ES2326515T3 - Adn que codifica una desoxihipusina sintasa de planta, plantas transgenicas y un procedimiento para controlar la senescencia y muerte celular programada en plantas. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para inhibir la expresión de la desoxihipusina sintasa endógena inducida por senescencia en una planta, comprendiendo dicho procedimiento (a) integrar en el genoma de una planta un vector que comprende (i) secuencias de nucleótidos antisentido sustancialmente complementarias a (1) una parte correspondiente de una cadena de una molécula de ADN seleccionada del grupo que consiste en: (aa) una molécula de ADN que hibrida en condiciones de restricción alta con la SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 9 y que codifica una desoxihipusina sintasa; (bb) un derivado funcional de la molécula de ADN de (aa) que hibrida en condiciones de restricción altas con la SEQ ID NO: 1 y/o la SEQ ID NO: 9 y que codifica una desoxihipusina sintasa; (cc) un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 9; y (dd) una molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 10, (2) una parte correspondiente de una cadena de una molécula de ADN, en la que dicha molécula de ADN hibrida en condiciones de alta restricción con el SEQ ID NO: 5 que codifica la desoxihipusina sintasa endógena inducida por senescencia, o (3) una parte correspondiente de una secuencia de ARN codificada por una molécula de ADN de (1) o (2); y (ii) secuencias reguladoras operativamente unidas a las secuencias de nucleótidos antisentido de modo que las secuencias de nucleótidos antisentido estén expresadas en una célula de planta en la que está transformada; y (b) hacer crecer dicha planta, de modo que dichas secuencias de nucleótidos antisentido se transcriben y se unen a dicha secuencia de ARN, de modo que se inhibe la expresión del gen de desoxihipusina sintasa endógena inducida por senescencia.

Description

ADN que codifica una desoxihipusina sintasa de planta, plantas transgénicas y un procedimiento para controlar la senescencia y muerte celular programada en plantas.

Campo de la invención

En el presente documento se describen polinucleótidos que codifican polipéptidos de planta que presentan expresión inducida por senescencia. Más en particular, en el presente documento se describe un gen de planta de desoxihipusina sintasa inducido por senescencia y un gen de eIF-5A inducido por senescencia, cuyas expresiones son inducidas por el inicio de la muerte celular programada, incluyendo la senescencia. La invención se refiere a plantas transgénicas que contienen el polinucleótido que codifica la desoxihipusina sintasa en orientación antisentido y a procedimientos para controlar la muerte celular programada, incluyendo la senescencia, en plantas. Además, en el presente documento se describe el uso del gen de eIF-5A para controlar la muerte celular programada y la senescencia en plantas.

La invención también se refiere al uso del gen de desoxihipusina sintasa para controlar la muerte celular programada y la senescencia en plantas.

Descripción de la técnica anterior

La senescencia es la fase terminal del desarrollo biológico en la vida de una planta. Presagia la muerte y ocurre a diferentes niveles de organización biológica incluyendo la planta entera, órganos, flores y frutos, tejidos y células individuales.

El inicio de la senescencia puede ser inducido por diferentes factores tanto internos como externos. La senescencia es una etapa del desarrollo compleja y altamente regulada en la vida de una planta o tejido de planta, tales como fruto, flores y hojas. La senescencia da como resultado la rotura coordinada de membranas celulares y macromoléculas y la posterior movilización de metabolitos de otras partes de la planta.

Además de la senescencia programada que tiene lugar durante el desarrollo normal de la planta, la muerte de células y tejidos y consiguiente removilización de metabolitos, ocurre como una respuesta coordinada a factores externos medioambientales. Los factores externos que inducen el inicio prematuro de la senescencia, que también se denomina necrosis o apoptosis, incluyen el estrés medioambiental tal como la temperatura, sequía, poca luz o poco suministro de nutrientes, así como el ataque de patógenos. Los tejidos de plantas expuestos al estrés medioambiental también producen etileno, normalmente conocido como etileno por estrés (Buchanan-Wollaston, V., 1997, J. Exp. Botany, 48:181-199; Wright, M., 1974, Plant, 120:63-69). Se sabe que el etileno causa la senescencia en algunas plantas.

La senescencia no es un proceso pasivo, sino más bien es un proceso regulado de forma activa que implica la expresión coordinada de genes específicos. Durante la senescencia, los niveles de ARN total disminuyen y la expresión de muchos genes se desconecta (Bate y col., 1991, J. Exper. Botany, 42, 801-11; Hensel y col., 1993, The Plant Cell, 5, 553-64). Sin embargo, hay cada vez más pruebas de que el proceso de senescencia depende de la transcripción nueva de genes nucleares. Por ejemplo, la senescencia es bloqueada por inhibidores del ARNm y la síntesis de proteínas y enucleación. Los estudios moleculares usando ARNm de hojas senescentes y hojas verdes para los experimentos de traducción in vitro muestran un patrón cambiado de los productos de proteínas de la hoja en las hojas senescentes (Thomas y col., 1992, J. Plant Physiol., 139, 403-12). Con el uso de técnicas de selección diferencial e hibridación sustractiva, se han identificado muchos clones de ADNc que representan genes que inducen la senescencia en una variedad de plantas, incluyendo tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, tales como Arabidopsis, maíz, pepino, espárrago, tomate, arroz y patata. La identificación de genes que se expresan específicamente durante la senescencia es una prueba importante del requisito de la transcripción nueva para que la senescencia proceda.

Los sucesos que tienen lugar durante la senescencia parece que están altamente coordinados para permitir el uso máximo de los componentes celulares antes de que se produzca necrosis y muerte celular. Las interacciones complejas que implican la percepción de señales específicas y la inducción de cascadas de expresión de genes deben ocurrir para regular este proceso. La expresión de genes que codifican las proteínas relacionadas con la senescencia es regulada probablemente por proteínas activadoras comunes que son, a su vez, activadas directa o indirectamente por señales hormonales. Se conoce poco sobre los mecanismos implicados en la señalización inicial o posterior coordinación del proceso.

La expresión coordinada de genes requiere factores implicados en la transcripción y traducción, incluyendo factores de inicio. Se han aislado y caracterizado genes del factor de inicio de la traducción en una variedad de organismos, incluyendo plantas. El factor de inicio de la traducción 5A (eIF-5A) en eucariotas es un factor proteínico esencial de aproximadamente 17 kDa de tamaño, que está implicado en el inicio de la síntesis de proteínas celulares eucariotas. Se caracteriza por la presencia de hipusina [N-(4-amino-2-hidroxibutil)lisina], un aminoácido modificado único, que se sabe que está presente sólo en eIF-5A. La hipusina se forma postraduccionalmente por la transferencia e hidroxilación del grupo butilamino de la poliamina espermidina al grupo amino de la cadena lateral de un resto lisina específico en eIF-5A. La activación de eIF-5A implica la transferencia del resto butilamina de la espermidina a la lisina de eIF-5A, formando hipusina y activando eIF-5A. En eucariotas, la desoxihipusina sintasa (DHS) media la síntesis postraduccional de la hipusina en eIF-5A. No se ha identificado un gen de DHS correspondiente en plantas, sin embargo, se sabe que el eIF-5A de la planta contiene hipusina. Se ha demostrado que la modificación de hipusina es esencial para la actividad de eIF-5A in vitro usando un ensayo de metionil-puromicina.

La hipusina se encuentra solo en eIF-5A y está presente en todos los eucariotas, algunas arqueobacterias (que parece que están relacionadas con los eucariotas), pero no en las eubacterias. Además, la secuencia de aminoácidos de eIF-5A es altamente conservada, en especial en la región que rodea el resto de hipusina, lo que sugiere que eIF-5A y su proteína activante, la desoxihipusina sintasa, ejecutan fundamentalmente pasos importantes en la fisiología de la célula eucariota (Joe y col., JBC, 270:22386-22392, 1995). Se ha clonado eIF-5A de seres humanos, alfalfa, moho del fango, Neurospora crassa tabaco y levadura. Se identificó originalmente como un factor de inicio de la traducción general basándose en su aislamiento de ribosomas de lisatos de reticulocitos de conejo y su actividad in vitro en la estimulación de la síntesis de metionina-puromicina. Sin embargo, los datos más recientes indican que eIF-5A no es un factor del inicio de la traducción para la síntesis global de proteínas, si no que sirve para facilitar la traducción de subconjuntos específicos de poblaciones de ARNm. Por ejemplo, hay pruebas importantes de experimentos con células animales y levaduras, de que una o más isoformas de eIF-5A tienen una función esencial en la mediación de la traducción de un subconjunto de ARNm implicados en la proliferación celular. Hay dos isoformas en la levadura, y si ambos genes son silenciados, las células no pueden dividirse (Park y col., Biol. Signals, 6:115-123, 1997). Igualmente, el silenciamiento de la expresión de la desoxihipusina sintasa de levadura que activa eIF-5A, bloquea la división celular. Realmente, se han desarrollado inhibidores de la desoxihipusina sintasa que es probable que tengan importancia en la terapia de las afecciones hiperproliferativas (Wolff, y col., JBC, 272:15865-15871, 1997). Otros estudios han indicado que otra isoforma de eIF-5A es esencial para la función de Rev en la replicación del VIH-1 o la función de Rex en la replicación de HTLV V (Park, y col., Biol. Signals, 6:115-123, 1997). También hay al menos dos genes de eIF-5A expresados en el tabaco. Las sondas específicas de genes indican que aunque se expresan ambos en todos los tejidos examinados, cada gen tiene un patrón de expresión distintivo, que se supone que regula la traducción de los transcritos específicos (Chamot, y col., Nuc. Acids Res., 20:625-669, 1992).

Se ha purificado desoxihipusina sintasa de testículos de rata, células HeLa, Neurospora crassa y levadura. La secuencia de aminoácidos de la desoxihipusina sintasa es muy conservada y las enzimas de las diferentes especies comparten propiedades físicas y catalíticas similares y presentan reactividades entre especies con precursores de eIF-5A heterólogos (Park, y col., 6 Biol. Signals, 6:115-123, 1997).

Las poliaminas de plantas se han implicado en una amplia variedad de efectos fisiológicos que incluyen la inducción floral, embriogénesis, resistencia a patógenos, crecimiento, diferenciación y división celulares (Evans y col., 1989, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 40, 235-269; y Galston, y col., 1990, Plant Physiol., 94, 406-10). Se ha sugerido que eIF-5A es el intermediario a través del cual ejercen sus efectos las poliaminas (Chamot y col., 1992, Nuc. Acids Res., 20(4), 665-69).

Se han identificado dos genes que codifican las isoformas de eIF-5ª (NeIF-5A1 y NeIF-5A2) (Chamot y col., 1992, Nuc. Acids Res., 20(4), 665-69). Se mostró que los genes eran muy similares. Sin embargo, presentan patrones de expresión diferenciales. Parece que un gen es expresado constitutivamente a nivel del ARNm, mientras que el patrón de expresión de los otros se correlaciona con la presencia o ausencia de actividad fotosintética. Basándose en la estructura génica y la cartografía genómica Southern, se ha sugerido que han una familia de multigenes de los genes NeIF-5A en el tabaco. Es probable que haya una isoforma eIF-5A que regula la traducción de un subconjunto de transcritos de ARNm específicos de senescencia/necrosis.

Actualmente, no hay procedimientos que se puedan aplicar ampliamente para controlar el inicio de la muerte celular programada (incluyendo la senescencia) causada por factores internos o externos, p. ej., el estrés medioambiental. Por lo tanto, tiene interés desarrollar tecnologías moduladoras de la senescencia que sean aplicables a todos los tipos de plantas y que sean eficaces en las etapas más tempranas de la cascada de sucesos que conducen a la senescencia.

Resumen de la invención

Esta invención se basa en el descubrimiento y clonación de un clon de ADNc de longitud completa que codifica la desoxihipusina sintasa (DHS) inducida por senescencia del tomate, así como de clones de ADNc de DHS inducido por senescencia de longitud completa de hoja de Arabidopsis y pétalo de clavel. En el presente documento se describen las secuencias de nucleótidos y las correspondientes secuencias de aminoácidos.

Además, se describe en el presente documento el descubrimiento y clonación de clones de ADNc de longitud completa que codifican un gen de eIF-5A inducido por senescencia del tomate, Arabidopsis y clavel. En el presente documento se describen la secuencia de nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos de cada uno de los clones de ADNc de eIF-5A.

La presente invención proporciona un procedimiento para la modificación genética de plantas para controlar el inicio de la senescencia, sea senescencia relacionada con la edad o senescencia inducida por estrés medioambiental. Se introducen las secuencias de nucleótidos de DHS inducidas por senescencia de la invención, fragmentos de las mismas, o combinaciones de dichos fragmentos, en una célula de planta en orientación inversa para inhibir la expresión del gen endógeno de la DHS inducido por senescencia, reduciendo de esta forma el nivel de proteína endógena de DHS inducida por senescencia, y reduciendo y/o previniendo la activación de eIF-5A y consiguiente expresión de los genes que median la senescencia.

