CN1636056A - 拟南芥属(Arabidopsis)用于生产人类及动物的治疗及诊断用蛋白质的商业用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供利用拟南芥属(Arabidopsis)的多种生长参数，使于经过控制的室内环境下生长致密植物族群，用以收获生物物质及分离蛋白质，特别是适合供医药用途的重组蛋白质。

Description

拟南芥属(Arabidopsis)用于生产人类及动物的治疗及 诊断用蛋白质的商业用途

相关申请案

本案遵照35U.S.C.§119(e)请求美国临时申请案第60/308,379号，申请日2001年7月27日的优先申请权，该案以引用方式并入此处。

技术领域

本发明涉及使用鼠耳芥大量制造蛋白质。

背景技术

大量制造蛋白质为有效探勘人类使用的重组基因产物例如治疗性蛋白质所需。虽然微生物系统经常就转殖以及制造转化细胞速度上提供明白优势，但由实验室规模扩大至大型发酵容器的规模扩增上经常有困难。由于细菌与真核生物间的多种翻译后处理步骤不同，故有某些蛋白质无法于原核生物系统制造。

哺乳类及昆虫细胞培养广泛用于制造多种蛋白质及最显著的优势可能是翻译后处理。但培养基、设备以及培养条件苛刻的趋势制造成本增高，显然为此种系统的劣势所在。此种系统的另一项缺点为可能携带有对人类健康构成威胁的病毒粒子或朊病毒。

也曾经描述转基因动物于乳汁、排泄于尿液、或透过鸟类的卵以制造用来制造人类蛋白质。类似动物细胞培养，转基因动物须提供具有所需翻译后修饰的蛋白质。但转基因动物的制造缓慢、维持困难、不容易大规模养育。制造成本相当高以及同样的纯化问题构成此种系统的问题。

使用植物作为重组蛋白质表达系统或「生物反应器」是在基于细菌、酵母菌、昆虫、动物及细胞制造系统以外的具有吸引力的替代的系统。植物制造蛋白质有多种好处，使用植物于制造转基因蛋白质正获得广泛证实。

植物制造系统容易纯化，不含动物病原性污染物。对大量植物种属存在有转化方法。当使用多种种子植物及农作物时，对于收获以及处理大量材料已经存在有方法及基础架构。将规模放大相当直接，只要单纯基于扩大制造种子以及栽种面积即可。如此生产成本减低，哺乳动物的病毒或者朊病毒污染风险下降，原料及制造设备成本比透过哺乳动物细胞培养或转基因动物来制造类似材料的设备投资需求相对较低。植物通常只有单一显著缺点，该缺点系在翻译后蛋白质的糖基化作用。但于许多案例已经验证植物的替代碳水化合物修改不会对糖蛋白造成有害影响或非期望的免疫原性质。

已经发展出多种制造系统用以于植物中表达的蛋白质。包括于油体表达的蛋白质(Rooijen等人，109植物生理学1353-61(1995)；Liu等人，3分子育种463-70(1997))透过根瘤菌表达的蛋白质(Borisjuk等人，17自然生物技术466-69(1999))于种子表达的蛋白质(Hood等人，3分子育种291-306(1997)；Hood等人，透过高等植物生物工程的化学品(编辑Shahidi等人)普雷能(Plenum)出版公司，127-148(1999)；Kusnadi等人，56生物技术及生物工程473-84(1997)；Kusnadi等人，60生物技术及生物工程44-52(1998)；Kusnadi等人，14生物技术进展149-55(1998)；Witcher等人，4分子育种301-12(1998))，于病毒表面的抗原决定簇(Verch等人，220免疫方法期刊69-75(1998)；Brennan等人，73病毒学期刊930-38(1999)；Brennan等人，145微生物学211-20(1999))以及于马铃薯块茎稳定表达的蛋白质(Arakawa等人，6转基因研究403-13(1997)；Arakawa等人，16自然生技292-97(1998)；Tacket等人，4自然药物607-09(1998))。重组蛋白质也可将目标锁定于种子、叶绿体或分泌来识别可获得最高度蛋白质蓄积程度的所在位置。

多方面努力探勘植物，意图对蛋白质制造问题获得生物技术的解决之道，已经将目光焦点集中于使用主要农作物。大半重点放在生物物质的制造，农业已经发展出全球最大型的生物物质制造系统，亦即农耕。过去7-8年间于农作物有许多外来蛋白质(例如疫苗、单株抗体、抗生物素及其它)范例。明白验证农业生产性植物可作为制造外来蛋白质的相当具有成本效益的手段。大多数情况下，对照于由典型发酵技术所得的产品，由此种植物制造产品的成本估计指出，使用植物可让成本降低50至100倍。

当考虑可栽种用来制造特定产物的全部土地面积时，确实基于植物的制造系统的产能显然较高。但至今为止此种系统及办法尚未能排除显著瑕疵及缺点。由于此种系统系用来制造供医药用途的高度经过调节的生物物质，但其最严重的缺点之一为户外制造系统本质上未经调节。由于户外条件多变，难以发展出一种有效符合CGMP方法，或可能难以在户外生长此种经过基因修改的有机体(GMOs)。

过去数十年来，植物生技研究已经被初步发现使用一种小型而生长快速的杂草植物拟南芥属(水芹)大为推动其进展。此种植物用于实验室研究有多项优异品质。拟南芥属小型、生命周期短、种子产生能力大量、有相对小而不复杂的基因体，且容易藉多种方法做转化，已经有多种突变变异株。过去十年来拟南芥属基因体已经完全被测序，代表第一种高等植物的里程碑。由于这些理由，拟南芥属变成植物生技常用的研究有机体。但普遍了解此种小型杂草植物只能作为研究模式。

如此拟南芥属通常只在研究室内探勘。对于特定农作物研究工程，由拟南芥属种属获得的知识典型用来更完整了解全球主要食物作物及园艺作物，且该项了解应用于修改及改进该等作物种属。

发明概述

制造生物医药或诊断材料时，有多项关键因素需要考虑包括生长条件、产品制造及调节需求。根据本发明方法提供一种高度可靠而快速的系统，该系统可由早期的试验阶段及雏型阶段放大规模直到全规模制造重组蛋白质。

很少有植物像拟南芥属(Arabidopsis)般适合快速产生植株及种子。就一方面而言，本发明提供一种经由筛选可表达高产率蛋白质的基因构建体及转基因植物，而由拟南芥属大规模制造重组蛋白质的方法。任一种适当技术皆可使用例如土壤杆菌(Agrobacterium)花浸渍或真空浸润转化程序。较好由转化至转基因种子所需时间少于10周，例如约8至10周。另一方面，使用快速暂时性表达分析系统，例如叶及幼苗浸润或原生质体电穿孔，而在其制造的数日内试验新颖基因构建体的适当性质。

用来导入此种重组基因构建体的载体包括有用序列，这些有用序列包括但非限于：有助于特定整合于选定的基因体所在位置的位置特异性重组位置，使用的可选择标记(例如BAR、NPTII等)及/或其它可筛选标记例如GFP(绿萤光蛋白质或其突变形式或修改形式)、虫萤光素酶或GUS(β葡萄糖醛酸酶)。较好重组构建体包含感兴趣蛋白质的编码核酸序列、以可操作方式连接至启动子及/或一或多个基因调节元件例如IRES(内部核糖体进入位置)。

一方面，突变重组蛋白质藉随机突变发生、或藉合理设计、或藉这些技术的组合筛选而识别构建体，该构建体的蛋白质具有例如稳定性增高以及活性增高等期望性质。表达此种蛋白质的重组构建体较好是在暂时性检定分析平行于可表达野生性蛋白质形式的构建体一起试验。

另一种产生可用于此类型生物「类似物」试验的变异株的方式系改变制造系统中影响终产物改变的某些参数。此种方式方便于拟南芥属达成，使用既存的拟南芥属变种、或产生植物的蛋白质处理特性变更的突变种。如此任何增加至制造新蛋白质系统的DNA信息皆可依据宿主植物的能力做些微变更，来进行某些翻译或翻译后修饰。

糖基化作用属于与此处讨论特别有关的范例。已知于糖基化作用期间将糖添加至蛋白质在动植物间有别。核心聚糖大致相同，但主要差异在于添加木糖以及a-1-3岩藻糖以及不含末端唾液酸。尚未确定何种(若有)以及多少差异将有关植物产物用作为医药分子的功效及安全性。有足够参考文献提示此种变化对活性及安全性等并不重要。已经有一组拟南芥属突变株可用于制造例如具有不同聚糖支链的蛋白质，此属于本发明的系统性办法的独特优点。例如得自拟南芥属野生型及多种突变株及基因工程形式的蛋白质可使用试管功能检定分析平行试验，使鉴别拟南芥属突变株或基因工程形式制造医药可接受性重组蛋白质产物的能力。

可使用的突变株种系的其它范例包括但非限于蛋白酶缺乏种系，以及比较其它拟南芥属种系的平均生物物质(特别叶部生物物质)增加的突变株。此处注意力焦点集中在提高产出量，并不一定制造其它产品形式。

如此，本发明的较佳方面为于制造稳定转基因种系前，决定何种构建体、何种突变株形式以及何种宿主系统背景可产生最具有药理功用的预定蛋白质形式。

检视本发明的特佳方面的方式始于公知拟南芥属工作停止之处。过去拟南芥属被用来确定某些蛋白质可于植物体表达、或提供有关特定表达载体特征资料的研究模式。蛋白质及载体通常于商业上系在不同的植物系统探索。相反地，本发明提供预选定期望表达构建体以及以大规模于拟南芥属表达该构建体，利用于制造前检定分析所识别的最理想构建体及拟南芥属种系(如前述)的方法及系统。于较佳方面，本发明包含识别可制造最理想数量及/或形式蛋白质的植物；以及于该植物的子代、克隆相关植物、或实质上基因相同植物制造大规模数量的蛋白质。

