등, Nuc. Acids Res., 20:625-669, 1992).
데옥시하이퓨신 신타제는 래트 고환, HeLa 세포, 뉴로스포라 크라싸 및 효모로부터 정제되었다. 데옥시하이퓨신 신타제의 아미노산 서열은 고도로 보존되어 있으며, 상이한 종으로부터의 효소는 유사한 물성 및 촉매 특성을 공유하고 이종성 eIF-5A 전구체와의 종-교차 반응성을 나타낸다 (Park 등, 6 Biol. Signals, 6:115-123, 1997).
식물 폴리아민은 꽃 유도, 배발생, 병원체 내성, 세포 생장, 분화 및 분열을 포함하여 다양한 생리학적 결과에 관련되어 있다 (Evans 등, 1989, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 40, 235-269; 및 Galston, 등, 1990, Plant Physiol., 94, 406-10). eIF-5A는 폴리아민이 그의 영향을 발휘하는 매개체라는 것이 제안되었다 (Chamot 등, 1992, Nuc. Acids Res., 20(4), 665-69).
eIF-5A의 이소형을 코딩하는 니코티아나 (Nicotiana)로부터의 2개의 유전자가 동정되었다 (NeIF-5Al 및 NeIF-5A2) (Chamot 등, 1992, Nuc. Acids Res., 20(4), 665-69). 상기 유전자는 매우 유사한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 상기 유 전자는 차등적인 발현 패턴을 나타낸다. 하나의 유전자는 mRNA 수준에서 콘스티튜티브하게 (constitutively) 발현되는 것으로 나타난 반면, 다른 것의 발현 패턴은 광합성 활성의 존재 또는 부재와 서로 관련되어 있다. 유전자 구조 및 게놈 서던 지도화를 기초로 하여, 담배에서 NeIF-5A 유전자의 다중유전자 패밀 리가 존재한다는 것이 제안되었다. 노화/괴사 특이적 mRNA 전사체 서브세트의 번역을 조절하는 eIF-5A 이소형이 존재하는 것 같다.
현재, 내적 또는 외적 인자, 예를 들어 환경 스트레스에 의해 야기되는 세포예정사멸(노화 포함)의 개시를 제어하는 광범위하게 적용가능한 방법은 전혀 없다. 따라서, 모든 유형의 식물에 적용가능하며, 노화로 이어지는 사건 캐스케이드에 있어서 가장 초기의 단계에서 유효한 노화 조정 기술을 개발하는 것이 중요하다.
본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 노화를 포함하여 세포예정사멸의 개시에 의해 발현이 유도되는 노화 유도 식물 데옥시하이퓨신 신타제 유전자 및 노화-유도 eIF-5A 유전자, 그리고 단독 또는 조합의 데옥시하이퓨신 신타제 유전자 및 eIF-5A 유전자의 식물에 있어서의 세포예정사멸 및 노화의 제어를 위한 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 노화-유도 토마토 데옥시하이퓨신 신타제(DHS)를 코딩하는 전장 cDNA 클론, 및 아라비돕시스 잎 및 카네이션 꽃잎으로부터의 전장 노화-유도 DHS cDNA 클론의 발견 및 클로닝을 기초로 한다. 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열을 본원에서 개시한다.
또한, 본 발명은 부분적으로는 토마토, 아라비돕시스 및 카네이션으로부터의 노화-유도 eIF-5A 유전자를 코딩하는 전장 cDNA 클론의 발견 및 클로닝을 기초로 한다. 각각의 eIF-5A cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열을 본원에 개시한다.
본 발명은 연령 관련 노화 또는 환경 스트레스-유도 노화일 수 있는 노화의 개시를 제어하기 위한 식물의 유전적 변형 방법을 제공한다. 본 발명의 노화-유도 DHS 뉴클레오티드 서열, 그의 프래그먼트, 또는 이러한 프래그먼트의 조합물을 역방향으로 식물 세포 내로 도입하여 내인성 노화-유도 DHS 유전자의 발현을 억제함으로써 내인성 노화-유도 DHS 단백질의 수준을 감소시키며, eIF-5A의 활성화 및 그 후의 노화를 매개하는 유전자의 발현을 감소 및/또는 방지한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명의 노화-유도 eIF-5A 뉴클레오티드 서열, 그의 프래그먼트, 또는 이러한 프래그먼트의 조합물을 역방향으로 식물 세포 내로 도입하여 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자의 발현을 억제함으로써 내인성 노화-유도 eIF-5A 단백질의 수준을 감소시키며, 그 후의 노화를 매개하는 유전자의 발현을 감소시키고/시키거나 방지한다. 이와는 달리, DHS 서열 및 eIF-5A 서열 모 두를 함께 사용하여 내인성 DHS 및 eIF-5A 단백질의 수준을 감소시킬 수 있다.
본 발명은, 또다른 측면에 있어서, 역방향의 본 발명의 노화-유도 eIF-5A 뉴클레오티드 서열 및 본 발명의 노화-유도 DHS 뉴클레오티드 서열의 조합물을 식물 세포 내로 도입하여 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자 및 노화-유도 DHS 유전자의 발현을 억제함으로써 내인성 노화-유도 DHS 단백질의 수준을 감소시키며, eIF-5A의 활성화 및 그 후의 노화를 매개하는 유전자의 발현을 감소 및/또는 방지하여, 연령-관련 노화 또는 환경 스트레스-유도 노화일 수 있는 노화의 개시를 제어하기 위한 식물의 유전적 변형 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법을 사용하여, 트랜스제닉 식물을 생성하고, 트랜스제닉 식물에 있어서 생육, 발육 및 천연 노화 또는 조숙하게 유도되는 노화에 대하여 모니터링한다. 노화-유도 DHS, 노화-유도 eIF-5A 또는 둘 모두의 수준의 감소로 인하여 연장된 수명 또는 저장 수명을 나타내는 (예를 들어 꽃의 수명 연장, 열매 또는 야채 변질의 감소, 생물량 (biomass) 증강, 종자 수율 증가, 종자 에이징 (aging) 감소 및/또는 잎의 황색화 감소) 식물 또는 분리된 식물 일부 (예를 들어 절단물, 꽃, 야채, 열매, 종자 또는 잎)은, 잎의 황색화 감소, 꽃잎 이탈 감소, 운송 및 보관 도중의 열매 및 야채 손상의 감소를 포함하여 특성이 개선된 바람직한 생성물로 선택된다. 이러한 탁월한 식물을 증식시킨다. 이와 유사하게, 환경 스트레스에 대하여 증가된 저항성을 나타내는 (예를 들어 저온 (냉각), 건조, 감염 등에 대한 민감성 감소, 및/또는 병원체에 대한 내성 증가) 식물을 우수한 생성물로서 선택한다.
본 발명은, 한 측면에 있어서, 서열 번호 1의 서열과 혼성화하며, 노화-유도 DHS를 코딩하는 단리된 DNA 분자, 또는 상기 서열 번호 1의 서열과 혼성화하는 단리된 DNA 분자의 기능성 유도체에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 측면의 한 실시 형태에 있어서, 단리된 DNA 분자는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 가진다 (즉, 서열 번호 1에 대하여 100%의 상보성 (서열 동일성)을 가짐).
또한, 본 발명은 서열 번호 9의 서열과 혼성화하며, 노화-유도 DHS를 코딩하는 단리된 DNA 분자, 또는 상기 서열 번호 9의 서열과 혼성화하는 단리된 DNA 분자의 기능성 유도체에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 측면의 한 실시 형태에 있어서, 단리된 DNA 분자는 서열 번호 9의 뉴클레오티드 서열을 가진다 (즉, 서열 번호 9에 대하여 100%의 상보성 (서열 동일성)을 가짐).
또한, 본 발명은 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15의 서열과 혼성화하며, 노화-유도 eIF-5A를 코딩하는 단리된 DNA 분자, 또는 상기 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15의 서열과 혼성화하는 단리된 DNA 분자의 기능성 유도체에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 측면의 한 실시 형태에 있어서, 단리된 DNA 분자는 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열을 가진다 (즉, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15에 대하여 100%의 상보성 (서열 동일성)을 가짐).
본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 본원에서 상기한 바와 같은 DNA 분자에 의해 코딩되는 단리된 단백질, 또는 그의 기능성 유도체가 제공된다. 바람직한 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 가지거나, 그의 기능성 유도체이다. 다른 바람직한 단백질은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 가지거나, 그의 기능성 유도체이다. 본 발명의 다른 바람직한 단백질은 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 가진다.
또한 본원에서는, 본원에서 상기한 DNA 분자의 상응하는 RNA 전사체 부분에 상보적인 RNA 분자를 코딩하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 제공되는데, 여기서, 본 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 RNA 전사체와 혼성화하여 내인성 노화-유도 DHS의 발현을 변경시킨다. 본 발명의 이러한 측면의 다른 실시 형태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는, 본원에서 상기한 DNA 분자의 상응하는 RNA 전사체 부분에 혼성화하여 내인성 노화-유도 eIF-5A의 발현을 변경시키는 RNA 분자이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 전장의 것일 수 있거나, 바람직하게는 약 6 내지 약 100개의 뉴클레오티드를 가진다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 노화-유도 DHS를 코딩하는 DNA 분자의 하나의 가닥의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 여기서, 노화-유도 DHS를 코딩하는 DNA 분자는 뉴클레오티드 서열 서열 번호 1, 서열 번호 5, 서열 번호 9, 또는 그의 조합물과 혼성화하거나, 노화-유도 DHS를 코딩하는 DNA 분자에 의해 코딩되는 RNA 서열의 하나 이상의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적이다. 본 발명의 하나의 실시 형태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 서열 번호 1, 서열 번호 5, 서열 번호 9, 또는 그의 조합물의 하나의 가닥의 상응하는 부분, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 5, 서열 번호 9 또는 그의 조합물로부터 전사되는 RNA 전사체에 실질적으로 상보적이다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 안티센스 올리고뉴클레오티드는 노화-유도 DHS를 코딩하는 DNA 분자의 하나의 가닥의 5' 비-코딩 부분 또는 3' 부분의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적이며, 여기서, 상기 DNA 분자는 서열 번호 1, 서열 번호 5, 서열 번호 9 또는 그의 조합물과 혼성화한다.
이와는 달리, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 노화-유도 eIF-5A를 코딩하는 DNA 분자의 하나의 가닥의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 여기서, 노화-유도 eIF-5A를 코딩하는 DNA 분자는 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 또는 그의 조합물과 혼성화하거나, 서열 번호 11, 서열 번호 13 또는 서열 번호 15로부터 전사되는 RNA 서열의 하나 이상의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적이다. 본 발명의 하나의 실시 형태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 또는 그의 조합물의 뉴클레오티드 서열의 하나의 가닥의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적이거나, 코딩되는 RNA 전사체는 노화-유도 eIF-5A를 코딩하는 DNA에 의해 코딩되는 RNA 서열의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적이다. 다른 실시 형태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 노화-유도 eIF-5A를 코딩하는 DNA 분자의 하나의 가닥의 5' 비-코딩 영역 또는 3' 영역의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적이며, 여기서, 상기 DNA 분자는 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15 또는 그의 조합물과 혼성화한다.
추가로 본 발명은, 하기를 포함하는 식물 세포의 형질전환용 벡터에 관한 것 이다:
(a) (1) 서열 번호 1, 서열 번호 5 또는 서열 번호 9의 서열과 혼성화하며 노화-유도 DHS를 코딩하는 DNA 분자의 하나의 가닥의 상응하는 부분, 또는 (2) 상기 노화-유도 DHS를 코딩하는 DNA 분자에 의해 코딩되는 RNA 서열의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드; 및
(b) 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 결합되어 형질전환 식물 세포에서 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 하는 조절 서열.
또한, 본 발명은 하기를 포함하는 식물의 형질전환용 벡터에 관한 것이다:
(a) (1) 서열 번호 11, 서열 번호 13 또는 서열 번호 15의 서열과 혼성화하며 노화-유도 eIF-5A를 코딩하는 DNA 분자의 하나의 가닥의 상응하는 부분, 또는 (2) 상기 노화-유도 eIF-5A를 코딩하는 DNA 분자에 의해 코딩되는 RNA 서열의 상응하는 부분에 실질적으로 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드; 및
(b) 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 결합되어 형질전환 식물 세포에서 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 하는 조절 서열.
조절 서열은 형질전환 식물 세포에서 기능적인 프로모터를 포함하며, 상기 프로모터는 유도성이거나 콘스티튜티브 프로모터일 수 있다. 임의로, 조절 서열은 폴리아데닐화 시그널을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기한 벡터 또는 벡터의 조합물로 형질전환되는 식물 세포, 이러한 세포로부터 생성되는 모종 (plantlet) 또는 성숙 식물, 또는 이러한 모종 또는 식물의 식물 일부를 제공한다.
또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 미변형 식물과 비교하여 노화-유도 DHS, 노화-유도 eIF-5A 또는 둘 모두의 수준이 감소된 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다:
(1) 상기한 벡터 또는 벡터의 조합물로 식물을 형질전환시키는 단계;
(2) 적어도 모종 단계로 식물을 생장시키는 단계:
(3) 형질전환 세포 또는 모종에 있어서, 변경된 노화-유도 DHS 활성 및/또는 eIF-5A 활성 및/또는 변경된 노화 및/또는 변경된 환경 스트레스-유도 노화 및/또는 병원체-유도 노화 및/또는 에틸렌-유도 노화를 분석하는 단계; 및
(4) 비-형질전환 식물과 비교하여 변경된 노화-유도 DHS 활성 및/또는 감소된 eIF-5A 및/또는 변경된 노화 및/또는 변경된 환경 스트레스-유도 노화 및/또는 변경된 병원체-유도 노화 및/또는 에틸렌-유도 노화를 가지는 식물을 선발 및 생장시키는 단계.
상기와 같이 생산되는 식물, 자손, 잡종, 클론 또는 식물 일부는 바람직하게는 감소된 노화-유도 DHS 발현, 감소된 노화-유도 eIF-5A 활성, 또는 둘 모두, 그리고 지연된 노화 및/또는 지연된 스트레스-유도 노화 및/또는 병원체-유도 노화 및/또는 에틸렌-유도 노화를 나타낸다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 식물 세포에 있어서 내인성 노화-유 도 DHS의 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다:
(1) (A) (i) 서열 번호 1, 서열 번호 5 및/또는 서열 번호 9의 서열과 혼성화하며 노화-유도 DHS를 코딩하는 DNA 분자의 하나의 가닥의 하나 이상의 부분, 또는 (ii) 상기 내인성 노화-유도 DHS 유전자에 의해 코딩되는 RNA 서열의 하나 이상의 부분에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드; 및
(B) 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 결합되어 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 하는 조절 서열
을 포함하는 벡터를 식물의 게놈 내로 통합시키는 단계; 및
(2) 식물을 생장시킴으로써 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 전사시키고, 전사체를 상기 내인성 RNA에 결합시켜 상기 노화-유도 DHS 유전자의 발현을 억제시키는 단계.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 식물 세포에 있어서 내인성 노화-유도 eIF-5A의 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다:
(1) (A) (i) 서열 번호 11, 서열 번호 15, 서열 번호 17 또는 그의 조합물과 혼성화하며, 내인성 노화-유도 eIF-5A를 코딩하는 DNA 분자의 하나의 가닥의 상응하는 부분, 또는 (ii) 상기 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자에 의해 코딩되는 RNA 서열의 하나 이상의 부분에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드; 및
(B) 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 결 합되어 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 하는 조절 서열
을 포함하는 벡터를 식물의 게놈 내로 통합시키는 단계; 및
(2) 식물을 생장시킴으로써 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 전사시키고, 전사체를 상기 내인성 RNA에 결합시켜 상기 노화-유도 eIF-5A 유전자의 발현을 억제시키는 단계.
식물 세포에 있어서, 노화-유도 DHS 유전자(들), 노화-유도 eIF-5A 유전자(들) 또는 둘 모두의 발현을 변경시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 식물에 있어서, 단독 또는 조합의 노화-유도 DHS 및 노화-유도 eIF-5A의 발현을 변경시키면 노화의 개시가 지연되며, 환경 스트레스 및 병원체에 대한 저항성이 개선되어, 식물의 저장 수명 및/또는 생장 기간이 연장된다.
노화-유도 발현을 나타내는 토마토 DHS 유전자를 코딩하는 전장 cDNA 서열은, 냉각-손상 토마토 잎으로부터 단리한 RNA를 주형으로 사용한 역전사효소 매개 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR), 및 소르비톨로 처리한 냉각-손상 토마토 잎 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 RT-PCR 생성물의 사용에 의해 단리되었다. 단리된 토마토 잎 cDNA 서열의 선택된 영역에 상응하는 폴리뉴클레오티드 프로브, 및 전장 토마토 잎 cDNA를 사용하여 환경 스트레스 (냉각) 토마토 잎, (탈수) 소르비톨-처리 토마토 잎, 원숙 토마토 열매 및 노화하는 토마토 꽃에 있어서 DHS 유전자를 코딩하는 mRNA의 존재를 측정하였다.
아라비돕시스 DHS 게놈 클론으로부터 디자인된 프라이머를 사용하여, 노화하 는 아라비돕시스 잎 cDNA 라이브러리를 주형으로 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 생성물을 생성하였다. 아라비돕시스 뉴클레오티드 서열은 상응하는 노화-유도 토마토 DHS 서열과 73%의 뉴클레오티드 서열 동일성 및 81%의 아미노산 서열 동일성을 가진다.