Usando los procedimientos de la invención, se generan plantas transgénicas y se controla el crecimiento, desarrollo y la senescencia inducida de forma prematura o natural. Las plantas o partes separadas de las plantas (p. ej., esquejes, flores, verduras, frutos, semillas u hojas) que presentan una vida o vida en anaquel prolongada (p. ej., vida prolongada de las flores, menor deterioro de frutas y verduras, mayor biomasa, aumento del rendimiento de semillas, menor envejecimiento de las semillas y/o menor amarillamiento de las hojas) debido a la reducción del nivel de DHS inducido por senescencia, se seleccionan como productos deseados que tienen propiedades mejoradas incluyendo el menor amarillamiento de las hojas, menor separación de pétalos, menor deterioro de frutas y verduras durante el transporte y el almacenamiento. Estas plantas superiores se propagan. Igualmente, las plantas presentan una mayor resistencia al estrés medioambiental, p. ej., menor susceptibilidad a la temperatura baja (frío), sequía, infección, etc. y/o mayor resistencia a patógenos, se seleccionan como productos superiores.

En un aspecto, en los procedimientos de la presente invención, se aplica una molécula de ADN aislada que codifica la DHS inducida por senescencia, en los que la molécula de ADN hibrida con el SEQ ID NO: 1, o un derivado funcional de la molécula de ADN aislada que hibrida con el SEQ ID NO: 1. En una realización de este aspecto de la invención, la molécula de ADN aislada tiene la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1, es decir, es 100% complementaria (identidad de secuencia) del SEQ ID NO: 1.

La presente invención también se dirige a procedimientos en los que se aplica una molécula de ADN aislada que codifica la DHS inducida por senescencia, en los que la molécula de ADN hibrida con el SEQ ID NO: 9, o un derivado funcional de la molécula de ADN aislada que hibrida con el SEQ ID NO: 9. En una realización de este aspecto de la invención, la molécula de ADN aislada tiene la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 9, es decir, es 100% complementaria (identidad de secuencia) del SEQ ID NO: 9.

En el presente documento también se describe una proteína aislada codificada por una molécula de ADN como se ha descrito antes en el presente documento, o un derivado funcional de la misma. Una proteína preferida tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2, o un derivado funcional de la misma. Otra proteína preferida tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10, o es un derivado funcional de la misma. Otras proteínas preferidas de la invención tienen la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16.

En los procedimientos de la presente invención, se aplica un oligonucleótido o polinucleótido antisentido que codifica una molécula de ARN que es complementaria de una parte correspondiente de un transcrito de ARN de una molécula de ADN descrita antes en el presente documento, en el que el oligonucleótido o polinucleótido hibrida con el transcrito de ARN, de modo que se altera la expresión de la DHS inducida por senescencia endógena. En otra realización de este aspecto de la invención, el oligonucleótido o polinucleótido antisentido es una molécula de ARN que hibrida con una parte correspondiente de un transcrito de ARN de una molécula de ADN descrita antes en el presente documento, de modo que se altera la expresión de la DHS inducida por senescencia endógena. El oligonucleótido o polinucleótido antisentido puede ser de longitud completa o preferiblemente tiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 100 nucleótidos.

El oligonucleótido o polinucleótido antisentido puede ser sustancialmente complementario de una parte correspondiente de una cadena de una molécula de ADN que codifica la DHS inducida por senescencia, en el que la molécula de ADN que codifica la DHS inducida por senescencia hibrida con los SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, o con una combinación de los mismos, o es sustancialmente complementario de al menos una parte correspondiente de una secuencia de ARN codificada por la molécula de ADN que codifica la DHS inducida por senescencia. En una realización de la invención, el oligonucleótido o polinucleótido antisentido es sustancialmente complementario de una parte correspondiente de una cadena de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9 o de una combinación de las mismas, o del transcrito de ARN transcrito del SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9 o de una combinación de los mismos. En otra realización, el oligonucleótido antisentido es sustancialmente complementario de una parte correspondiente de la parte 5' no codificante o la parte 3' de una cadena de una molécula de ADN que codifica la DHS inducida por senescencia, en la que la molécula de ADN hibrida con el SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9 o una combinación de los mismos.

En los procedimientos de la presente invención, se aplica un vector para la transformación de células de plantas, que comprende:

(a) un oligonucleótido o polinucleótido antisentido sustancialmente complementario de (1) una parte correspondiente de una cadena de una molécula de ADN que codifica la DHS inducida por senescencia, en el que la molécula de ADN que codifica la DHS inducida por senescencia hibrida con el SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 9, o (2) una parte correspondiente de una secuencia de ARN codificada por la molécula de ADN que codifica la DHS inducida por senescencia; y

(b) secuencias reguladoras operativamente unidas al oligonucleótido o polinucleótido antisentido, de modo que el oligonucleótido o polinucleótido antisentido se expresa en una célula de planta en la que se ha transformado.

Las secuencias reguladoras incluyen un promotor funcional en la célula de planta transformada, cuyo promotor puede ser inducible o constitutivo. Opcionalmente, las secuencias reguladoras incluyen una señal de poliadenilación.

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La invención también proporciona una célula de planta transformada con un vector o una combinación de vectores como se ha descrito antes, una plántula o planta madura generada a partir de dicha célula, o una parte de planta de dicha plántula o planta.

La presente invención se dirige además a un procedimiento para producir una planta que tiene un nivel reducido de DHS inducido por senescencia comparado con una planta no modificada, que comprende:

(1) transformar una planta con un vector o combinación de vectores como se ha descrito antes;

(2) dejar que la planta crezca hasta al menos una fase de plántula;

(3) ensayar en la planta o plántula transformada la actividad de la DHS inducida por senescencia alterada y/o la actividad de eIF-5A y/o la senescencia alterada y/o la senescencia inducida por estrés medioambiental alterada y/o la senescencia inducida por patógenos y/o la senescencia inducida por etileno; y

(4) seleccionar y hacer crecer una planta que tiene la actividad de DHS inducida por senescencia alterada y/o la senescencia alterada y/o la senescencia inducida por estrés medioambiental alterada y/o la senescencia inducida por patógenos y/o la senescencia inducida por etileno, comparado con una planta no transformada.

Las plantas producidas como antes, o progenie, híbridos, clones o partes de plantas presentan preferiblemente expresión de DHS inducido por senescencia reducida y senescencia retrasada y/o senescencia inducida por estrés y/o senescencia inducida por patógenos y/o senescencia inducida por etileno retrasadas.

La invención se dirige además a un procedimiento de inhibición de la expresión de la DHS inducida por senescencia endógena en una célula de planta, comprendiendo dicho procedimiento:

(1) integrar en el genoma de una planta un vector que comprende

(A)

un oligonucleótido o polinucleótido antisentido complementario de (1) al menos una parte de una cadena de una molécula de ADN que codifica la DHS inducida por senescencia endógena, en el que la molécula de ADN que codifica la DHS inducida por senescencia endógena hibrida con el SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 y/o SEQ ID NO: 9, o (ii) al menos una parte de una secuencia de ARN codificada por el gen endógeno de DHS inducida por senescencia; y

(B)

secuencias reguladoras operativamente unidas al oligonucleótido o polinucleótido antisentido de modo que el oligonucleótido o polinucleótido antisentido se expresa; y

(2) hacer crecer dicha planta, en el que dicho oligonucleótido o polinucleótido antisentido se transcribe y el transcrito se une a dicho ARN endógeno de modo que se inhibe la expresión de dicho gen de la DHS inducida por senescencia.

Breve descripción de los dibujos

la fig. 1 representa la secuencia de nucleótidos de la secuencia del ADNc de la DHS inducida por senescencia de hoja de tomate (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO: 2) obtenida de una genoteca de ADNc de hoja de tomate;

la fig. 2A representa la secuencia de nucleótidos de un gen de DHS de Arabidopsis obtenido por alineamiento de la secuencia de DHS de tomate con secuencias genómicas no identificadas en el banco de genes de Arabidopsis (http://qenome-www.stanford.edu/Arabidopsis/) (SEQ ID NO: 5). Los huecos entre las secuencias de aminoácidos son intrones previstos. La figura 2B representa la secuencia de aminoácidos de DHS de Arabidopsis derivada (SEQ ID NO: 6). La figura 2C representa la secuencia de nucleótidos de un ADNc de DHS inducida por senescencia de Arabidopsis de 600 pares de bases obtenida por PCR. La figura 2D representa la secuencia de aminoácidos derivada del fragmento de ADNc de DHS inducida por senescencia de Arabidopsis;

la fig. 3 es un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de DHS inducida por senescencia de hoja de tomate, de longitud completa (SEQ ID NO: 2) y la secuencia de aminoácidos derivada de DHS inducida por senescencia de Arabidopsis, de longitud completa con secuencias de proteínas DHS de ser humano, levadura, hongos y arqueobacterias. Están recuadrados aminoácidos idénticos entre 3 ó 4 de las secuencias;

la fig. 4 es un mapa de restricción del ADNc de la DHS de tomate;

la fig. 5 es una transferencia Southern del ADN genómico aislado de hojas de tomate e hibridada con el ADNc de la DHS inducida por senescencia del tomate, de longitud completa, marcado con ^{32}P-dCTP;

la fig. 6 es una transferencia Northern de ARN aislado de flores de tomate en diferentes fases del desarrollo. La figura 6A es el gel del ARN total teñido con bromuro de etidio. Cada calle contiene 10 \mug de ARN. La figura 6B es una autorradiografía de la transferencia Northern hibridada con el ADNc de la DHS inducido por senescencia del tomate, de longitud completa, marcado con ^{32}P-dCTP;

la fig. 7 es una transferencia Northern del ARN aislado del fruto de tomate en diferentes fases de maduración que se ha hibridado con el ADNc de la DHS inducida por senescencia del tomate, de longitud completa, marcado con ^{32}P-dCTP. Cada calle contiene 10 \mug de ARN.

la fig. 8 es una transferencia Northern de ARN aislado de hojas de tomate que se han estresado por la sequía, por tratamiento con sorbitol 2 M durante 6 horas. Cada calle contiene 10 \mug de ARN. La transferencia se hibridó con ADNc de DHS inducido por senescencia del tomate, de longitud completa, marcado con ^{32}P-dCTP;

la fig. 9 es una transferencia Northern de hojas de tomate que se han expuesto a temperaturas frías. La figura 9A es el gel del ARN total teñido con bromuro de etidio. Cada calle contenía 10 \mug de ARN. La figura 9B es una autorradiografía de la transferencia Northern hibridada con ADNc de DHS inducido por senescencia del tomate, de longitud completa, marcado con ^{32}P-dCTP. La figura 9C muestra los datos de filtración correspondientes medidos como conductividad de las difusiones de hojas;

la fig. 10 es la secuencia de nucleótidos del clon de ADNc (1384 pares de bases) de longitud completa, de la DHS de clavel (SEQ ID NO: 9), que no incluye la cola de PoliA ni la región no codificante 5' terminal. La secuencia de aminoácidos derivada se muestra debajo de la secuencia de nucleótidos (373 aminoácidos). (SEQ ID NO: 10);

la fig. 11 es una transferencia Northern del ARN total de hojas de Arabidopsis senescentes hibridada con el ADNc de DHS inducido por senescencia de Arabidopsis, de longitud completa, marcado con ^{32}P-dCTP. La autorradiografía está en la parte superior, y debajo el gel teñido con etidio;

la fig. 12 es una transferencia Northern del ARN total aislado de pétalos de flores de clavel en diferentes fases. La transferencia se hibridó con ADNc de DHS inducido por senescencia del clavel, de longitud completa, marcado con ^{32}P-dCTP. La autorradiografía está en la parte superior, debajo el gel teñido con etidio.

la fig. 13 es la secuencia de nucleótidos (parte superior) (SEQ ID NO: 11) y de aminoácidos derivada (parte inferior) (SEQ ID NO: 12) del gen de eIF-5A inducido por senescencia del fruto del tomate;

la fig. 14 es la secuencia de nucleótidos (parte superior) (SEQ ID NO: 13) y de aminoácidos derivada (parte inferior) (SEQ ID NO: 14) del gen de eIF-5A inducido por senescencia del clavel;

la fig. 15 es la secuencia de nucleótidos (parte superior) (SEQ ID NO: 15) y de aminoácidos derivada (parte inferior) (SEQ ID NO: 16) del gen de eIF-5A inducido por senescencia de Arabidopsis;

la fig. 16 es una transferencia Northern del ARN total aislado de hojas de plantas Arabidopsis en diferentes fases del desarrollo. La transferencia se hibridó con el ADNc de DHS inducido por senescencia de Arabidopsis, de longitud completa, marcado con ^{32}P-dCTP. La autorradiografía está en la parte superior, debajo el gel teñido con etidio.