最好选用的拟南芥属种系及使用的表达系统系设计成对每株植物可获得最高蛋白质产量。包括于基因之一序列使用多数拷贝，以及表达载体，该表达载体尽可能如同植物的许多部分可制造蛋白质产出量。然后将此种载体引进拟南芥属，诱导表达，同时植物是于经过设计成可获得最大植物生长以及蛋白质最大表达的条件下生长。虽然以可获得最大产量的最理想系统为最佳，但于本发明的此一方面的范围仍然考虑经济可行的低于最理想产量的系统。

通常根据本发明的植物系于有利于叶及根生物物质制造的条件下生长，甚至可能牺牲掉种子产量，使产量减少、或在种子产生以及成熟之前即收获植物。

本发明的一方面使用土壤杆菌来导入由前述检定分析选出的最理想载体及构建体，用于导引入植物细胞，以及用于生长及制造可稳定表达感兴趣的重组蛋白质的植物及/或种子。较好使用浸润方法例如真空浸润方法。

在一段极短时间且在极小的空间中，即可能制造数以百计的T1转基因种系，其可能在数周内产生数以千计的个别推定的T1转基因种系。由这些数以千计的推定转基因T1植物，进行筛选来评估何种种系具有预定的转基因表达。然后让这些种系自我授粉，约在8周时间产生T2族群。使用标准孟德尔遗传学作为指南，制造的T2世代正常对单点插入应该有25％同种接合转基因种系。然后将这些种系快速扩大规模制造大量「纯种」同种接合种子。

希望植物生长规模远超过研究使用的规模。例如于特定植物生长隔间例如于温室或生长室内，拟南芥属在任何特定时间乃唯一生长的植物。但在该温室中的每株植物不可能含有与获得确切相同蛋白质最大产量确切相同目标确切相同的构建体。经由使用相同表达系统生长设计用来获得最大蛋白质产出量的植物，温室可用于本发明。

本发明的特佳具体实施例中，以此种规模持续制造一段长时间，例如数周、数月或数年。如此即使有人考虑将整个温室种植含有单一构建体可表达单一研究目的蛋白质的拟南芥属，但无法只完成植物的一个生命周期，无法于确切相同条件下开始第二、第三、第四及第五次栽种，例如将温室的全部面积收成，然后一再地对温室的全部面积再度栽种相同类型的植物其可使用相同类型的表达系统来表达相同蛋白质。如此本发明的一方面涉及制造每英亩某种质量的蛋白质(若于二度空间生长)或每立方米某种质量的蛋白质(若以三度空间例如在生长室内以堆栈层生长)。

根据本发明的此一方面的特佳具体实施例中，持续以此种规模生长及/或至少经历6个月时间，结果可获得具有商业意义数量的蛋白质。

一方面，约20吋×20吋(400平方呎)的生长室用来当植物以单一水平层生长时约45至60日时间制造至少约4千克总量拟南芥属生物物质供收成。另一方面，植物生长超过一年。例如增加至少约六成，可在约45至60日每一生长期每一生长室制造约240千克植物生物物质。假定每年有6至8个生长/收成周期，假设中等表达约0.5％总可溶性蛋白质，则估计此种系统每年至少可获得约72至96克可纯化蛋白质。

如此一方面，本发明包含一种于适当条件下制造转基因拟南芥属种系的方法，达成至少约10千克总植物生物物质，以及由该总植物生物物质，可获得合理数量的可纯化基因工程蛋白质产品。较好经由增加栽种面积，增加总蛋白质中表示期望蛋白质的百分比，缩短获得某种生物物质及期望蛋白质所需时间或前述任一种组合可方便将该方法扩大规模，获得更大量产物。

本发明的特佳具体实施例为由拟南芥属制造期望蛋白质的方法。本发明也包含由这些方法衍生的蛋白质。这些方法包括提供特定多种拟南芥属的步骤，包括至少一个表达暗盒其可表达至少一种感兴趣的蛋白质。蛋白质可为非同源蛋白质或对植物而言为外来蛋白质。

详细描述

相反地，本发明中使用小型杂草植物拟南芥属作为蛋白质制造宿主。本发明提供可利用多种拟南芥属生长参数，使于经过控制的室内条件下生长致密植物的族群用于收获生物物质及分离蛋白质。就此方面而言，本发明提供每单位时间每单位面积或空间获得最大量植物材料生长的参数或输入的识别方法。

定义

对后文书面说明使用的特定术语提出下列各项定义。

如说明书及权利要求使用，单数形的「一」以及「该」除非于上下文中明白指示否则也包括复数形。例如「一个细胞」一词包括多个细胞也包括其混合物。「一种蛋白质」一词包括多种蛋白质。

「拟南芥属」一词用于此处表示完整植株或其各部分。本术语包括但非限制完整植株、植物细胞、植物器官、植物种子、原生质体、胼胝体、细胞培养以及任何一组植物细胞组织成为结构单元及/或功能单元。本术语结合或未结合任何特定类型的上列植物组织或本定义包含其它植物组织绝非意图排除任何其它类型的植物组织。

「植物细胞」一词用于此处包括于植物组织的植物细胞或植物组织以及培养中的植物细胞及原生质体、或分离或半分离细胞。「植物组织」包括经过分化以及未经分化的植物组织，包括但非限于根、茎、叶、花粉、种子、肿瘤组织以及多种其它类型的培养细胞例如单细胞、原生质体、胚细胞及胼胝体组织。植物组织可于植物体、或于器官、组织或细胞培养。

用于此处「植物材料」包括经过处理后的衍生物，包括但非限于：食品、食物、食物补充物、萃取物、浓缩物、丸剂、口含锭、咀嚼组合物、散剂、调配剂、糖浆剂、糖果剂、圆锭剂、胶囊剂及锭剂。

「筛选」一词通常表示识别具有已经被转化于植物的重组基因表达的细胞。通常筛选系用来选择经过成功地转化的种子(例如转基因种子)用于进一步栽培以及生成植物(换言之，制造转基因植物)。如下所述，为了改良识别转化株的能力，可能需要采用可选择或可筛选标记基因作为感兴趣的重组基因，或除了感兴趣的重组基因的外采用可选择或可筛选的标记基因。此种情况下，通常系经由将细胞、种子、植物或幼苗暴露于选定的作用剂而检定分析可能已经被转化的细胞、种子或植株；或可对植物的细胞、种子植株或组织筛选预定标记基因。例如转基因细胞、种子或植物可于选定条件下筛选，例如将种子或幼苗于含有选定作用剂例如抗生素(潮霉素、卡那霉素、巴龙霉素或巴斯塔(BASTA))的培养基生长种子或幼苗，成功转化的植物已经使用对此种选定作用剂有抗性的编码基因转化。

用于此处「多亚单位蛋白质」为含有多于一种分开多肽或蛋白质链彼此关联而形成单一球状蛋白质的蛋白质，此处至少两种分开多肽系由不同基因所编码。一较佳方面，多亚单位蛋白质包含至少抗体的免疫活性部分，如此可特别与抗原组合。例如多亚单位蛋白质包含抗体分子的重链及轻链或其部分。多重抗原组合蛋白质也可由不同结构基因编码来产生多价抗体。

以医药制品为例，「实质纯质」一词通常表示该产品为至少97％，更好至少99％，又更好至少99.99％纯质。

「间质流体」一词表示得自植物未由质膜(亦即细胞表面细胞膜)覆盖的全部区域所得的萃取物。该术语包括植物的非属于细胞内的全部流体、材料、区域或空间(其中细胞内定义为细胞内部的同义词)，包括通过此项处理未经显著细胞溶解而可由质膜释放出的分子。本术语的同义词为外质、或浆质、或胞间流体、或胞外流体。

「启动子」一词表示指示开始转录且位于结构基因5′端的核苷酸序列。通常需要启动子(但非经常性足够)驱动下游基因的表达。于非同源启动子/结构基因组合的组成中，结构基因系位于启动子的调节控制之下，故结构基因的表达系受启动子序列控制。启动子偏好位于结构基因上游，启动子距离转录起点位置的距离约略等于启动子与其于天然设计中距离其控制的基因间的距离。如业界已知，可忍受此种距离有些变化而未尚失启动子功能。用于此处「以可操作方式连接」一词表示启动子连结至编码区的连结方式让该编码区的转录系由该启动子所控制及调节。以可操作方式连接启动子至编码区的手段为业界众所周知。

「重组基因」或「重组核酸」为欲转化植物的外生性或非天然存在的基因/核酸。此种外来序列包括病毒、原核生物及真核生物序列。原核生物序列包括但非限于微生物序列(例如用于制造抗原，抗原可作为疫苗使用；病毒序列也可用于此项目的)。真核生物序列包括哺乳类序列，也包括得自非哺乳类甚至其它植物的序列。于一较佳方面，重组基因/核酸编码人类蛋白质。「重组基因」或「重组核酸」可为天然出现、化学合成、cDNA、突变、或任何这些序列的组合。