본 발명의 노화-유도 토마토 DHS 유전자를 RT-PCR을 사용하여 단리하였다. 토마토 DHS 유전자의 단리에 사용한 상류 프라이머는 24개의 뉴클레오티드 프라이머: 5'AG TCT AGA AGG TGC TCG TCC TGA T 3' (서열 번호 3) 이며;하류 프라이머는 34개의 뉴클레오티드: 5'G ACT GCA GTC GAC ATC GAT (T)15 3'(서열 번호 4)를 포함한다. 100 pmol의 하류 프라이머를 사용하여, 표준 RT-PCR의 사용에 의해 첫번째 cDNA 가닥을 단리하였다. 이어서, 상류 및 하류 프라이머 모두를 사용하는 RT-PCR에서 첫 번째 가닥을 주형으로 사용하였다. 아가로스 겔 상에서 RT-PCR 생성물을 분리하였더니 크기가 1.5 kb 내지 600 bp 범위인 3개의 독특한 밴드가 존재한다는 것이 나타났다. 3개의 프래그먼트를, 각각 상류 및 하류 프라이머에 존재하는 XbaI 및 SalI 클로닝 부위를 사용하여, 플라스미드 벡터 pBluescript (상표명) (미국 캘리포니아주 라졸라 소재의 Stratagene Cloning Systems제) 내로 서브클로닝하여, 서열결정하였다. 상기 프래그먼트의 서열을 젠뱅크 데이터 베이스에 존재하는 서열과 비교 정렬하였다. 결과에 의하면, 1.5 kb 및 1 kb 프래그먼트가 토마토 DHS 서열인 것으로 나타났다. 600 bp 프래그먼트는 인간, 효모 및 뉴로스포라 DHS 서열과도 정렬되었다.
600 bp RT-PCR 프래그먼트를 사용하여, 2 M 소르비톨로 6시간 동안 처리하여 탈수를 유도한 토마토 잎으로부터 수득되는 RNA로부터 제조한 토마토 (cv. 매치 F1 잡종) cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다. cDNA 라이브러리는, λZap (상표명) (미국 캘리포니아주 라졸라 소재의 Stratagene Cloning Systems제) cDNA 라이브러리 키트를 사용하여 콘스트럭션하였다. 노화-유도 DHS 유전자에 상응하는 3개의 동일한 양성 전장 cDNA 클론을 수득하여 서열결정하였다. 노화-유도 DHS cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 1에 나타내었다. cDNA 클론은 계산된 분자량이 42.1 KDa인 381개의 아미노산의 폴리펩티드 (서열 번호 2)를 코딩한다.
발육 및 스트레스 토마토 꽃, 열매 및 잎에서의 유전자 발현 패턴에 기초하면, 상기 클론은 노화에 연루되어 있다.
토마토 DHS cDNA 서열은 아라비돕시스 탈리아나 게놈 뱅크(http://genome-www.stanford.edu/Arabidopsis)의 미확인 게놈 서열과 정렬되었다. 결과에 의하면 미확인 아라비돕시스 게놈 서열 (AB 107060)과 정렬되는 것으로 밝혀졌다. 정렬 정보를 사용하여, 아라비돕시스 서열에서의 개봉 판독 프레임을 동정하여 그로부터 추정 아미노산 서열을 생성하였다. 정렬된 아라비돕시스 DHS 유전자의 생성 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 서열 번호 5 (도 2A) 및 서열 번호 6으로 각각 나타내었다.
확인된 짧은 영역의 아라비돕시스 DHS 유전자 서열에 기초한 2개의 하기 프라이머 1 및 2를 생성하였다: 프라이머 1, 5'GGTGGTGTTGAGGAAGATC 3'(서열 번호 7); 및 프라이머 2, 5' GGTGCACGCCCTGATGAAGC 3'(서열 번호 8). 표준 PCR에서 아 라비돕시스 노화 잎 cDNA 라이브러리를 2개의 상기 프라이머에 대한 주형으로 사용하였다. 600 bp PCR 생성물을 단리하여 서열결정하였더니, 상기 생성물은 상응하는 게놈 DHS 서열 프래그먼트의 생성물과 동일한 서열을 가지는 것으로 밝혀졌다.
전장 노화-유도 토마토 DHS cDNA 클론을 또한 사용하여 전장 노화-유도 아라비돕시스 및 카네이션 DHS cDNA 클론을 단리하였다. 전장 토마토 DHS cDNA 클론을 프로브로 사용하여, 노화 아라비돕시스 잎 cDNA 라이브러리 및 노화 카네이션 꽃잎 cDNA 라이브러리를 각각 스크리닝함으로써 아라비돕시스 및 카네이션 DHS cDNA 클론을 단리하였다. 이어서, cDNA 라이브러리로부터 수득되는 cDNA 클론을 서열결정하였다. 이러한 방식으로 단리한 아라비돕시스 전장 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열은, 토마토 cDNA 서열과의 정렬에 의해 아라비돕시스 DHS를 코딩하는 것으로 확인된 아라비돕시스 게놈 서열의 코딩 영역의 서열 (도 2A, 서열 번호 5)과 동일하였다. 전장 카네이션 꽃잎 노화-유도 DHS 클론의 뉴클레오티드 서열 및 유래되는 아미노산 서열을 도 10에 나타내었다 (각각 서열 번호 9 및 10).
이와 같이, 토마토, 카네이션 및 아라비돕시스로부터의 DHS를 코딩하는 본 발명의 cDNA 서열을 유사한 방식으로 프로브로 사용하여 다른 식물로부터의 DHS 유전자를 단리할 수 있으며, 이는 트랜스제닉 식물에서의 노화를 변경시키기 위하여 사용될 수 있다.
노화-유도 DHS 유전자는 DHS 유전자 패밀리의 일원인 것으로 나타났다. 토마토 잎 DNS의 게놈 서던 블롯 분석은 잡종 식물로부터 추출한 게놈 DNA를 사용하여 실시하였다. DHS 유전자의 코딩 영역 내의 단일 부위를 인식하거나, DHS 유전 자의 개봉 판독 프레임 내의 다른 부위를 인식하지 않는 여러 제한 효소를 사용하여 DNA를 절단하였다. 토마토 DHS의 제한효소 지도를 도 4에 나타내었다.
제한 효소로 절단한 토마토 잎 게놈 DNA를 32P-dCTP-라벨링 전장 토마토 DHS cDNA로 프로빙하였다. 높은 엄격도 조건 하에서의 혼성화에 의하면, 각각의 제한 효소 절단 DNA 샘플에 있어서 2 내지 3개의 제한효소 프래그먼트에 전장 cDNA 프로브가 혼성화하는 것으로 나타났다. 특히 주목해야 할 것은, DHS의 개봉 판독 프레임 내에 제한효소 부위를 가지는 XbaI 및 EcoRI으로 토마토 잎 게놈 DNA를 절단할 경우 (도 4), 서던 블롯에서 2개 이상의 제한효소 프래그먼트를 검출할 수 있었다는 것이다 (도 5). 잡종 변종인 cv 매치 F1, 및 호모접합체 주, UCT5로부터의 게놈 DNA는 동일한 제한효소 프래그먼트 패턴을 생성하였다. 이러한 결과는, 토마토 식물에서 2개 이상의 DHS 유전자 이소형이 존재한다는 것을 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이, DHS 유전자는 종들간에 고도로 보존되어 있어, 임의의 종들 이내의 이소형들 사이에서 상당한 양의 보존이 존재할 것으로 기대된다.
전장 토마토 cDNA로 프로브된 토마토 꽃의 전체 RNA의 노던 블롯은 노화-유도 DHS 유전자의 발현이 토마토 꽃송이에서는 유의하게 유도되지만, 꽃봉오리에서는 발현이 거의 검출되지 않는다는 것을 보여준다 (도 6). 토마토 열매의 상이한 발육 단계 동안 DHS 발현의 노던 블롯 분석은 DHS 유전자가 브레이커(breaker) 및 분홍색 열매에서는 낮은 수준으로 발현하는 반면, 적색 (완숙) 토마토 열매에서 DHS 발현은 유의하게 증진된다는 것을 증명한다 (도 7).
노던 블롯 분석은 또한 노화-유도 DHS 유전자가 예를 들면, 탈수 (도 8)와 냉각 (도 9)와 같은 환경 스트레스 조건에 의해 유도된다는 것을 증명한다. 탈수를 유도하기 위해 2 M 소르비톨로 처리한 토마토 잎은 비처리 잎에 비해 탈수된 잎에서 DHS 발현의 유도를 증명한다 (도 8). 냉각 온도에 노출시키고 주변 온도로 되돌린 식물은 냉각 손상 증상 (예, 누출)의 발생과 동시에 노화-유도 DHS 유전자의 유도된 발현을 보여준다 (도 9). 토마토 식물와 상이한 식물 조직, 예를 들면, 잎, 열매 및 꽃에서의 유전자 발현의 전체 패턴은 본 발명의 DHS 유전자가 이들 식물와 식물 조직에서 노화의 개시에 관여한다는 것을 증명한다.
아라비돕시스의 잎 노화와 카네이션의 꽃잎 노화의 개시에서 DHS 유전자 발현의 유도의 면에서 유사한 결과가 관찰된다. 다양한 연령의 식물로부터 단리된 아라비돕시스 잎의 전체 RNA의 노던 블롯 분석은 노화-유도 DHS 유전자의 발현이 어린 식물 (5주된 식물)에서는 명백하지 않지만 약 6주째에 나타나기 시작하는 것을 보여준다. DHS 유전자의 발현은 7주에서는 유의하게 유도된다. 노던 블롯 분석은 아라비돕시스 DHS 유전자가 식물이 나이가 듦에 따라 유의하게 증진된다는 것을 나타낸다 (도 11).
노던 블롯 분석은 또한 DHS 유전자가 카네이션과 같은 꽃이 피는 식물에서 유사하게 조절된다는 것을 증명한다 (도 12). 상이한 연령의 카네이션 꽃의 꽃잎으로부터 단리된 전체 RNA의 노던 블롯 분석은 카네이션 DHS의 발현이 노화의 첫번째 형태적인 증거인 꽃잎의 말림 (inrolling)과 같은 연령 유도된 노화의 증상을 갖는 꽃으로부터의 꽃잎에서 유의하게 유도되지만, 발현이 닫힌 꽃봉오리의 꽃에서 는 훨씬 더 적다는 것을 보여준다. 막 벌어지기 시작하는 카네이션 꽃으로부터의 꽃잎에서는 닫힌 꽃봉오리 단계의 꽃보다 DHS 발현이 유의하게 더 많으며, 완전히 벌어진 꽃으로부터의 꽃잎에서는 또한 DHS의 증진된 발현을 보여준다.
따라서, 식물 조직에서 노화-유도 DHS 유전자의 발현을 실질적으로 억제하거나 변경시킴으로써, 썩기쉬운 열매, 꽃 및 야채의 저장 기간을 증가시키면서 변질과 손상을 지연시킬 수 있으며, 식물와 그 조직은 스트레스에 보다 잘 견디며, 병원체에 보다 더 내성이 될 수 있는 것으로 예상된다. 이는 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터와 같은 콘스티튜티브 프로모터를 사용하여 또는 조직 특이적 또는 노화/스트레스 유도성 프로모터를 사용하여, DHS cDNA 또는 그의 올리고뉴클레오티드 프래그먼트가 열매, 꽃, 잎 및 야채에서 안티센스 배위로 발현되는 트랜스제닉 식물을 생산함으로써 성취할 수 있다.
식물에서 노화와 관련된 형태학적 변화의 유도에 관여하는 다른 유전자인 eIF-5A가 또한 DHS와 마찬가지로 본원에서 단리되고 서열결정되었으며, 이는 바람직하게는 안티센스 방향으로 식물 내에 도입함으로써 식물에서 노화 및 노화 관련 과정을 변경시키기 위해 사용할 수 있다. 전장 노화-유도 eIF-5A cDNA 클론을 완숙 토마토 열매, 노화 아라비돕시스 잎 및 노화 카네이션 꽃 cDNA 라이브러리 각각으로부터 단리하였다. 각각의 전장 클론의 뉴클레오티드 및 유도된 아미노산 서열을 도 13 (토마토 노화-유도 eIF-5A), 도 14 (카네이션 노화-유도 eIF-5A) 및 도 15 (아라비돕시스 노화-유도 eIF-5A)에 나타냈다. 이들 cDNA 클론 각각의 뉴클레오티드 서열을 또한 서열 11 (토마토; 도 13), 서열 13 (카네이션; 도 14) 및 서열 15 (아라비돕시스; 도 15)로서 나타냈다. 각 유전자의 유도된 아미노산 서열을 서열 12 (도 13), 서열 14 (도 14) 및 서열 16 (도 15)로서 각각 나타냈다.
본원에 기술한 DHS 유전자 서열의 경우와 마찬가지로, 본 발명의 eIF-5A 서열은 다른 식물로부터 eIF-5A 유전자를 단리하기 위해 사용할 수 있다. 단리된 eIF-5A 서열은 식물에서 노화 및 노화 관련 과정을 변경시키기 위해 사용할 수 있다. 식물로부터의 eIF-5A 서열의 단리는 약 70% 이상의 교차 종의 서열 유사성에 기초하여 당업계의 공지된 방법을 이용하여 성취할 수 있다.
노화 동안 식물에서 eIF-5A 및 DHS의 평행 유도가 일어난다. 노던 블롯 분석은 eIF-5A가 자연 및 스트레스 유도된 노화 모두의 개시시 DHS와 평행으로 상향조절된다는 것을 증명한다 (도 16 내지 도 20). 예를 들면, 다양한 연령의 아라비돕시스 식물의 잎으로부터 단리된 전체 RNA의 노던 블롯 분석은 식물에서 잎 노화가 명백한 시간부터 eIF-5A의 발현이 유도되며 노화가 진행함에 따라 발현이 유의하게 증진된다는 것을 증명한다. 토마토와 같은 열매를 맺는 식물에서, eIF-5A 및 DHS는 적색의 연질 열매에서 열매의 연화 및 손상의 개시와 동시에 평행하게 상향조절된다 (도 17).
노던 블롯 분석은 또한 eIF-5A 및 DHS가 건조 (도 18)과 냉각 손상 (도 20)과 같은 환경 스트레스에 반응하여 식물 내에서 평행하게 상향조절된다는 것을 증명한다. 유사하게, 꽃이 피는 식물에서, eIF-5A 및 DHS는 벌어진 꽃에서 평행하게 상향조절되며, 두 유전자의 발현은 개화의 보다 후기 단계를 통해 계속 증진된다.
클로닝된 노화-유도 DHS 유전자, 그의 프래그먼트(들), 또는 클로닝된 노화- 유도 eIF-5A 유전자 또는 그의 프래그먼트(들), 또는 eIF-5A 및 DHS 서열의 조합은 무화과 혹 (fig wart) 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모터 CaMV35S, 이중 35S 프로모터 또는 MAS 프로모터와 같은 콘스티튜티브 프로모터의 제어 하에 역 방향 (안티센스)으로 도입될 때 식물을 유전적으로 변형시키고 변형된 식물에서 노화를 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 토마토, 아라비돕시스 또는 카네이션 노화-유도 DHS 유전자 또는 노화-유도 eIF-5A 유전자와 충분한 서열 동일성을 갖는 다른 식물로부터의 선택된 안티센스 서열이 유사한 유전자 변형을 성취하기 위해 사용될 수 있다. 유전자 변형의 한 결과는 내인성 번역가능한 노화-유도 DHS를 코딩하는 mRNA, eIF-5A를 코딩하는 mRNA 또는 둘 모두의 양의 감소이다. 결론적으로, 식물 세포 내에서 생산된 노화-유도 DHS 및(또는) 노화-유도 eIF-5A의 양이 감소되어 활성화된 eIF-5A의 양을 감소시키며, 이는 다시 노화-유도 리파제, 노화-유도 프로테아제 및 노화-유도 뉴클레아제를 포함한 노화-유도 단백질의 번역을 감소시킨다. 따라서, 노화의 개시를 위해 드 노보 단백질 합성이 요구되기 때문에 노화가 억제되거나 또는 지연된다.
예를 들면, 아라비돕시스 노화-유도 DHS 유전자 (서열 26; 도 38)의 전장 또는 3'-영역을 이중 35S 프로모터의 조절 하에 안티센스 방향으로 발현하는 벡터로 형질전환된 아라비돕시스 식물은 도 21 내지 도 24에 나타낸 바와 같이 대조군 식물에 비해 증가된 생물량, 예를 들면, 더 큰 잎 크기와 모든 성장 단계 동안 전체적으로 더 큰 식물 성장, 및 지연된 잎의 노화를 보인다.
트랜스제닉 아라비돕시스 식물에서 아라비돕시스 노화-유도 DHS 유전자의 전 장 또는 3' 코딩 영역을 안티센스 방향으로 발현함으로써 발생된 노화-유도 DHS 유전자의 감소된 발현의 효과는 또한 형질전환된 식물에서 종자 수율의 증가로서 나타난다. 아라비돕시스 노화-유도 DHS 유전자의 안티센스 3' 비코딩 영역을 발현하는 아라비돕시스 식물주는 야생형 식물에 비해 6배 이상까지의 종자를 생산한다 (도 25).
