CN101340814B - 在植物中产生所需蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

包含谷蛋白的至少一种亚基和所需蛋白质的融合蛋白能提高植物中可利用形式的所需蛋白质的产生。这类融合蛋白可以通过提高可利用形式的特殊必需氨基酸的产量而改进植物，如稻米的营养价值。

Description

在植物中产生所需蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及表达有用蛋白质的植物基因表达系统。这类蛋白质包括药物、抗体链和具有高营养价值的蛋白质。本发明是关于产生与植物储藏蛋白谷蛋白相融合的所需蛋白质。根据所选择的控制序列，可采用种子特异性启动子在种子中或在植物的其它部分中产生所述融合蛋白。
背景技术
早已知道，若产生的所需蛋白质是融合蛋白，尤其是含有与表达宿主同源的氨基酸序列的融合蛋白是有利的。例如，LaVallie，E.R.等，CurrentOpinioninBiotech(1995)6：501-506提供了关于利用在大肠杆菌中融合表达所需蛋白质来克服与细菌表达有关的问题如形成包含体(需要再折叠方案)，或大肠杆菌不能完全除去氨基末端甲硫氨酸起始密码子的综述和评论。也可以将融合蛋白用于植物中产生多种效果。例如，Parmenter，D.L.等，PlantMol.Biol.(1995)29：1167-1180描述了产生作为与种子特异性蛋白质油质蛋白相融合的蛋白质的抗凝血蛋白水蛭素。油质蛋白是小蛋白质，埋在油体的磷脂单层内，因此此融合蛋白较易纯化。用此法在油菜籽中成功产生了水蛭素。VanRooijen，G.J.H.等，Bio/technology(1995)13：72-77也证明了油质蛋白编码序列在欧洲油菜(Brassicanapus)籽中能与异源β-葡糖醛酸糖苷酶成功融合。另一方面，尽管Vendekerckhove，J.等，Bio/technology(1989)7：929-932利用与2S种子储藏白蛋白融合在欧洲油菜和耳芥籽中产生了外源蛋白亮氨酸-脑啡肽，但由于融合影响到修饰种子储藏蛋白的翻译后变化，看来此法不太成功。
尤其相关的是Sardana，R.K.等，TransgenicRes.(2002)11：521-531的报道，此报道说在稻米乳胚特异性谷蛋白启动子Gt3调控下与谷蛋白的8个N末端氨基酸融合，可在转基因烟草植物中产生人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。看来提取自植物的包含8个谷蛋白氨基酸或只包含GM-CSF构建物的蛋白质具有生物活性。
尽管本发明涉及通常在植物中融合而产生的所需蛋白质，但具体应用是利用这类融合蛋白来提高营养物含量。植物蛋白质中，哺乳动物所需的9种必需氨基酸的含量较低。因此，例如，由于谷物蛋白质大都缺乏赖氨酸和其它必需氨基酸(Sun，S.S.M.等，TransgenicPlants(1993)1：339-371)，因此其营养价值严重限制了它们用作人类食品和动物饲料。稻米，一种低成本的能量和蛋白质来源和全世界超过一半人的主要食物，其必需氨基酸含量相对不平衡，赖氨酸是含量最有限的必需氨基酸。为谷物种子补充晶体赖氨酸或其它营养均衡的蛋白质来纠正该缺乏费用昂贵有时不可行。因此，改善稻米种子的蛋白质，提高其赖氨酸含量对依靠稻米作为主要主食的人们来说极其重要。