la fig. 17 es una transferencia Northern del ARN total aislado del fruto del tomate en las fases del desarrollo de color inicial (I), rojo firme (RF) y rojo blando (RB). La transferencia se hibridó con el ADNc de DHS inducido por senescencia de longitud completa, marcado con ^{32}P-dCTP, y eIF-5A inducido por senescencia de longitud completa. DHS y eIF-5A aumentan la expresión en paralelo en el fruto rojo blando que coincide con la maduración del fruto. La autorradiografía está en la parte superior, debajo el gel teñido con etidio;

la fig. 18 es una transferencia Northern del ARN total aislado de hojas de tomate que se habían tratado con sorbitol para inducir estrés por sequía. C es control; S es tratado con sorbitol. La transferencia se hibridó con el ADNc de la DHS inducida por senescencia de longitud completa, marcado con ^{32}P-dCTP, y eIF-5A inducido por senescencia de longitud completa. Tanto eIF-5A como DHS aumentan su expresión en respuesta al estrés por sequía. La autorradiografía está en la parte superior, debajo el gel teñido con etidio;

la fig. 19 es una transferencia Northern del ARN total aislado de capullos de flores y flores abiertas senescentes de plantas de tomate. La transferencia se hibridó con el ADNc de DHS inducido por senescencia de longitud completa, marcado con ^{32}P-dCTP, y eIF-5A inducido por senescencia de longitud completa. Tanto eIF-5A como DHS aumentan la expresión en flores abiertas/senescentes. La autorradiografía está en la parte superior, debajo el gel teñido con etidio;

la fig. 20 es una transferencia Northern del ARN total aislado de hojas de tomate dañadas por el frío. La transferencia se hibridó con el ADNc de DHS inducido por senescencia de longitud completa, marcado con ^{32}P-dCTP, y eIF-5A inducido por senescencia de longitud completa. Tanto eIF-5A como DHS aumentan la expresión con el desarrollo de daños por frío durante el recalentamiento. La autorradiografía está en la parte superior, debajo el gel teñido con etidio;

la fig. 21 es una fotografía de plantas silvestres (izquierda) y transgénicas de Arabidopsis de 3,1 semanas de edad, que expresan el extremo 3' del gen de DHS de senescencia (secuencia mostrada en la figura 36) en orientación antisentido, que muestra un tamaño mayor de las hojas en las plantas transgénicas;

la fig. 22 es una fotografía de plantas silvestres (izquierda) y transgénicas de Arabidopsis de 4,6 semanas de edad, que expresan el extremo 3' del gen de DHS de senescencia (secuencia mostrada en la figura 36) en orientación antisentido, que muestra un tamaño mayor de las hojas en las plantas transgénicas;

la fig. 23 es una fotografía de plantas silvestres (izquierda) y transgénicas de Arabidopsis de 5,6 semanas de edad, que expresan el extremo 3' del gen de DHS de senescencia (secuencia mostrada en la figura 36) en orientación antisentido, que muestra un tamaño mayor de las hojas en las plantas transgénicas;

la fig. 24 es una fotografía de plantas silvestres (izquierda) y transgénicas de Arabidopsis de 6,1 semanas de edad, que expresan el extremo 3' del gen de DHS de senescencia (secuencia mostrada en la figura 36) en orientación antisentido, que muestra un tamaño mayor de las plantas transgénicas;

la fig. 25 es una gráfica que muestra el aumento del rendimiento de las semillas de 3 líneas de plantas transgénicas de Arabidopsis T_{1} que expresan el gen DHS inducido por senescencia en orientación antisentido. El rendimiento de las semillas se expresa como volumen de semillas. Se muestra SE para n=30 para las plantas silvestres;

la fig. 26 es una fotografía de plantas de tomate transgénicas que expresan el extremo 3' del gen de DHS de senescencia (secuencia mostrada en la figura 36) en orientación antisentido (izquierda) y plantas silvestres (derecha), que muestra un tamaño de hoja mayor y un tamaño de planta mayor en las plantas transgénicas. La fotografía se tomó 18 días después de transferir las plántulas al suelo;

la fig. 27 es una fotografía de plantas de tomate transgénicas que expresan el extremo 3' del gen de DHS de senescencia (secuencia mostrada en la figura 36) en orientación antisentido (izquierda) y plantas silvestres (derecha), que muestra un tamaño de hoja mayor y un tamaño de planta mayor en las plantas transgénicas. La fotografía se tomó 32 días después de transferir las plántulas al suelo;

las figs. 28 a 35 son fotografías del fruto del tomate de plantas silvestres (paneles superiores) y transgénicas que expresan el gen de DHS de senescencia de longitud completa (paneles inferiores. Los frutos se recogieron en la fase de color inicial del desarrollo y se hicieron madurar en una cámara de crecimiento. Los días después de la recolección se indican en la esquina superior izquierda de cada panel;

la fig. 36 es la secuencia de nucleótidos (parte superior) (SEQ ID NO: 30) y de aminoácidos derivada (parte inferior) del extremo 3' del gen DHS inducido por senescencia de Arabidopsis usada en la orientación antisentido para transformar las plantas;

la fig. 37 es la secuencia de nucleótidos (parte superior) (SEQ ID NO: 31) y de aminoácidos derivada (parte inferior) del extremo 3' del gen DHS inducido por senescencia del tomate usada en la orientación antisentido para transformar las plantas;

la fig. 38 es la secuencia de nucleótidos (parte superior) (SEQ ID NO: 26) y de aminoácidos derivada (parte inferior) de una sonda de DHS inducido por senescencia de Arabidopsis de 600 pares de bases usado para aislar el gen de Arabidopsis de longitud completa;

la fig. 39 es la secuencia de nucleótidos (parte superior) (SEQ ID NO: 27) y de aminoácidos derivada (parte inferior) de la secuencia de la sonda de DHS inducido por senescencia del clavel de 483 pares de bases usada para aislar el gen del clavel de longitud completa.

Descripción detallada de la invención

Se proporcionan procedimientos para alterar la expresión del o de los genes de DHS inducidos por senescencia en células de plantas. La alteración de la expresión de la DHS inducida por senescencia en plantas, da como resultado el inicio retrasado de la senescencia y una mayor resistencia al estrés medioambiental y a patógenos, prolongado así la vida en anaquel y/o el periodo de crecimiento.

Se ha aislado una secuencia de ADNc de longitud completa que codifica un gen de DHS de tomate que presenta expresión inducida por senescencia, por la reacción en cadena de la polimerasa mediada por transcriptasa inversa (RT-PCR) usando ARN aislado de hojas de tomate dañadas por el frío como molde y usando el producto de la RT-PCR para seleccionar una genoteca de ADNc de hojas de tomate tratadas con sorbitol, dañadas por el frío. Se usaron sondas de polinucleótido que correspondían a regiones seleccionadas de la secuencia de ADNc de hoja de tomate aislada así como el ADNc de hoja de tomate de longitud completa, para determinar la presencia de ARNm que codifica el gen de DHS en hojas de tomate medioambientalmente estresadas (frío), hojas de tomate tratadas por sorbitol (deshidratadas), frutos de tomate en maduración y flores de tomate senescentes.

Se usaron cebadores diseñados a partir de un clon genómico de DHS de Arabidopsis para generar un producto de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando una genoteca de ADNc de hoja de Arabidopsis senescente como molde. La secuencia de nucleótidos de Arabidopsis tiene una identidad de secuencia de nucleótidos de 73% y una identidad de secuencia de aminoácidos de 81% con la correspondiente secuencia de la DHS inducida por senescencia de tomate.

El gen DHS inducido por senescencia de tomate de la presente invención se aisló usando la RT-PCR. El cebador secuencia arriba usado para aislar el gen de DHS de tomate es un cebador de 24 nucleótidos: 5' AG TCT AGA AGG TGC TCG TCC TGA T 3' (SEQ ID NO. 3); el cebador secuencia abajo contiene 34 nucleótidos: 5' G ACT GCA GTC GAC ATC GAT (T)_{15} 3' (SEQ ID NO. 4). Usando 100 pmoles de cebador secuencia abajo, se aisló una primera cadena de ADNc usando la RT-PCR estándar. La primera cadena después se usó como molde en una RT-PCR, usando los cebadores tanto de secuencia arriba como de secuencia abajo. La separación de los productos de la RT-PCR en un gel de agarosa puso de manifiesto la presencia de tres bandas distintas en el intervalo de tamaños de 1,5 kb a 600 pb. Los tres fragmentos se subclonaron en el vector plasmídico, pBluescript^{TM} (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA) usando los sitios de clonación XbaI y SalI presentes en los cebadores secuencia arriba y secuencia abajo, respectivamente, y se secuenciaron. Las secuencias de los fragmentos se compararon y se alinearon con secuencias presentes en la base de datos de GeneBank. Los resultados mostraron que los fragmentos de 1,5 kb y 1 kb eran secuencias de DHS de tomate. El fragmento de 600 pb también se alineó con secuencias de DHS de ser humano, levadura y Neurospora.

El fragmento de RT-PCR de 600 pb se usó para seleccionar una genoteca de ADNc de tomate (variedad cultivada híbrida Match F1) hecha a partir de ARN obtenido de hojas de tomate que se habían tratado con sorbitol 2 M durante 6 horas para inducir la deshidratación. La genoteca de ADNc se construyó usando el kit de genoteca de ADNc \lambdaZap^{TM} (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA). Se obtuvieron y secuenciaron 3 clones de ADNc positivos de longitud completa idénticos correspondientes al gen DHS inducido por senescencia. La secuencia de nucleótidos del clon de ADNc de DHS inducido por senescencia se muestra en el SEQ ID NO: 1. El clon de ADNc codifica un polipéptido de 381 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) que tiene una masa molecular calculada de 42,1 kDa.

Basándose en el patrón de expresión del gen en las flores, frutos y hojas de tomate estresadas y en desarrollo, está implicado en la senescencia.

La secuencia del ADNc de DHS del tomate se alineó con secuencias genómicas no identificadas en el banco de genoma de Arabidopsis thaliana (http://genome-www.stanford.edu/Arabidopsis). Los resultados mostraron el alineamiento con una secuencia genómica de Arabidopsis no identificada (AB107060). La información del alineamiento se usó para identificar un marco de lectura abierto en la secuencia de Arabidopsis y para generar la secuencia de aminoácidos prevista a partir de la misma. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos resultantes del gen de DHS de Arabidopsis alineados se denominan SEQ ID NO. 5 (Figura 2A) y SEQ ID NO. 6, respectivamente.

Se generaron 2 cebadores basados en regiones cortas de la secuencia de DHS de Arabidopsis identificada: cebador 1, 5' GGTGGTGTTGAGGAAGATC 3' (SEQ ID NO. 7); y cebador 2, 5' GGTGCACGCCCTGATGAAGC 3' (SEQ ID NO. 8). Se usó una genoteca de ADNc de hojas senescentes de Arabidopsis como molde para los dos cebadores en una PCR estándar. Se aisló y secuenció un producto de PCR de 600 pb y mostró que tenía una secuencia idéntica a la del fragmento correspondiente a la secuencia de DHS genómica.

El clon de ADNc de DHS inducido por senescencia de longitud completa, del tomate, también se usó para aislar los clones de ADNc de DHS inducido por senescencia de longitud completa de clavel y Arabidopsis. Los clones del ADNc de DHS de Arabidopsis y clavel se aislaron por selección de una genoteca de ADNc de hojas senescentes de Arabidopsis y una genoteca de ADNc de pétales de clavel senescentes, respectivamente, usando el clon de ADNc de DHS de longitud completa del tomate, como sonda. Después se secuenciaron los clones de ADNc obtenidos de las genotecas de ADNc. La secuencia de nucleótidos del clon de ADNc de longitud completa de Arabidopsis aislada de esta forma tiene la misma secuencia que la región codificante de la secuencia genómica de Arabidopsis identificada como DHS codificante de Arabidopsis por alineamiento con la secuencia de ADNc de tomate. (Figura 2A, SEQ ID NO: 5). La secuencia de nucleótidos del clon de DHS inducido por senescencia de longitud completa de pétalos de clavel y la secuencia de aminoácidos derivada, se muestran en la Figura 10 (SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente).

Por lo tanto, las secuencias de ADNc de la invención, que codifican la DHS de tomate, clavel y Arabidopsis se pueden usar como sonda de una forma similar, para aislar genes de DHS de otras plantas, los cuales después se pueden usar para alterar la senescencia de las plantas.

Parece que el gen DHS inducido por senescencia es un miembro de una familia de genes de DHS. El análisis genómico por transferencia Southern de ADN de hoja de tomate se llevó a cabo usando ADN genómico extraído de una planta híbrida. El ADN se cortó con diferentes enzimas de restricción que reconocen un solo sitio en la región codificante del gen de DHS o que no reconocen ningún sitio en el marco de lectura abierto del gen de DHS. En la figura 4 se muestra un mapa de restricción de la DHS de tomate.

El ADN genómico de hoja de tomate digerido con enzimas de restricción se hibridó con ADNc de DHS de tomate de longitud completa marcado con ^{32}-dCTP. La hibridación en condiciones de restricción alta puso de manifiesto la hibridación de la sonda de ADNc de longitud completa con 2 a 3 fragmentos de restricción para cada muestra de ADN digerida con enzimas de restricción. Hay que destacar que cuando el ADN genómico de hoja de tomate se hizo digerir con XbaI y EcoRI, que tenían sitios de restricción en el marco de lectura abierto de DHS (figura 4), en la transferencia Southern eran detectables más de dos fragmentos de restricción (figura 5). El ADN genómico de la variedad cultivada Match F1, una variedad híbrida, y la línea homocigótica, UCT5, dieron el mismo patrón de fragmentos de restricción. Estos resultados sugieren que hay 2 o más isoformas del gen de DHS en las plantes de tomate. Como se muestra en la figura 3, el gen de DHS está muy conservado entre especies y por lo tanto, se esperaría que hubiera una cantidad significativa de conservación entre isoformas dentro de cualquier especie.