이중 35S 프로모터의 조절 하에 안티센스 방향의 토마토 노화-유도 DHS 유전자 (서열 27)의 3' 말단으로 형질전환된 토마토 식물에서 유사한 결과가 얻어진다. 안티센스 방향의 유전자의 3' 말단으로 형질전환된 식물은 대조군 (형질전환되지 않은) 토마토 식물에 비해 증가된 잎 크기와 증가된 식물 크기를 보인다 (도 26 및 도 27).
안티센스 방향의 전장 토마토 노화-유도 DHS로 형질전환된 토마토 식물은 야생형 식물에 비해 연화와 손상이 지연된 열매를 생산한다 (도 28 내지 도 35). 따라서, 본 발명의 방법 및 서열은 열매의 연화와 손상을 지연시키기 위해서 뿐만 아니라, 식물 생물량과 종자 수율을 증가시키고 일반적으로 식물에서 노화를 지연시키기 위해서 사용할 수 있다.
본 발명의 단리된 뉴클레오티드 서열은 다른 식물 또는 유기체로부터의 실질적으로 상보적인 DHS 및(또는) eIF-5A 뉴클레오티드 서열을 단리하기 위해 사용할 수 있다. 이들 서열은 다시 식물을 형질전환시키고 그에 의해 본원에 나타낸 단리된 뉴클레오티드 서열의 사용에서 보이는 바와 동일한 방식으로 형질전환된 식물의 노화를 변경시키기 위해서 사용할 수 있다.
DHS, eIF-5A, 그의 프래그먼트 또는 그의 조합을 사용한 식물의 형질전환에서 얻어진 유전자 변형은 식물 내에서 노화-유도 DHS, eIF-5A 또는 둘 모두의 수준을 영구적으로 변화시키고 자가수분 또는 다른 번식법에 의해 자손 식물에 전해질 수 있다. 유전적으로 변경된 식물은 상기 변경이 세대간에 안정하게 전달되는 새로운 변종 또는 식물주를 생산하기 위해 사용된다. 본 발명은 최초로 광범위한 상이한 식물들에서 노화의 안정한 유전적 변형을 성취하기 위해 사용할 수 있는 적절한 DNA 서열을 제공한다.
노화-유도 DHS 유전자와 eIF-5A 유전자의 확인 및 단리를 위해, 일반적으로 플라스미드 DNA의 제조, 제한효소 소화, DNA의 아가로스 겔 전기영동, 단백질의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, PCR, RT-PCR, 서던 블롯, 노던 블롯, DNA 결찰 및 박테리아 형질전환을 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법을 이용하여 수행하였다 (예를 들어 문헌[Sambrook, J. 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989] 참조). 핵산 혼성화 기술은 문헌[Sambrook (상동)]에 개시되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "식물"는 전체 식물, 식물의 일부, 식물 세포 또는 식물 세포군을 나타낸다. 본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 식물의 종류로는 예를 들어 에틸렌 감수성 및 에틸렌 불감수성 식물; 열매를 맺는 식물, 예를 들어 살구, 사과, 오렌지, 바나나, 포도, 배, 토마토, 딸기, 아보카도 등; 야채, 예를 들어 당근, 완두콩, 상추, 양배추, 순무, 감자, 브로콜리, 아스파라거스 등; 꽃, 예를 들어 카네이션, 장미, 국화 등; 농작물 및 임업 작물, 예를 들어 옥수수, 벼, 콩, 알팔파 등; 및 일반적으로 본 발명의 DNA 분자를 받아들여 발현할 수 있는 임의의 식물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 식물은 반수체, 배수체, 4배체 및 다배체를 포함한 다양한 배수성(ploidy) 수준의 식물을 포함할 수도 있다. 식물은 단자엽식물 또는 쌍자엽식물일 수 있다.
본원에서 트랜스제닉 식물은 이종 또는 동종 노화-유도 DHS DNA 또는 변형된 DNA, 또는 이종 노화-유도 DHS DNA 또는 동종 노화-유도 DHS DNA의 일부 부분을 그의 게놈 내에 포함하는 식물을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 몇몇 방식으로 유전적으로 변형된 식물로서 정의된다. 별법으로, 본 발명의 트랜스제닉 식물은 이종 또는 동종 노화-유도 eIF-5A DNA 또는 변형된 DNA, 또는 이종 노화-유도 eIF-5A DNA 또는 동종 노화-유도 eIF-5A DNA의 일부 부분을 그의 게놈 내에 포함할 수 있다. 본 발명의 트랜스제닉 식물은 이종 또는 동종 노화-유도 DHS 및 eIF-5A DNA 또는 변형된 DNA, 또는 이종 노화-유도 DHS 및 eIF-5A DNA 또는 동종 노화-유도 DHS DNA의 일부 부분, 또는 이종 및 동종 DHS 및 eIF-5A 서열의 조합을 그의 게놈 내에 포함할 수 있다. 변경된 유전 물질은 단백질을 암호화하며, 조절 또는 제어 서열을 포함할 수 있거나, 또는 식물의 내인성 노화-유도 DHS 또는 eIF-5A DNA 또는 mRNA 서열 또는 그 일부에 안티센스인 안티센스 RNA를 암호화하거나, 또는 안티센스 서열이거나 포함할 수 있다. "트랜스젠" 또는 "트랜스제닉 서열"은 트랜스제닉 식물 내에 포함된 외래 유전자 또는 부분 서열로서 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "혼성화"는 일반적으로 프로브 서열 및 표적 서열의 성질에 의존하여 당업계의 숙련인에게 쉽게 명백해지는 바와 같은 적절한 엄격도 조건에서의 핵산의 혼성화를 의미하는 것으로 사용된다. 혼성화 및 세척 조건은 당업계에 잘 알려져 있으며, 인큐베이션 시간, 온도 및(또는) 용액의 이온 강도를 변화시킴으로써 원하는 엄격도에 의존한 조건의 조정이 쉽게 성취된다 (예를 들어 문헌[Sambrook, J. 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 참조). 조건의 선택은 혼성화시킬 서열의 길이, 특히 프로브 서열의 길이, 핵산의 상대적인 G-C 함량 및 허용되는 미스매치의 양에 의해 규정된다. 상보성 정도가 더 적은 스트랜드들 사이의 부분적인 혼성화가 요망되는 경우 낮은 엄격도 조건이 바람직하다. 완전한 또는 거의 완전한 상보성이 요망되는 경우 높은 엄격도 조건이 바람직하다. 전형적인 높은 엄격도 조건에 있어서, 혼성화 용액은 6×S.S.C., 0.01 M EDTA, 1×덴하르트 (Denhardt's) 용액 및 0.5% SDS를 함유한다. 혼성화는 약 68℃에서 클로닝된 DNA의 프래그먼트에 대해 약 3 내지 4시간 동안 및 전체 진핵세포 DNA에 대해 약 12 내지 약 16시간 동안 수행한다. 보다 낮은 엄격도에 있어서, 혼성화 온도를 듀플렉스의 융점 (TM) 미만 약 42℃로 낮춘다. TM은 G-C 함량과 듀플렉스 길이 뿐만 아니라 용액의 이온 강도의 함수인 것으로 알려져 있다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적인 서열 동일성" 또는 "실질적인 상동성"는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 다른 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 실질적인 구조적 또는 기능적 동등함을 나타내는 것을 가르키도록 사용된다. 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 상동성을 갖는 서열들 사이에서 임의의 구조적 또 는 기능적 차이는 최소일 것이며 (de minimis); 즉, 그 차이는 원하는 용도에서 지시되는 바와 같이 기능하는 서열의 능력에 영향을 끼치지 않을 것이다. 차이는 예를 들어 상이한 종들 사이의 코돈 사용에서의 본질적인 변동으로 인한 것일 수 있다. 구조적 차이는 2종 이상의 상이한 서열들 사이에 서열 겹침 또는 유사성의 유의한 양이 존재하는 경우, 또는 상이한 서열들이 그 서열들의 길이 또는 구조가 상이하더라도 유사한 물리적 특성을 나타내는 경우에 최소인 것으로 간주한다. 그러한 특성은 예를 들어 규정된 조건 하에 혼성화하는 능력, 또는 단백질의 경우 면역학적 교차반응성, 유사한 효소 활성 등을 포함한다. 이들 특성은 각각 당업계의 공지된 방법에 의해 숙련된 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.
부가적으로, 2개의 뉴클레오티드 서열들은 그 서열들이 그들 사이에 약 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상 및 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 유사성을 갖는 경우 "실질적으로 상보적"이다. 2개의 아미노산 서열은 그들이 폴리펩티드의 활성 부분들 사이에 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상의 유사성을 갖는 경우 실질적으로 상동성이다.
본원에서 사용되는 어구 DNA 또는 RNA 분자의 "상응하는 부분에 혼성화하는"은 혼성화하는 분자, 예를 들어 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 임의의 뉴클레오티드 서열 (센스 또는 안티센스 방향으로)이 적절한 조건 하에 혼성화를 수행하기에 충분한 서열 유사성을 갖는 대략 동일한 크기의 다른 핵산 분자 내의 서열을 인지하여 혼성화하는 것을 의미한다. 예를 들면, 토마토 DHS의 3' 코딩 또는 비코딩 영역으로부터의 100개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 분자는 두 서열 들 사이에 약 70% 이상의 서열 유사성이 존재하는 한, 카네이션 DHS 유전자 또는 임의의 다른 식물 DHS 유전자의 각각 3' 코딩 또는 비코딩 영역 내의 뉴클레오티드 서열의 대략 100 뉴클레오티드 부분을 인지하여 혼성화할 것이다. "상응하는 부분"의 크기는 "상응하는 부분"이 그에 혼성화하는 분자보다 더 작거나 더 클 수 있도록, 예를 들면, 20 내지 30% 더 크거나 더 작을 수 있도록, 바람직하게는 약 12 내지 15% 이하로 더 크거나 더 작을 수 있도록 혼성화에서 약간의 미스매치를 허용할 것임을 이해해야 한다.
본원에서 용어 핵산 (또는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드)의 "기능성 유도체"는 노화-유도 DHS 또는 노화-유도 eIF-5A를 코딩하는 유전자 또는 뉴클레오티드 서열의 프래그먼트, 변형체, 상동체 또는 유사체를 의미하는 것으로 사용된다. 기능성 유도체는 본 발명에 따른 유용성을 허용하는 DNA를 코딩하는 노화-유도 DHS 또는 eIF-5A의 기능의 적어도 일부를 보유할 수 있다. 그러한 기능은 낮은 엄격도 조건 하에 천연 토마토, 아라비돕시스 또는 카네이션의 노화-유도 DHS 또는 eIF-5A, 또는 노화-유도 DHS 또는 eIF-5A를 코딩하는 다른 식물로부터의 실질적으로 상동성인 DNA와, 또는 그의 mRNA 전사체와 혼성화하는 능력, 또는 안티센스 방향으로, 식물의 노화-유도 DHS 또는 eIF-5A mRNA의 전사 및(또는) 번역을 억제하는 능력 등을 포함할 수 있다.
유전자 또는 DNA 서열의 "프래그먼트"은 분자의 임의의 서브세트(subset), 예를 들어 보다 짧은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. "변형체"는 전체 유전자 또는 그의 프래그먼트에 실질적으로 유사한 분자, 예를 들어 하나 이상의 치환된 뉴클레오티드를 갖지만 특정 유전자와 혼성화하는 능력 또는 천연 DNA와 혼성화하는 mRNA 전사체를 코딩하는 능력을 유지하는 뉴클레오티드 치환 변형체를 나타낸다. "상동체"는 상이한 식물 종 또는 속으로부터의 프래그먼트 또는 변형 서열을 나타낸다. "유사체"는 전체 분자, 그의 변형체 또는 프래그먼트에 실질적으로 유사하거나 또는 그와 관련하여 기능하는 비천연 분자를 나타낸다.
유전자, 예를 들면, 노화-유도 DHS 유전자 또는 노화-유도 eIF-5A 유전자의 "변경된 발현" 또는 "변형된 발현"은 유전자의 정상적인 발현, 예를 들면, 비변형된 열매를 맺는 또는 꽃이 피는 또는 다른 식물에서 일어나는 발현이 어떠한 방식으로 변화되는 임의의 과정 또는 결과를 의미한다. 본원에서 의도되는 유전자 발현에서의 변경은 노화-유도 DHS 유전자 또는 노화-유도 eIF-5A 유전자 또는 둘 모두의 발현에서의 완전한 또는 부분적인 감소이지만, 또한 발현 시점에서의 변화, 또는 노화-유도 DHS 유전자 또는 노화-유도 eIF-5A 유전자 또는 둘 모두의 발현이 비변형된 식물 또는 재배종에서 가장 자연적으로 발생할 것과는 상이한 또다른 상태를 포함할 수 있다. 바람직한 변경은 비변형 식물에서의 생산에 비해 식물에 의한 노화-유도 DHS 생산, 노화-유도 eIF-5A 생산 또는 둘 모두의 감소를 일으키는 것이다.
본 발명에 따라 유전적으로 변경된 식물의 제조시에, 원하는 특질인 일반적으로 감소된 노화-유도 DHS의 발현 또는 생산, 또는 감소된 노화-유도 eIF-5A의 발현 또는 둘 모두에 의해 개별적인 모종 또는 식물을 선택하는 것이 바람직하다. 노화-유도 DHS 및 노화-유도 eIF-5A의 발현은 예를 들면, 트랜스제닉 식물에서 지연되거나 감소된 노화의 관찰에 의해 결정할 수 있다. 공지된 분석법을 이용하여 대조군 (정상, 비-트랜스제닉) 식물에 비교하여 트랜스제닉 식물에서의 DHS 및(또는) eIF-5A의 활성을 정량하는 것도 또한 가능하다.
새로 삽입된 유전자 또는 DNA 서열을 발현시켜 그가 코딩하는 단백질을 생산시키거나 또는 안티센스 DNA의 경우 상기 서열을 전사시켜 안티센스 RNA 분자를 제조하기 위해서, 적합한 조절 성분이 유전자 또는 DNA 서열에 대해 적합한 위치 및 방향으로 존재하여야 한다. 조절 영역은 프로모터, 5'-비번역 리더(leader) 서열 및 3'-폴리아데닐화 서열 뿐만 아니라 인핸서 및 다른 조절 서열을 포함할 수 있다.
노화-유도 DHS 유전자와 조합하여 유전자의 센스 또는 안티센스 전사체를 제조하기 위해 유용한 프로모터 조절 성분은 일반적으로 임의의 식물 프로모터, 및 더 구체적으로 콘스티튜티브 프로모터, 예를 들어 무화과 혹 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모터, CaMV35S 프로모터, 또는 MAS 프로모터, 또는 조직 특이적 또는 노화-유도 프로모터, 예를 들어 카네이션 꽃잎 GST1 프로모터 또는 아라비돕시스 SAG12 프로모터를 포함한다 (예를 들어 본원에 참고로 인용한 문헌[J.C. Palaqui 등, Plant Physiol., 112: 1447-1456 (1996); Morton 등, Molecular Breeding, 1: 123-132 (1995); Fobert 등, Plant Journal, 6: 567-577 (1994); 및 Gan 등, Plant Physiol., 113: 313 (1997)] 참조). 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 프로모터는 콘스티튜티브 프로모터이며, 가장 바람 직하게는 이중 35S 프로모터가 사용된다.
본 발명에 유용한 프로모터로부터의 발현 수준은 통상의 발현 시스템을 이용하여, 예를 들어 프로모터/리포터 유전자가 도입된 트랜스제닉 식물의 잎, 꽃, 열매 또는 다른 조직의 추출물에서 리포터 유전자 산물, 예를 들어 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정함으로써 시험할 수 있다.
본 발명은 토마토 노화-유도 DHS, 카네이션 노화-유도 DHS, 아라비돕시스 노화-유도 DHS를 코딩하는 유전자에 상보성이거나, 또는 낮은 내지 높은 엄격도 조건 하에 토마토, 카네이션 또는 아라비돕시스 노화-유도 DHS 유전자와 혼성화하는 다른 식물로부터의 유전자 또는 유전자 프래그먼트에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 토마토 노화-유도 eIF-5A, 카네이션 노화-유도 eIF-5A, 아라비돕시스 노화-유도 eIF-5A를 코딩하는 유전자에 상보성이거나, 또는 낮은 내지 높은 엄격도 조건 하에 토마토, 카네이션 또는 아라비돕시스 노화-유도 eIF-5A 유전자와 혼성화하는 다른 식물로부터의 유전자 또는 유전자 프래그먼트에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 최소의 혼성화 특이성을 제공하기 위해 약 6개 이상의 뉴클레오티드 길이이어야 하며, 노화-유도 유전자 또는 그의 일부를 코딩하는 DNA 또는 mRNA의 한 가닥, 또는 노화-유도 DHS 또는 eIF-5A 유전자 발현을 조절하는데 관여하는 게놈 DNA의 플랭킹 서열에 상보성일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 100개 이상의 뉴클레오티드만큼 클 수 있으며, 길이가 그가 안티센스인 전체 코딩 서열까지 또는 그 이상으로 뻗을 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 또는 그의 키메라 혼합물 또는 유도체 또는 변형체, 단쇄 또는 이중쇄일 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 작용은 세포에서 노화-유도 DHS 발현, 노화-유도 eIF-5A 발현 또는 둘 모두를 변경, 주로 억제시킬 수 있다. 안티센스에 대한 일반적인 논의는 본원에 참고로 인용한 문헌[Alberts 등, Molecular Biology of the Cell, 2판, Garland Publishing, Inc. New York, New York, 1989 (특히 195-196 페이지)]을 참조한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 노화-유도 DHS 또는 eIF-5A 유전자의 임의의 상응하는 부분에 상보성일 수 있다. 한 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 6 내지 100개 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 예를 들어 노화-유도 DHS 또는 eIF-5A 서열의 3' 말단 내의 5'-비코딩 서열에 상보성일 수 있다. 주로 5'-비코딩 서열에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전사 인자를 코딩하는 유전자의 발현의 효과적인 억제제인 것으로 알려져 있다 [Branch, M.A., Molec. Cell Biol., 13: 4284-4290 (1993)].