过去已做了大量努力来提高谷物蛋白质的质量(赖氨酸含量)，例如建立了玉米的不透明-2(opaque-2(o2))突变体(Mertz，E.T.等，Science(1964)145：279-280)。不幸的是，这类改良农作物常常伴有不良性状，如产量较低和对害虫和疾病更易感，而妨碍了它们在农业中的应用。类似地，种植赖氨酸含量较高稻米秧苗的努力也未获得显著成功。近年来，随着生物技术的进展，已证明可通过引入富含必需氨基酸的异源或改良基因编码储藏蛋白来提高农作物的营养价值可行。例如，提高了豆类和其它农作物，尤其是谷物中的含硫氨基酸甲硫氨酸和半胱氨酸的含量，但未能提高赖氨酸的含量(Sun，S.S.M.等，InVitroCell.Dev.Biol.-Plant(2004)40：155-162)。
克隆四棱豆(Psophocarpustetragonolobus)的编码18kDa富含赖氨酸蛋白质(LRP)的cDNA的方法可参见Sun，S.S.M.等的美国专利6,184,437所述。该蛋白质的赖氨酸含量为10.7摩尔％，具有提高谷物赖氨酸含量的极大潜力。更近年来，证明了LRP能在稻米谷蛋白Gt1启动子的控制下在转基因稻米植物种子中组织特异性表达和在转基因稻米的成熟种子中稳定积累(Liu等，未发表)。然而，LRP在转基因稻米种子中的积累水平不特别高，即使在最高表达情况下，其含量只约占种子储藏总蛋白的1％，导致干燥稻米种子中的赖氨酸含量只升高很少的％。因此，为了有效提高谷物的营养价值需要进一步提高赖氨酸含量。
即使可通过提高转录水平，如采用种子特异性强启动子而利用异源蛋白质，但仍然存在与产生稳定的成熟蛋白质所需的各种转录后步骤有关的障碍，例如，构象和亚细胞靶向和沉积。在以前的研究中，我们尝试过采用更强的启动子和/或与稻米储藏蛋白基因的信号肽序列相融合来增强LRP基因的表达，但在成熟的转基因种子中没观察到蛋白质产量的显著增加(Liu等，未发表)。
发明内容
本发明利用种子储藏蛋白谷蛋白的高效合成和包装系统产生了包含至少一种谷蛋白亚基的氨基酸序列和所需蛋白质序列的融合蛋白。可产生能提高植物营养价值的蛋白质。一实施方式是提高赖氨酸的含量。
因此，在一方面，本发明涉及包含与谷蛋白至少一种亚基的氨基酸序列融合的所需蛋白质的氨基酸序列的融合蛋白。还包含任选含有切割位点，具体是酶切割位点的接头序列。所需蛋白质可具有提高的营养价值和/或显示具有其它所需特性。本发明还包括产生这些蛋白质的重组材料，包括表达系统、包含所述表达系统的载体、含有这些表达系统的植物细胞和植物，和产生的融合蛋白和各种植物组织，具体是含有它们和/或所述融合蛋白本身的种子。所述谷蛋白可来源于任何植物。
本发明说明了如何与四棱豆(P.tetragonolobus)的编码富含赖氨酸蛋白质(LRP)的异源cDNA融合来改良编码谷蛋白储藏蛋白的稻米天然Gt1基因，而形成可高表达的Gt:LRP融合蛋白基因以提高其营养甲酯；然而，也可采用其它谷蛋白基因和可产生除LRP以外的其它蛋白质进行融合。因为谷蛋白具有两个亚基，可将所需蛋白质序列与一个或另一个或两个亚基偶联。所述融合蛋白还可包含任选含有切割位点的接头部分，以便回收独立于谷蛋白序列的所需蛋白质。
因此，本发明还包括在启动子序列控制下的种子特异性表达本发明融合蛋白的DNA构建物。可修饰单子叶植物或双子叶植物使其包含该构建物。稻米(OryzasativaL.)由于缺乏必需氨基酸赖氨酸，是一种营养不完全的主食，只用它来说明本发明。
本发明范围还包括修饰植物使其包含本发明的DNA构建物的方法，由所得植物或其后代或组织产生的食品和食品补充剂，和利用这些食品来增加营养的方法。
附图简要说明
图1a是用于转化稻米的二元构建物pGLF-B的示意图。