Las transferencias Northern del ARN total de flor de tomate hibridadas con el ADNc de tomate de longitud completa, muestran que la expresión del gen DHS inducido por senescencia es inducido significativamente en flores de tomate, pero la expresión apenas es detectable en los capullos (Figura 6). El análisis de transferencia Northern de la expresión de DHS durante diferentes fases del desarrollo del fruto del tomate demuestra que el gen de DHS es expresado con niveles bajos en el fruto en la fase de color inicial y rosa, mientras que la expresión en el fruto del tomate rojo (maduro) está significativamente potenciada (figura 7).

El análisis de transferencia Northern también demuestra que el gen DHS inducido por senescencia es inducido por condiciones de estrés medioambientales, p. ej., deshidratación (figura 8) y frío (figura 9). Las hojas de tomate que se han tratado con sorbitol 2 M para inducir la deshidratación demuestran la inducción de la expresión de DHS en las hojas deshidratadas comparado con hojas no tratadas (figura 8). Las plantas que se han expuesto a temperaturas frías y se han devuelto a temperatura ambiente muestran expresión inducida por senescencia del gen DHS inducido por senescencia, coincidente con el desarrollo de síntomas de daño por frío (p. ej., pérdida de agua) (figura 9). El patrón general de la expresión de genes en las plantas de tomate y diferentes tejidos de plantas, p. ej., hojas, fruto y flores, demuestra que el gen de DHS de la invención está implicado en el inicio de la senescencia en estas plantas y tejidos de plantas.

Se observan resultados similares en términos de inducción de la expresión del gen de DHS con el inicio de la senescencia de las hojas en Arabidopsis y la senescencia de los pétalos en el clavel. El análisis de transferencia Northern del ARN total de hoja de Arabidopsis aislado de plantas de diferentes edades, muestra que la expresión del gen DHS inducido por senescencia por senescencia no es evidente en plantas jóvenes (5 semanas de edad), pero empieza a aparecer aproximadamente a las 6 semanas. La expresión del gen de DHS es inducido significativamente a las 7 semanas. El análisis de transferencia Northern indica que el gen de DHS de Arabidopsis es potenciado significativamente a medida que la planta envejece (figura 11).

Los análisis de transferencia Northern también demuestran que el gen de DHS es regulado de forma similar en las plantas que florecen, tal como en clavel (figura 12). El análisis de transferencia Northern del ARN total aislado de pétalos de flores de clavel de diferentes edades muestra que la expresión de DHS de clavel es inducida significativamente en pétalos de flores que tienen síntomas de senescencia inducida por la edad, tales como el enrollamiento hacia dentro de los pétalos, que es la primera manifestación morfológica de la senescencia, pero la expresión es mucho menor en flores de capullos apretados. Los pétalos de las flores de clavel que están justo empezando a abrirse tienen significativamente más expresión de DHS que las flores en la fase de capullos apretados, y los pétalos de flores que están completamente abiertos, también muestran expresión potenciada de la DHS.

Por lo tanto, se espera que reprimiendo o alterando sustancialmente la expresión del gen de DHS de inducida por senescencia en tejidos de plantas, se pueda retrasar el deterioro, aumentando la vida en anaquel de frutas, flores y verduras perecederos, y las plantas y sus tejidos se puedan hacer más tolerantes al estrés y resistentes a patógenos. Esto se puede lograr produciendo plantas transgénicas en las que el ADNc de DHS o uno de sus fragmentos de oligonucleótido se expresa en la configuración antisentido en frutos, flores, hojas y verduras, preferiblemente usando un promotor constitutivo tal como el promotor 35S de CaMV, o usando un promotor específico de tejido o inducible por senescencia/estrés.

También se ha aislado y secuenciado en el presente documento otro gen descrito en el presente documento, eIF-5A, que está implicado en la inducción de cambios morfológicos relacionados con la senescencia en plantas, y como la DHS se puede usar para alterar la senescencia y los procesos relacionados con la senescencia en plantas, preferiblemente, por introducción en la orientación antisentido en plantas. Se aisló un clon de ADNc de eIF-5A inducible por senescencia, de longitud completa, de cada una de las genotecas de ADNc del fruto del tomate en maduración, hoja de Arabidopsis senescente y flor de clavel senescente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos derivadas de cada uno de los clones de longitud completa se muestra en las figuras 13 (eIF-5A inducido por senescencia del tomate), 14 (eIF-5A inducido por senescencia del clavel) y 15 (eIF-5A inducido por senescencia de Arabidopsis). La secuencia de nucleótidos de cada uno de estos clones de ADNc se muestra también como SEQ ID NO: 11 (tomate) (Figura 13), SEQ ID NO: 13 (clavel) (Figura 14) y SEQ ID NO: 15 (Arabidopsis) (Figura 15). La secuencia de aminoácidos derivada de cada uno de los genes se muestra como SEQ ID NO: 12 (Figura 13), SEQ ID NO: 14 (Figura 14) y SEQ ID NO: 16 (Figura 15), respectivamente.

Al igual que en el caso de las secuencias de gen de DHS descritas en el presente documento, la secuencia de eIF-5A descrita en el presente documento se puede usar para aislar los genes de eIF-5A de otras plantas. Las secuencias de eIF-5A aisladas se pueden usar para alterar la senescencia y los procesos relacionados con la senescencia en plantas. El aislamiento de las secuencias de eIF-5A de plantas se puede lograr usando procedimientos conocidos en la técnica, basados en las similitudes de secuencias de al menos aproximadamente 70% entre las especies.

La inducción paralela de eIF-5A y DHS ocurre en plantas durante la senescencia. Los análisis de transferencia Northern demuestran que se favorece la expresión de eIF-5A en paralelo con DHS al inicio de la senescencia tanto natural como inducida por estrés (Figuras 16 a 20). Por ejemplo, los análisis de transferencia Northern del ARN total aislado de hojas de plantas Arabidopsis de diferentes edades, demuestran que a partir del momento en que la senescencia de la hoja es evidente en la planta, la expresión de eIF-5A es inducida y la expresión es potenciada significativamente a medida que la la senescencia avanza. En las plantas que llevan frutos, tales como el tomate, está favorecida la expresión de eIF-5A y DHS en paralelo en el fruto rojo blando con el inicio del ablandamiento y deterioro del fruto (Figura 17).

Los análisis de transferencia Northern también demuestran la expresión favorecida de eIF-5A y DHS en paralelo en plantas en respuesta al estrés medioambiental, tal como daño por sequía (figura 18) y frío (figura 20). Igualmente, en las plantas que florecen, se favorece la expresión de eIF-5A y DHS en paralelo en flores abiertas y la expresión de ambos genes continúa estando potenciada en las últimas fases de la floración.

El gen de DHS inducido por senescencia clonado, fragmento(s) del mismo, cuando se introduce en orientación inversa (antisentido) bajo el control de un promotor constitutivo, tal como el promotor 35S del virus del mosaico de la higuera, promotor caM35S del virus del mosaico de la coliflor, promotor 35S doble o promotor MAS, se puede usar para modificar genéticamente plantas y alterar la senescencia en plantas modificadas. Se pueden usar secuencias antisentido seleccionadas de otras plantas que compartan suficiente identidad de secuencia con los genes de DHS inducidos por senescencia del tomate, Arabidopsis o clavel, para lograr una modificación genética similar. Un resultado de la modificación genética es una reducción de la cantidad de ARNm que codifica la DHS inducida por senescencia que se puede traducir endógena.

Por consiguiente, se reduce la cantidad de DHS inducido por senescencia producido en las células de las plantas, reduciéndose de esta forma la cantidad de eIF-5A activado, que a su vez reduce la traducción de las proteínas inducidas por senescencia, incluyendo la lipasa inducida por senescencia, proteasas inducidas por senescencia y nucleasas inducidas por senescencia. De esta forma se inhibe o retrasa la senescencia, puesto que es necesaria la síntesis nueva de proteína para el inicio de la senescencia.

Por ejemplo, las plantas de Arabidopsis transformadas con vectores que expresan la longitud completa o la región 3' del gen DHS inducido por senescencia de Arabidopsis (SEQ ID NO: 26) (Figura 38) en orientación antisentido, bajo la regulación de un promotor 35S doble, presentan una mayor biomasa, p. ej., mayor tamaño de las hojas y crecimiento general de la planta mayor a lo largo de todas las fases del crecimiento, y senescencia retrasada comparado con las plantas de control como se muestra en las figuras 21 a 24.

El efecto de la menor expresión del gen DHS inducido por senescencia provocado por la expresión de la longitud completa o la región 3' del gen DHS inducido por senescencia de Arabidopsis en orientación antisentido en plantas Arabidopsis transgénicas también se ve como un aumento del rendimiento de semillas en las plantas transformadas. Las líneas de plantas Arabidopsis que expresan la región 3' no codificante antisentido del gen DHS inducido por senescencia de Arabidopsis, producen hasta 6 veces más semillas que las plantas silvestres (figura 25).

Se obtienen resultados similares con las plantas de tomate transformadas con el extremo 3' del gen DHS inducido por senescencia del tomate (SEQ ID NO: 27) en orientación antisentido y bajo la regulación de un promotor 35S doble. Las plantas transformadas con el extremo 3' del gen en orientación antisentido muestran un mayor tamaño de las hojas y mayor tamaño de la planta en comparación con las plantas de tomate de control (no transformadas (figuras 26 y 27).

Las plantas de tomate transformadas con DHS inducido por senescencia de longitud completa del tomate en orientación antisentido, producen frutos que presentan ablandamiento y deterioro retrasados en comparación con las plantas silvestres (figura 28 a 35). Por lo tanto, los procedimientos y secuencias de la presente invención se pueden usar para retrasar el ablandamiento y deterioro del fruto, así como para aumentar la biomasa de la planta y el rendimiento de semillas, y en general, retrasar la senescencia en plantas.

Las secuencias de nucleótidos aisladas de esta invención se pueden usar para aislar sustancialmente la secuencia de nucleótidos de DHS complementaria de otras plantas u organismos. Estas secuencias, a su vez, se pueden usar para transformar plantas y por lo tanto alterar la senescencia de las plantas transformadas de la misma forma que se muestra con el uso de las secuencias de nucleótidos aisladas mostradas en el presente documento.

Las modificaciones genéticas obtenidas con la transformación de plantas con DHS o fragmentos de la misma, pueden realizar un cambio permanente en los niveles de DHS, eIF-5A inducido por senescencia o ambos, en la planta, y pueden propagarse a las plantas descendientes por autofecundación o por otros esquemas reproductivos. La planta genéticamente alterada se usa para producir una variedad o línea nueva de plantas en la que la alteración se transmite de forma estable de una generación a otra. La presente invención proporciona por primera vez, las secuencias de ADN adecuadas que se pueden usar para lograr una modificación genética estable de la senescencia en una amplia variedad de plantas diferentes.

Para la identificación y el aislamiento del gen DHS inducido por senescencia y el gen de eIF-5A, en general, se llevaron a cabo la preparación de ADN plasmídico, digestión con enzimas de restricción, electroforesis del ADN en gel de agarosa, electroforesis de la proteína en gel de poliacrilamida, PCR, RT-PCR, transferencias Southern, transferencias Northern, ligado de ADN y transformaciones bacterianas, usando procedimientos convencionales bien conocidos en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Sambrook describe técnicas de hibridación de ácido nucleico (Véase antes).

Tal como se usa en el presente documento, el término "planta" se refiere a una planta entera, una parte de una planta, una célula de planta o un grupo de células de planta. El tipo de planta que se puede usar en los procedimientos de la invención no está limitado e incluye, por ejemplo, plantas sensibles al etileno y plantas insensibles al etileno; plantas que tienen frutos tales como albaricoques, melocotones, naranjas, bananas, uvas, peras, tomates, fresas, aguacates, etc.; verduras tales como zanahorias, guisantes, lechuga, repollo, nabos, patatas, brócoli, espárragos, etc.; flores tales como claveles, rosas, crisantemos, etc.; plantas de cultivo agroquímico y especies forestales tales como maíz, arroz, soja, alfalfa y similares; y en general, cualquier planta que pueda absorber y expresar las moléculas de ADN de la presente invención. Puede incluir plantas de una variedad de niveles de ploidía, incluyendo haploides, diploides, tetraploides y poliploides. La planta puede ser además monocotiledónea o dicotiledónea.

Una planta transgénica se define en el presente documento como una planta que está genéticamente modificada de alguna forma, incluyendo, pero sin limitar a una planta que ha incorporado ADN de DHS inducido por senescencia heterólogo u homólogo, o ADN modificado o alguna parte del ADN de DHS inducido por senescencia heterólogo o ADN de DHS de senescencia inducida homólogo en su genoma.

Las plantas transgénicas de la invención pueden haber incorporado ADN modificado o de DHS inducido por senescencia heterólogo u homólogo o alguna parte del ADN de DHS inducido por senescencia heterólogo o ADN de DHS inducido por senescencia homólogo, en su genoma. El material genético alterado puede codificar una proteína, comprender una secuencia reguladora o de control, o puede ser o incluir una secuencia antisentido o codificar un ARN antisentido, que es antisentido de la secuencia de ARNm de DHS inducido por senescencia endógena o una parte de la misma, de la planta. Un "transgén" o "secuencia transgénica" se defina como un gen extraño o secuencia parcial que se ha incorporado en una planta transgénica.