바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 노화-유도 DHS 또는 노화-유도 eIF-5A를 코딩하는 mRNA의 일부에 실질적으로 상보성이며, 상기 mRNA의 일부는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 크기가 거의 동일하다. 예를 들어, 안티센스 방향으로 노화-유도 DHS 또는 eIF-5A를 코딩하는 전장 cDNA 클론을 식물에 도입시키면 노화-유도 DHS 및(또는) eIF-5A 유전자 발현을 성공적으로 변경시킬 것으로 예상된다. 또한, 도 21 내지 도 35에서 증명되는 바와 같이, 노화-유도 DHS 유전자 또는 노화-유도 eIF-5A 유전자 또는 둘 모두의 특정 부분을 표적으로 하는 부분 서열을 도입시키는 것도 동등하게 효과적일 수 있다.
본 발명에서 요구되는 상동성의 최소량은 다른 RNA 또는 DNA 분자의 기능 및 다른 유전자의 발현에 영향을 주지 않으면서 특정한 표적 RNA 또는 DNA의 인식과 그의 번역 또는 기능의 억제 또는 감소를 제공하기에 충분한 상보성을 유도하기에 충분한 것이다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 노화-유도 DHS 유전자 또는 노화-유도 eIF-5A 유전자의 RNA 전사체의 상응하는 부분에 상보성인 서열을 포함하지만, 절대적인 상보성은 바람직하기는 하지만 요구되지는 않는다. 혼성화하는 능력은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 따를 수 있다. 일반적으로, 혼성화 핵산의 길이가 길수록, 그가 포함하여 여전히 안정한 이중체를 형성할 수 있는 노화-유도 DHS 표적 서열과의 염기 미스매치가 더 많다. 당업계의 숙련자는 예를 들어 혼성화된 복합체의 융점을 측정하기 위해 표준 절차를 이용함으로써 허용가능한 미스매치 정도를 확인할 수 있다.
안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 외래 도입된 핵산 서열로부터의 전사에 의해 세포내에서 생성될 수 있다. 안티센스 분자는 프로모터를 포함한 적절한 조절 성분에 작동가능하게 연결된 안티센스 노화-유도 DHS 서열을 코딩하는 DNA를 내부에 포함하는 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스를 사용한 형질전환 또는 형질감염 또는 감염에 의해 세포에 전달될 수 있다. 세포 내에서 외인성 DNA 서열이 발현되어, 노화-유도 DHS 유전자의 안티센스 RNA를 생산한다.
벡터는 바람직하게는 플라스미드일 수 있거나, 또는 식물 세포 또는 박테리 아 세포에서 코딩하는 유전자를 복제 및 발현하는 것으로 당업계에 알려진 바이러스 벡터 또는 다른 벡터일 수 있다. 벡터는 목적하는 안티센스 노화-유도 DHS RNA를 생산하기 위해 전사될 수 있도록 염색체 내로 통합된다. 그러한 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 당업계의 표준인 재조합 DNA 기술로 콘스트럭션할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 원핵세포 숙주 내에서 기능적인 복제 시스템과 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 플라스미드 벡터일 수 있다. 별법으로, 벡터는 아그로박테리움 (Agrobacterium)에서 기능적인 복제 시스템과 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 플라스미드일 수 있다. 아그로박테리움 내에서 복제할 수 있는 플라스미드는 당업계에 잘 알려져 있다 (문헌[Miki 등, Procedures for Introducing Foreign DNA Into Plants, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Eds. B.R. Glick 및 J.E. Thompson. CRC Press (1993), PP. 67-83] 참조).
토마토 DHS 유전자를 다음 방식으로 플라스미드 벡터 내로 안티센스 방향으로 클로닝시켰다. pUC18 골격으로부터 콘스트럭션되고, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)로부터의 35S 프로모터에 이어 다중 클로닝 부위와 옥타핀 합성효소 종결 서열을 함유하는 pCD 플라스미드를 사용하여 토마토 DHS 유전자를 클로닝하였다. pCd-DHS (안티센스) 플라스미드는 XhoI 및 SacI 제한효소 부위를 사용하여 안티센스 방향의 전장 토마토 DHS 유전자를 pCD 플라스미드 내로 서브클로닝하여 콘스트럭션하였다.
바람직하게는 노화-유도 DHS 또는 노화-유도 eIF-5A 유전자의 표적 서열에 상보성인 약 6 내지 약 100개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드는 재조합 뉴클레오티드 기술에 의해 제조할 수 있거나, 또는 예를 들어 모노뉴클레오티드 또는 보다 짧은 올리고뉴클레오티드로부터 합성할 수 있다. 자동화 합성기를 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 화학적 합성에 적용할 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 뉴클레오티드 분자의 콘스트럭션 절차는 본원에 그 전문을 참고로 인용한 문헌[Sambrook 등, In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 개시되어 있다. 노화-유도 데옥시하이퓨신 합성효소 서열에 상보성인 안티센스 RNA를 코딩하는 올리고뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 절차를 이용하여 제조할 수 있다. 그러한 절차에 관한 상세한 내용은 문헌[Maniatis, T. 등, Molecular mechanisms in the Control of Gene expression, eds., Nierlich 등, eds., Acad. Press, N.Y. (1976)]에 제공되어 있다.
본 발명의 별도의 실시태양에서, 내인성 식물 노화-유도 DHS, 노화-유도 eIF-5A 또는 둘 모두의 발현의 억제는 식물 세포 내에 도입된 외인성 노화-유도 DHS 또는 eIF-5A 유전자 또는 유전자 프래그먼트 또는 둘 모두의 과다발현을 통한 공동억제의 결과이다. 본 발명의 상기 실시태양에서, 노화-유도 DHS, 노화-유도 eIF-5A 또는 둘 모두를 센스 방향으로 코딩하는 벡터를 안티센스 분자에 대해 설명한 바와 동일한 방식으로 세포내에 도입시킨다. 바람직하게는, 노화-유도 DHS 또는 노화-유도 eIF-5A는 강력한 콘스티튜티브 프로모터, 예를 들어 무화과 혹 모자 이크 바이러스 프로모터 또는 CaMV35S 또는 이중 35 S 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 내인성 식물 노화-유도 DHS, 노화-유도 eIF-5A 또는 둘 모두의 발현의 억제는 리보자임의 사용을 통해 수행한다. 리보자임은 서열 특이적 엔도뉴클레아제 활성을 보이는 RNA 분자이다. 한 예는 표적 RNA에서 UH (여기서 H는 A, C 또는 U 잔기임) 인식 부위를 절단하며 리보자임의 촉매 도메인을 기질 RNA의 표적 부위에 지시하는 염기-페어링 영역을 함유하는 햄머헤드 (hammerhead) 리보자임이다. 리보자임은 표적 특이성이 높으며, 관련 mRNA의 보존 영역에 표적화되거나 다중유전자 패밀리의 한 구성원을 불활성화시키도록 설계될 수 있다 (문헌[Merlo 등, The Plant Cell, 10: 1603-1621, 1998] 참조). 리보자임 분자는 프로모터를 포함한 적절한 조절성분에 작동가능하게 연결된 리보자임이 내부에 포함된 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스를 사용한 형질전환, 형질감염 또는 감염에 의해 세포에 전달될 수 있다. 그러한 리보자임 구조체는 노화-유도 DHS mRNA 또는 노화-유도 eIF-5A mRNA 내의 절단 부위로 지시하여, DHS 또는 eIF-5A mRNA의 절단 및 노화-유도 DHS 및(또는) eIF-5A 발현의 억제를 일으키는 염기-페어링 암 (arms)을 포함한다.
본 발명에 따라 제조된 트랜스제닉 식물은 당업계에 공지된 임의의 식물 형질전환 방법을 사용하는 DNA 형질전환에 의해 제조할 수 있다. 식물 형질전환 방법은 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 식물, 조직 또는 세포의 직접 동시배양 또는 직접 감염 [Miki 등, Meth. in Plant Mol. Biol. and Biotechnology, (1993), p. 67-88]; 원형질 내로의 직접 유전자 전달 또는 원형질 흡수 [Paszkowski 등, EMBO J., 12: 2717 (1984)]; 전자천공 [Fromm 등, Nature, 319: 719 (1986)]; 입자 폭격(bombardment) [Klein 등, BioTechnology, 6: 559-563 (1988)]; 모종 및 식물의 분열조직 내로의 주사 [De LaPena 등, Nature, 325: 274-276 (1987)]; 배양된 세포 및 조직의 원형질 내로의 주사 [Reich 등, BioTechnology, 4: 1001-1004 (1986)]을 포함한다.
일반적으로, 완전한 식물은 형질전환 공정을 통해 얻는다. 식물은 원형질, 유합조직 (callus), 조직 일부 또는 체외이식편 등으로부터 재생된다. 노화-유도 DHS, 노화-유도 eIF-5A 또는 둘 모두의 발현이 변경된 재생된 식물로부터 얻은 식물 부분, 예를 들어 잎, 꽃, 열매, 종자 등은 본원에서 사용되는 "식물"의 정의 내에 포함된다. 재생된 식물의 자손, 변이체 및 돌연변이체도 또한 "식물"의 정의 내에 포함된다.
토마토, 카네이션 또는 아라비돕시스의 노화-유도 DHS 단백질 또는 그의 기능성 유도체, 및 토마토, 카네이션 또는 아라비돕시스의 노화-유도 eIF-5A 단백질 또는 그의 기능성 유도체는 바람직하게는 재조합 기술에 의해 임의로 화학 합성법과 조합하여 제조한다. 본 발명의 한 실시태양에서, 노화-유도 DHS는 바람직하게 말토스 결합 단백질과 융합된 노화-유도 DHS로 이루어진 융합 단백질로서 발현된다.
본원에 기술된 노화-유도 DHS 또는 노화-유도 eIF-5A 단백질의 "기능성 유도체"는 각각 노화-유도 DHS 또는 eIF-5A 활성, 또는 노화-유도 DHS 또는 노화-유도 eIF-5A에 대해 특이적인 항체와의 면역학적 교차 반응성의 적어도 일부를 보유하는, 각각 노화-유도 DHS 또는 노화-유도 eIF-5A의 프래그먼트, 변이체, 유사체 또는 화학적 유도체이다. 노화-유도 DHS 또는 노화-유도 eIF-5A 단백질의 프래그먼트는 분자의 임의의 서브세트를 나타낸다. 변이 펩티드는 예를 들어 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 직접 화학 합성법에 의해 제조할 수 있다. 노화-유도 DHS 또는 노화-유도 eIF-5A의 유사체는 전체 단백질 또는 그의 프래그먼트에 실질적으로 유사한 비천연 단백질을 나타낸다. 노화-유도 DHS 또는 노화-유도 eIF-5A의 화학적 유도체는 보통 펩티드 또는 펩티드 프래그먼트의 일부가 아닌 추가의 화학적 잔기를 함유한다. 펩티드의 표적된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도화제와 반응시켜 펩티드 또는 그의 프래그먼트를 변형시킬 수 있다.
본 발명에 따른 노화-유도 DHS 또는 노화-유도 eIF-5A 단백질 또는 펩티드는 본 발명의 뉴클레오티드 서열 (센스 방향)로 형질전환된 세포를 배양하고, 이 세포가 단백질을 합성하도록 한 후, 상기 단백질을 사용된 클로닝 프로토콜에 의존하여 유리 단백질으로서 또는 융합 단백질으로서 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 단리함으로써 제조할 수 있다. 별법으로, 단백질은 무세포계 (cell-free system)에서 제조할 수 있다 [Ranu 등, Meth. Enzymol., 60: 459-484 (1979)].
이하 본 발명을 일반적으로 설명하였고, 본 발명은 하기 실시예를 참고하여 보다 쉽게 이해할 수 있을 것이며 이 실시예는 예시로서 제공된 것이지 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
<실시예 1>
메신저 RNA (mRNA) 단리
전체 RNA를 상이한 발육 단계의 토마토 꽃과 토마토 열매, 및 잎 (비처리된 또는 냉각 또는 소르비톨 처리 후)으로부터 단리하였다. 간략히, 조직 5 g을 액체 질소 내에서 연마하였다. 연마된 분말을 30 ㎖의 구아니디늄 완충액 (4 M 구아니디늄 이소티오시아네이트, 2.5 mM NaOAc pH 8.5, 0.8% β-머캅토에탄올)과 혼합하였다. 혼합물을 4층의 무명천을 통해 여과하고 10,000×g에서 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 이어서 상등액을 26,000×g에서 20시간 동안 염화세슘 밀도 구배 원심분리하였다. 펠렛화된 RNA를 75% 에탄올로 세정하고, 600 ㎕의 DEPC 처리된 물에 재현탁시키고, 0.75 ㎖의 95% 에탄올과 30 ㎕의 3 M NaOAc를 사용하여 -70℃에서 RNA를 침전시켰다. 10 ㎍의 RNA를 1.2% 변성 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 분획화시키고 나일론막에 옮겼다. 랜덤하게 프라이밍된 32P-dCTP-표지된 전장 DHS cDNA (서열 1)를 사용하여 막을 42℃에서 철야 프로빙하였다. 이어서, 막을 0.1% SDS를 함유하는 1×SSC로 실온에서 15분 동안 1회 및 0.1% SDS를 함유하는 0.2×SSC로 65℃에서 각각 15분 동안 3회 세척하였다. 막을 -70℃에서 x-선 필름에 철야 노출시켰다.
프로메가(Promega)에서 입수가능한 PolyA+ 트랙(track) mRNA 단리계 (Isolation System)를 사용하여 전체 RNA로부터 PolyA+ mRNA를 단리하였다. 이 PolyA+ mRNA를 스트라타젠(Stratagene; 캘리포니아주 라 졸라 소재)에서 입수가능한 ZAP Express
Figure 112006067394290-pat00002
cDNA 합성계를 이용하는 cDNA 합성을 위한 주형으로서 사용하였다.
토마토 잎 cDNA 라이브러리 스크리닝
2 M 소르비톨에 6시간 동안 노출시킨 Match F1 하이브리드 토마토 잎에서 단리시킨 mRNA를 사용하여 제조한 cDNA 라이브러리를 약 5×106 PFU/㎖로 희석하였다. 이 cDNA 라이브러리를 32P-표지된 600 bp RT-PCT 프래그먼트를 사용하여 스크리닝하였다. 3개의 양성 cDNA 클론을 절제하여 제조업자의 지시에 따른 방법을 사용하여 pBK-CMV
Figure 112006067394290-pat00003
(스트라타젠) 파지미드 (phagemid) 내로 재순환시켰다. 전장 cDNA를 pBK-CMV 벡터에 삽입하였다.
플라스미드 DNA 단리, DNA 서열결정
샘브룩 (Sambrook) 등의 문헌(상동)에 기재된 알칼리 용해법을 사용하여 플라스미드 DNA를 단리하였다. 디데옥시 서열결정법 [Sanger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467]을 이용하여 전장 양성 cDNA 클론을 서열결정하였다. 개방 해독 프레임을 모아서 BLAST 써치 (젠뱅크(GenBank; 매릴랜드주 베테스다 소재))를 사용하여 분석하고, 5개의 가장 상동성인 단백질의 암호화된 유전자의 유도된 아미노산 서열과의 정렬을 BCM Search Launcher: Multiple Sequence Alignments Pattern-Induced Multiple Alignment Method (문헌[F. Corpet, Nuc. Acids Res., 16:10881-10890 (1987)] 참조)를 사용하여 수행하였다. 유도된 아미노산 서열에 존재하는 기능적 모티프는 MultiFinder에 의해 확인하였다.
토마토 RNA의 노던 블롯 혼성화
상이한 단계의 토마토 꽃 (꽃봉오리와 꽃송이, 및 활짝 벌어지거나 또는 마르는 노화 꽃잎), 토마토 잎 및 상이한 숙성 단계의 토마토 열매 (브레이커, 즉 적색이 10% 미만인 녹색 열매, 분홍색 열매, 즉 전체 열매가 오렌지색 또는 분홍색인 열매, 및 적색 열매 (무르거나 또는 단단한))으로부터 단리한 전체 RNA 10 ㎍을 1% 변성 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 분리시키고 나일론막에 고정시켰다. 랜덤 프라이머 키트 (Boehringer Mannheim)을 사용하여 32P-dCTP로 표지된 전장 토마토 cDNA를 사용하여 필터 (7×107 cpm)를 프로빙하였다. 필터를 1×SSC, 0.1% SDS로 실온에서 1회 및 0.2×SSC, 0.1% SDS로 65℃에서 3회 세척하였다. 필터를 건조시키고 -70℃에서 x-선 필름에 철야 노출시켰다. 그 결과를 도 6, 도 7, 도 8 및 도 9에 나타냈다.