「融合蛋白质」为一种含有至少两种不同胺基酸序列连接于一多肽的蛋白质，此处该等胺基酸序列未天然表达成单一蛋白质。

用于此处「效应物分子」表示胺基酸序列例如蛋白质、多肽或肽，且包括但非限于调节因子、酶、抗体、毒素等。由效应物分子产生的期望效应的非限制例包括，但非限于细胞增殖或细胞死亡、引发免疫反应、或作为诊断目的的检测分子(例如融合物可编码萤光多肽如GFP、EGFP、BFP、YFP、EBFP等)。

用于此处「减低糖基化」表示比野生型种系拟南芥属的糖基化程度至少低10％的糖基化。

用于此处「经培养」或「培养」表示由种子生长至产生叶的拟南芥属。

用于此处「诊断性蛋白质」或「诊断试剂」表示一种蛋白质或多肽，其与生物分子的反应可用来诊断该生物分子是否存在。用于此处「与生物分子的反应」表示结合至生物分子、生物分子的催化、裂解或修改。一方面，诊断性蛋白质或试剂经直接或间接加标记，让其与生物分子的反应产生可测量的响应。根据本发明的诊断性蛋白质/试剂例如为抗体或其抗原结合片段。抗体可为双链或单链。若为双链抗体，则抗体链可编码于分开的顺反子、或编码作为多顺反子单元之一部份。

用于此处「效应物分子」表示胺基酸序列例如蛋白质、多肽或肽，且包括但非限于调节因子、酶、抗体、毒素等。由效应物分子产生的期望效应的非限制例包括，但非限于细胞增殖或细胞死亡、引发免疫反应、或作为诊断目的的检测分子(例如融合物编码萤光多肽如GFP、EGFP、BFP、YFP、EBFP等)。

用于此处「生物物质」表示由生长区段亦即生长隔间的特定区域分离的全部拟南芥属活存组织。较好此种生物物质为种子以外的定量组织。

拟南芥属种系

拟南芥属种系可由商业上购得，且例如可得自雷尔(Lehle)种子公司(sales@arabidopsis.com)以及各个储存中心例如拟南芥属生物研究中心(ABRC)(俄亥俄州立大学，美国俄亥俄州43210哥伦比亚尼尔大道1735号植物与动物学系大楼309室)、诺汀罕(Nottingham)拟南芥属储存中心(英国LE12 5RD，劳伯洛，撒坦伯尼顿(Sutton Bonnington)校园诺汀罕大学生物科学植物科学分部)。一方面使用野生型种系作为后述基因构建体的宿主背景(例如参考http：//www.arabidopsis.com/main/cat/seeds/wildtypes/lwl.html)。这些种系可含或未含标记使用来辅助选出转基因种系。

拟南芥属突变株制造其它形式蛋白质产物

由于有多种拟南芥属突变种系，因此也可取得且使用于特定路径上有缺陷的拟南芥属种系，结果制造出其它形式蛋白质。由于拟南芥属的基因体已经完全测序，故可识别、分离、或于特定基因及路径形成突变来达成期望效果。既有较佳突变株例如包括cg1及mur突变株，其具有较低度翻译后蛋白质糖基化程度。这些种系经由免除植物特异性蛋白质糖基化作用，有助于制造某种类型的蛋白质(亦即人类抗体或人类糖蛋白)。

目前未知糖化作用于植物制造生物物质的功效、安全性以及使用上扮演何种角色。内生植物糖蛋白以及于转基因植物表达的重组蛋白质的糖化模式上高度不一致。此种不一致情况可能受到植物生长阶段影响，以及受到特定生长条件例如温度和光影响。因此于本发明之一方面cg1、mur1及mur4突变种系用于形成转基因植物用来制造蛋白质，特别系用作为治疗剂。另一方面，将可编码人类糖基转移酶的基因引进背景种系，用来制造更多人类植物宿主系统。例如参考WO 0,034,490所述。

其它期望种系可使用标准突变发生技术产生。此外，经过突变发生的种子可由商业来源获得，例如得自雷尔种子公司(http：//www.arabidopsis.com/main/cat/seeds/M2/EMS/12e.html)。

表达暗盒

本发明的较佳具体实施例中，野生型或突变种或经过修改的拟南芥属变种经过基因工程处理而表达感兴趣的基因。此种构建体至少包含一种编码预定蛋白质的核酸序列，以可操作方式连接至启动子及/或其它调节元件，来辅助基因的转录以及最终辅助蛋白质的翻译。

一方面，基因构建体经过基因工程处理，而于5′至3′方向带有启动子、基因及终止子。另一方面，基因构建体包含多个编码区连接于一个共通质体上，或共同转化入植物(此种共同转化的构建体合并包含于此处使用的「基因构建体」一词的范围)。多数基因可编码为分离顺反子、或编码作为多顺反子单元的一部份。另一方面，基因构建体包含一或多个IRES元件。

蛋白质

对于欲藉本发明制造的蛋白质并无预设限制，但某些类别蛋白质特别相关，需要于经过调节且可再现的条件下制造产品。特别包括于实验过程需要采用优良实验室规范及有效方法的各类医药及/或诊断用蛋白质。

也可表达用于营养品及化妆品使用的蛋白质，原因在于这些产品系供人体直接摄食、注射或施用(例如局部投药)。也可表达可用于制造同样经过调节的兽医用蛋白质产品。但通常后述方法及转基因植物及植物细胞可用于任何类型的大量蛋白质制造，无论是否经调节且无论是否预期供人类或动物消费使用、或供治疗或诊断用皆可。

可制造的范例蛋白质包括但非限于：生长因子(例如胰岛素类生长因子I)、受体、配体、发讯分子；激酶、肿瘤抑制剂、凝血蛋白质、细胞周期蛋白质、端粒酶、代谢性蛋白质、神经元蛋白质、心脏蛋白质、特定疾病状态缺乏的蛋白质、抗体、抗原例如(口服抗原)、提供疾病抵抗力的蛋白质、抗微生物蛋白质、人类血清白蛋白(例如人类血清白蛋白)、干扰素及细胞因子。

植物也可使用一或多种基因转化来再现化学合成或其它产业制程的酶路径。

另一方面，拟南芥属以一或多种基因转化来提高该种植物用作为大规模制造蛋白质的来源植物。此种基因包括让拟南芥属对疾病及昆虫有抗性的基因、及/或编码蛋白质而该蛋白质具有抗霉菌、抗细菌或抗病毒活性的基因。

一方面，选择可编码预定蛋白质的核酸序列，其中核酸序列系设计成可提供拟南芥属所偏好的密码子。拟南芥属使用的密码子特征述于Wada等人，「由基因存库基因序列资料列表的密码子用途」，核酸研究19(补遗)1981至1986(1991)(举例)。

如下所述，一方面本发明提供一种表达多种重组蛋白质的方法。此种蛋白质可于个别独立的构建体共同转化时表达，或可由后述的多顺反子表达单元表达。此种蛋白质包括于其天然状态需要多个结构基因协力表达才能变成具有生物活性的蛋白质。一方面，蛋白质需要多个亚单位的组装才能变成具有活性。另一方面，蛋白质系以不成熟形式制造，需要藉一或多种其它蛋白质之处理例如蛋白质的裂解或修改(例如磷酸化、糖基化、核糖基化、乙酰化、法尼基化(farnesylation)等)才能变成具有活性。

这些蛋白质的非限制性实例包括非同质二聚体或非同质多聚体蛋白质例如T细胞受体、MHC分子、免疫球蛋白家族的蛋白质、核酸结合蛋白质(例如复制因子、转录因子等)、酶、抗体酶(abzymes)、受体(特别可溶性受体)、生长因子、细胞膜蛋白质、分化因子、血红素类蛋白质、多聚体激酶等。

本发明的较佳方面，表达暗盒可编码人类蛋白质。

于特佳方面，表达暗盒可编码一或多种单株抗体基因。此种基因可得自鼠、人或其它动物来源。另外，此种单株抗体基因可为合成，例如编码抗体分子的重链或轻链组成元件的基因嵌合体形式或修改形式。编码区于构建体的顺序亦即重链及轻链或轻链然后重链并不重要。编码重及轻多肽(例如可变重多肽及可变轻多肽)的基因可衍生自可制造IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的细胞。制造基因体DNA片段的方法而由该基因体DNA可克隆免疫球蛋白可变区基因，此种方法为业界众所周知。例如参考Herrmann等人，酶学方法，152：180-183(1987)；Frischauf，酶学方法，152：183-190(1987)；Frischauf，酶学方法，152：199-212(1987)。较佳具体实施例中，例如后述，这些基因被编码为多顺反子单元之一部份。

基因也可编码融合蛋白质。例如结构基因可包含编码效应物多肽的序列。用于此处「效应物分子」表示胺基酸序列例如蛋白质、多肽或肽，且包括但非限于调节因子、酶、抗体、毒素等。由效应物分子产生的期望效应的非限制例包括但非限于细胞增殖或细胞死亡、引发免疫反应、或作为诊断目的的检测分子(例如融合物编码萤光多肽如GFP、EGFP、BFP、YFP、EBFP等)。又另一方面，蛋白质包括胺基酸序列其可提高蛋白质安定性，或可增加蛋白质的转录。例如蛋白质可融合至转录活化剂，该转录活化剂可活化由该基因以可操作方式连接的启动子的转录(例如参考Schwechheimer等人，功能整合基因体1(1)：35-43(2000))。