El término "hibridación" tal como se usa en el presente documento en general se usa para referirse a hibridación de ácidos nucleicos en condiciones de restricción adecuadas como será fácilmente evidente para los expertos en la materia, dependiendo de la naturaleza de la secuencia de la sonda y las secuencias diana. Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas en la técnica, y el ajuste de las condiciones que depende de la restricción deseada, se puede lograr fácilmente variando el tiempo de incubación, la temperatura y/o la fuerza iónica de la disolución. Véase, por ejemplo, Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. La elección de las condiciones viene dada por la longitud de las secuencias que se van a hibridar, en particular, la longitud de la secuencia de la sonda, el contenido relativo de G-C de los ácidos nucleicos y la cantidad de apareamientos erróneos permitidos. Se prefieren las condiciones de restricción bajas cuando se desea la hibridación parcial entre cadenas que tienen menos grados de complementaridad. Cuando se desea la complementaridad perfecta o casi perfecta, se prefieren las condiciones de restricción altas. Para las condiciones de restricción altas típicas, la disolución contiene 6X SSC, EDTA 0,01 M, 1X disolución de Denhardt y SDS al 0,5%. La hibridación se lleva a cabo a aproximadamente 68ºC durante aproximadamente 3 a 4 horas para fragmentos de ADN clonados, y durante aproximadamente 12 a aproximadamente 16 horas para el ADN eucariota total. Para la restricción menor, la temperatura de hibridación se reduce a aproximadamente 42ºC por debajo de la temperatura de fusión (T_{f}) del dúplex. Se sabe que la T_{f} es una función del contenido de G-C y la longitud del dúplex así como de la fuerza iónica de la disolución.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "identidad de secuencia sustancial" u "homología sustancial" se usa para indicar que una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos presentan equivalencia estructural o funcional sustanciales con otra secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Cualquier diferencia estructural o funcional entre secuencias que tienen identidad de secuencia sustancial u homología sustancial será mínima; es decir, no afectará a la capacidad de la secuencia para funcionar como se indica en la aplicación deseada. Las diferencias pueden deberse a variaciones inherentes en el uso de codones entre especies diferentes, por ejemplo. Las diferencias estructurales se consideran las mínimas si hay una cantidad significativa de superposición o similitud de secuencias entre dos o más secuencias diferentes o si las secuencias diferentes presentan características físicas similares, incluso aunque la secuencia difiera en longitud o estructura. Dichas características incluyen, por ejemplo, capacidad para hibridar en condiciones definidas, o en el caso de proteínas, reactividad cruzada inmunológica, actividad enzimática similar etc. Cada una de estas características las puede determinar fácilmente el experto en la materia por procedimientos conocidos en la técnica.

Además, dos secuencias de nucleótidos son "sustancialmente complementarias" si las secuencias tienen al menos aproximadamente 70 por ciento, más preferiblemente 80 por ciento y lo más preferiblemente aproximadamente 90 por ciento de similitud de secuencia entre ellas. Dos secuencias de aminoácidos son sustancialmente homólogas si tienen al menos 50%, preferiblemente 70% de similitud entre las partes activas de los polipéptidos.

Tal como se usa en el presente documento, la frase "hibrida con una parte correspondiente" de la molécula de ADN o ARN, significa que la molécula que hibrida, p. ej., oligonucleótido, polinucleótido o cualquier secuencia de nucleótidos (en orientación homosentido o antisentido) reconoce e hibrida con una secuencia en otra molécula de ácido nucleico que es de aproximadamente el mismo tamaño y tiene suficiente similitud de secuencia con la misma para realizar la hibridación en condiciones adecuadas. Por ejemplo, una molécula antisentido de 100 nucleótidos de longitud de la región 3' codificante o no codificante de DHS del tomate reconocerá e hibridará con una parte de aproximadamente 100 nucleótidos de una secuencia de nucleótidos en la región 3' codificante o no codificante, respectivamente, del gen DHS del clavel o gen DHS de cualquier otra planta, con la condición de que haya aproximadamente 70% o más de similitud de secuencia entre las dos secuencias. Hay que entender que el tamaño de la "parte correspondiente" permitirá algunos apareamientos erróneos en la hibridación, de modo que la "parte correspondiente" puede ser menor o mayor que la molécula con la que hibrida, por ejemplo 20-30% más grande o más pequeña, preferiblemente no más de aproximadamente 12-15% más grande o más pequeña.

La expresión "derivado funcional" de un ácido nucleico (o poli u oligonucleótido) se usa en el presente documento para referirse a un fragmento, variante, homólogo o análogo del gen o secuencia de nucleótidos que codifica la DHS inducida por senescencia. Un derivado funcional puede retener al menos una parte de la función del ADN que codifica la DHS inducida por senescencia, que permite su utilidad de acuerdo con la invención. Dicha función puede incluir la capacidad de hibridar en condiciones de restricción bajas con ADN de DHS inducido por senescencia de Arabidopsis o clavel o ADN sustancialmente homólogo de otra planta que codifica la DHS inducida por senescencia o con su transcrito de ARN, o en orientación antisentido, para inhibir la transcripción y/o traducción del ARNm de DHS inducido por senescencia, o similares.

Un "fragmento" del gen o secuencia de ADN se refiere a cualquier subconjunto de la molécula, p. ej., un polinucleótido u oligonucleótido más corto. Una "variante" se refiere a una molécula sustancialmente similar al gen entero o un fragmento del mismo, tal como una variante de sustitución de nucleótido que tiene uno o más nucleótidos sustituidos, pero que mantiene la capacidad para hibridar con el gen particular o codificar el transcrito de ARNm que hibrida con el ADN nativo. Un "homólogo" se refiere a un fragmento o secuencia variante de un género o especie de planta diferente. Un "análogo" se refiere a una molécula no natural sustancialmente similar o que funciona en relación con la molécula entera, una variante o un fragmento de la misma.

Por "expresión alterada" o "expresión modificada" de un gen, p. ej., el gen DHS inducido por senescencia, se indica cualquier proceso o resultado por el cual se modifica de alguna manera la expresión normal del gen, por ejemplo, la expresión que se produce en una planta que lleva frutos, en floración u otra planta. Como se entiende en el presente documento, la alteración en la expresión del gen es la reducción completa o parcial de la expresión del gen DHS inducido por senescencia, pero también puede incluir un cambio en el tiempo de expresión, u otro estado en el que la expresión del gen DHS inducido por senescencia difiere del que sería el más probable que ocurriera naturalmente en una planta o variedad de cultivo no modificado. Una alteración preferida es aquella que da como resultado la reducción de la producción de DHS inducido por senescencia por la planta comparada con la producción en una planta no modificada.

Cuando se produce una planta genéticamente alterada de acuerdo con esta invención, se prefiere seleccionar plántulas o plantas individuales por los rasgos deseados, en general expresión o producción reducida de DHS inducido por senescencia. La expresión de DHS inducido por senescencia se puede determinar, por ejemplo, mediante observaciones de la senescencia retrasada o reducida en plantas transgénicas. También se puede cuantificar la actividad de DHS en plantas transgénicas en comparación con plantas de control (normales, no transgénicas) usando ensayos conocidos.

Con el fin de que un gen o secuencia de ADN recién insertado sea expresado, dando como resultado la producción de la proteína que codifica, o en el caso del ADN antisentido, sea transcrito dando como resultado una molécula de ARN antisentido, deben estar presentes elementos reguladores adecuados en posiciones y orientación adecuados con respecto al gen o secuencia de ADN. Las regiones reguladoras pueden incluir un promotor, una secuencia líder 5' no traducida y una secuencia 3' de poliadenilación, así como potenciadores y otras secuencias reguladoras.

Los elementos reguladores promotores que son útiles combinados con el gen DHS inducido por senescencia para generar transcritos homosentido o antisentido del gen, incluyen cualquier promotor de planta en general, y más en particular, un promotor constitutivo tal como el promotor 35S del virus del mosaico de la higuera, el promotor del virus del mosaico de la coliflor, promotor CaMV35S, o el promotor MAS, o un promotor específico de tejido o de senescencia inducida, tal como el promotor GST1 de pétalo de clavel o el promotor SAG12 de Arabidopsis (Véase, por ejemplo, J.C. Palaqui y col., Plant Physiol., 112:1447-1456 (1996); Morton y col., Molecular Breeding, 1:123-132 (1995); Fobert y col., Plant Journal, 6:567-577 (1994); y Gan y col., Plant Physiol., 113:313 (1997), incorporados en el presente documento por referencia). Preferiblemente, el promotor usado en la presente invención es un promotor constitutivo, lo más preferiblemente se usa un promotor 35S doble.

Los niveles de expresión para un promotor que es útil para la presente invención, se pueden ensayar usando sistemas de expresión convencionales, por ejemplo, midiendo los niveles de un producto de gen indicador, p. ej., proteína o ARNm en extractos de hojas, flores, frutos u otros tejidos de una planta transgénica en la que se ha introducido el gen promotor/indicador.

En los procedimientos de la presente invención se aplican oligonucleótidos y polinucleótidos antisentido complementarios del gen que codifica la DHS inducido por senescencia del tomate, DHS inducido por senescencia del clavel, DHS inducido por senescencia de Arabidopsis o complementarios de un gen o fragmento de gen de otra planta, que hibrida con el gen DHS inducido por senescencia del tomate, clavel o Arabidopsis en condiciones de alta restricción.

Dichos oligonucleótidos antisentido deben tener al menos aproximadamente 6 nucleótidos de longitud para proporcionar la especificidad de hibridación mínima y pueden ser complementarios de una cadena de ADN o ARNm que codifica el gen inducido por senescencia o una parte del mismo, o de secuencias flanqueadoras en el ADN genómico que están implicadas en la regulación de la expresión del gen DHS inducido por senescencia. El oligonucleótido antisentido puede ser tan largo como 100 nucleótidos o más y puede extenderse hasta y más allá de la longitud de la secuencia codificante completa para la cual es antisentido. Los oligonucleótidos antisentido pueden ser ADN o ARN o mezclas quiméricas o versiones derivadas o modificadas de las mismas, mono o bicatenarias.

La acción del oligonucleótido antisentido puede dar como resultado la alteración, principalmente inhibición de la expresión de DHS inducido por senescencia.

Para una discusión general del antisentido, véase: Alberts, y col., Molecular Biology of the Cell, 2ª ed., Garland Publishing, Inc. New York, New York, 1989 (en particular las páginas 195-196, incorporadas en el presente documento por referencia).

El oligonucleótido antisentido puede ser complementario de cualquier parte correspondiente del gen DHS inducido por senescencia. En una realización, el oligonucleótido antisentido puede tener entre 6 y 100 nucleótidos de longitud, y puede ser complementario de la región 5' no codificante o secuencias en el extremo 3' de la secuencia de DHS inducido por senescencia, por ejemplo. Se sabe que los oligonucleótidos antisentido principalmente complementarios de las secuencias 5' no codificante son inhibidores eficaces de la expresión de factores de transcripción que codifican genes. Branch, M.A., Molec. Cell Biol., 13:4284-4290 (1993).

Los oligonucleótidos antisentido preferidos son sustancialmente complementarios de una parte del ARNm que codifica la parte de DHS inducido por senescencia del ARNm que es aproximadamente del mismo tamaño que el oligonucleótido antisentido. Por ejemplo, la introducción del clon de ADNc de longitud completa que codifica la DHS inducida por senescencia en una orientación antisentido en una planta, se espera que de como resultado la expresión del gen DHS inducido por senescencia alterada satisfactoriamente. Además, como se demuestra en la figuras 21-35, la introducción de secuencias parciales, dirigidas a partes específicas del gen DHS inducido por senescencia o el gen de eIF-5A inducido por senescencia, puede ser igualmente eficaz.

La cantidad mínima de homología necesaria para la presente invención, es la que es suficiente para dar como resultado suficiente complementariedad para proporcionar el reconocimiento del ARN o ADN diana específico y la inhibición o reducción de su traducción o función mientras no afecten a la función de otras moléculas de ARN o ADN y a la expresión de otros genes. Aunque los oligonucleótidos antisentido de la invención comprenden secuencias complementarias de una parte correspondiente de un transcrito de ARN del gen DHS inducido por senescencia, se prefiere, aunque no es necesaria, la complementariedad absoluta. La capacidad de hibridación puede depender de la longitud del oligonucleótido antisentido y del grado de complementariedad. En general, cuanto más largo es el ácido nucleico que hibrida, más apareamientos erróneos de bases con la secuencia diana de DHS inducido por senescencia puede contener y formar todavía un dúplex estable. Un experto en la materia puede determinar un grado tolerable de apareamientos erróneos usando procedimientos estándar para determinar, por ejemplo, la temperatura de fusión del complejo hibridado.