图1b是转基因稻米植物的Southern印迹分析。用于Southern和Northern印迹分析的LRP和Gt1特异性探针分别标示为“探针1”和“探针2”。
图2a-2c是Gt:LRP(B)融合蛋白基因在转基因稻米中表达的Northern印迹分析。
图3a-3c是Gt:LRP融合蛋白在转基因稻米成熟种子中积累的SDS-PAGE分析。
实施本发明的方法
本发明提供了使包含衍生自谷蛋白至少一种亚基的氨基酸序列和所需蛋白质的氨基酸序列的编码序列在植物中表达产生所需蛋白质的方法。所需蛋白质可以是需要产生的任何蛋白质，包括可用于治疗目的或可用来增强生物机体如哺乳动物、鸟类和鱼类生理机能或代谢的蛋白质。这类蛋白质包括，例如，人生长激素、人血清白蛋白、人表皮生长因子、鲑鱼生长因子、人α-干扰素、水蛭素、红细胞生成素、人α1-抗胰蛋白酶、人胚胎碱性磷酸酶、白介素、人毒蕈碱的胆碱能受体、葡糖脑苷脂酶、亚基疫苗(如，乙型肝炎)、抗体、植物口服疫苗等。该列表并不穷尽，仅是说明性的。
在一尤其重要的实施方式中，本发明提供了通过引入和表达一种或多种本发明转基因而显著提高植物各组织，包括种子如稻谷的营养价值的方法。这种提高不是通过提高蛋白总量，而是提高必需氨基酸的水平而实现。由于植物各组织的总蛋白质过剩会对其质地和储藏性能造成有害影响，因此优选不改变蛋白质总含量而能提高其营养质量。本发明以下所述的方法涉及天然植物储藏蛋白基因的基因工程改造方法，以使高营养价值的重组蛋白质在植物各组织中过量积累，供人和动物的消费。
在一些实施方式中，通过与谷蛋白融合在植物中产生的所需蛋白质含有更高价值的9种必需氨基酸中一种或多种。这些“必需”氨基酸是组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。“含量增加”或“富含”指，当经修饰的植物产生了此种融合蛋白时，这类氨基酸的含量高于未修饰植物中相应氨基酸的含量。或者，所需蛋白质中的此种氨基酸含量显著水平高于植物中所见的任何蛋白质的相应氨基酸的含量。“显著水平”指所述蛋白质占蛋白质总含量的至少10％、20％、30％或甚至50％。
如背景技术部分所述，稻米的氨基酸含量相对不均衡，其中赖氨酸是第一种含量有限氨基酸。其它谷类植物也如此。因此，本发明的一类重要植物是谷类植物，如稻米、小麦、燕麦和大麦。利用天然种子储藏蛋白的较高效表达和包装系统，本发明提供了定量修饰种子蛋白质的组成而显著提高植物种子如谷物的营养质量的方法。在以下实施例中，通过将谷蛋白与LRP融合来提高赖氨酸含量而提高转基因稻米种子的营养质量。赖氨酸含量的这种提高得自两个因素，其一是LRP多肽的赖氨酸含量高，另一是稻米谷蛋白的赖氨酸残基水平较高。将这两种谷蛋白和LRP的赖氨酸含量相组合，以及随后Gt:LRP融合蛋白在稻米胚乳中的过量积累会导致必需氨基酸赖氨酸的显著提高。
在一实施方式中，通过与编码四棱豆LRP的异源cDNA融合修饰种子储藏蛋白基因，稻米谷蛋白Gt1基因，使其富含赖氨酸残基。将此融合基因转入宿主细胞，优选稻米细胞中。此宿主细胞再生成为植物表达靶蛋白，和得到子代。已证明在高表达转基因稻米系中，工程改造的融合蛋白能够种子特异性地表达和积累到约占种子总蛋白质的30％和种子干重的2.7％。融合蛋白在种子中的过量积累能导致种子总赖氨酸含量显著增长，含量比非转基因亲本品系高45％以上，而未观察到转基因种子的总氮含量有统计学显著增长。还观察到转基因种子中其它一些氨基酸的浓度变化但其余的必需氨基酸水平无显著降低(如Met)。看来，Gt:LRP融合蛋白在转基因稻米种子中的高表达对其它种子蛋白的表达和种子外观有所影响。从转化株的后续子代中选择到多株纯合转基因品系进行田间试验。转基因与对照品系之间的农学性能没有差异或差异有限。在饲养大鼠的饲养试验中，当与非转基因野生型种子相比时，转基因稻米种子导致了体重、饲养效率、纯蛋白质消化率、生物利用值和蛋白质净利用的统计学显著性增加。这些发现证明了利用基因工程改造提高供人和动物消费的谷物农作物的营养价值是可行的。