调节元件

可基于欲表达的重组蛋白质类型选择可产生特定构建体的适当调节元件。通常需要于全部或大部分20-40日龄拟南芥属植株的植物组织高度表达能力。

植物启动子

使用的构建体包括全部遗传物质以及例如启动子、IRES元件等。这些表达暗盒需要若干外部刺激来诱发表达，例如添加特定营养素或化学剂、改变温度等，或可设计成可于生长期间瞬间及/或自发表达所编码的蛋白质。

如此，编码所需蛋白质的基因的表达可由组成启动子或经过调节的启动子加以控制。经过调节的启动子可为组织特异性、经过发育调节、或以其它方式经过诱导或压制，但必须于植物细胞有功能。调节可基于时间、空间或发育线索、可由环境发讯、或利用化学诱导剂或压制剂控制，这些作用剂可属于天然或合成来源，启动子可属于天然来源或经过基因工程处理。启动子也可为嵌合体。换言之，使用来自两种或多种不同的天然或合成启动子的序列元件衍生而得。

较好用于构建体的启动子可获得基因的高度表达，允许基因蓄积至占总可溶性蛋白质的至少约0.1至1％，至少约1至5％及更好至少约5％；及/或获得至少约0.1％，较好至少约0.5％及最好至少约1％的总胞间流体(ICF)可萃取蛋白质。

启动子偏好允许于全部植物组织表达，但最好于全部叶、茎及根组织表达。此外或另外启动子允许于花及/或种子组织表达。本发明中，以拟南芥属肌动蛋白2启动子、OCS(MAS)启动子及其变化形式、CaMV35S以及玄蔘嵌纹病毒34S启动子为较佳。但也可使用其它组成性启动子。例如泛素启动子也曾经由多种种属转殖而用于转基因植物(例如向日葵(Binet等人，植物科学79：87至94(1991)；及玉米(Christensen等人，植物分子生物学，12，619至632(1989))。进一步有用的启动子为得自玉米的U2及U5 snRNA启动子(Brown等人，核酸研究，17，8991(1989))以及得自酒精去氢酶的启动子(Dennis等人，核酸研究，12，3983(1984))。

另一方面，经过调节的启动子系以可操作方式连接至该基因。经过调节的启动子包括，但非限于受到外部影响而调节的启动子(例如藉施用外部作用剂例如化学、光、温度等)，或受到内因性调节的启动子，例如植物体经过调节的发育变化。经调节的启动子可用于特别于或接近于收获时间，诱发期望基因的高度表达。如此特别可用于该期望基因限制或以其它方式约束植物的生长，或以某种方式而变成不稳定的案例。

藉某些方法控制转基因于不同植物组织的表达的植物启动子为熟暗技艺人士已知(Gasser & Fraley，科学244：1293-99(1989))。花椰菜嵌纹病毒35S启动子(CaMV)以及经过提升的CaMv启动子衍生物(Odell等人，自然，3(13)：810(1985))、肌动蛋白启动子(McElroy等人，植物细胞2：163-71(1990))、AdHI启动子(Fromm等人，生物/技术8：833-39(1990)，Kyozuka等人，分子基因遗传学228：40-48(1991))、泛素启动子、玄蔘嵌纹病毒启动子、曼诺平(mannopine)合成酶启动子、诺帕林(nopaline)合成酶启动子及欧托平(octopine)合成酶启动子及其衍生物被视为组成性启动子。将经过调节的启动子描述为光可诱变(核酮糖二磷酸羧基酶启动子小型亚单元)、热震启动子、硝酸盐以及其它化学可诱变的启动子(例如参考美国专利第5,364,780及5,777,200号)。

当需要于植物的特定部分表达的蛋白质时可使用组织特异性启动子。叶特异性启动子包括前方由35S促进基因的C4PPDK启动子(Sheen，15EMBO，12：3497-505(1993))或任何其它于叶部表达的特异性启动子。用于于种子表达的蛋白质，可使用纳平(napin)基因启动子(美国专利第5,420,034及5,608,152号)、乙酰-CoA羧基酶启动子(美国专利第5,420,034及5,608,152号)、2S白蛋白启动子、种子储存蛋白质启动子、菜豆素(phaseolin)启动子(Slightom等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA80：1897-1901(1983))、油素(oleosin)启动子(Plant等人，植物分子生物学25：193-205(1994)；Rowley等人，1997，Biochim.Biophys.Acta.1345：1-4(1997)；美国专利第5,650,554号；PCT WO 93/20216)、玉米蛋白启动子、麸蛋白启动子、淀粉合成酶启动子、以及淀粉歧化酶启动子。

通常任一种植物可表达的基因构建体皆可用于本发明方法。考虑表达的重组蛋白质类型而选用特殊启动子。

也可提供其它调节元件例如促进基因序列。例如一方面，使用含有得自花椰菜嵌纹病毒(CaMV)35S基因的多元件转录促进基因。例如参考Weigel等人，植物生理122(4)：1003-13(2000)。

IRES元件

一般认为编码产物的DNA基本功能节段，包括启动子接着为蛋白质编码区然后为终止子。此种基本上单一顺反子(也称作「一顺反子」)格式成为于任何有机体表达基因的标准。根据核糖体扫描模式，亦即大部分真核生物mRNA传统采用的核糖体扫描模式，40S核糖体亚单元结合至5′-帽，顺着未经翻译的5′序列移动至其到达AUG密码子(Kozak Adv.Virus Res.31：229-292(1986)；Kozak J.Mol.Biol.108：229-241(1989))。虽然对大部分真核生物mRNA而言，只有第一个开放阅读框(ORF)具有翻译活性，但有也不同机制，藉该机制mRNA可发挥多顺反子功能(Kozak Adv.Virus Res.31：229-292(1986))，因此可表达多数编码区，而个别未由分开启动子所控制。

如此于本发明的一方面，提供使用IRES技术做翻译调节的表达暗盒。如此本发明并非限于对各编码区仰赖使用启动子的基因构建体。

IRES元件可为前述元件之一(Atebekov等人，WO 98/54342)或为人造IRES，其于植物细胞具有活性。至于含多数IRES构建体，可使用有不同DNA序列的IRES元件。晚近由药菜(Oleracia officinalis L.)植物已经分离一种新颖托巴摩病毒(tobamovirus)，crTMV，crTMV的基因体已经测序(6312核苷酸)(Dorokhov等人，332Doklady，苏联科学院518-22(1993)；Dorokhov等人，350FEBS Lett.5-8(1994))。

不似典型托巴摩病毒的RNA，crTMV RNA的3′-近端CP基因的翻译于试管内以及于植物体内系由一种内部核糖体进入机制进行，内部核糖体进入机制系由特测序列元件IRESCP所媒介(Ivanov等人，病毒学232，32至43(1997))。结果指出crTMV RNA的CP基因上游148核苷酸区含有于试管内以及活体内(原生质体以及转基因植物)激活内部引发翻译的IRESCP。

晚近也显示(Skulachev等人，病毒学263：139-154(1999))托巴摩病毒的基因体RNAs含有MP基因上游序列，该序列可于试管试验中以帽-非相依性方式，激活由以可操作方式连接至该序列的嵌合体mRNAs进行3′-近端基因表达。crTMV RNA的MP基因(IRES_MP228CR)上游228核苷酸序列媒介由双顺反子转录的3′-近端GUS基因的翻译。crTMVRNA的MP基因上游的75-核苷酸区仍然可有效作为228-核苷酸序列。因此75-核苷酸序列含有IRES_MP元件(IRES_MP75CR)。发现类似crTMVRNA，托巴摩病毒族群之一种型成员(TMV UI)的基因体RNA上游75-核苷酸序列也含有IRES_MP75UI元件，该元件可调节3′-近端基因的帽-非相依性翻译。

托巴摩病毒提供内部引发翻译的新范例，本范例系于对小RNA病毒以及其它病毒性及真核生物mRNA所示的IRES显然不同。可调节帽-非相依性翻译的IRES_MP元件不仅含于crTMV RNA，同时也含于托巴摩病毒族群中一种型成员的基因体TMV UI；以及另一种托巴摩病毒、黄瓜绿斑驳斑纹病毒的基因体。结果托巴摩病毒族群的不同成员皆含有IRES_MP。

如此本发明也包括使用IRESes及/或启动子的任一种组合，基于多顺反子基因构建体的表达而制造蛋白质。

举例言的两种特定IRES元件用于证实本发明。得自十字花科烟草斑纹病毒(crTMV)基因体的两种IRESes的核苷酸序列：

IRESmp75cr：

5′TTCGTTTGCTTTTTGTAGTATAATTAAATATTTGTCAGATAAGAGA

TTGTTTAGAGATTTGTTCTTTGTTTGATA3′(序列ID编号1)

IREScp148cr：

5′GAATTCGTCGATTCGGTTGCAGCATTTAAAGCGGTTGACAACTT

TAAAAGAAGGAAAAAGAAGGTTGAAGAAAAGGGTGTAGTAAGT

AAGTATAAGTACAGACCGGAGAAGTACGCCGGTCCTGATTCGTTT

AATTTGAAAGAAGAAA3′(序列ID编号2)

如此本发明的一方面系有关一种重组核酸分子其含有5′至3′转录起始因子以及多个结构基因，其个别由一个内部核糖体结合序列(IRES)分开。

包含IRES元件的构建体进一步述于PCT/US02/17927，申请日2002年6月7日，该案以引用方式并入此处。

靶序列

较佳具体实施例中，表达产物对靶向植物细胞的特定位置，例如细胞膜、胞外空间或细胞小器官，例如色素体例如叶绿体。较佳具体实施例中，表达产物系靶向胞外空间，如此可基于胞内流体的分离做纯化。例如参考专利案第6,096,546号，美国专利案第6,284,875号及WO 0,009,725。