Los oligonucleótidos de ARN antisentido pueden generarse de forma intracelular por transcripción de secuencias de ácido nucleico introducidas de forma exógena. La molécula antisentido puede suministrarse a una célula por transformación o transfección o infección con un vector, tal como un plásmido o virus en el que se incorpora el ADN que codifica la secuencia antisentido de DHS inducido por senescencia operativamente unida a elementos reguladores adecuados, incluyendo un promotor. Dentro de la célula la secuencia de ADN exógena es expresada, produciendo un ARN antisentido del gen DHS inducido por senescencia.

Los vectores que se aplican en los procedimientos de la presente invención pueden ser plásmidos, preferiblemente, o pueden ser vectores víricos u otros vectores conocidos en la técnica para replicar y expresar genes codificados por los mismos en células de plantas o células de bacterias. El vector se convierte en integrado en el cromosoma de modo que puede ser transcrito para producir el ARN de DHS inducido por senescencia deseado. Dichos plásmidos o vectores víricos se pueden construir por procedimientos de tecnología de ADN recombinante que son estándar en la técnica. Por ejemplo, el vector puede ser un vector plasmídico que contiene un sistema de replicación funcional en un huésped procariota y un oligonucleótido o polinucleótido antisentido de acuerdo con la invención. Alternativamente, el vector puede ser un plásmido que contiene un sistema de replicación funcional en Agrobacterium y un oligonucleótido o polinucleótido antisentido de acuerdo con la invención. Los plásmidos que son capaces de replicación en Agrobacterium son bien conocidos en la técnica. Véase, Miki, y col., Procedures for Introducing Foreign DNA Into Plants, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Eds. B.R. Glick y J.E. Thompson. CRC Press (1993), PP. 67-83.

El gen de DHS del tomate se clonó en orientación antisentido en un vector plasmídico de la siguiente forma. Se usó el plásmido pCD, que se construye a partir de una cadena principal de pUC18 y contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) seguido de un sitio de clonación múltiple y una secuencia de terminación de octapina sintasa para clonar el gen de DHS del tomate. El plásmido pCd-DHS (antisentido) se construyó por subclonación del gen de DHS del tomate de longitud completa en una orientación antisentido en el plásmido pCD usando los sitios de restricción XhoI y SacI.

Un oligonucleótido, preferiblemente entre aproximadamente 6 y aproximadamente 100 nucleótidos de longitud y complementario de la secuencia diana del gen DHS inducido por senescencia o eIF-5A inducido por senescencia, se puede preparar por tecnologías de nucleótidos recombinante o se puede sintetizar a partir de mononucleótidos u oligonucleótidos más cortos, por ejemplo. Se pueden aplicar sintetizadores automáticos a la síntesis química de los oligos y polinucleótidos de la invención. Los procedimientos para construir moléculas de nucleótidos recombinantes de acuerdo con la presente invención se describen en Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. Los oligonucleótidos que codifican ARN antisentido complementarios de una secuencia de desoxihipusina sintasa inducida por senescencia se pueden preparar usando procedimientos bien conocidos para los expertos en la técnica. Los detalles relativos a dichos procedimientos se proporcionan en Maniatis, T. y col., Molecular mechanisms in the Control of Gene expression, eds., Nierlich, y col., eds., Acad. Press, N.Y. (1976).

En una realización alternativa de la invención, la inhibición de la expresión de DHS inducido por senescencia endógena de planta, es el resultado de la cosupresión a través de la sobreexpresión de un gen o fragmento de gen DHS inducido por senescencia exógeno en la célula de planta. En esta realización de la invención, se introduce un vector que codifica la DHS inducida por senescencia en la orientación homosentido en las células de la misma forma que se ha descrito en el presente documento para las moléculas antisentido. Preferiblemente, DHS inducido por senescencia está operativamente unido a un promotor constitutivo fuerte, tal como por ejemplo el promotor del virus del mosaico de la higuera o CaMV35S o un promotor 35S doble.

En otra realización de la invención, la inhibición de la expresión de DHS inducido por senescencia endógena de la planta se realiza mediante el uso de ribozimas. Los ribozimas son moléculas de ARN que presentan actividad de endorribonucleasa específica de secuencia. Un ejemplo es el ribozima de cabeza de martillo que escinde en el sitio de reconocimiento UH (en el que H es un resto A, C o U) en el ARN diana y contiene regiones de apareamiento de bases que dirigen el dominio catalítico del ribozima al sitio diana del ARN sustrato. Los ribozimas son altamente específicos para la diana y se pueden diseñar para inactivar un miembro de una familia de multigenes o dirigirlos a regiones conservadas de ARNm (Véase, Merlo y col., The Plant Cell, 10:1603-1621, 1998). La molécula de ribozima se puede suministrar a una célula por transformación, transfección o infección con un vector, tal como un plásmido o virus, en el que se incorpora el ribozima operativamente unido a elementos reguladores adecuados, incluyendo un promotor. Dicha construcción de ribozima contiene brazos de apareamiento de bases que lo dirigen a un sitio de escisión dentro del ARNm de DHS inducido por senescencia, dando como resultado la escisión del ARNm de DHS y la inhibición de la expresión de DHS inducido por senescencia.

Las plantas transgénicas hechas de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por transformación del ADN usando cualquier procedimiento de transformación de planta conocido en la técnica. Los procedimientos de transformación de plantas incluyen el cocultivo directo de plantas, tejidos o células con Agrobacterium tumefaciens o infección directa (Miki, y col., Meth. in Plant Mol. Biol. and Biotechnology, (1993), p. 67-88); transferencia directa de genes en protoplastos o absorción de protoplastos (Paszkowski, y col., EMBO J., 12:2717 (1984); electroporación (Fromm, y col., Nature, 319:719 (1986); bombardeo de partículas (Klein y col. BioTechnology, 6:559-563 (1988); inyección en tejidos meristémicos de plántulas y plantas (De LaPena, y col., Nature, 325:274-276 (1987); inyección en protoplastos de células y tejidos cultivados (Reich, y col., BioTechnology, 4:1001 -1004 (1986)).

En general, se obtiene una planta completa del procedimiento de transformación. Las plantas se regeneran a partir de protoplastos, callos, partes de tejidos o explantes, etc. Las partes de plantas obtenidas a partir de las plantas regeneradas en las que se ha alterado la expresión de la DHS inducida por senescencia, tales como hojas, flores, frutos, semillas y similares, están incluidas en la definición de "planta" tal como se usa en el presente documento. La progenie, variantes y mutantes de las plantas regeneradas también están incluidos en la definición de "planta".

La proteína DHS inducida por senescencia del tomate, clavel o Arabidopsis o derivados funcionales de la misma, se producen preferiblemente por tecnologías recombinantes, opcionalmente en combinación con procedimientos de síntesis química. En una realización de la invención la DHS inducida por senescencia se expresa como una proteína de fusión, que consiste preferiblemente en la DHS inducida por senescencia fusionada con la proteína de unión a maltosa.

Los "derivados funcionales" de la proteína DHS inducida por senescencia como se describen en el presente documento son fragmentos, variantes, análogos o derivados químicos de la DHS inducida por senescencia, que retienen al menos una parte de la actividad de la DHS inducida por senescencia o reactividad cruzada inmunológica con un anticuerpo específico para la DHS inducida por senescencia.

Un fragmento de la proteína DHS inducida por senescencia se refiere a cualquier subconjunto de la molécula. Los péptidos variantes se pueden hacer por síntesis química directa, por ejemplo, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Un análogo de la DHS inducida por senescencia se refiere a una proteína no natural sustancialmente similar a la proteína entera o un fragmento de la misma. Los derivados químicos de la DHS inducida por senescencia contienen restos químicos adicionales que normalmente no son una parte del péptido o fragmento de péptido. Se pueden introducir modificaciones en péptidos o fragmentos de los mismos, haciendo reaccionar los restos de aminoácidos dirigidos del péptido con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o restos terminales.

Una proteína o péptido de DHS inducidos por senescencia de acuerdo con la invención, se puede producir cultivando una célula transformada con una secuencia de nucleótidos de esta invención (en la orientación homosentido), dejando que la célula sintetice la proteína y después aislando la proteína, sea como una proteína libre o como una proteína de fusión, dependiendo del protocolo de clonación usado, del medio de cultivo o de extractos celulares. Alternativamente, la proteína se puede producir en un sistema sin células. Ranu y col., Meth. Enzymol., 60-459-484 (1979).

Habiendo descrito en general la invención, ahora se entenderá mejor mediante la referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que limiten la presente invención.

Ejemplo 1 Aislamiento del ARN mensajero (ARNm)

Se aisló ARN total de flores de tomate y fruto del tomate en diferentes fases del desarrollo y de hojas (no tratadas o después de tratamiento con frío o con sorbitol). Brevemente, el tejido (5 g) se trituró en nitrógeno líquido. El polvo triturado se mezcló con 30 ml de tampón de guanidinio (isotiocianato de guanidinio 4 M, NaOAc 2,5 mM pH 8,5, \beta-mercaptoetanol al 0,8%). La mezcla se filtró a través de 4 capas de estopilla y se centrifugó a 10.000 Xg a 4ºC durante 30 minutos. Después, el líquido sobrenadante se sometió a centrifugación en gradiente de densidad con cloruro de cesio a 26.000 Xg durante 20 horas. El ARN sedimentado se aclaró con etanol al 75%, se volvió a suspender en 600 \mul de agua tratada con DEPC y el ARN se hizo precipitar a -70ºC con 0,75 ml de etanol al 95% y 30 \mul de NaOAc 3 M. Se fraccionaron 10 \mug de ARN en un gel de formaldehído-agarosa desnaturalizante al 1,2% y se transfirieron a una membrana de nailon. Se usó ADNc de DHS de longitud completa marcado con ^{32}P-dCTP cebado aleatoria miente (SEQ ID NO: 1) para hibridación de la membrana a 42ºC durante una noche. Después, la membrana se lavó una vez en 1X SSC que contenía SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 minutos y 3 veces en 0,2X SSC que contenía SDS al
0,1% a 65ºC durante 15 minutos cada uno. La membrana se expuso a película de rayos X durante 1 noche a -70ºC.

Se aisló ARNm PoliA^{+} del ARN total usando el sistema de aislamiento de ARNm con extensión de PoliA^{+} disponible en Promega. El ARNm PoliA^{+} se usó como un molde para la síntesis de ADNc usando el sistema de síntesis de ADNc ZAP Express® disponible en Stratagene (La Jolla, Calif.)

Cribado de genoteca de ADNc de hoja de tomate

Una genoteca de ADNc hecha usando el ARNm aislado de hojas de tomate de híbrido Match F1 que se habían expuesto a sorbitol 2 M durante 6 horas se diluyó a aproximadamente 5 x 10^{6} UFP/ml. La genoteca de ADNc se cribó usando un fragmento de la RT-PCR de 600 pb marcado con ^{32}P. Se escindieron 3 clones de ADNc positivos y se volvieron a circularizar en un fagémido pBK-CMV® (Stratagene) usando el procedimiento de las instrucciones del fabricante. El ADNc de longitud completa se insertó en el vector pBK-CMV.

Aislamiento de ADN plasmídico, secuenciación de ADN

Se usó el procedimiento de lisis alcalina descrito por Sambrook y col., (véase antes) para aislar el ADN plasmídico. El clon de ADNc positivo de longitud completa se secuenció usando el procedimiento de secuenciación didesoxi. Sanger, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467. El marcó de lectura abierto se compiló y se analizó usando la búsqueda BLAST (GenBank, Bethesda, MD) y el alineamiento de las 5 proteínas más homólogas con la secuencia de aminoácidos derivada del gen codificado se logró usando un BCM Search Launcher: Procedimiento de alineamiento múltiple inducido por patrón de alineamiento de múltiples secuencias (véase F. Corpet, Nuc. Acids Res., 16:10881-10890, 10 (1987)). Los patrones funcionales presentes en la secuencia de aminoácidos derivada se identificaron por MultiFinder.

Hibridaciones de transferencias Northern del ARN del tomate

Se separaron 10 \mug de ARN total de flores de tomate en diferentes fases (capullo y flores y pétalos senescentes que están muy abiertos o secándose), hojas de tomate y fruto del tomate en diferentes fases de maduración (fase de color inicial, es decir, fruto verde con menos de 10% de color rojo; rosa, es decir, el fruto entero es naranja o rosa; y rojo blando o firme) en geles de formaldehído-agarosa desnaturalizantes al 1% y se inmovilizaron en membranas de nailon. Se usó el ADNc de tomate de longitud completa marcado con ^{32}P-dCTP usando un kit de cebador aleatorio (Boehriger Mannheim) para hibridar con los filtros (7 x 10^{7} cpm). Los filtros se lavaron una vez con 1X SSC, SDS al 0,1% a temperatura ambiente y 3 veces con 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC. Los filtros se secaron y se expusieron a película de rayos X durante una noche a -70ºC. Los resultados se muestran en las Figuras 6, 7, 8 y 9.

Hibridación de transferencia Northern de ARN de Arabidopsis

Se aisló ARN de hojas de plantas Arabidopsis de edades de 5 semanas, (calle 1), 6 semanas (calle 2) y 7 semanas (calle 3) como antes, se separaron en geles de formaldehído-agarosa desnaturalizantes al 1% y se inmovilizaron en membranas de nailon. Se usó el ADNc de DHS inducido por senescencia de longitud completa de Arabidopsis marcado con ^{32}P-dCTP usando un kit de cebador aleatorio (Boehriger Mannheim) para hibridar con los filtros (7 x 10^{7} cpm). Los filtros se lavaron una vez con 1X SSC, SDS al 0,1% a temperatura ambiente y 3 veces con 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC. Los filtros se secaron y se expusieron a película de rayos X durante una noche a -70ºC. Los resultados se muestran en la figura 11.