아라비돕시스 RNA의 노던 블롯 혼성화
5주 (레인 1), 6주 (레인 2) 및 7주 (레인 3)된 아라비돕시스 식물의 잎으로부터의 전체 RNA를 상기한 바와 같이 단리하고, 1% 변성 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 분리시키고 나일론막에 고정시켰다. 랜덤 프라이머 키트 (Boehringer Mannheim)을 사용하여 32P-dCTP로 표지된 전장 아라비돕시스 노화-유도 DHS cDNA를 사용하여 필터 (7×107 cpm)를 프로빙하였다. 필터를 1×SSC, 0.1% SDS로 실온에서 1회 및 0.2×SSC, 0.1% SDS로 65℃에서 3회 세척하였다. 필터를 건조시키고 -70℃에서 x-선 필름에 철야 노출시켰다. 그 결과를 도 11에 나타냈다.
카네이션 RNA의 노던 블롯 혼성화
상이한 꽃 발육 단계의 카네이션 식물, 즉 꽃봉오리가 꽉닫힌 꽃 (레인 1), 벌어지기 시작한 꽃 (레인 2), 활짝 벌어진 꽃 (레인 3) 및 꽃잎이 말리고 있는 꽃 (레인 4)의 꽃잎으로부터의 전체 RNA를 상기한 바와 같이 단리하고, 1% 변성 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 분리시키고 나일론막에 고정시켰다. 랜덤 프라이머 키트 (Boehringer Mannheim)을 사용하여 32P-dCTP로 표지된 전장 카네이션 노화-유도 DHS cDNA를 사용하여 필터 (7×107 cpm)를 프로빙하였다. 필터를 1×SSC, 0.1% SDS로 실온에서 1회 및 0.2×SSC, 0.1% SDS로 65℃에서 3회 세척하였다. 필터를 건조시키고 -70℃에서 x-선 필름에 철야 노출시켰다. 그 결과를 도 12에 나타냈다.
<실시예 2>
토마토 노화-유도 DHS 유전자의 소르비톨 유도
토마토 잎을 밀봉실에서 2 M 소르비톨로 6시간 동안 처리하였다. 다음과 같이 소르비톨 처리된 잎으로부터 RNA를 추출하였다.
잎 5 g을 액체 질소 내에서 연마하였다. 연마된 분말을 30 ㎖의 구아니디늄 완충액 (4 M 구아니디늄 이소티오시아네이트, 2.5 mM NaOAc pH 8.5, 0.8% β-머캅토에탄올)과 혼합하였다. 혼합물을 4층의 무명천을 통해 여과하고 10,000×g에서 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상등액을 26,000×g에서 20시간 동안 염화세슘 밀도 구배 원심분리하였다. 펠렛화된 RNA를 75% 에탄올로 세정하고, 600 ㎕의 DEPC 처리된 물에 재현탁시키고, 0.75 ㎖의 95% 에탄올과 30 ㎕의 3 M NaOAc를 사용하여 -70℃에서 RNA를 침전시켰다. 10 ㎍의 RNA를 1.2% 변성 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 분획화시키고 나일론막에 옮겼다. 랜덤하게 프라이밍된 32P-dCTP로 표지된 전장 DHS cDNA (서열 1)를 사용하여 막을 42℃에서 철야 프로빙하였다. 이어서, 막을 0.1% SDS를 함유하는 1×SSC로 실온에서 15분 동안 1회 및 0.1% SDS를 함유하는 0.2×SSC로 65℃에서 각각 15분 동안 3회 세척하였다. 막을 -70℃에서 x-선 필름에 철야 노출시켰다.
그 결과를 도 8에 나타냈다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 소르비톨에 의해 잎에서 DHS의 전사가 유도된다.
<실시예 3>
노화 꽃에서의 토마토 DHS 유전자의 유도
토마토 식물의 닫힌 꽃봉오리와 벌어진 노화 꽃을 수확하여, 실시예 2에서와 같이 RNA를 단리하였다. 10 ㎍의 RNA를 1.2% 변성 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 분획화시키고 나일론막에 옮겼다. 랜덤하게 프라이밍된 32P-dCTP로 표지된 전장 DHS cDNA (서열 1)를 사용하여 막을 42℃에서 철야 프로빙하였다. 이어서, 막을 0.1% SDS를 함유하는 1×SSC로 실온에서 15분 동안 1회 및 0.1% SDS를 함유하는 0.2×SSC로 65℃에서 각각 15분 동안 3회 세척하였다. 막을 -70℃에서 x-선 필름 에 철야 노출시켰다.
그 결과를 도 6에 나타냈다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 노화 꽃에서 DHS의 전사가 유도된다.
<실시예 4>
완숙 열매에서의 토마토 DHS 유전자의 유도
브레이커, 분홍색 열매 및 익은 열매로부터 실시예 2에서와 같이 RNA를 단리하였다. 10 ㎍의 RNA를 1.2% 변성 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 분획화시키고 나일론막에 옮겼다. 랜덤하게 프라이밍된 32P-dCTP로 표지된 전장 DHS cDNA (서열 1, 도 1)를 사용하여 막을 42℃에서 철야 프로빙하였다. 이어서, 막을 0.1% SDS를 함유하는 1×SSC로 실온에서 15분 동안 1회 및 0.1% SDS를 함유하는 0.2×SSC로 65℃에서 각각 15분 동안 3회 세척하였다. 막을 -70℃에서 x-선 필름에 철야 노출시켰다.
그 결과를 도 7에 나타냈다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 손상에 이르는 노화의 개시 직전의 익은 적색 열매에서 DHS의 전사가 가장 강하다.
<실시예 5>
냉각에 의한 토마토 노화-유도 DHS 유전자의 유도
화분의 토마토 식물 (7 내지 8주)를 성장실에서 2일, 3일 또는 6일 동안 6℃에 노출시켰다. 광주기는 8시간의 어둠과 16시간의 밝음으로 설정하였다. 식물을 온실로 옮겨 재가온시켰다. 재가온시키지 않은 식물을 성장실로부터 꺼낸 직후 수 확하였다. 다음과 같이 잎으로부터 RNA를 추출하였다.
잎 5 g을 액체 질소 내에서 연마하였다. 연마된 분말을 30 ㎖의 구아니디늄 완충액 (4 M 구아니디늄 이소티오시아네이트, 2.5 mM NaOAc pH 8.5, 0.8% β-머캅토에탄올)과 혼합하였다. 혼합물을 4층의 무명천을 통해 여과하고 10,000g에서 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 이어서 상등액을 26,000g에서 20시간 동안 염화세슘 밀도 구배 원심분리하였다. 펠렛화된 RNA를 75% 에탄올로 세정하고, 600 ㎕의 DEPC 처리된 물에 재현탁시키고, 0.75 ㎖의 95% 에탄올과 30 ㎕의 3 M NaOAc를 사용하여 -70℃에서 RNA를 침전시켰다. 10 ㎍의 RNA를 1.2% 변성 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 분획화시키고 나일론막에 옮겼다. 랜덤하게 프라이밍된 32P-dCTP로 표지된 전장 DHS cDNA (서열 1)를 사용하여 막을 42℃에서 철야 프로빙하였다. 이어서, 막을 0.1% SDS를 함유하는 1×SSC로 실온에서 15분 동안 1회 및 0.1% SDS를 함유하는 0.2×SSC로 65℃에서 각각 15분 동안 3회 세척하였다. 막을 -70℃에서 x-선 필름에 철야 노출시켰다.
그 결과를 도 9에 나타냈다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 냉각 온도에 노출시키고 후속적으로 재가온시킴으로써 잎에서 DHS의 전사가 유도되며, 강화된 전사는 막 누출로서 측정된 냉각 손상과 서로 관련된다.
<실시예 6>
미확인 아라비돕시스 게놈 서열에 기초한 프라이머를 사용한 아라비돕시스 PCR 생성물의 생성
아라비돕시스 게놈 서열로부터 고안된 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 PCR에 의해 아라비돕시스 cDNA 주형으로부터 부분 길이의 노화-유도 DHS 서열을 생성하였다. 5' 프라이머는 서열 5'-GGTGGTGTTGAGGAAGATC (서열 7)을 갖는 19mer이고; 3' 프라이머는 서열 GGTGCACGCCCTGATGAAGC-3' (서열 8)을 갖는 20mer이다. 주형으로서 아라비돕시스 노화 잎 cDNA 라이브러리와 Expand High Fidelity PCR 시스템 (Boehringer Mannheim)을 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응을 다음과 같이 수행하였다.
반응 성분:
cDNA 1 ㎕ (5×107 pfu)
dNTP (각각 10 mM) 1 ㎕
MgCl2 (5 mM) + 10×완충액 5 ㎕
프라이머 1 및 2 (각각 100 μM) 2 ㎕
Expand High Fidelity DNA 폴리머라제 1.75 U
반응 부피 50 ㎕
반응 파라미터:
94℃에서 3분
94℃/1분, 58℃/1분, 72℃/2분, 45 싸이클
72℃에서 15분
<실시예 7>
게놈 DNA의 단리 및 서던 분석
토마토 잎 조직 10 g을 액체 질소 내에서 미세 분말로 연마하여 토마토 잎으로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 25 ㎖의 균질화 완충액 [100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mm EDTA, 250 mM NaCl, 1% 사르코실, 1% 2-머캅토에탄올, 10 ㎍/㎖ RNase 및 12.5 ㎖ 페놀]을 함유하는 혼합물 37.5 ㎖을 60℃로 예비가온시켜 연마된 조직에 첨가하였다. 혼합물을 15분 동안 진탕하였다. 추가로 12.5 ㎖의 클로로포름/이소아밀 알콜 (24:1)을 혼합물에 첨가하고 추가로 15분 동안 진탕하였다. 혼합물 을 원심분리하고, 수성상을 25 ㎖ 페놀/클로로포름/이소아밀알콜 (25:24:1) 및 클로로포름/이소아밀알콜 (24:1)로 재추출하였다. 실온에서 15 ㎖ 이소프로판올로 침전시켜 핵산을 회수하였다. 침전물을 물 1 ㎖에 재현탁하였다.
게놈 DNA를 다음과 같이 제한효소 소화시켰다:
10 ㎍의 게놈 DNA, 40 ㎕의 10×반응 완충액 및 100 U 제한효소 (XbaI, EcoRI, EcoRV 또는 HinDIII)를 400 ㎕의 총 반응 부피로 5 내지 6시간 동안 반응시켰다. 이어서 혼합물을 페놀로 추출하고 에탄올로 침전시켰다. 소화된 DNA를 0.8% 아가로스겔 상에서 15 볼트에서 약 15시간 동안 아가로스 겔 전기영동시켰다. 겔을 변성 완충액 [87.66 g NaCl 및 20 g NaOH/리터]에 30분 동안 부드럽게 교반하면서 침액시키고, 증류수로 세정하고, 중화 완충액 [87.66 g NaCl 및 60.55 g tris-HCl, pH 7.5/리터]에 30분 동안 부드럽게 교반하면서 침액시켰다. DNA를 모세관 블롯팅에 의해 Hybond-N+ 나일론막에 옮겼다.
혼성화를 1×106 cpm/㎖의 32P-dCTP-표지된 전장 DHS cDNA, 또는 DHS cDNA 클론의 3' 비코딩 영역을 사용하여 42℃에서 철야로 수행하였다. 예비혼성화 및 혼성화를 50% 포름아미드, 6×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.1% SDS 및 100 mg/㎖ 변성 연어 정자 DNA를 함유하는 완충액 중에서 수행하였다. 막을 2 내지 4시간 동안 예비혼성화시키고; 혼성화를 철야로 수행하였다.
혼성화가 완료된 후, 막을 2×SSC 및 0.1% SDS에서 실온에서 세정한 후, 2×SSC 및 0.1% SDS에서 15분 및 0.2×SSC 및 0.1% SDS에서 15분 동안 세척하였다. 이어서 막을 -80℃에서 x-선 필름에 철야 노출시켰다. 그 결과를 도 5에 나타냈다.
<실시예 8>
아라비돕시스로부터의 노화-유도 eIF-5A 유전자의 단리
아라비돕시스 잎에서 발현된 노화-유도 eIF-5A 유전자의 전장 cDNA 클론을 주형으로서 아라비돕시스 노화 잎 cDNA 라이브러리를 사용하여 PCR에 의해 수득하였다. 먼저, 벡터 T7 프라이머 <AATACGACTCACTATAG> (서열 18)과 페어링된 변성 상류 프라이머 <AAARRYCGMCCYTGCAAGGT> (서열 17), 및 벡터 T3 프라이머 <ATTAACCCTCACTAAAG> (서열 20)과 페어링된 변성 하류 프라이머 <TCYTTNCCYTCMKCTAAHCC> (서열 19)를 사용하여 유전자의 5'-말단 및 3'-말단에 상응하는 PCR 생성물을 제조하였다. PCR 생성물을 서열결정을 위해 pBluescript에 서브클로닝하였다. 이어서, 3' 특이적 프라이머 <AGAAGAAGTATAAAAACCATC> (서열 22)과 페어링된 5' 특이적 프라이머 <CTGTTACCAAAAAATCTGTACC> (서열 21)을 사용하여 전장 cDNA를 수득하여, 서열결정을 위해 pBluescript에 서브클로닝하였다.
<실시예 9>
토마토 열매로부터의 노화-유도 eIF-5A 유전자의 단리
토마토 열매에서 발현된 노화-유도 eIF-5A 유전자의 전장 cDNA 클론을 주형으로서 토마토 열매 cDNA 라이브러리를 사용하여 PCR에 의해 수득하였다. 먼저, 벡터 T7 프라이머 (서열 18)과 페어링된 변성 상류 프라이머 (서열 17), 및 벡터 T3 프라이머 (서열 20)과 페어링된 변성 하류 프라이머 (서열 19)를 사용하여 유전 자의 5'-말단 및 3'-말단에 상응하는 PCR 생성물을 제조하였다. PCR 생성물을 서열결정을 위해 pBluescript에 서브클로닝하였다. 이어서, 벡터 T7 프라이머 (서열 18)과 페어링된 5' 특이적 프라이머 <AAAGAATCCTAGAGAGAGAAAGG> (서열 23)을 사용하여 전장 cDNA를 수득하여, 서열결정을 위해 pBluescript에 서브클로닝하였다.
<실시예 10>
카네이션으로부터의 노화-유도 eIF-5A 유전자의 단리
카네이션 꽃에서 발현된 노화-유도 eIF-5A 유전자의 전장 cDNA 클론을 주형으로서 카네이션 노화 꽃 cDNA 라이브러리를 사용하여 PCR에 의해 수득하였다. 먼저, 벡터 T7 프라이머 (서열 18)과 페어링된 변성 상류 프라이머 (서열 17), 및 벡터 T3 프라이머 (서열 20)과 페어링된 변성 하류 프라이머 (서열 19)를 사용하여 유전자의 5'-말단 및 3'-말단에 상응하는 PCR 생성물을 제조하였다. PCR 생성물을 서열결정을 위해 pBluescript에 서브클로닝하였다. 이어서, 3'-특이적 프라이머 <ACCAAAACCTGTGTTATAACTCC> (서열 25)와 페어링된 5'-특이적 프라이머 <TTTTACATCAATCGAAAA> (서열 24)을 사용하여 전장 cDNA를 수득하여, 서열결정을 위해 pBluescript에 서브클로닝하였다.
<실시예 11>
아라비돕시스로부터의 노화-유도 DHS 유전자의 단리
아라비돕시스 잎에서 발현된 노화-유도 DHS 유전자의 전장 cDNA 클론을 아라비돕시스 노화 잎 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 수득하였다. 스크리닝에 사용된 프로브의 서열 (서열 26)은 도 38에 나타냈다. 프로브는 주형으로서 노화 잎 cDNA, 및 젠뱅크의 미확인 게놈 서열 (AB017060)으로부터 설계된 프라이머 (도 38에서 밑줄친 영역으로 표시함)을 사용하여 PCR에 의해 수득하였다. PCR 생성물을 서열결정을 위해 pBluescript에 서브클로닝하였다.
<실시예 12>
카네이션으로부터의 노화-유도 DHS 유전자의 단리
카네이션 꽃잎에서 발현된 노화-유도 DHS 유전자의 전장 cDNA 클론을 카네이션 노화 꽃잎 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 수득하였다. 스크리닝에 사용된 프로브의 서열 (서열 27)을 도 39에 나타냈다. 프로브는 주형으로서 노화 꽃잎 cDNA 라이버러리, 및 변성 프라이머 (상류: 5' TTG ARG AAG ATY CAT MAA RTG CCT 3') (서열 28); 하류: 5' CCA TCA AAY TCY TGK GCR GTG TT 3') (서열 29)를 사용하여 PCR에 의해 수득하였다. PCR 생성물을 서열결정을 위해 pBluescript에 서브클로닝하였다.