蛋白质通过靶序列的功效而可靶向特定细胞以下或胞外所在位置。某些情况下，胺基酸序列被合成为多肽的胺基端基部分，以及于转位或局限化过程后或过程中藉蛋白酶裂解。例如于真核生物的蛋白的分泌路径模式为于核糖体结合至mRNA且翻译起始后，出现新生多肽链。若该多肽链为预定分泌的蛋白质，则出现的蛋白质胺基端可由信号辨识粒子辨识(SRP)，SRP带来翻译的暂时拖延翻译，同时mRNA、核糖体及SRP复体停靠于内质网(ER)。于停靠之后，恢复翻译，但现在多肽链系以共同翻译方式转位至ER管腔。

也可能蛋白质于翻译后转位；但此种过程于活体内远较为无效，通常不被考虑为进入ER的正常途径。蛋白质靶向内膜系统用来局限于空泡内或用来分泌的信号序列于动物体及植物体类似。信号肽可根据标准技术调整用于本发明(例如制备适当末端用于与任何其它基因做架构内克隆)。

一方面，编码所需蛋白质的表达暗盒包含于架构内融合至编码预定蛋白质序列的信号序列。于较佳方面，信号序列为可指示基因表达产物至分泌路径的序列。

由于抗体通常为分泌蛋白质，故分泌过程于成熟抗体分子的制造中扮演重要角色。为了于植物体达成此项目的，基因经合成例如(克隆)而具有其天然哺乳类信号肽编码区，或呈融合基因，其中植物分泌信号肽经取代。信号肽与蛋白质间的融合须为藉植物处理时，结果所得蛋白质的胺基终端系与人类宿主产生的胺基终端完全相同。

于较佳具体实施例中，使用得自钙网素(calreticulin)蛋白质的分泌目标信号。已经证实此种植物信号肽可有效将外来蛋白质靶向植物的胞质外空间(例如参考Borisjuk等人，17自然生物技术466-69(1999))。也可使用其它植物蛋白质信号肽，例如对大麦所述(a-淀粉酶During等人15植物分子生物学287-93(1990)；Schillberg等人8转基因研究255-63(1999))。

对于通常需要胺基端处理才能达成成熟形式蛋白质，将蛋白质靶向植物内膜系统属于本发明的较佳具体实施例，原因在于如此提供蛋白质胺基端的适当成熟。进一步若感兴趣的蛋白质具有或被基因工程处理而含有额外靶信息，则可达成局限于内膜系统特定区(例如述于Voss等人，1分子育种39-50(1995)；During等人，15植物分子生物学281-93(1990)；Baum等人，9分子植物微生物交互作用，382-87(1996)；DeWilde等人，114植物科学，231-41(1996)；Ma等人，24欧洲免疫学期刊131-38(1994)；Schouten等人，30植物分子生物学781-93(1996)；Firek等人，23植物分子生物学，861-70(1993)；Artsaenko等人，8植物期刊745-50(1995)；Conrad & Fiedler 38植物分子生物学101-09(1998))。

靶向小器官例如色素体(例如叶绿体及粒线体)也可有利地达成预定胺基端的成熟，原因在于靶向这些位置系依据胺基端信号序列的指令，该指令随后进行裂解。较佳具体实施例中，信号肽指示表达产物至色素体(例如叶绿体)或其它次细胞小器官。例如苜蓿核酮糖-二磷酸羧基酶的小型亚单元暂时性肽(Khoudi等人，197基因343-5(1997))。过氧化物酶体靶序列表示任何可将蛋白质靶向过氧化物酶体的肽序列，包括N-端、内部或C-端，例如植物C-端靶三肽SKL(Banjoko等人，107植物生理学1201-08(1995))。

其它方面，核定位信号并非天然限于蛋白质5′端位置(胺基端)，也未藉任何已知细胞机制以蛋白质分解方式去除。如此，由处理观点视之，将蛋白质靶向核并不合乎所需。

此外，或作为将蛋白质靶向特定次细胞位置的替代之道，一方面增加「抗原决定簇标记」及/或位置特异性裂解位置来形成融合蛋白质。利用此种标记让其可提供方便的纯化机制。例如包含由生物素结合至链丝菌抗生物素的关键胺基酸序列的小型肽可于感兴趣基因5′端做基因工程处理。新合成的蛋白质基本上可基于生物素：链丝菌抗生物素结合而藉多种已知方法捕捉。若希望由蛋白质去除「仿生物素肽」，则也可包括蛋白酶辨识位置。蛋白质辨识位置可插入「抗原决定簇标记」序列之下游，且恰位在编码预定蛋白质成熟形式的序列的前方。熟谙技艺人士了解对抗原决定簇及蛋白酶(例如因子Xa、烟草蚀刻病毒蛋白酶、肠激酶等)有多种选择，较佳位置及蛋白酶的选择系依据该特定蛋白质胺基酸及DNA序列决定。

如前述，调节元件例如启动子、促进基因、IRES元件及信号序列的选择通常系依据欲表达的蛋白质类型而定。例如于一方面，若干用于制造IgG目的的较佳构建体包括构建体，该构建体具有5′拟南芥属肌动蛋白2启动子：钙网素(任何植物)信号肽：IgG重链基因成熟部分编码区：翻译中止信号：IRES(mp75 cp148)：BAR：转录中止及腺苷化序列；以及第二构建体(含有类似前述元件)，但以轻链基因置换重链基因，以及以另一选择/筛选标记例如GFP置换BAR基因。另外，于另一较佳具体实施例中，重链基因及轻链基因可位于同一DNA构建体上。

载体

通常，适当表达载体可为任一种已知可用于转化植物的载体系统。通常此种载体含有一或多个序列用以于植物细胞稳定复制载体，此种基因可作为附加体、或作为内生性植物染色体一部份。可提供有助于整合于植物染色体的序列。就某些方面而言，需要提供由不同类型细胞复制起点，来辅助于一类型细胞扩增以及于另一类型细胞作蛋白质表达。例如虽然一般而言蛋白质表达可于植物细胞达成，但扩增可于原核细胞(例如细菌细胞)进行，使获得适量核酸用于随后植物细胞的转化。

就本发明的精髓而言，有关欲导入拟南芥属植物的基因构建体确切性质并无特殊区别，表示任何可于拟南芥属表达的核酸(DNA或RNA构建体)皆适合用于本发明，包括基于病毒的表达系统。但因本发明之一方面系有关新颖基因转化入拟南芥属的速度优势，以及于随后的世代提供大量种子的优势，故以土壤杆菌花浸渍及真空浸润方法为导入基因用以稳定整合于基因体的较佳方法，因此以适合用于此种技术的构建体为特佳。

例如用于土壤杆菌媒介转化，较佳载体为Ti质体衍生载体。其它有用的适当载体为业界已知。这些转化植物组织及原生质体的载体述于deFramond，A.等人，生物/技术1，263(1983)；An，G.等人，EMBO J.4，277(1985)；及Rothstein，S.J.等人，基因53，153(1987)。

也提供其它有助于位置特异性基因体的整合及/或以控制方式剪接及/或再插入基因体的序列。例如Cre/lox系统可用来于拟南芥属基因体的lox位置获得土壤杆菌T-DNA的靶整合。位置特异性重组株(而非随机事件)偏好经由活化无声lox-新霉素磷酸转移酶(nptII)目标基因而选择。使用共同转化办法可暂时性提供Cre重组酶。例如参考Vergunst等人，植物分子生物学38(3)：393-406(1998)的说明。

使用适合用于叶绿体转化的载体。叶绿体系在真核细胞内部的原核隔间。由于叶绿体的转录及翻译机制皆类似大肠杆菌(Brixey等人，1997)，故于植物叶绿体比于植物细胞核可以极高程度表达原核基因。此外植物细胞含有多达50,000圆形色素体基因体复本(Bendich1987)，色素体基因体可类似质体而扩增重组基因，加强表达程度。叶绿体的表达比于转基因植物的细胞核表达高100倍(Daniell，WO 99/10513)。

因此一方面，表达暗盒被克隆于叶绿体载体。较好表达暗盒包含重组基因以可操作方式连接至叶绿体启动子(例如16S rRNA启动子)。一方面，可提供可选择标记基因[例如胺基糖苷腺苷基转移酶(aadA)，提供对观霉素(spectinomycin)的抗药性]。也可提供重组基因下游的终止子及/或可选择标记基因[例如得自拟南芥属叶绿体基因体psbA 3′区的终结序列(得自编码光系统II反应中心组成分的基因的终止子)]。较好载体额外编码拟南芥属叶绿体基因体作为同源重组的旁出序列。

可选择标记及/或报道子基因

可选择标记，例如抗生素(例如卡那霉素及潮霉素，nptII，hpt)抗性、杀草剂(古芙希纳(glufosinate)、伊米达诺(imidazlinone)、葛来福塞(glyphosate)、AHAS、EPSPS)抗性或生理标记(可目视或生物化学)用来选择以核酸构建体转化的细胞。其它方面，非转基因细胞(亦即非转化体)则被杀死，或于选用的条件下不会生长。一方面，可选择标记基因为编码提供抗性的蛋白质或生理标记基因。另一方面，可选择标记基因为编码反义核酸的基因。

报道子基因可涵括于构建体，或报道子基因可含于载体，而该载体最终将该构建体转运至植物细胞。用于此处「报道子基因」为任何可对该基因于其中表达的细胞提供可观察或可量测的表达型的基因。