以上概述仅说明了本发明的工作。本领域技术人员熟知对除LRP外的其它有关所需蛋白质、有关的各种谷蛋白基因和有关的各种各样植物可进行类似操作。
本发明采用谷蛋白亚基作为所需蛋白质的融合伴侣。对谷蛋白用作种子储藏蛋白的描述大体如下：
种子储藏蛋白，如来源自稻米的那些蛋白质，根据它们的溶解度，可分成白蛋白(水溶性)、球蛋白(盐溶性)、醇溶谷蛋白(醇溶性)和谷蛋白(残余物)。它们包装和储藏在称为蛋白体(PB)的细胞器内。谷蛋白和球蛋白位于液泡室(PBII)内，而醇溶谷蛋白位于内质网(ER)-衍生的PBI(Tanaka，K.等，Agric.Biol.Chem.(1980)44：16331639)、Okita，T.W.等，Annu.Rev.PlantPhysiol.Mol.Biol.(1996)47：327350)内。谷蛋白是稻米的主要储藏蛋白，其含量占种子胚乳蛋白的60-80％。与其它种子储藏蛋白相比，稻米谷蛋白含有更多的赖氨酸残基，储藏在PBII内。已证实易于被人和牲畜消化。这些特点使谷蛋白具有比其它谷物储藏蛋白更好的营养质量。而且，谷蛋白由至少6种不同类型组成的多基因家族所编码(Takaiwa，F.等，《种子蛋白(SeedProteins)》(1999)401-425，P.R.Shewry、R.Casey编，库鲁学术出版社(KluwerAcademicPublishers)，荷兰多德雷赫特市)，大多数谷蛋白基因在稻米胚乳中高表达和积累。因此，最宜将谷蛋白用作融合受体蛋白质有效产生靶蛋白来提高稻米的营养质量。
成功所需要的是构建的融合蛋白能否导致其高水平合成和积累，进而显著提高有关的必需氨基酸(含量)。可将所需蛋白质插入谷蛋白的一个或两个亚基中来实现这种需要。
本发明包括修饰植物使之能产生营养价值显著高于那些未修饰植物的种子或其它组织，或产生感兴趣的蛋白质的方法。所述方法包括以下步骤：
a)构建包含表达上述融合蛋白的DNA构建物的载体；
b)直接用该载体或经农杆菌(Agrobacterium)介导的转化系统转化植物细胞；
c)使植物细胞再生成为含本文所述DNA构建物的转基因植物或其子代；和
d)回收再生转基因植物的种子或其它组织如叶子。
转基因植物或其子代或植物细胞的繁殖物质可用于维持原种。
载体和DNA构建物的性质取决于所选择的用于转化的植物、转化方式和产生所需蛋白质的植物组织。启动子的性质能影响所述植物组织中的表达；合适的启动子包括，例如，对任何具体植物组织无特异性的常用的花椰菜花斑病毒35S启动子，以及那些组织特异性更强的启动子，如玉米醇溶蛋白和谷蛋白基因的启动子及光可诱导的可在曝光组织中表达的二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的启动子。其它更常见的基因包括持家基因，如玉米肌动蛋白基因。尤其合适的是马铃薯的块茎蛋白基因启动子，因为它能在可食用植物组织中高表达。其它种子特异性启动子包括以谷蛋白为代表的与多基因家族那些启动子有关的启动子，如GluA1-4、GluB1-4、GluA2-Gt1等。其它可采用其启动子的种子特异性基因是醇溶谷蛋白基因(RP3、prol17、RP5)；白蛋白基因(RA5、14、16和17)；和球蛋白基因(26kD和Gb1)。可选择启动子来提供所需的表达，根据时间和空间条件改变表达的强度。