<실시예 13>
안티센스 방향의 아라비돕시스 DHS의 전장 또는 3' 영역을 사용하는 아라비돕시스의 형질전환
아그로박테리아를 전장 노화-유도 아라비돕시스 DHS의 cDNA 서열, 또는 DHS 유전자의 3' 말단 (서열 30, 도 36) (둘 모두 이중 35S 프로모터의 조절 하에 안티센스 배위로 발현됨)을 함유하는 2원 벡터 pKYLX71로 형질전환시켰다. 아라비돕시스 식물을 진공 침윤 (infiltration)에 의해 상기 형질전환된 아그로박테리아로 형 질전환시키고, 생성된 T0 식물로부터 형질전환된 종자를 암피실린 상에서 선별하였다.
도 21 내지 도 24는 형질전환된 아라비돕시스 식물의 사진으로서, 형질전환된 식물에서 안티센스 방향의 DHS 유전자 또는 그의 3' 말단의 발현이 증가된 생물량, 예를 들어 더 큰 잎과 증가된 식물 크기를 일으킨다는 것을 보여준다. 도 25는 트랜스제닉 아라비돕시스 식물에서 종자 수율이 증가하였음을 입증한다.
<실시예 14>
안티센스 방향의 토마토 DHS의 전장 또는 3' 영역을 사용한 토마토 식물의 형질전환
아그로박테리아를 전장 노화-유도 토마토 DHS cDNA의 서열, 또는 DHS 유전자의 3' 말단 (서열 31, 도 37) (둘 모두 이중 35S 프로모터의 조절 하에 안티센스 배위로 발현됨)을 함유하는 2원 벡터 pKYLX71로 형질전환시켰다. 상기 아그로박테리아로 토마토 잎 체외배양편을 형성시키고, 형질전환된 유합조직과 모종을 표준 조직 배양법에 의해 생성시켜 선별하였다. 형질전환된 모종을 온실 조건 하에서 성숙한 열매를 맺는 T1 식물로 정상시켰다.
도 26 내지 도 35는 형질전환된 식물에서 노화-유도 토마토 DHS 유전자의 발현 감소가 형질전환된 아라비돕시스 식물에서 보이는 바와 같이 증가된 생물량, 예를 들어 보다 큰 잎 크기와 보다 큰 식물 뿐만 아니라 토마토 열매의 연화와 손상을 지연시키는 것을 보여주는 사진이다.
본 발명의 효과는 노화를 포함하여 세포예정사멸의 개시에 의해 발현이 유도되는 노화 유도 식물 데옥시하이퓨신 신타제 유전자 및 노화-유도 eIF-5A 유전자, 그리고 단독 또는 조합의 데옥시하이퓨신 신타제 유전자 및 eIF-5A 유전자의 식물에 있어서의 세포예정사멸 및 노화의 제어를 위한 용도를 제공하는 것이다.
<110> SENESCO, INC. <120> DNA ENCODING A PLANT DEOXYHYPUSINE SYNTHASE, A PLANT EUKARYOTIC INITIATION FACTOR 5A, TRANSGENIC PLANTS AND A METHOD FOR CONTROLLING SENESCENCE AND PROGRAMMED CELL DEATH IN PLANTS <150> US 09/348,675 <151> 1999-07-06 <150> US 09/597,771 <151> 2000-06-19 <160> 35 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1609 <212> DNA <213> Lycopersicon sp. <220> <221> CDS <222> (54)..(1196) <400> 1 cgcagaaact cgcggcggca gtcttgttcc ctacataatc ttggtctgca ata 53 atg gga gaa gct ctg aag tac agt atc atg gac tca gta aga tcg gta 101 Met Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Ser Ile Met Asp Ser Val Arg Ser Val 1 5 10 15 gtt ttc aaa gaa tcc gaa aat cta gaa ggt tct tgc act aaa atc gag 149 Val Phe Lys Glu Ser Glu Asn Leu Glu Gly Ser Cys Thr Lys Ile Glu 20 25 30 ggc tac gac ttc aat aaa ggc gtt aac tat gct gag ctg atc aag tcc 197 Gly Tyr Asp Phe Asn Lys Gly Val Asn Tyr Ala Glu Leu Ile Lys Ser 35 40 45 atg gtt tcc act ggt ttc caa gca tct aat ctt ggt gac gcc att gca 245 Met Val Ser Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn 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Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn 165 170 175 tac tgc aaa ttt gag aat tgg atc atc cca gtt ttt gac caa atg tat 629 Tyr Cys Lys Phe Glu Asn Trp Ile Ile Pro Val Phe Asp Gln Met Tyr 180 185 190 gag gag cag att aat gag aag gtt cta tgg aca cca tct aaa gtc att 677 Glu Glu Gln Ile Asn Glu Lys Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Val Ile 195 200 205 gct cgt ctg ggt aaa gaa att aat gat gaa acc tca tac ttg tat tgg 725 Ala Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asp Glu Thr Ser Tyr Leu Tyr Trp 210 215 220 gct tac aag aac cgg att cct gtc ttc tgt cct ggc ttg acg gat gga 773 Ala Tyr Lys Asn Arg Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly 225 230 235 240 tca ctt ggt gac atg cta tac ttc cat tct ttc aaa aag ggt gat cca 821 Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Lys Lys Gly Asp Pro 245 250 255 gat aat cca gat ctt aat cct ggt cta gtc ata gac att gta gga gat 869 Asp Asn Pro Asp Leu Asn Pro Gly Leu Val Ile Asp Ile Val Gly Asp 260 265 270 att agg gcc atg aat ggt gaa gct gtc cat gct ggt ttg agg aag aca 917 Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Gly Leu Arg Lys Thr 275 280 285 gga atg att ata ctg ggt gga ggg ctg cct aag cac cat gtt tgc aat 965 Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Val Cys Asn 290 295 300 gcc aat atg atg cgc aat ggt gca gat ttt gcc gtc ttc att aac acc 1013 Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Phe Ala Val Phe Ile Asn Thr 305 310 315 320 gca caa gag ttt gat ggt agt gac tct ggt gcc cgt cct gat gaa gct 1061 Ala Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala 325 330 335 gta tca tgg gga aag ata cgt ggt ggt gcc aag act gtg aag gtg cat 1109 Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Gly Ala Lys Thr Val Lys Val His 340 345 350 tgt gat gca acc att gca ttt ccc ata tta gta gct gag aca ttt gca 1157 Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Ile Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala 355 360 365 gct aag agt aag gaa ttc tcc cag ata agg tgc caa gtt tgaa 1200 Ala Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gln Ile Arg Cys Gln Val 370 375 380 cattgaggaa gctgtccttc cgaccacaca tatgaattgc tagcttttga agccaacttg 1260 ctagtgtgca gcaccattta ttctgcaaaa ctgactagag agcagggtat attcctctac 1320 cccgagttag acgacatcct gtatggttca aattaattat ttttctcccc ttcacaccat 1380 gttatttagt tctcttcctc ttcgaaagtg aagagcttag atgttcatag gttttgaatt 1440 atgttggagg ttggtgataa ctgactagtc ctcttaccat atagataatg tatccttgta 1500 ctatgagatt ttgggtgtgt ttgataccaa ggaaaatgtt tatttggaaa acaattggat 1560 ttttaattta ttttttcttg tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1609 <210> 2 <211> 381 <212> PRT <213> Lycopersicon sp. <400> 2 Met Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Ser Ile Met Asp Ser Val Arg Ser Val 1 5 10 15 Val Phe Lys Glu Ser Glu Asn Leu Glu Gly Ser Cys Thr Lys Ile Glu 20 25 30 Gly Tyr Asp Phe Asn Lys Gly Val Asn Tyr Ala Glu Leu Ile Lys Ser 35 40 45 Met Val Ser Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp Ala Ile Ala 50 55 60 Ile Val Asn Gln Met Leu Asp Trp Arg Leu Ser His Glu Leu Pro Thr 65 70 75 80 Glu Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asp Val Ala Tyr Arg Glu Ser Val 85 90 95 Thr Cys Lys Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly 100 105 110 Val Arg Asp Thr Val Arg Tyr Leu Val Gln His Arg Met Val Asp Val 115 120 125 Val Val Thr Thr Ala Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu 130 135 140 Ala Pro Thr Tyr Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Ser Leu Arg 145 150 155 160 Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn 165 170 175 Tyr Cys Lys Phe Glu Asn Trp Ile Ile Pro Val Phe Asp Gln Met Tyr 180 185 190 Glu Glu Gln Ile Asn Glu Lys Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Val Ile 195 200 205 Ala Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asp Glu Thr Ser Tyr Leu Tyr Trp 210 215 220 Ala Tyr Lys Asn Arg Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly 225 230 235 240 Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Lys Lys Gly Asp Pro 245 250 255 Asp Asn Pro Asp Leu Asn Pro Gly Leu Val Ile Asp Ile Val Gly Asp 260 265 270 Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Gly Leu Arg Lys Thr 275 280 285 Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Val Cys Asn 290 295 300 Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Phe Ala Val Phe Ile Asn Thr 305 310 315 320 Ala Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala 325 330 335 Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Gly Ala Lys Thr Val Lys Val His 340 345 350 Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Ile Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala 355 360 365 Ala Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gln Ile Arg Cys Gln Val 370 375 380 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 3 agtctagaag gtgctcgtcc tgat 24 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 4 gactgcagtc gacatcgatt tttttttttt tttt 34 <210> 5 <211> 2272 <212> DNA <213> Arabidopsis sp. <220> <221> CDS <222> (68)..(265) <220> <221> CDS <222> (348)..(536) <220> <221> CDS <222> (624)..(842) <220> <221> CDS <222> (979)..(1065) <220> <221> CDS <222> (1154)..(1258) <220> <221> CDS <222> (1575)..(1862) <400> 5 gaactcccaa aaccctctac tactacactt tcagatccaa ggaaatcaat tttgtcattc 60 gagcaac atg gag gat gat cgt gtt ttc tct tcg gtt cac tca aca gtt 109 Met Glu Asp Asp Arg Val Phe Ser Ser Val His Ser Thr Val 1 5 10 ttc aaa gaa tcc gaa tca ttg gaa gga aag tgt gat aaa atc gaa gga 157 Phe Lys Glu Ser Glu Ser Leu Glu Gly Lys Cys Asp Lys Ile Glu Gly 15 20 25 30 tac gat ttc aat caa gga gta gat tac cca aag ctt atg cga tcc atg 205 Tyr Asp Phe Asn Gln Gly Val Asp Tyr Pro Lys Leu Met Arg Ser Met 35 40 45 ctc acc acc gga ttt caa gcc tcg aat ctc ggc gaa gct att gat gtc 253 Leu Thr Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Glu Ala Ile Asp Val 50 55 60 gtc aat caa atg gttcg tttctcgaat tcatcaaaaa taaaaattcc ttctttttgt 310 Val Asn Gln Met 65 tttcctttgt tttgggtgaa ttagtaatga caaagag ttt gaa ttt gta ttg 362 Phe Glu Phe Val Leu 1 5 aag cta gat tgg aga ctg gct gat gaa act aca gta gct gaa gac tgt 410 Lys Leu Asp Trp Arg Leu Ala Asp Glu Thr Thr Val Ala Glu Asp Cys 10 15 20 agt gaa gag gag aag aat cca tcg ttt aga gag tct gtc aag tgt aaa 458 Ser Glu Glu Glu Lys Asn Pro Ser Phe Arg Glu Ser Val Lys Cys Lys 25 30 35 atc ttt cta ggt ttc act tca aat ctt gtt tca tct ggt gtt aga gat 506 Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Val Arg Asp 40 45 50 act att cgt tat ctt gtt cag cat cat atg gttt gtgatttttg 550 Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His Met 55 60 ctttatcacc ctgctttttt atagatgtta aaattttcga gctttagttt tgatttcaat 610 ggtttttctg cag gtt gat gtt ata gtc acg aca act ggt ggt gtt 656 Val Asp Val Ile Val Thr Thr Thr Gly Gly Val 1 5 10 gag gaa gat ctc ata aaa tgc ctt gca cct aca ttt aaa ggt gat ttc 704 Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe 15 20 25 tct cta cct gga gct tat tta agg tca aag gga ttg aac cga att ggg 752 Ser Leu Pro Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly 30 35 40 aat ttg ctg gtt cct aat gat aac tac tgc aag ttt gag gat tgg atc 800 Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile 45 50 55 att ccc atc ttt gac gag atg ttg aag gaa cag aaa gaa gag gtattgct 850 Ile Pro Ile Phe Asp Glu Met Leu Lys Glu Gln Lys Glu Glu 60 65 70 ttatctttcc tttttatatg atttgagatg attctgtttg tgcgtcacta gtggagatag 910 attttgattc ctctcttgca tcattgactt cgttggtgaa tccttctttc tctggttttt 970 ccttgtag aat gtg ttg tgg act cct tct aaa ctg tta gca cgg ctg gga 1020 Asn Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly 1 5 10 aaa gaa atc aac aat gag agt tca tac ctt tat tgg gca tac aag gtatc 1070 Lys Glu Ile Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys 15 20 25 caaaatttta acctttttag ttttttaatc atcctgtgag gaactcgggg atttaaattt 1130 tccgcttctt gtggtgtttg tag atg aat att cca gta ttc tgc cca 1177 Met Asn Ile Pro Val Phe Cys Pro 1 5 ggg tta aca gat ggc tct ctt ggg gat atg ctg tat ttt cac tct ttt 1225 Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe 10 15 20 cgt acc tct ggc ctc atc atc gat gta gta caa gg tacttctttt 1270 Arg Thr Ser Gly Leu Ile Ile Asp Val Val Gln 25 30 35 actcaataag tcagtgtgat aaatattcct gctacatcta gtgcaggaat attgtaacta 1330 gtagtgcatt gtagcttttc caattcagca acggacttta ctgtaagttg atatctaaag 1390 gttcaaacgg gagctaggag aatagcatag gggcattctg atttaggttt ggggcactgg 1450 gttaagagtt agagaataat aatcttgtta gttgtttatc aaactctttg atggttagtc 1510 tcttggtaat ttgaatttta tcacagtgtt tatggtcttt gaaccagtta atgttttatg 1570 aaca gat atc aga gct atg aac ggc gaa gct gtc cat gca aat cct 1616 Asp Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro 1 5 10 aaa aag aca ggg atg ata atc ctt gga ggg ggc ttg cca aag cac cac 1664 Lys Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His 15 20 25 30 ata tgt aat gcc aat atg atg cgc aat ggt gca gat tac gct gta ttt 1712 Ile Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe 35 40 45 ata aac acc ggg caa gaa ttt gat ggg agc gac tcg ggt gca cgc cct 1760 Ile Asn Thr Gly Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro 50 55 60 gat gaa gcc gtg tct tgg ggt aaa att agg ggt tct gct aaa acc gtt 1808 Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Ser Ala Lys Thr Val 65 70 75 aag gtc tgc ttt tta att tct tca cat cct aat tta tat ctc act cag 1856 Lys Val Cys Phe Leu Ile Ser Ser His Pro Asn Leu Tyr Leu Thr Gln 80 85 90 tgg ttt tgagtaca tatttaatat tggatcattc ttgcaggtat actgtgatgc 1910 Trp Phe 95 taccatagcc ttcccattgt tggttgcaga aacatttgcc acaaagagag accaaacctg 1970 tgagtctaag acttaagaac tgactggtcg ttttggccat ggattcttaa agatcgttgc 2030 tttttgattt tacactggag tgaccatata acactccaca ttgatgtggc tgtgacgcga 2090 attgtcttct tgcgaattgt actttagttt ctctcaacct aaaatgattt gcagattgtg 2150 ttttcgttta aaacacaaga gtcttgtagt caataatcct ttgccttata aaattattca 2210 gttccaacaa cacattgtga ttctgtgaca agtctcccgt tgcctatgtt cacttctctg 2270 cg 2272 <210> 6 <211> 362 <212> PRT <213> Arabidopsis sp. <400> 6 Met Glu Asp Asp Arg Val Phe Ser Ser Val His Ser Thr Val Phe Lys 1 5 10 15 Glu Ser Glu Ser Leu Glu Gly Lys Cys Asp Lys Ile Glu Gly Tyr Asp 20 25 30 Phe Asn Gln Gly Val Asp Tyr Pro Lys Leu Met Arg Ser Met Leu Thr 35 40 45 Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Glu Ala Ile Asp Val Val Asn 50 55 60 Gln Met Phe Glu Phe Val Leu Lys Leu Asp Trp Arg Leu Ala Asp Glu 65 70 75 80 Thr Thr Val Ala Glu Asp Cys Ser Glu Glu Glu Lys Asn Pro Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Ser Val Lys Cys Lys Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu 100 105 110 Val Ser Ser Gly Val Arg Asp Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His 115 120 125 Met Val Asp Val Ile Val Thr Thr Thr Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu 130 135 140 Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly 145 150 155 160 Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val 165 170 175 Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe 180 185 190 Asp Glu Met Leu Lys Glu Gln Lys Glu Glu Asn Val Leu Trp Thr Pro 195 200 205 Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asn Glu Ser Ser 210 215 220 Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Met Asn Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly 225 230 235 240 Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg 245 250 255 Thr Ser Gly Leu Ile Ile Asp Val Val Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn 260 265 270 Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu 275 280 285 Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn Met Met Arg 290 295 300 Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr Gly Gln Glu Phe Asp 305 310 315 320 Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys 325 330 335 Ile Arg Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu Ile Ser Ser 340 345 350 His Pro Asn Leu Tyr Leu Thr Gln Trp Phe 355 360 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 7 ggtggtgttg aggaagatc 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 8 ggtgcacgcc ctgatgaagc 20 <210> 9 <211> 1660 <212> DNA <213> Dianthus sp. <220> <221> CDS <222> (256)..