由报道子基因的表达获得可检测的结果，例如可目测的比色、萤光、发光或生物化学可检定分析产物；可选择标记允许基于生理及生长差异而选择转化体；或显示可目测的生理或生化踪迹。常用的报道子基因包括lacZ(β-半乳糖苷酶)、GUS(β-葡萄醛糖苷酶)、GFP(绿色萤光蛋白质及其突变或修改形式)、虫萤光素酶或CAT(氯霉素(chloramphenicol)乙酰转移酶)该等报道子基因容易以目测观察或可检定分析。这些基因组合可选择标记或替代可选择标记用来容易挑选出感兴趣的纯株。一方面可选择标记基因为编码蛋白质产物的基因。

可选择标记也包括有助于分离表达该标记细胞的基因。例如可选择标记可编码抗原，该抗原可由抗体辨识出，且用来藉基于亲核纯化技术或藉流动细胞计量法而分离转化细胞。报道子基因也包含对植物细胞为外来基因的可检测的序列(例如藉PCR检测)。本具体实施例中，报道子无需表达的蛋白质、或于表达型中造成可目测的变化。

拟南芥属的转化

DNA基因移转且整合于植物宿主基因体的方法为众所周知。以拟南芥属真空浸润或浸渍方法为较佳，原因在于许多植物可在小空间内转化，获得大量种子用来筛选转化体。典型地，土壤杆菌可移转带有特定末端(T-DNA)边界的线性DNA片段(T-DNA)，因此使利用土壤杆菌成为较佳的方法。也可使用直接DNA转化例如显微注射、化学处理、或微弹射碰撞或生物弹(biolistics)较好用于叶绿体媒介的转化。除了对重组构建体的大小有限制的外，基因编码序列也可使用病毒载体而输送入植物体。经转化的植物细胞可为原生质体、细胞培养、胼胝体组织、悬浮培养、叶、花粉或分生组织。第一阶段，只需暂时性表达，换言之，表达一段时间来确定该构建体用于产生随后稳定转化种系的适合性。快速转化系统包括，但非限于花浸渍或真空浸润(Bechtold等人，C.R.Acad.Sci.巴黎，316生命科学1194-99(1993))；叶及幼苗浸润(Kapila等人，122植物科学101-108(1997))，以及原生质体电穿孔。

较佳具体实施例中，适当基因型拟南芥属植物可生长至开花。拟南芥属的转化的最方便方式系将发育中的植物组织浸渍于土壤杆菌溶液内。此步骤进行中可将幼苗植物(35日龄附近)于浸渍阶段接触真空或未接触真空。于花浸渍的数周内，拟南芥属植物产生的种子可被收获及筛检含有感兴趣基因的T1植物。例如参考Clough及Bent，植物期刊16：735-43(1998)。

较佳具体实施例中，筛选方式系将种子以每平方呎约10颗或10颗以上种子的密度展开于盆装土壤混合物(例如美彻密斯(Metromix)350)，然后以足够杀死未转化植物的施用率喷雾施用古芙希纳或佛菲诺辛(phophinothricin)进行筛选。可表达可选择标记(本例为BAR)的T1转基因植物于此种处理下形成，于施用选择作用剂之后的1至3日内方便识别。有其它方法及可选择作用剂可使用，且系涵盖于本发明的范围，但由于此种方法简单且产出量高，故以此种方法为佳。

识别最理想的构建体

T1植物生长至成熟，让T1植物自我授粉。较佳具体实施例中进行暂时性表达检定分析，使识别用于特定蛋白质表达计划为最理想的基因构建体。更好平行引进一系列构建体，用来筛选何种构建体有适当蛋白质表达、蛋白质修改、蛋白质安定性及/或活性等性质。至少有一构建体表达野生型蛋白质，另外有一或多个构建体将表达随机突变及/或合理的突变蛋白质。

此种构建体的表达可使用对感兴趣蛋白质有适当敏感度的检定分析评估，可由各种幸存的经过转化的T1植物取少量组织来试验，使证实期望产物的表达/活性。此种试验可用来识别以最高相对量表达期望蛋白质的植物及/或该表达的蛋白质有特定期望活性或活性程度。于较佳具体实施例，至少平行试验约50，至少约100，至少约250或至少约500构建体。

另一方面，去除小量植物组织或间质流体(例如够大量而可获得适当蛋白质试样)，将该组织/间质流体轧碎或藉真空过滤捕捉，进行适当检定分析来测量蛋白质含量及/或活性。可选用适合用于评估蛋白质含量/活性的任一种适当检定分析。一具体实施例中，该检定分析为免疫检定分析。

例如试样经过离心，以及点墨于适当类型的过滤膜(例如PVDF)上而结合蛋白质。较好过滤膜经洗涤，然后于一次及二次抗体存在下培养。一次抗体可辨识且结合感兴趣的蛋白质，而二次抗体可结合一次抗体。二次抗体典型系连接至碱性磷酸酶或辣根过氧化酶，因而可藉添加单纯比色或萤光计量基质进行检测。同理于多孔板进行ELISA检定分析，可用来检测一或多种感兴趣的蛋白质。此种方法通常为熟谙技艺人士已知，可视需要经修改而适合检测任何特定蛋白质。

此外或另外，可进行多种检定分析来证实拟南芥属的表达暗盒或「转基因」的存在。这些检定分析例如包括分子生物学检定分析，如南方(southern)及北方(northern)点分析及PCR；生物化学检定分析，酶功能检定分析；电泳检定分析；层析检定分析；质谱术；植物部分检定分析，例如叶或根的检定分析；也可藉分析全株再生植株的表达型而检定分析。

T2及T3世代种子同样经过筛选来识别带有最高制造程度且最稳定的基因构建体的植物种系。通常较好获得插入基因同种接合的植物种系，可经由获得第二及第三世代来完成及证实属于插入基因的同种接合植物种系。基于孟德尔遗传学基本原理。若欲插入多于一种基因，而基因并非实体连接在一起，则可制造较多世代来筛选出于各个位置呈现同种接合的种系。总而言之，拟南芥属由于容易产生后代以及产生后代的速度因而提供优于典型作物的特殊优势。拟南芥属只需要8至10周即可完成一个世代周期。每株拟南芥属预期可至少产生200个后代种子，且更常见显著高于此数目(例如约500颗种子)。

如此，于一具体实施例中该方法为阶层式，筛选第一T1世代，识别带有预定性质构建体；然后选出可表达此种构建体的最理想T1植物，来产生带有稳定「预定表达性质」的最理想的随后各植物世代，换言之，稳定的转基因种系。暂时性检定分析也系以阶层方式进行，换言之，首先于基于细胞的检定分析筛选构建体，然后筛选于T1世代于第一检定分析识别的最理想构建体。特佳具体实施例中，植物经过筛选，而识别出对指定量生物物质而言可表达出最高量蛋白质的植物。一具体实施例中，识别可产生至少约50，至少约100，至少约150，及至少约200克生物物质/平方呎培养植物的植物种系。

大规模制造蛋白质

一具体实施例中，多种含有至少一个基因构建体的拟南芥属系于可促进营养体以及叶性生物物质制造的条件下生长。简言之，如此表示带有强劲叶系统的健康植物，且在植物产生成熟种子之前收成。为了放大规模，某种族群的稳定转基因植物于产生种子的有利条件下生长使由各植物获得至少约200克种子。然后收成拟南芥属(种子或成熟植株)，且由收割的植物分离一或多种感兴趣的蛋白质。若制造多种重组蛋白质，则可制造成为个别蛋白质、或制造成多重亚单元复体。较好此种多重亚单元复体组装后具有功能性。

根据本发明用于大规模制造的拟南芥属种系可以已知活性程度/活性类型以及已知修改模式表达已知量的蛋白质。同理，植物本身的生物特征为已知(例如对蛋白质稳定性、靶、修饰等的影响)。如此与先前技艺使用拟南芥属的方法相反，用于大规模制造蛋白质时，预设且预选定的拟南芥属及表达系统被提供「预定表达性质」。如此表示经由前述暂时性表达检定分析，已经测定所表达的蛋白质性质、表达程度、于植物或植物细胞的表达点(叶、根、全株、胞浆体、ER、叶绿体)、较佳条件、较佳表达载体、产量等。

例如用于欲大规模生长的特定拟南芥属种系，已知此种拟南芥属变种若于栽种后且于特定条件下生长时于某一日收获，将表达粗略可预定量的外来/非同源蛋白质。提供具有预定表达性质的植物或种子用于大规模生长拟南芥属，用以制造至少一种期望蛋白质生物物质。

此种区别可通过相对于时间、面积、产量及条件等因素讨论生长而获得最佳说明。但由于时间及面积可放大，故最好取一组条件作为举例说明但非限制性。因此考虑20呎×20呎的植物生长隔间或生长室含有单层植物生长介质(自然土、商业及人造土、水耕法介质)。根据本发明的「植物生长隔间」一词包括任何类型可完全隔离自然光、水等的空间，或可为温室其允许暴露于不等量的自然光、雨水等。该术语也涵盖20呎×20呎暴露或经过覆盖的田野面积，例如用于水耕法或公知以土壤为主的农耕。

一具体实施例中，拟南芥属系于可促进营养性及叶性生物物质制造的条件下生长。较好植物通常系暴露于约8至10小时日光或适当生长光照条件下，且维持于约18℃至约24℃温度。生长介质供给足够营养(肥料)来促进激烈生长(例如米洛克葛罗(Miracle Grow)品牌植物肥料或其它类似产品)。于土壤生长时，最好系由底部浇水维持湿润，但整个生长期间并未过饱和土壤。