因此，可根据已知的植物细胞表达技术和根据需要表达的植物组织而选择的调控序列来制备所需蛋白质的融合蛋白表达系统。在大多数情况下，优选植物的可食用部分。
可采用本领域已知的各种方法，包括直接摄入DNA，有些情况下摄入原生质体中，或粒子轰击或采用显微注射，或直接培育DNA与发芽花粉，或采用植物病毒，用构建的载体转化植物细胞。常用方法是农杆菌介导的基因转移，需要用含有DNA区段的载体将其整合入植物基因组DNA中。因此，此载体中采用了根癌农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒，因为这些质粒包含能够整合入植物细胞基因组中的转化DNA。为了构建这类载体，使编码融合蛋白的DNA侧接T-DNA边缘序列。载体中还可含有可选择标记。该系统尤其适用于双子叶植物，但也知道可用于单子叶植物。
或者，使原生质体暴露于强电场进行DNA转化，或者用小型微量移液器注射DNA或使其吸附到微粒如硫酸镁晶体或金颗粒上。
需要时，选择得到的细胞、培养，然后使它们再生成植物。然后收获含有融合蛋白的组织，根据所需蛋白质的性质进行加工。
如上所述，融合蛋白可含有接头以便回收无谷蛋白融合配体的所需蛋白质。接头的切割位点可包括对酶，如肠激酶或其它内肽酶处理敏感的那些位点，以及对试剂的特异性切割敏感的位点。
可用于本发明方法的合适植物包括谷类植物，如谷物(corn)、玉米(maize)、稻米、大麦、燕麦等，以及块茎植物如山药和马铃薯以及种植方便含有可食用部分的任何植物。
如果所需蛋白质是治疗剂或疫苗，或是诊断剂如抗体，则需要回收融合蛋白中的这些蛋白质。然后以本领域已知的方法所产生的具体的所需蛋白进行应用。如果目的是提高植物的营养价值而包含所需蛋白质，仍然可回收融合蛋白中的这种蛋白质，但不一定要。植物的可食用部分可直接用作食品供人消费或作为动物饲料。加工相关植物组织供牲畜消费或作为人类食谱成分的标准方法随所选择的具体植物和组织而不同，这是普通技术人员所熟知的。
实施例概述
在以下实施例中，利用稻米天然种子储藏蛋白谷蛋白与LRP融合，转基因稻米种子高水平产生了LRP。
商品化稻米变种或育种系均可用于转化实验。稻米组织培养和农杆菌介导转化的方法先前已有报道(Liu，Q.Q.等，ActaPhytophysiolSin(1998)24：259-271)。使筛选的具有潮霉素抗性的稳定转化植物再生，将T0转基因植物移种土壤作分子鉴定并使其生长，T1种子种在温室中。用从各T1植物收获的T2种子来鉴定具有纯合子转基因的植物。进一步繁殖选择的纯合子转基因品系和非转基因野生型植株进行田间试验和动物饲养研究。
进行RNA凝胶印染以确证转基因稻米谷粒中的融合基因表达。授粉后12-15天(DAP)用冷苯酚法分离得到发育稻米种子的总RNA(Liu，Q.Q.等，TransgenicRes.(2003)12：71-82)。使这些印迹与地高辛配基(DIG)标记的LRP或Gt1cDNA片段杂交，通过DIG核酸标记和检测系统(Roche)显色。
分析转基因植物种子的提取蛋白质的营养价值。发现转基因种子比野生型含有更高水平的赖氨酸。此外，用SDS凝胶电泳和Western印迹评估产生的融合蛋白水平从而鉴定特定的转基因植物系。
在温室中繁殖选择的纯合转基因植物系以获得足够多的种子作进一步的大规模田间试验。进行田间试验评价和评估在相同环境条件下所选转基因品系与未转化变种相比的形态学特性、产量和其它的谷物生理化学特性。该试验期间对主要的农学特性进行了仔细研究。种子成熟后，收获各小块试验田的米谷，小部分用来质量评估。余下的种子留作进一步繁殖和动物饲养试验。所有田间试验和转基因稻米的进一步商业推广均需要中国农业部的许可。这些均按中国政府提出的生物安全指导方针要求下进行。