Hibridación de transferencia Northern de ARN de clavel

Se aisló ARN de pétalos de plantas de clavel en diferentes fases de desarrollo de la flor, es decir, flores en capullos apretados, (calle 1), empezando a abrirse (calle 2), flores completamente abiertas (calle 3), flores con pétalos enrollados hacia dentro (calle 4) como antes, se separaron en geles de formaldehído-agarosa desnaturalizantes al 1% y se inmovilizaron en membranas de nailon. Se usó el ADNc de DHS inducido por senescencia de longitud completa del clavel marcado con ^{32}P-dCTP usando un kit de cebador aleatorio (Boehriger Mannheim) para hibridar con los filtros (7 x 10^{7} cpm). Los filtros se lavaron una vez con 1X SSC, SDS al 0,1% a temperatura ambiente y 3 veces con 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC. Los filtros se secaron y se expusieron a película de rayos X durante una noche a -70ºC. Los resultados se muestran en la figura 12.

Ejemplo 2 Inducción con sorbitol del gen DHS inducido por senescencia del tomate

Se trataron hojas de tomate con sorbitol 2 M en una cámara cerrada durante 6 horas. Se extrajo el ARN de las hojas tratadas con sorbitol como sigue.

Se trituraron las hojas (5 g) en nitrógeno líquido. El polvo triturado se mezcló con 30 ml de tampón de guanidinio (isotiocianato de guanidinio 4 M, NaOAc 2,5 mM pH 8,5, \beta-mercaptoetanol al 0,8%). La mezcla se filtró a través de 4 capas de estopilla y se centrifugó a 10.000 Xg a 4ºC durante 30 minutos. Después, el líquido sobrenadante se sometió a centrifugación en gradiente de densidad con cloruro de cesio a 26.000 Xg durante 20 horas. El ARN sedimentado se aclaró con etanol al 75%, se volvió a suspender en 600 \mul de agua tratada con DEPC y el ARN se hizo precipitar a -70ºC con 0,75 ml de etanol al 95% y 30 \mul de NaOAc 3 M. Se fraccionaron 10 \mug de ARN en un gel de formaldehído-agarosa desnaturalizante al 1,2% y se transfirieron a una membrana de nailon. Se usó ADNc de DHS de longitud completa marcado con ^{32}P-dCTP cebado aleatoria miente (SEQ ID NO: 1) para hibridar la membrana a 42ºC durante una noche. Después, la membrana se lavó una vez en 1X SSC que contenía SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 minutos y 3 veces en 0,2X SSC que contenía SDS al 0,1% a 65ºC durante 15 minutos cada uno. La membrana se expuso a película de rayos X durante 1 noche a -70ºC.

Los resultados se muestran en la figura 8. Como puede verse, se ha inducido la transcripción de DHS en las hojas mediante el sorbitol.

Ejemplo 3 Inducción del gen de DHS del tomate en flores senescentes

Se recogieron capullos de flores cerradas y abiertas, y flores senescentes de plantas de tomate, y se aisló ARN como en el ejemplo 2. Se fraccionaron 10 \mug de ARN en un gel de formaldehído-agarosa desnaturalizante al 1,2% y se transfirieron a una membrana de nailon. Se usó ADNc de DHS de longitud completa marcado con ^{32}P-dCTP cebado aleatoria miente (SEQ ID NO: 1) para hibridar la membrana a 42ºC durante una noche. Después, la membrana se lavó una vez en 1X SSC que contenía SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 minutos y después 3 veces en 0,2X SSC que contenía SDS al 0,1% a 65ºC durante 15 minutos cada uno. La membrana se expuso a película de rayos X durante 1 noche a -70ºC.

Los resultados se muestran en la figura 6. Como puede verse, se ha inducido la trascripción de DHS en flores senescentes.

Ejemplo 4 Inducción del gen de DHS del tomate en frutos en maduración

Se aisló ARN de frutos en la fase de color inicial, rosas y maduros como en el ejemplo 2. Se fraccionaron 10 \mug de ARN en un gel de formaldehído-agarosa desnaturalizante al 1,2% y se transfirieron a una membrana de nailon. Se usó ADNc de DHS de longitud completa marcado con ^{32}P-dCTP cebado aleatoriamente (SEQ ID NO: 1) para hibridar la membrana a 42ºC durante una noche. Después, la membrana se lavó una vez en 1X SSC que contenía SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 minutos y después 3 veces en 0,2X SSC que contenía SDS al 0,1% a 65ºC durante 15 minutos cada uno. La membrana se expuso a película de rayos X durante 1 noche a -70ºC.

Los resultados se muestran en la figura 7. Como puede verse, la trascripción de DHS en frutos maduros, rojos es fuerte, justo antes del inicio de la senescencia que conduce al deterioro.

Ejemplo 5 Inducción del gen DHS inducido por senescencia del tomate por frío

Se expusieron plantas de tomate en macetas (7-8 semanas de edad) a 6ºC durante 2 días, 3 días o 6 días en una cámara de crecimiento. El ciclo de luz se fijó para 8 horas de oscuridad y 16 horas de luz. Las plantas se volvieron a calentar volviéndolas a poner en un invernadero. Las plantas que no se volvieron a calentar se recogieron inmediatamente después de sacarlas de la cámara de crecimiento. Se extrajo el ARN de las hojas como sigue.

\newpage

Se trituraron hojas (5 g) en nitrógeno líquido. El polvo triturado se mezcló con 30 ml de tampón de guanidinio (isotiocianato de guanidinio 4 M, NaOAc 2,5 mM pH 8,5, \beta-mercaptoetanol al 0,8%).La mezcla se filtró a través de 4 capas de estopilla y se centrifugó a 10.000 Xg a 4ºC durante 30 minutos. Después, el líquido sobrenadante se sometió a centrifugación en gradiente de densidad con cloruro de cesio a 26.000 Xg durante 20 horas. El ARN sedimentado se aclaró con etanol al 75%, se volvió a suspender en 600 ml de agua tratada con DEPC y el ARN se hizo precipitar a -70ºC con 0,75 ml de etanol al 95% y 30 ml de NaOAc 3 M. Se fraccionaron 10 \mug de ARN en un gel de formaldehído-agarosa desnaturalizante al 1,2% y se transfirieron a una membrana de nailon. Se usó ADNc de DHS de longitud completa marcado con ^{32}P-dCTP cebado aleatoriamente (SEQ ID NO: 1) para hibridar la membrana a 42ºC durante una noche. Después, la membrana se lavó una vez en 1X SSC que contenía SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 minutos y 3 veces en 0,2X SSC que contenía SDS al 0,1% a 65ºC durante 15 minutos cada uno. La membrana se expuso a película de rayos X durante 1 noche a -70ºC.

Los resultados se muestran en la figura 9. Como puede verse, se ha inducido la transcripción de DHS en hojas por exposición a temperatura fría y posterior recalentamiento, y la transcripción potenciada se correlaciona con el daño por el frío medido como pérdidas de agua en la membrana.

Ejemplo 6 Generación de un producto de PCR de Arabidopsis usando cebadores basados en la secuencia genómica de Arabidopsis no identificada

Se generó por PCR una secuencia de DHS inducido por senescencia de longitud parcial a partir de un molde de ADNc de Arabidopsis, usando una pareja de cebadores de oligonucleótidos diseñados a partir de la secuencia genómica de Arabidopsis. El cebador 5' es un oligonucleótido de 19 bases que tiene la secuencia 5'-GGTGGTGTT
GAGGAAGATC (SEQ ID NO: 7); el cebador 3' es un oligonucleótido de 20 bases que tiene la secuencia, GGTG
CACGCCCTGATGAAGC-3' (SEQ ID NO: 8). Se llevó a cabo como sigue una reacción en cadena de la polimerasa usando el sistema de PCR de alta fidelidad expandido (Boehringer Mannheim) y una genoteca de ADNc de hojas senescentes de Arabidopsis como molde.

\vskip1.000000\baselineskip

Componentes de la reacción:

ADNc

1 \mul (5x10^{7} ufp)

dNTP (10 mM cada uno)

1 \mul

MgCl_{2} (5 mM) + 10x tampón

5 \mul

Cebadores 1 y 2 (100 \muM cada uno)

2 \mul

ADN polimerasa de alta fidelidad expandida

1,75 U

Volumen de reacción

50 \mul

\vskip1.000000\baselineskip

Parámetros de reacción:

94ºC durante 3 min

94ºC /1 min, 58ºC /1 min, 72ºC 12 min, durante 45 ciclos

72ºC durante 15 min

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Ejemplo 7 Aislamiento de ADN genómico y análisis Southern

Se extrajo ADN genómico de hojas de tomate triturando 10 gramos de tejido de hojas de tomate hasta un polvo fino en nitrógeno líquido. Se añadieron 37,5 ml de una mezcla que contiene 25 ml de tampón de homogeneización [Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, EDTA 100 mM, NaCl 250 mM, sarcosil al 1%, 2-mercaptoetanol al 1%, RNasa 10 \mug/ml y
12,5 ml de fenol) previamente calentados a 60ºC, al tejido triturado. La mezcla se agitó durante 15 minutos. Se añadieron 12,5 ml adicionales de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) a la mezcla y se agitó durante otros 15 minutos. La mezcla se centrifugó y la fase acuosa se volvió a extraer con 25 ml de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Los ácidos nucleicos se recuperaron por precipitación con 15 ml de isopropanol a temperatura ambiente. El precipitado se volvió a suspender en 1 ml de agua.

El ADN genómico se sometió a digestión con enzimas de restricción como sigue:

Se hicieron reaccionar 10 \mug de ADN genómico, 40 \mul de 10X tampón de reacción y 100 U de enzima de restricción (XbaI, EcoRI, EcoRV o HinDIII) durante 5 a 6 horas en un volumen total de reacción de 400 \mul. La mezcla después se extrajo con fenol y se hizo precipitar con etanol. El ADN digerido se sometió a electroforesis en gel de agarosa en un gel de agarosa al 0,8% a 15 voltios durante aproximadamente 15 horas. El gel se sumergió en tampón de desnaturalización [87,66 g de NaCl y 20 g de NaOH/litro] durante 30 minutos con agitación suave, se aclaró en agua destilada y se sumergió en tampón de neutralización [87,66 g de NaCl y 60,55 g de Tris-HCl, pH 7,5/litro] durante 30 minutos con agitación suave. El ADN se transfirió a una membrana de nailon Hybond-N^{+} por transferencia capilar.

La hibridación se llevó a cabo durante una noche a 42ºC usando 1 x 10^{6} cpm/ml de ADNc de DHS de longitud completa marcado con ^{32}P-dCTP o región no codificante 3' del clon de ADNc de DHS. La prehibridación y la hibridación se llevaron a cabo en tampón que contenía formamida al 50%, 6X SSC, 5X disolución de Denhardt, SDS al 0,1% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 mg/ml. La membrana se prehibridó durante 2 a 4 horas; la hibridación se llevó a cabo durante una noche.

Tras completarse la hibridación, las membranas se aclararon a temperatura ambiente en 2X SSC y SDS al 0,1% y después se usaron en 2X SSC y SDS al 0,1% durante 15 minutos y 0,2X SSC y SDS al 0,1% durante 15 minutos. La membrana después se expuso a película de rayos X a -80ºC durante una noche. Los resultados se muestran en la figura 5.

Ejemplo 8 Aislamiento de un gen de eIF-5A inducido por senescencia de Arabidopsis

Se obtuvo por PCR un clon de ADNc de longitud completa del gen de eIF-5A inducido por senescencia expresado en hojas de Arabidopsis, usando una genoteca de ADNc de hojas senescentes de Arabidopsis como molde. Inicialmente, los productos de la PCR correspondientes a los extremos 5' y 3' del gen se hicieron usando un cebador secuencia arriba degenerado <AAARRYCGMCCYTGCAAGGT> (SEQ ID NO: 17) emparejado con el vector del cebador T7 <AATACGACTCACTATAG> (SEQ ID NO: 18), y un cebador secuencia abajo degenerado <TCYTTNCCYTCMKCTAAHCC> (SEQ ID NO: 19) emparejado con el vector del cebador T3 <ATTAACCC
TCACTAAAG> (SEQ ID NO: 20). Los productos de la PCR se subclonaron en pBluescript para la secuenciación. Después se obtuvo el ADNc de longitud completa usando un cebador específico de 5' <CTGTTACCAAAAAATCTGTA
CC> (SEQ ID NO: 21) emparejado con un cebador específico de 3' <AGAAGAAGTATAAAAACCATC> (SEQ ID NO: 22), y se subclonó en pBluescript para la secuenciación.