根据本发明之一具体实施例，植物生长隔间栽种包括至少一个表达暗盒的单种拟南芥属变种，该表达暗盒将于前述条件下表达至少一种感兴趣的蛋白质。确实植物变种与表达暗盒的组合已经经过试验并决定特征，让其表达的蛋白质为已知，表达程度已知至合理估值，故可基于每个隔间收获某种数量的拟南芥属做估计。

理想上于适当规定条件下生长的植物系于栽种后约30至80日，更好40至70日及最好约45至60日间收成。最佳生成日数通常系于早先阶段预先规定，界定最适当的拟南芥属宿主变种、最佳表达暗盒、以及对期望蛋白质的最佳生物物质对蛋白质产率。通常收获的目标日期系于外消旋混合物出现时或出现附近直到恰在形成种子前或附近决定。锁定此一时间窗口，如此让可收成的叶及根生物物质量变最大量。

虽然进一步生长可获得更多量植物生物物质，但这些组织(茎、花、种子荚及种子)通常并非商业上由拟南芥属大规模制造蛋白质目的的预定目标组织。因此较好制造可提供有用蛋白质产物的最大量生物物质而无法再提供更多量有用生物物质。

随后含有相同表达系统，意图用于表达同样所需蛋白质而获得约略等量期望蛋白质的其它相同变种植物被栽种于同一空间或类似空间。可在固定数月或数年进行2、3、4、5或更多次。于各个栽种/收成周期后，感兴趣的蛋白质由所得生物物质分离而实质上获得适合用于药物的实质纯质蛋白质。如此与意图供研究用的拟南芥属相反，相同植物(例如得自可表达最理想构建体的稳定转基因植物种系的种子)不断播种而获得生物物质，由此植物分离经过特征化的蛋白质产品。较好种子可快速制造(例如少于约8至10周)。

拟南芥属的独特形态学也允许有效利用空间来获得最大生物物质制造量。拟南芥属具有小型紧密生长形态，而产生叶环。于约5至8周时间，播种密度10-15种子/平方呎之一平方呎面积的整个表面完全被致密的叶席所覆盖，由生物基质表面伸长约2-5厘米。此时有类似量的生物物质系以根的形式制造。由于在此阶段植物的生长高度矮，故可于垂直方向堆栈多个棚架来生长植物(亦即至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10)。其它方面，若需增加种子供应量，则容易于更适当的光照计划下生长植物，提供足够空间给予足够空间让花苞萌出。通常由播种种子至下次收成种子需时约8至10周，每株植株至少产生数百颗种子。

通常如前述根据本发明的20呎×20呎生长隔间于单一生长/收成周期，经由收获于生长隔间生长的拟南芥属，基于回收的总可溶性蛋白质重量，将制造至少0.1％较好至少0.5％及更好1％或以上所需蛋白质。

以另一种测量方式叙述，由此单一20呎×20呎生长隔间，较好制造至少约1克(例如100克/平方呎×400平方呎×6层×10克蛋白质/1000克生物物质×0.1％占总蛋白质的期望蛋白质＝2.4克)所需蛋白质，更好制造至少约5克且又更好至少约10克感兴趣的所需蛋白质。更好蛋白质系以至少约500毫克、1克、2.5克、5克、7克、8克、9克或至少约10克重组蛋白质的数量制造。

此种蛋白质量的制造可为绝对量，换言之，与时间无关。亦即特定生长隔间会一再使用直到生产所需程度的期望蛋白质为止。当以此种方式表示时，是否属于下列何种情况并不重要，例如1克系由于当年度单次栽种的结果，以大于1％总回收可溶性蛋白质的量生产所需蛋白质；或由于8至10次栽种/收成周期所得的结果，每个周期各35至45日，而于一年中粗略相等间隔时间产生的期望蛋白质量远较不集中。

若拟南芥属系于低于所需条件下生长，则可能改变收成窗口至某种程度。例如于高于25℃温度收成始于35日。于低于20℃温度，虽然较有利于产生叶，但整体植物将受到压力而相对不具有生产力。

如前述某些前文讨论的因素可放大规模。例如总产率为多项因素的函数，包括但非限于植物栽种密度、允许持续生长的程度、于一段指定时间例如一年中于指定空间将进行栽种与收成周期数目、指定植物表达的蛋白质数量等。但栽种程度于蛋白质的最终产量上也扮演重大角色。下述实例考虑于单层可栽种表面有20呎×20呎生长面积的生长隔间。但通常于生长隔间或温室，可在指定空间堆栈两层或两层以上例如以阶梯或多层车架堆栈。产量将因于指定空间栽种的层数而倍增。较好生长隔间至少约有两层植物，至少部分系培养非种子的生物物质。

产量系以平方呎为单位的面积比例报告。例如一年期间于具有单层生物物质的20呎×20呎生长隔间生产4克期望蛋白质，则当年的产量系以每年每400平方呎4克表示。若栽种面积达数英亩，则产率约略与基于400平方呎考虑的产率相等。若在相同隔间栽种两层，也可使用相同测量方式，假设总栽种平方呎为800平方呎，由总可溶性蛋白质分离的蛋白质总量在同一年内为8克。则比例仍然为每年每400平方呎4克。栽种的最小及最大面积将依据多项因素决定，例如可利用的空间亦即隔间数目、英亩数目等、选用的变种及表达暗盒系统的实际产率、所需蛋白质期望总量以及时间限制(若有)。若在一段短时间内需要更大量蛋白质，则需栽种更大表面积及/或需要使用更多次栽种/收成周期。可能需要发展出更有效的表达系统。

最小量栽种空间为一年至少可产生约100毫克期望蛋白质，更好至少约300毫克又更好至少约500毫克，又更好至少约700毫克及最好一年中产生至少一克或一克以上期望蛋白质空间。本文所举范例(20呎×20呎生长室)只做为参考用。该方法的各方面就空间及时间而言皆可扩充而制造更大量特定产物。基于任何特定拟南芥属宿主种系，空间及时间等方面可能对任何特定蛋白质的产率百分比造成正面或负面影响。

即使于20呎×20呎生长室规模，较好采用自动化或半自动化收成方法。依据实际生长基质而定(土壤相对于水耕)，有些系统为较佳。由大量生鲜植物组织纯化蛋白质可藉多种方法达成，其中部分方法可参考美国专利第6,096,546、WO 00009725及W09946288号有关蛋白质纯化。

拟南芥属适合用于多种培养室及温室条件下生长。可改变生长条件，例如光照强度，及白昼长度来有利于叶生物物质的产生，以免转成发育花朵。通常白昼时间缩短(8至10小时)有利于较多叶表达型，而白昼长度延长(大于12小时)有利于花及种子的发育。生长温度也影响形态及发育，温度较冷较有利于生长叶。如此通常白昼长度8至10小时及生长温度20℃至23℃有利于叶的营养性生长，相对于白昼长度12至14小时及24至25℃温度则有利于更快速成熟及产生种子。虽然拟南芥属就种子繁殖速率而言相当多产，但拟南芥属种子极小而非期望蛋白质的可收获产物。本案中感兴趣的蛋白质系由植物的营养性部分表达及分离(但也可表达于种子)。

一具体实施例中，植物系于2时高的平面于美彻密斯350于25℃以白昼长度10小时生长35日。播种密度为每平方呎10至15植株，则溶液获得每平方呎100至150克总生鲜产品重量。其中约1克为总可溶性蛋白质。任何特定转基因产物的相对表达程度，达成约0.1％至1％总可溶性蛋白质表达程度。较好至少约1至5％及更好大于5％分离作为生物物质的总可溶性蛋白质为所需重组蛋白质。为了达成商业量产目的，有100平方呎拟南芥属幼苗可获得数毫克且较好高达数克数量的纯质蛋白质。拟南芥属高度不高叶生物物质产量不大。本研究工作证实当用于高密度生长时，相对于生长植物需要的总空间容积、时间、能量及输入，拟南芥属可获得极佳生物物质总产率。

本发明使用拟南芥属植物用来量产蛋白质，特别包括生产适合用于法规规范领域如药物及诊断试剂用蛋白质。

蛋白质的分离

培养后，收获生物物质，回收重组蛋白质。收获步骤包括收获整个植株，或只收获植物的叶或根或细胞。此步骤可能杀死植物，或若收获部分转基因植物则可让其余部分植物继续生长。但较好于生长区段(亦即生长面积或生长隔间如温室)的至少部分全部生物物质皆收获，包括收获含种子的全部植物组织。其余部分可用来获得种子与用于再度播种，收集种子的植物可让其继续生长，或可加至收集的生物物质来回收重组蛋白质。

收获后，蛋白质分离可使用业界例行方法进行。例如至少部分生物物质可经均化，重组蛋白质经过萃取以及进一步纯化。萃取包含将均化物浸泡或浸没于适当溶剂。如前文讨论，蛋白质也可藉真空浸润方法由植物的间质流体分离，如美国专利案第6,284,875号所述。

纯化方法包括但非限于免疫亲核纯化程序，以及基于蛋白质/蛋白质复体的特定大小、电泳移动性、生物活性及/或欲分离的重组蛋白质净电荷、或蛋白质是否存在有标记分子的纯化程序。