(1374) <400> 9 gtcattacaa tgcataggat cattgcacat gctaccttcc tcattgcact tgagcttgcc 60 atacttttgt ttttgacgtt tgataataat actatgaaaa tattatgttt tttcttttgt 120 gtgttggtgt ttttgaagtt gtttttgata agcagaaccc agttgtttta cacttttacc 180 attgaactac tgcaattcta aaactttgtt tacattttaa ttccatcaaa gattgagttc 240 agcataggaa aaagg atg gag gat gct aat cat gat agt gtg gca tct 288 Met Glu Asp Ala Asn His Asp Ser Val Ala Ser 1 5 10 gcg cac tct gca gca ttc aaa aag tcg gag aat tta gag ggg aaa agc 336 Ala His Ser Ala Ala Phe Lys Lys Ser Glu Asn Leu Glu Gly Lys Ser 15 20 25 gtt aag att gag ggt tat gat ttt aat caa ggt gta aac tat tcc aaa 384 Val Lys Ile Glu Gly Tyr Asp Phe Asn Gln Gly Val Asn Tyr Ser Lys 30 35 40 ctc ttg caa tct ttc gct tct aat ggg ttt caa gcc tcg aat ctt gga 432 Leu Leu Gln Ser Phe Ala Ser Asn Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly 45 50 55 gat gcc att gaa gta gtt aat cat atg cta gat tgg agt ctg gca gat 480 Asp Ala Ile Glu Val Val Asn His Met Leu Asp Trp Ser Leu Ala Asp 60 65 70 75 gag gca cct gtg gac gat tgt agc gag gaa gag agg gat cct aaa ttc 528 Glu Ala Pro Val Asp Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asp Pro Lys Phe 80 85 90 aga gaa tct gtg aag tgc aaa gtg ttc ttg ggc ttt act tca aat ctt 576 Arg Glu Ser Val Lys Cys Lys Val Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu 95 100 105 att tcc tct ggt gtt cgt gac aca att cgg tat ctc gtg caa cat cat 624 Ile Ser Ser Gly Val Arg Asp Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His 110 115 120 atg gtt gac gtg ata gta acg aca acc gga ggt ata gaa gaa gat cta 672 Met Val Asp Val Ile Val Thr Thr Thr Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu 125 130 135 ata aaa gga aga tcc atc aag tgc ctt gca ccc act ttc aaa ggc gat 720 Ile Lys Gly Arg Ser Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp 140 145 150 155 ttt gcc tta cca gga gct caa tta cgc tcc aaa ggg ttg aat cga att 768 Phe Ala Leu Pro Gly Ala Gln Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile 160 165 170 ggt aat ctg ttg gtt ccg aat gat aac tac tgt aaa ttt gag gat tgg 816 Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp 175 180 185 atc att cca att tta gat aag atg ttg gaa gag caa att tca gag aaa 864 Ile Ile Pro Ile Leu Asp Lys Met Leu Glu Glu Gln Ile Ser Glu Lys 190 195 200 atc tta tgg aca cca tcg aag ttg att ggt cga tta gga aga gaa ata 912 Ile Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Ile Gly Arg Leu Gly Arg Glu Ile 205 210 215 aac gat gag agt tca tac ctt tac tgg gcc ttc aag aac aat att cca 960 Asn Asp Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Phe Lys Asn Asn Ile Pro 220 225 230 235 gta ttt tgc cca ggt tta aca gac ggc tca ctc gga gac atg cta tat 1008 Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr 240 245 250 ttt cat tct ttt cgc aat ccg ggt tta atc gtc gat gtt gtg caa gat 1056 Phe His Ser Phe Arg Asn Pro Gly Leu Ile Val Asp Val Val Gln Asp 255 260 265 ata aga gca gta aat ggc gag gct gtg cac gca gcg cct agg aaa aca 1104 Ile Arg Ala Val Asn Gly Glu Ala Val His Ala Ala Pro Arg Lys Thr 270 275 280 ggc atg att ata ctc ggt gga ggg ttg cct aag cac cac atc tgc aac 1152 Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn 285 290 295 gca aac atg atg aga aat ggc gcc gat tat gct gtt ttc atc aac act 1200 Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr 300 305 310 315 gcc gaa gag ttt gac ggc agt gat tct ggt gct cgc ccc gat gag gct 1248 Ala Glu Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala 320 325 330 att tca tgg ggc aaa att agc gga tct gct aag act gtg aag gtg cat 1296 Ile Ser Trp Gly Lys Ile Ser Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val His 335 340 345 tgt gat gcc acg ata gct ttc cct cta cta gtc gct gag aca ttt gca 1344 Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala 350 355 360 gca aaa aga gaa aaa gag agg aag agc tgt taaaac ttttttgatt 1390 Ala Lys Arg Glu Lys Glu Arg Lys Ser Cys 365 370 gttgaaaaat ctgtgttata caagtctcga aatgcatttt agtaattgac ttgatcttat 1450 catttcaatg tgttatcttt gaaaatgttg gtaatgaaac atctcacctc ttctatacaa 1510 cattgttgat ccattgtact ccgtatcttg taattttgga aaaaaaaaac cgtctattgt 1570 tacgagagag tacatttttg aggtaaaaat ataggatttt tgtgcgatgc aaatgctggt 1630 tattcccttg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1660 <210> 10 <211> 373 <212> PRT <213> Dianthus sp. <400> 10 Met Glu Asp Ala Asn His Asp Ser Val Ala Ser Ala His Ser Ala Ala 1 5 10 15 Phe Lys Lys Ser Glu Asn Leu Glu Gly Lys Ser Val Lys Ile Glu Gly 20 25 30 Tyr Asp Phe Asn Gln Gly Val Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Gln Ser Phe 35 40 45 Ala Ser Asn Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp Ala Ile Glu Val 50 55 60 Val Asn His Met Leu Asp 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Arg Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu 275 280 285 Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn Met Met Arg 290 295 300 Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr Ala Glu Glu Phe Asp 305 310 315 320 Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Ile Ser Trp Gly Lys 325 330 335 Ile Ser Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile 340 345 350 Ala Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala Lys Arg Glu Lys 355 360 365 Glu Arg Lys Ser Cys 370 <210> 11 <211> 780 <212> DNA <213> Lycopersicon sp. <220> <221> CDS <222> (43)..(522) <400> 11 aaagaatcct agagagagaa agggaatcct agagagagaa gc atg tcg gac 51 Met Ser Asp 1 gaa gaa cac cat ttt gag tca aag gca gat gct ggt gcc tca aaa act 99 Glu Glu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala Ser Lys Thr 5 10 15 ttc cca cag caa gct gga acc atc cgt aag aat ggt tac atc gtt atc 147 Phe Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr Ile Val Ile 20 25 30 35 aaa ggc cgt ccc tgc aag gtt gtt gag gtc tcc act tca aaa act gga 195 Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly 40 45 50 aaa cac gga cat gct aaa tgt cac ttt gtg gca att gac att ttc aat 243 Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile Phe Asn 55 60 65 gga aag aaa ctg gaa gat atc gtt ccg tcc tcc cac aat tgt gat gtg 291 Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys Asp Val 70 75 80 cca cat gtt aac cgt acc gac tat cag ctg att gat atc tct gaa gat 339 Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser Glu Asp 85 90 95 ggt ttt gtc tca ctt ctt act gaa agt gga aac acc aag gat gac ctc 387 Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Ser Gly Asn Thr Lys Asp Asp Leu 100 105 110 115 agg ctt ccc acc gat gaa aat ctg ctg aag cag gtt aaa gat ggg ttc 435 Arg Leu Pro Thr Asp Glu Asn Leu Leu Lys Gln Val Lys Asp Gly Phe 120 125 130 cag gaa gga aag gat ctt gtg gtg tct gtt atg tct gcg atg ggc gaa 483 Gln Glu Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met Gly Glu 135 140 145 gag cag att aac gcc gtt aag gat gtt ggt acc aag aat tagttatg 530 Glu Gln Ile Asn Ala Val Lys Asp Val Gly Thr Lys Asn 150 155 160 tcatggcagc ataatcactg ccaaagcttt aagacattat catatcctaa tgtggtactt 590 tgatatcact agattataaa ctgtgttatt tgcactgttc aaaacaaaag aaagaaaact 650 gctgttatgg ctagagaaag tattggcttt gagcttttga cagcacagtt gaactatgtg 710 aaaattctac tttttttttt ttgggtaaaa tactgctcgt ttaatgtttt gcaaaaaaaa 770 aaaaaaaaaa 780 <210> 12 <211> 160 <212> PRT <213> Lycopersicon sp. <400> 12 Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala 1 5 10 15 Ser Lys Thr Phe Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr 20 25 30 Ile Val Ile Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser 35 40 45 Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp 50 55 60 Ile Phe Asn Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn 65 70 75 80 Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile 85 90 95 Ser Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Ser Gly Asn Thr Lys 100 105 110 Asp Asp Leu Arg Leu Pro Thr Asp Glu Asn Leu Leu Lys Gln Val Lys 115 120 125 Asp Gly Phe Gln Glu Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala 130 135 140 Met Gly Glu Glu Gln Ile Asn Ala Val Lys Asp Val Gly Thr Lys Asn 145 150 155 160 <210> 13 <211> 812 <212> DNA <213> Dianthus sp. <220> <221> CDS <222> (67)..(546) <400> 13 ctcttttaca tcaatcgaaa aaaaattagg gttcttattt tagagtgaga ggcgaaaaat 60 cgaacg atg tcg gac gac gat cac cat ttc gag tca tcg gcc gac gcc 108 Met Ser Asp Asp Asp His His Phe Glu Ser Ser Ala Asp Ala 1 5 10 gga gca tcc aag act tac cct caa caa gct ggt aca atc cgc aag agc 156 Gly Ala Ser Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Ser 15 20 25 30 ggt cac atc gtc atc aaa aat cgc cct tgc aag gtg gtt gag gtt tct 204 Gly His Ile Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser 35 40 45 acc tcc aag act ggc aag cac ggt cat gcc aaa tgt cac ttt gtt gcc 252 Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala 50 55 60 att gac att ttc aac ggc aag aag ctg gaa gat att gtc ccc tca tcc 300 Ile Asp Ile Phe Asn Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser 65 70 75 cac aat tgt gat gtt cca cat gtc aac cgt gtc gac tac cag ctg ctt 348 His Asn Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Val Asp Tyr Gln Leu Leu 80 85 90 gat atc act gaa gat ggc ttt gtt agt ctg ctg act gac agt ggt gac 396 Asp Ile Thr Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Asp 95 100 105 110 acc aag gat gat ctg aag ctt cct gct gat gag gcc ctt gtg aag cag 444 Thr Lys Asp Asp Leu Lys Leu Pro Ala Asp Glu Ala Leu Val Lys Gln 115 120 125 atg aag gag gga ttt gag gcg ggg aaa gac ttg att ctg tca gtc atg 492 Met Lys Glu Gly Phe Glu Ala Gly Lys Asp Leu Ile Leu Ser Val Met 130 135 140 tgt gca atg gga gaa gag cag atc tgc gcc gtc aag gac gtt agt ggt 540 Cys Ala Met Gly Glu Glu Gln Ile Cys Ala Val Lys Asp Val Ser Gly 145 150 155 ggc aag taga agcttttgat gaatccaata ctacgcggtg cagttgaagc 590 Gly Lys 160 aatagtaatc tcgagaacat tctgaacctt atatgttgaa ttgatggtgc ttagtttgtt 650 ttggaaatct ctttgcaatt aagttgtacc aaatcaatgg atgtaatgtc ttgaatttgt 710 tttatttttg ttttgatgtt tgctgtgatt gcattatgca ttgttatgag ttatgacctg 770 ttataacaca aggttttggt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 812 <210> 14 <211> 160 <212> PRT <213> Dianthus sp. <400> 14 Met Ser Asp Asp Asp His His Phe Glu Ser Ser Ala Asp Ala Gly Ala 1 5 10 15 Ser Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Ser Gly His 20 25 30 Ile Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser 35 40 45 Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp 50 55 60 Ile Phe Asn Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn 65 70 75 80 Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Val Asp Tyr Gln Leu Leu Asp Ile 85 90 95 Thr Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Asp Thr Lys 100 105 110 Asp Asp Leu Lys Leu Pro Ala Asp Glu Ala Leu Val Lys Gln Met Lys 115 120 125 Glu Gly Phe Glu Ala Gly Lys Asp Leu Ile Leu Ser Val Met Cys Ala 130 135 140 Met Gly Glu Glu Gln Ile Cys Ala Val Lys Asp Val Ser Gly Gly Lys 145 150 155 160 <210> 15 <211> 702 <212> DNA <213> Arabidopsis sp. <220> <221> CDS <222> (56)..(529) <400> 15 ctgttaccaa aaaatctgta ccgcaaaatc ctcgtcgaag ctcgctgctg caacc 55 atg tcc gac gag gag cat cac ttt gag tcc agt gac gcc gga gcg tcc 103 Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser 1 5 10 15 aaa acc tac cct caa caa gct gga acc atc cgt aag aat ggt tac atc 151 Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr Ile 20 25 30 gtc atc aaa aat cgt ccc tgc aag gtt gtt gag gtt tca acc tcg aag 199 Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45 act ggc aag cat ggt cat gct aaa tgt cat ttt gta gct att gat atc 247 Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile 50 55 60 ttc acc agc aag aaa ctc gaa gat att gtt cct tct tcc cac aat tgt 295 Phe Thr Ser Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys 65 70 75 80 gat gtt cct cat gtc aac cgt act gat tat cag ctg att gac att tct 343 Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser 85 90 95 gaa gat gga tat gtc agt ttg ttg act gat aac ggt agt acc aag gat 391 Glu Asp Gly Tyr Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Ser Thr Lys Asp 100 105 110 gac ctt aag ctc cct aat gat gac act ctg ctc caa cag atc aag agt 439 Asp Leu Lys Leu Pro Asn Asp Asp Thr Leu Leu Gln Gln Ile Lys Ser 115 120 125 ggg ttt gat gat gga aaa gat cta gtg gtg agt gta atg tca gct atg 487 Gly Phe Asp Asp Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met 130 135 140 gga gag gaa cag atc aat gct ctt aag gac atc ggt ccc aag t 530 Gly Glu Glu Gln Ile Asn Ala Leu Lys Asp Ile Gly Pro Lys 145 150 155 gagactaaca aagcctcccc tttgttatga gattcttctt cttctgtagg cttccattac 590 tcgtcggaga ttatcttgtt tttgggttac tcctattttg gatatttaaa cttttgttaa 650 taatgccatc ttcttcaacc ttttccttct agatggtttt tatacttctt ct 702 <210> 16 <211> 158 <212> PRT <213> Arabidopsis sp. <400> 16 Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser 1 5 10 15 Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr Ile 20 25 30 Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45 Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile 50 55 60 Phe Thr Ser Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys 65 70 75 80 Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser 85 90 95 Glu Asp Gly Tyr Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Ser Thr Lys Asp 100 105 110 Asp Leu Lys Leu Pro Asn Asp Asp Thr Leu Leu Gln Gln Ile Lys Ser 115 120 125 Gly Phe Asp Asp Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met 130 135 140 Gly Glu Glu Gln Ile Asn Ala Leu Lys Asp Ile Gly Pro Lys 145 150 155 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 17 aaarrycgmc cytgcaaggt 20 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 18 aatacgactc actatag 17 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 19 tcyttnccyt cmkctaahcc 20 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 20 attaaccctc actaaag 17 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 21 ctgttaccaa aaaatctgta cc 22 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 22 agaagaagta taaaaaccat c 21 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 23 aaagaatcct agagagagaa agg 23 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 24 ttttacatca atcgaaaa 18 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 25 accaaaacct gtgttataac tcc 23 <210> 26 <211> 581 <212> DNA <213> Arabidopsis sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(579) <400> 26 ggt ggt gtt gag gaa gat ctc ata aaa tgc ctt gca cct aca ttt aaa 48 Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys 1 5 10 15 ggt gat ttc tct cta cct gga gct tat tta agg tca aag gga ttg aac 96 Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn 20 25 30 cga att ggg aat ttg ctg gtt cct aat gat aac tac tgc aag ttt gag 144 Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu 35 40 45 gat tgg atc att ccc atc ttt gac gag atg ttg aag gaa cag aaa gaa 192 Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe Asp Glu Met Leu Lys Glu Gln Lys Glu 50 55 60 gag aat gtg ttg tgg act cct tct aaa ctg tta gca cgg ctg gga aaa 240 Glu Asn Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly Lys 65 70 75 80 gaa atc aac aat gag agt tca tac ctt tat tgg gca tac aag atg aat 288 Glu Ile Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Met Asn 85 90 95 att cca gta ttc tgc cca ggg tta aca gat ggc tct ctt agg gat atg 336 Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Arg Asp Met 100 105 110 ctg tat ttt cac tct ttt cgt acc tct ggc ctc atc atc gat gta gta 384 Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg Thr Ser Gly Leu Ile Ile Asp Val Val 115 120 125 caa gat atc aga gct atg aac ggc gaa gct gtc cat gca aat cct aaa 432 Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys 130 135 140 aag aca ggg atg ata atc ctt gga ggg ggc ttg cca aag cac cac ata 480 Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile 145 150 155 160 tgt aat gcc aat atg atg cgc aat ggt gca gat tac gct gta ttt ata 528 Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile 165 170 175 aac acc ggg caa gaa ttt gat ggg agc gac tcg ggt gca cgc cct gat 576 Asn Thr Gly Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp 180 185 190 gaa g c 581 Glu <210> 27 <211> 522 <212> DNA <213> Dianthus sp. <220> <221> CDS <222> (3)..