Ejemplo 9 Aislamiento de un gen de eIF-5A inducido por senescencia del fruto del tomate

Se obtuvo por PCR un clon de ADNc de longitud completa del gen de eIF-5A inducido por senescencia expresado en el fruto del tomate, usando una genoteca de ADNc del fruto del tomate como molde. Inicialmente, los productos de la PCR correspondientes a los extremos 5' y 3' del gen se hicieron usando un cebador secuencia arriba degenerado (SEQ ID NO: 17) emparejado con el vector del cebador T7 (SEQ ID NO: 18), y un cebador secuencia abajo degenerado (SEQ ID NO: 19) emparejado con el vector del cebador T3 (SEQ ID NO: 20). Los productos de la PCR se subclonaron en pBluescript para la secuenciación. Después se obtuvo el ADNc de longitud completa usando un cebador específico de 5' <AAAGAATCCTAGAGAGAGAAAGG> (SEQ ID NO: 23) emparejado con el cebador vector T7 (SEQ ID NO: 18), y se subclonó en pBluescript para la secuenciación.

Ejemplo 10 Aislamiento de un gen de eIF-5A inducido por senescencia del clavel

Se obtuvo por PCR un clon de ADNc de longitud completa del gen de eIF-5A inducido por senescencia expresado en flores de clavel, usando una genoteca de ADNc de flores senescentes de clavel como molde. Inicialmente, los productos de la PCR correspondientes a los extremos 5' y 3' del gen se hicieron usando un cebador secuencia arriba degenerado (SEQ ID NO: 17) emparejado con el vector del cebador T7 (SEQ ID NO: 18), y un cebador secuencia abajo degenerado (SEQ ID NO: 19) emparejado con el vector del cebador T3 (SEQ ID NO: 20). Los productos de la PCR se subclonaron en pBluescript para la secuenciación. Después se obtuvo el ADNc de longitud completa usando un cebador específico de 5' <TTTTACATCAATCGAAAA> (SEQ ID NO: 24) emparejado con un cebador específico de 3' <ACCAAAACCTGTGTTATAACTCC> (SEQ ID NO: 25), y se subclonó en pBluescript para la secuenciación.

Ejemplo 11 Aislamiento de un gen DHS inducido por senescencia de Arabidopsis

Se obtuvo un clon de ADNc de longitud completa del gen DHS inducido por senescencia expresado en hojas de Arabidopsis por cribado de una genoteca de ADNc de hojas senescentes de Arabidopsis. La secuencia de la sonda (SEQ ID NO: 26) que se usó para el cribado se muestra en la figura 38. La sonda se obtuvo por PCR usando la genoteca de ADNc de hojas senescentes como molde y cebadores (indicados como regiones subrayadas en la figura 38) diseñados a partir de la secuencia genómica no identificada (AB017060) en GenBank. El producto de la PCR se subclonó en pBluescript para la secuenciación.

Ejemplo 12 Aislamiento de un gen DHS inducido por senescencia de clavel

Se obtuvo un clon de ADNc de longitud completa del gen DHS inducido por senescencia expresado en pétalos de clavel por cribado de una genoteca de ADNc de pétalos senescentes de clavel. La secuencia de la sonda (SEQ ID NO: 27) que se usó para el cribado se muestra en la figura 39. La sonda se obtuvo por PCR usando la genoteca de ADNc de pétalos senescentes como molde y cebadores degenerados (secuencia arriba: 5' TTG ARG AAG ATY CAT MAA RTG CCT 3') (SEQ ID NO: 28); secuencia abajo: 5' CCA TCA AAY TCY TGK GCR GTG TT 3') (SEQ ID NO: 29)). El producto de la PCR se subclonó en pBluescript para la secuenciación.

Ejemplo 13 Transformación de Arabidopsis con DHS de Arabidopsis de longitud completa o la región 3' en orientación antisentido

Se transformaron agrobacterias con el vector binario, pKYLX71, que contenía la secuencia de ADNc de DHS de Arabidopsis inducido por senescencia de longitud completa o el extremo 3' del gen de DHS (SEQ ID NO: 30) (figura 36), ambos expresados en la configuración antisentido, bajo la regulación del promotor 35S doble. Las plantas Arabidopsis se transformaron con las agrobacterias transformadas por infiltración a vacío, y se seleccionaron las semillas transformadas de las plantas T_{o} resultantes con ampicilina.

Las figuras 21 a 24 son fotografías de las plantas Arabidopsis transformadas, que muestran que la expresión del gen DHS o el extremo 3' del mismo en orientación antisentido en las plantas transformadas da como resultado una mayor biomasa, p. ej., hojas más grandes y tamaño mayor de la planta. La figura 25 ilustra que las plantas Arabidopsis transgénicas tienen mayor rendimiento de semillas.

Ejemplo 14 Transformación de plantas de tomate con DHS de tomate de longitud completa o la región 3' en orientación antisentido

Se transformaron agrobacterias con el vector binario, pKYLX71, que contenía la secuencia de ADNc de DHS inducido por senescencia del tomate de longitud completa o el extremo 3' del gen de DHS (SEQ ID NO: 31) (figura 37), ambos expresados en la configuración antisentido, bajo la regulación del promotor 35S doble. Se transformaron explantes de hojas de tomate con estas agrobacterias, y se generaron callos y plántulas transformadas y se seleccionaron por procedimientos de cultivo tisular. Las plántulas transformadas se hicieron crecer en plantas T_{1} que producían frutos maduros en condiciones de invernadero.

Las figuras 26 a 35 son fotografías que muestran que la expresión reducida del gen DHS inducido por senescencia del tomate en plantas transformadas da como resultado una mayor biomasa, p. ej., hojas más grandes y plantas más grandes como se ve en las plantas Arabidopsis transformadas, así como un retraso del ablandamiento y deterioro del fruto del tomate.

<110> Thompson, John E.

\hskip1cm Wang, Tzann-Wei

\hskip1cm Lu, Dongen Lilly

\vskip0.400000\baselineskip

<120> ADN QUE CODIFICA UNA DESOXIHIPUSINA SINTASA DE PLANTA, PLANTAS TRANSGÉNICAS Y UN PROCEDIMIENTO PARA CONTROLAR LA MUERTE CELULAR PROGRAMADA EN PLANTAS

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 10799/9

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 09/348.675

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1999-07-06

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1609

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lycopersicon sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (54..1196)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DHS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

1

2

3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 381

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lycopersicon sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DHS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

4

5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtctagaag gtgctcgtcc tgat

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactgcagtc gacatcgatt tttttttttt tttt

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2272

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (68..265, 348..536, 624..842, 979..1065, 1154..1258, 1575..1862)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

6

7

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 362

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis sp.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

9

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtggtgttg aggaagatc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgcacgcc ctgatgaagc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1660

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Dianthus sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DHS

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (256)...(1374)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

11

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 373

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Dianthus sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

13

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 780

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lycopersicon sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> eif-5A

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (43)..(522)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

15

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lycopersicon sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> eif-5A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

17

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 812

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Dianthus sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> eif-5A

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (67)..(546)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

19

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Dianthus sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> eif-5A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

21

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 702

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> eif-5A

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (56)..(529)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

23

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> eif-5A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaarrycgmc cytgcaaggt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatacgactc actatag

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> las bases "n" representan a, t, c, g, otras o desconocidas

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcyttnccyt cmkctaahcc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attaaccctc actaaag

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgttaccaa aaaatctgta cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaagaagta taaaaaccat c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaagaatcct agagagagaa agg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttttacatca atcgaaaa

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accaaaacct gtgttataac tcc

\hfill

23

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 581

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Arabidopsis sp.

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DHS

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(579)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 522

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Dianthus sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DHS

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(521)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgargaaga tycatmaart gcct

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatcaaayt cytgkgcrgt gtt

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 484

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DHS

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(112)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 559

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lycopersicon sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DHS

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(156)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> las bases "n" representan a, t, c, g, otras o desconocidas

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DHS

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Dianthus sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DHS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

31

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DHS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Lycopersicon sp.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DHS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

34

35

Claims (18)

1. Un procedimiento para inhibir la expresión de la desoxihipusina sintasa endógena inducida por senescencia en una planta, comprendiendo dicho procedimiento

(a) integrar en el genoma de una planta un vector que comprende

(i)

secuencias de nucleótidos antisentido sustancialmente complementarias a

(1)

una parte correspondiente de una cadena de una molécula de ADN seleccionada del grupo que consiste en:

(aa)

una molécula de ADN que hibrida en condiciones de restricción alta con la SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 9 y que codifica una desoxihipusina sintasa;

(bb)

un derivado funcional de la molécula de ADN de (aa) que hibrida en condiciones de restricción altas con la SEQ ID NO: 1 y/o la SEQ ID NO: 9 y que codifica una desoxihipusina sintasa;

(cc)

un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 9; y

(dd)

una molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 10,

(2)

una parte correspondiente de una cadena de una molécula de ADN, en la que dicha molécula de ADN hibrida en condiciones de alta restricción con el SEQ ID NO: 5 que codifica la desoxihipusina sintasa endógena inducida por senescencia, o

(3)

una parte correspondiente de una secuencia de ARN codificada por una molécula de ADN de (1) o (2); y

(ii)

secuencias reguladoras operativamente unidas a las secuencias de nucleótidos antisentido de modo que las secuencias de nucleótidos antisentido estén expresadas en una célula de planta en la que está transformada; y

(b) hacer crecer dicha planta, de modo que dichas secuencias de nucleótidos antisentido se transcriben y se unen a dicha secuencia de ARN, de modo que se inhibe la expresión del gen de desoxihipusina sintasa endógena inducida por senescencia.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la parte del ADN o la parte del ARN de la que la secuencia de nucleótidos antisentido es sustancialmente complementaria comprende las secuencias 5' no codificante o 3' no codificante y/o secuencias no codificantes.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la secuencia de nucleótidos antisentido es sustancialmente complementaria a la SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 30.

4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha inhibición da como resultado la senescencia alterada de la planta, mayor resistencia de dicha planta a la senescencia inducida por estrés medioambiental y/o inducida por patógenos, mayor biomasa de dicha planta, ablandamiento y/o deterioro del fruto en dicha planta retrasados, senescencia relacionada con la edad y/o el estrés medioambiental en dicha planta alterados, envejecimiento de semillas retrasado o inhibido o mayor rendimiento de semillas de dicha planta.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las secuencias reguladoras comprenden un promotor constitutivo, un promotor activo específico de tejido en la planta o un promotor activo inducido por senescencia en la planta.

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha planta se selecciona del grupo que consiste en plantas que llevan frutos, plantas que florecen, vegetales, plantas de cultivo agronómico y especies forestales.

7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la planta es una planta de tomate.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las secuencias reguladoras comprenden un promotor y una región de terminación de la transcripción.

\newpage

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 u 8, en el que las secuencias reguladoras comprenden un promotor constitutivo, un promotor específico de tejido de planta, un promotor de planta inducida por senescencia o un promotor vírico.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que las secuencias reguladoras comprenden además un promotor constitutivo.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, 8, 9 ó 10, en el que dicho vector además comprende

(a) secuencias de nucleótidos antisentido sustancialmente complementarias de (1) una parte correspondiente a una cadena de una molécula de ADN como se define en la reivindicación 1, o (2) una parte correspondiente de una secuencia de ARN codificada por dicha molécula de ADN; y

(b) secuencias reguladoras operativamente unidas a las secuencias de nucleótidos antisentido, de modo que las secuencias de nucleótidos antisentido se expresan en una célula de planta en la están transformadas.

12. Un procedimiento para inhibir la expresión de un gen endógeno de desoxihipusina sintasa inducido por senescencia en una célula de planta, comprendiendo dicho procedimiento

(a) integrar en el genoma de al menos una célula de la planta un vector que comprende

(i)

una molécula de ADN como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1(a)(i)(1)(aa) a 1(a)(i)(1)(dd) o una molécula de ADN que hibrida en condiciones de restricción alta con la SEQ ID NO: 5 que codifica una desoxihipusina sintasa; y

(ii)

secuencias reguladoras operativamente unidas a la molécula de ADN de modo que la desoxihipusina sintasa se expresa en una célula de planta en la que está transformada,

en el que dicha molécula de ADN de dicho vector codifica una desoxihipusina sintasa exógena inducida por senescencia; y

(b) hacer crecer dicha planta, de modo que dicha molécula de ADN es sobreexpresada y el gen endógeno de la desoxihipusina sintasa inducido por senescencia es inhibido por la desoxihipusina sintasa inducida por senescencia exógena.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que las secuencias reguladoras comprenden un promotor constitutivo.

14. Un procedimiento para producir una planta que tiene un nivel reducido de desoxihipusina sintasa inducida por senescencia, que comprende:

(a) transformar una planta con un vector como se describe en la reivindicación 1(a) o 12(a);

(b) dejar que la planta crezca al menos a la fase de plántula;

(c) ensayar en la planta o plántula transformada la actividad de DHS alterada inducida por senescencia; y

(d) seleccionar y hacer crecer una planta que tiene la actividad de DHS alterada inducida por senescencia comparada con una planta no transformada.

15. Una planta y progenie de la misma que se puede obtener por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

16. Una célula de planta derivada de una planta o progenie de la misma, de la reivindicación 15.

17. Una planta y progenie de la misma, en la que la planta se genera a partir de una célula de planta de la reivindicación 16.

18. Un parte de planta derivada de una planta o progenie de acuerdo con la reivindicación 17.