但一具体实施例中，重组蛋白质未经分离，反而获得部分生物物质经口投予动物(例如人类)。此部分可以下述剂型提供，该等剂型包括但非限于锭剂、胶囊剂、丸粒剂及悬浮液剂(例如呈饮剂、糖浆剂等)。其又一方面该方法包含对动物经口投予拟南芥属细胞或其部分。

医药组合物

由拟南芥属分离的重组蛋白质可用于预防或治疗疾病、用于其营养价值、用作为营养补充品、化妆品、抗微生物剂，或用于提引出期望的免疫反应(例如作为疫苗)等。

于本发明之一方面，得自拟南芥属生物物质的重组蛋白质或其生物活性片段被调配呈医药组合物。较好医药组合物为无菌水或非水性溶液剂、悬浮液剂或乳液剂，其额外包含生理可接受性载剂(亦即不会干扰活性成分活性的无毒材料)。更好组合物不含热原且不含病毒或其它微生物。熟谙技艺人士已知的任何适当载剂皆可使用。代表性载剂包括但非限于：生理食盐水溶液、明胶、水、醇类、天然或合成油类、糖类溶液、二醇类、可注射的有机酯类例如油酸乙酯或这些材料的组合。视需要地，医药组合物额外含有保藏剂及/或其它添加剂例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂及/或惰性气体及/或其它活性成分。

投药途径及投药频率以及投药剂量将因病人而异且将依据欲预防或治疗的病情或欲提供的效果(例如若提供作为营养补充物)改变。通常医药组合物系经静脉、腹内、肌肉、皮下、局部、吸入等途径投药。但确切投药方法并无限制。投予有效剂量的重组蛋白质或生物活性片段。

用于此处，有效剂量为足够显示带有疾病病情的病人症状改善的数量、或足够对病人提供效益的剂量。此种改善或效益可如业界已知通过监视适当临床终点或生化终点予以检测。通常重组蛋白质的存在量为每千克宿主约1微克至约100毫克。适当剂量将随病人身材而异，典型用于10至60千克动物的剂量系于约10毫升至约500毫升的范围。病人可为哺乳类如人类或家畜。

本说明引用的全部专利案以及非专利案公开文献皆对熟谙技艺人士指示本发明相关技巧层面。全部这些公开文献及专利申请案皆以引用方式并入此处，彷佛个别公开文献或专利申请案特别或个别指示合并于本案。

熟谙技艺人士了解或确定无需使用超过例行实验即可做出于此处所述特定物质及程序相当变化。这些等同例被视为属于本发明的范围，涵盖于权利要求。

虽然已经就特定具体实施例说明本发明，但须了解这些具体实施例仅供举例说明本发明的原理及应用。因此须了解可未悖离如随附的权利要求界定的本发明的精髓及范围对范例具体实施例以及其它配置做出多项修改。

Claims (50)

1.一种于拟南芥属制造大量重组蛋白质的方法包含：

(a)将至少一个可表达重组蛋白质的表达暗盒导入拟南芥属(Arabidopsis)细胞；

(b)识别可表达期望程度及/或活性重组蛋白质的细胞；

(c)由细胞子代获得拟南芥属种子；

(d)于可快速产生种子的条件下培养种子；以及

(e)筛选得自该种子的植株，识别何种植株可表达期望程度及/或活性的重组蛋白质；

(f)于可快速产生种子的条件下培养至少二世代蛋白质产生性植株且选择蛋白质产量最高的植株；以及

(g)于可制造至少约50克生物物质/平方呎的条件下，培养可表达最高量蛋白质的植物种系。

2.根据权利要求1所述的方法，其中每平方呎可制造至少约100克生物物质。

3.根据权利要求1所述的方法，其中每平方呎可制造至少约200克生物物质。

4.一种于拟南芥属制造重组蛋白质的方法，包含：

a.于可促进植物性及叶性生物物质产量的条件下，生长拟南芥属变种，该拟南芥属变种包含至少一个可表达重组蛋白质的表达暗盒；

b.于种子形成前，收获至少部分含重组蛋白质的拟南芥属；以及

c.于一年时间至少回收1克重组蛋白质。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其中该拟南芥属系经预先选择以获得蛋白质的最大表达及/或最大活性。

6.根据权利要求1或4所述的方法，其中该拟南芥属具有较低翻译后蛋白质糖基化程度。

7.根据权利要求6所述的方法，其中拟南芥属包括人类糖基转移酶基因。

8.根据权利要求7所述的方法，其中该拟南芥属为cgl或mur突变株。

9.根据权利要求1所述的方法，还包括下述步骤：预先选出一种拟南芥属种系，该拟南芥属种系比野生型拟南芥属种系可产生出平均量较高的生物物质，以及由预选定的种系获得拟南芥属细胞。

10.根据权利要求1或4所述的方法，其中至少一个表达暗盒系通过浸润而导入拟南芥属细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其中浸润系于真空中进行。

12.根据权利要求4所述的方法，其中部分拟南芥属系培养至种子形成，以及由该部分获得种子。

13.根据权利要求12所述的方法，其中至少再度栽种若干种子。

14.根据权利要求4所述的方法，其中经历至少6个月时间重复进行步骤(a)及(b)。

15.根据权利要求1或4所述的方法，其中该表达构建体包括一种可表达重组蛋白质的基因，以可操作方式连接至调节序列。

16.根据权利要求15所述的方法，其中该调节序列包括一或多个启动子、促进基因序列、转录终止子、或IRES元件。

17.根据权利要求15所述的方法，其中该重组蛋白质系选自下列组成的组群：生长因子、受体、配体、信号分子、激酶、肿瘤抑制剂、凝血蛋白质、细胞周期蛋白质、端粒酶、代谢蛋白质、酶、人类缺陷蛋白、抗体、抗原、胰岛素、白蛋白、干扰素以及细胞因子。

18.根据权利要求1或4所述的方法，其中该表达暗盒表现多种重组蛋白质。

19.根据权利要求1或4所述的方法，其中该表达暗盒表达多顺反子mRNA。

20.根据权利要求19所述的方法，其中该表达暗盒表达多亚单元蛋白质。

21.根据权利要求20所述的方法，其中该多亚单元蛋白质系选自T细胞受体、MHC分子、免疫球蛋白超家族蛋白质、核酸结合蛋白质、多亚单位酶及多亚单位抗体酶组成的组群。

22.根据权利要求1或4所述的方法，其中该蛋白质为人类蛋白。

23.根据权利要求1或4所述的方法，其中该蛋白质为药剂、诊断用蛋白质、营养品、化妆品及动物用药。

24.根据权利要求1或4所述的方法，其中该蛋白质为融合蛋白质。

25.根据权利要求24所述的方法，其中该融合蛋白质包括效应物多肽。

26.根据权利要求24所述的方法，此处该融合蛋白质包括一种可提高融合蛋白质的转录的转录活化多肽。

27.根据权利要求24所述的方法，其中该融合蛋白质包括标记多肽。

28.根据权利要求24所述的方法，其中该融合蛋白质包括连接子多肽。

29.根据权利要求28所述的方法，其中该连接子多肽为可裂解连接子。

30.根据权利要求15所述的方法，其中该调节序列包括启动子，该启动子于约20-40日龄拟南芥属植物中在大于50％拟南芥属植物组织具有活性。

31.根据权利要求15所述的方法，其中该调节序列包括启动子，该启动子于叶、茎及根组织中的至少一或多者具有活性。

32.根据权利要求15所述的方法，其中该调节序列为一种选自拟南芥属肌动蛋白2启动子、OCS(MAS)启动子、CaMV35S启动子、玄蔘(figwort)斑纹病毒34S启动子及叶绿体启动子组成的组群的启动子。

33.根据权利要求1或4所述的方法，其中该蛋白质包括靶序列。

34.根据权利要求1或4所述的方法，其中该靶序列可将重组蛋白质靶向植物细胞的特定位置，该特定位置系选自下列组成的组群：细胞膜、胞外空间、质体及内膜。

35.根据权利要求34所述的方法，其中该靶序列为钙网素或枯草杆菌蛋白。

36.根据权利要求24所述的方法，其中该融合蛋白质包括位置特异性裂解位置。

37.根据权利要求1或4所述的方法，其还包括分离该蛋白质。

38.一种包括至少约10克的拟南芥属生物物质，其中该拟南芥属生物物质中至少0.1％可溶性蛋白质包括重组蛋白质。

39.根据权利要求38项的生物物质，其中该生物物质包括多于种子者。

40.一种对人类提供蛋白质的方法，包括对人类经口给予拟南芥属细胞或其部分。

41.根据权利要求40所述的方法，其中该蛋白质并未于拟南芥属自然表达。

42.根据权利要求40所述的方法，其中该蛋白质系由表达于拟南芥属细胞的重组基因编码。

43.根据权利要求40所述的方法，其中该细胞包括可用以提引出有效免疫反应的抗原。

44.根据权利要求40所述的方法，还包括由至少部分制造的拟南芥属收获生物物质，其中该生物物质并非种子。

45.根据权利要求44所述的方法，其中该收获系经历约2个生长周期至少进行约2次。

46.根据权利要求44所述的方法，其中该收获系经历约5个生长周期至少进行约5次。

47.根据权利要求44所述的方法，其中该收获系经历约10个生长周期至少进行约10次。

48.根据权利要求44所述的方法，其中该收获系经历多于2个生长周期至少进行约2次。

49.根据权利要求44所述的方法，其中该收获系经历多于5个生长周期至少进行约5次。

50.根据权利要求45或46所述的方法，其中至少有一个生长周期并未收获生物物质。