(521) <400> 27 ga aga tcc atc aag tgc ctt gca ccc act ttc aaa ggc gat ttt 44 Arg Ser Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe 1 5 10 gcc tta cca gga gct caa tta cgc tcc aaa ggg ttg aat cga att ggt 92 Ala Leu Pro Gly Ala Gln Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly 15 20 25 30 aat ctg ttg gtt ccg aat gat aac tac tgt aaa ttt gag gat tgg atc 140 Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile 35 40 45 att cca att tta gat aag atg ttg gaa gag caa att tca gag aaa atc 188 Ile Pro Ile Leu Asp Lys Met Leu Glu Glu Gln Ile Ser Glu Lys Ile 50 55 60 tta tgg aca cca tcg aag ttg att ggt cga tta gga aga gaa ata aac 236 Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Ile Gly Arg Leu Gly Arg Glu Ile Asn 65 70 75 gat gag agt tca tac ctt tac tgg gcc ttc aag aac aat att cca gta 284 Asp Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Phe Lys Asn Asn Ile Pro Val 80 85 90 ttt tgc cca ggt tta aca gac ggc tca ctc gga gac atg cta tat ttt 332 Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe 95 100 105 110 cat tct ttt cgc aat ccg ggt tta atc atc gat gtt gtg caa gat ata 380 His Ser Phe Arg Asn Pro Gly Leu Ile Ile Asp Val Val Gln Asp Ile 115 120 125 aga gca gta aat ggc gag gct gtg cac gca gcg cct agg aaa aca ggc 428 Arg Ala Val Asn Gly Glu Ala Val His Ala Ala Pro Arg Lys Thr Gly 130 135 140 atg att ata ctc ggt gga ggg ttg cct aag cac cac atc tgc aac gca 476 Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala 145 150 155 aac atg atg aga aat ggc gcc gat tat gct gtt ttc atc aac acc 521 Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr 160 165 170 g 522 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 28 ttgargaaga tycatmaart gcct 24 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 29 ccatcaaayt cytgkgcrgt gtt 23 <210> 30 <211> 484 <212> DNA <213> Arabidopsis sp. <220> <221> CDS <222> (2)..(112) <400> 30 t gca cgc cct gat gaa gct gtg tct tgg ggt aaa att agg ggt 43 Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly 1 5 10 tct gct aaa acc gtt aag gtc tgc ttt tta att tct tca cat cct aat 91 Ser Ala Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu Ile Ser Ser His Pro Asn 15 20 25 30 tta tat ctc act cag tgg ttt tgagtaca tatttaatat tggatcattc 140 Leu Tyr Leu Thr Gln Trp Phe 35 ttgcaggtat actgtgatgc taccatagcc ttcccattgt tggttgcaga aacatttgcc 200 acaaagagag accaaacctg tgagtctaag acttaagaac tgactggtcg ttttggccat 260 ggattcttaa agatcgttgc tttttgattt tacactggag tgaccatata acactccaca 320 ttgatgtggc tgtgacgcga attgtcttct tgcgaattgt actttagttt ctctcaacct 380 aaaatgattt gcagattgtg ttttcgttta aaacacaaga gtcttgtagt caataatcct 440 ttgccttata aaattattca gttccaacaa aaaaaaaaaa aaaa 484 <210> 31 <211> 559 <212> DNA <213> Lycopersicon sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(156) <400> 31 ggt gct cgt cct gat gaa gct gta tca tgg gga aag ata cgt ggt ggt 48 Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Gly 1 5 10 15 gcc aag act gtg aag gtg cat tgt gat gca acc att gca ttt ccc ata 96 Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Ile 20 25 30 tta gta gct gag aca ttt gca gct aag agt aag gaa ttc tcc cag ata 144 Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gln Ile 35 40 45 agg tgc caa gtt tgaa cattgaggaa gctgtccttc cgaccacaca tatgaattgc 200 Arg Cys Gln Val 50 tagcttttga agccaacttg ctagtgtgca gcaccattta ttctgcaaaa ctgactagag 260 agcagggtat attcctctac cccgagttag acgacatcct gtatggttca aattaattat 320 ttttctcccc ttcacaccat gttatttagt tctcttcctc ttcgaaagtg aagagcttag 380 atgttcatag gttttgaatt atgttggagg ttggtgataa ctgactagtc ctcttaccat 440 atagataatg tatccttgta ctatgagatt ttgggtgtgt ttgataccaa ggaaaaatgt 500 ttatttggaa aacaattgga tttttaattt aaaaaaaatt gnttaaaaaa aaaaaaaaa 559 <210> 32 <211> 193 <212> PRT <213> Arabidopsis sp. <400> 32 Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys 1 5 10 15 Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn 20 25 30 Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu 35 40 45 Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe Asp Glu Met Leu Lys Glu Gln Lys Glu 50 55 60 Glu Asn Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly Lys 65 70 75 80 Glu Ile Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Met Asn 85 90 95 Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Arg Asp Met 100 105 110 Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg Thr Ser Gly Leu Ile Ile Asp Val Val 115 120 125 Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys 130 135 140 Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile 145 150 155 160 Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile 165 170 175 Asn Thr Gly Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp 180 185 190 Glu <210> 33 <211> 173 <212> PRT <213> Dianthus sp. <400> 33 Arg Ser Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ala Leu 1 5 10 15 Pro Gly Ala Gln Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu 20 25 30 Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro 35 40 45 Ile Leu Asp Lys Met Leu Glu Glu Gln Ile Ser Glu Lys Ile Leu Trp 50 55 60 Thr Pro Ser Lys Leu Ile Gly Arg Leu Gly Arg Glu Ile Asn Asp Glu 65 70 75 80 Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Phe Lys Asn Asn Ile Pro Val Phe Cys 85 90 95 Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser 100 105 110 Phe Arg Asn Pro Gly Leu Ile Ile Asp Val Val Gln Asp Ile Arg Ala 115 120 125 Val Asn Gly Glu Ala Val His Ala Ala Pro Arg Lys Thr Gly Met Ile 130 135 140 Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn Met 145 150 155 160 Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr 165 170 <210> 34 <211> 37 <212> PRT <213> Arabidopsis sp. <400> 34 Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Ser Ala 1 5 10 15 Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu Ile Ser Ser His Pro Asn Leu Tyr 20 25 30 Leu Thr Gln Trp Phe 35 <210> 35 <211> 52 <212> PRT <213> Lycopersicon sp. <400> 35 Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Ile 20 25 30 Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gln Ile 35 40 45 Arg Cys Gln Val 50

Claims (49)

  1. 삭제
  2. 서열번호: 11, 서열번호: 13 또는 서열번호: 15의 뉴클레오타이드 서열을 지님을 특징으로 하는 노화-유도 eIF-5A 단백질을 암호화하는 단리된 DNA 분자.
  3. 삭제
  4. 서열번호: 12, 서열번호: 14 또는 서열번호: 16의 아미노산 서열을 지님을 특징으로 하는 노화-유도 eIF-5A 단백질.
  5. (a) 서열번호: 11, 서열번호: 13 또는 서열번호: 15의 서열의 노화-유도 eIF-5A를 암호화하는 DNA 분자의 코딩 가닥에 상보적인 서열을 지닌 안티센스 폴리뉴클레오타이드; 및
    (b) 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 결합되어 형질전환 식물 세포 내에서 안티센스 폴리뉴클레오타이드가 발현되도록 하는 조절 서열을 포함하는
    식물 세포 형질전환용 벡터.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 조절 서열은 프로모터 및 전사 종결 영역을 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 조절 서열은 구성적 프로모터를 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 조절 서열은 식물 조직-특이적 프로모터를 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 조절 서열은 노화-유도 식물 유래의 프로모터를 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  10. 제 5항에 있어서, 상기 조절 서열은 바이러스 유래의 프로모터를 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 조절 서열은 구성적 프로모터를 더욱 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  12. 제 5항에 따른 벡터로 형질전환된 박테리아 세포.
  13. 제 5항에 따른 벡터로 형질전환된 식물 세포.
  14. 제 5항에 따른 벡터로 형질전환된 식물 세포로부터 생성된 식물.
  15. 삭제
  16. 제 5항에 따른 벡터를 포함하고 노화-유도 eIF-5A의 발현이 억제되거나 감소된 세포로부터 유래한 식물.
  17. 노화-유도 eIF-5A 유전자를 암호화하는 DNA 분자의 코딩 가닥에 상보적인 RNA 분자를 암호화하는 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 있어서, 상기 DNA 분자의 코딩 가닥은 서열번호: 11, 서열번호: 13 또는 서열번호: 15의 서열을 지니고 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 식물 세포 내에서 발현시 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자의 발현을 억제함을 특징으로 하는 안티센스 폴리뉴클레오타이드.
  18. 삭제
  19. 제 17항에 있어서, 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 RNA 전사체의 5'-비-코딩 영역의 상응하는 부분에 상보적임을 특징으로 하는 안티센스 폴리뉴클레오타이드.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 제 17항에 있어서, 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 30의 서열에 상보적임을 특징으로 하는 안티센스 폴리뉴클레오타이드.
  23. 원핵성 숙주 내에서 복제 관련 폴리뉴클레오타이드와 제 17항의 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드.
  24. 아그로박테리움 (Agrogbacterium) 내에서 복제 관련 폴리뉴클레오타이드와 제 17항의 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드.
  25. 삭제
  26. (a) 서열번호: 11, 서열번호: 13 또는 서열번호: 15를 지니는 노화-유도 eIF-5A를 암호화는 DNA 분자; 및
    (b) 상기 DNA 분자에 작동가능하게 결합되어 형질전환 식물 세포 내에서 상기 노화-유도 eIF-5A가 발현되도록 하는 조절 서열을 포함하는 벡터.
  27. 제 5항 또는 제 26항에 따른 벡터를 포함한 형질전환 식물 세포.
  28. (a) (ⅰ) 서열번호: 11, 서열번호: 13 또는 서열번호: 15의 서열을 지니는 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자를 암호화는 DNA 분자의 하나의 가닥의 상응하는 부분 또는 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자에 의해 코딩되는 RNA 서열의 상응하는 부분에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오타이드;
    (ⅱ) 상기 안티센스 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 결합되어 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 조절 서열을 포함하는
    벡터를 적어도 하나 이상의 식물 세포의 게놈 내로 통합시키는 단계; 및
    (b) 식물을 생장시킴으로써 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열을 전사시켜 상기 RNA 서열에 결합시킴으로써 노화-유도 eIF-5A 유전자의 발현을 억제시키는 단계를 포함하는
    식물 내 내인성 노화-유도 eIF-5A 발현의 억제 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열에 상보적인 DNA 부분 또는 RNA 부분은 5'-비코딩, 3'-코딩 또는 비코딩 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 28항에 있어서, 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 23에 상보적임을 특징으로 하는 방법
  31. 제 28항에 있어서, 상기 억제는 상기 식물의 노화를 변경시킴을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 28항에 있어서, 상기 억제는 환경 스트레스-유도 및/또는 병원체-유도 노화에 대한 상기 식물의 저항성을 증가시킴을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 28항에 있어서, 상기 억제는 상기 식물의 생물량을 증가시킴을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 28항에 있어서, 상기 억제는 상기 식물의 열매 연화 및 부패를 지연시킴을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 28항에 있어서, 상기 억제는 상기 식물로부터의 종자 수확량을 증가시킴을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 28항에 있어서, 상기 조절 서열은 상기 식물 내에서 활성적인 구성적 프로모터를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 28항에 있어서, 상기 조절 서열은 상기 식물 내에서 활성적인 조직 특이적 프로모터를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 28항에 있어서, 상기 조절 서열은 상기 식물 내에서 활성적인 노화-유도 프로모터를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 28항 내지 제 38항의 어느 한 항에 따른 방법에 있어서, 상기 식물은 과실 식물, 개화 식물, 야채에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 39항에 있어서, 상기 식물은 토마토임을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 39항에 있어서, 상기 식물은 개화 식물임을 특징으로 하는 방법.
  42. (a) (ⅰ) 서열번호: 11, 서열번호: 13 또는 서열번호: 15의 서열을 지닌 외인성 노화-유도 eIF-5A를 암호화는 DNA 분자의 하나의 가닥의 상응하는 부분; 및
    (ⅱ) 상기 DNA 분자에 작동가능하게 결합되어 외인성 노화-유도 eIF-5A 유전자가 발현되도록 하는 조절 서열을 포함하는
    벡터를 적어도 하나 이상의 식물 세포의 게놈 내로 통합시키는 단계; 및
    (b) 식물을 생장시킴으로써 상기 DNA 분자가 발현되어 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자를 외인성 노화-유도 eIF-5A로 억제시키는 단계를 포함하는
    식물 세포 내 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자 발현의 억제 방법.
  43. 제 42항에 있어서, 상기 조절 서열은 구성적 프로모터임을 특징으로 하는 방법.
  44. (a) (ⅰ) 서열번호: 11, 서열번호: 13 또는 서열번호: 15의 서열을 지닌 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자를 암호화는 DNA 분자의 하나의 가닥의 상응하는 부분 또는 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자에 의해 암호화되는 RNA 서열의 상응하는 부분에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
    (ⅱ) 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 결합되어 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현되도록 하는 조절 서열을 포함하는
    벡터를 적어도 하나 이상의 식물 세포의 게놈 내로 통합시키는 단계; 및
    (b) 식물을 생장시킴으로써 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열을 전사시켜 상기 RNA 서열에 결합시킴으로써 노화-유도 eIF-5A 유전자의 발현을 억제시키는 단계를 포함하는
    식물 내 연령-관련 노화 및/또는 환경 스트레스-관련 노화의 변경 방법.
  45. 삭제
  46. (a) (ⅰ) 서열번호: 11, 서열번호: 13 또는 서열번호: 15의 서열을 지닌 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자를 암호화는 DNA 분자의 하나의 가닥의 상응하는 부분 또는 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자에 의해 암호화되는 RNA 서열의 상응하는 부분에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
    (ⅱ) 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 결합되어 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현되도록 하는 조절 서열을 포함하는
    벡터를 적어도 하나 이상의 식물 세포의 게놈 내로 통합시키는 단계; 및
    (b) 식물을 생장시킴으로써 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열을 전사시켜 상기 RNA 서열에 결합시킴으로써 노화-유도 eIF-5A 유전자의 발현을 억제시키는 단계에 의해 생성된
    억제되거나 감소된 노화-유도 eIF-5A 발현을 지닌 세포로부터 유래한 식물에 있어서, 상기 식물은 토마토임을 특징으로 하는 식물.
  47. (a) (ⅰ) 서열번호: 11, 서열번호: 13 또는 서열번호: 15의 서열을 지닌 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자를 암호화는 DNA 분자의 하나의 가닥의 상응하는 부분 또는 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자에 의해 암호화되는 RNA 서열의 상응하는 부분에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
    (ⅱ) 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 결합되어 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현되도록 하는 조절 서열을 포함하는
    벡터를 적어도 하나 이상의 식물 세포의 게놈 내로 통합시키는 단계; 및
    (b) 식물을 생장시킴으로써 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열을 전사시켜 상기 RNA 서열에 결합시킴으로써 노화-유도 eIF-5A 유전자의 발현을 억제시키는 단계에 의해 생성된
    억제되거나 감소된 노화-유도 eIF-5A 발현을 지닌 세포로부터 유래한 식물에 있어서, 상기 식물은 개화 식물임을 특징으로 하는 식물.
  48. (a) (ⅰ) 서열번호: 11, 서열번호: 13 또는 서열번호: 15의 서열을 지닌 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자를 암호화는 DNA 분자의 하나의 가닥의 상응하는 부분 또는 (내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자를 암호화하는 DNA 분자로부터 전사되는 RNA 서열의 상응하는 부분에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
    (ⅱ) 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 결합되어 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현되도록 하는 조절 서열을 포함하는
    벡터를 적어도 하나 이상의 식물 세포의 게놈 내로 통합시키는 단계; 및
    (b) 식물을 생장시킴으로써 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열을 전사시켜 상기 RNA 서열에 결합시킴으로써 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자의 발현을 억제시켜 종자 노화를 억제시키는 단계를 포함하는
    종자 노화(aging)의 억제 방법
  49. (a) (ⅰ) 서열번호: 11, 서열번호: 13 또는 서열번호: 15의 서열을 지닌 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자를 암호화는 DNA 분자의 하나의 가닥의 상응하는 부분 또는 내인성 노화-유도 eIF-5A 유전자를 암호화하는 DNA 분자로부터 전사되는 RNA 서열의 상응하는 부분에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
    (ⅱ) 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 결합되어 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현되도록 하는 조절 서열을 포함하는
    벡터를 식물 게놈 내로 통합시키는 단계; 및
    (b) 식물을 생장시킴으로써 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열을 전사시켜 상기 RNA 서열에 결합시킴으로써 eIF-5A 유전자의 발현을 억제시켜 종자 수확량을 증가시키는 단계를 포함하는 식물로부터의 종자 수확량의 증가 방법
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