通过实施本发明而产生的植物种子可用作新颖的营养增强动物饲料或饲料补充剂。出于该目的，按照上述用稻米作为例子的实施方式所发育成的转基因植物的成熟种子可以不经加工、或除壳和碾净成为糙米、去壳米和米糠碎片。完整谷物或经加工的一种碎片均可直接使用或与其它成分组合来饲养动物。用稻米种子作为动物的唯一或部分膳食源喂养的动物显示比非转基因对照组体重增加更为显著。证明与非转基因种子相比，转基因植物种子的饲料和蛋白质效率显著更高。
本发明不受以下公开实施例的限制。可以对转基因种子的蛋白质进行修饰，使其富含其它所需的营养性能供动物和人类消费，和其它农业应用。为了说明提供以下具体实施方式，不应解释为限制本发明的范围。应理解对本文所述内容进行的修饰和变化也属于本专利的思路和范围内。
实施例1
设计谷蛋白：LRP融合蛋白
该实施例中，分别在谷蛋白的酸性和碱性亚基的编码区中选择两个位点，插入LRPcDNA，研制了三类嵌合融合蛋白基因：Gt:LRP(A)、Gt:LRP(B)和Gt:LRP(AB)，分别代表将LRPcDNA插入谷蛋白编码序列酸性亚基(A)的Ax↓Ay、碱性亚基(B)的Az↓Aw或两个亚基(AB)的读码框内的。这3种融合蛋白中的赖氨酸含量是4.41摩尔％、4.41摩尔％或5.64摩尔％，分别比正常谷蛋白中的含量高84％、84％或135％。然后将这3种融合基因构建物引入稻米中，研究它们的表达和对转基因种子赖氨酸含量的影响。
用Gt:LRP(B)构建物做了进一步的工作。克隆包含稻米谷蛋白Gt1基因整个开放阅读框的基因组DNA片段(Okita，T.W.等，J.Biol.Chem.(1989)264：12573-12581)，通过分别在5’和3’末端加入BamHI和SacI限制性酶切位点进行扩增。图1a显示稻米Gt1基因是包含全部4个外显子、3个内含子、启动子(1.8kb)和部分3’UTR区(136bp)序列的3.8kb片段。限制性酶切位点的缩写：H为HindIII；B为BamHI；Nc为NcoI；H2为HincII；Sa为SacI；E为EcoRI。潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因是用于稻米转化的选择性抗生素抗性基因。然后将四棱豆的编码富含赖氨酸蛋白质(LRP)的含有起始密码子ATG但不含终止密码子的474bpcDNA序列(参见纳入本文的U.S.6,184,437)插入到Gt1基因的碱性亚基编码区的Az↓Aw处，即，距第4个Gt1外显子5’末端下游的69位与70位核苷酸之间。这不会影响稻米Gt1基因或四棱豆LRPcDNA的开放阅读框，从而获得编码赖氨酸含量提高的Gt:LRP融合蛋白的融合基因。将该融合基因克隆到二载体pCAMBIA1300多接头内的1.8kbGt1启动子与胭脂碱合酶(NOS)终止子之间(网址：cambia.com)。自动化测序验证所有的克隆和融合序列，将得到的质粒pGLF-B转移到根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105中。
实施例2
产生转基因稻米
利用高效的农杆菌介导转化系统(Liu，同上，1998)，用实施例1的pGLF-B构建物转化良种稻米栽培品种武香粳9。经含有50mg/l潮霉素的培养基选择后，产生了超过100个原代转基因稻米植物(T0植物)，代表了至少16种独立的转基因品系FB1-16。DNA凝胶印迹分析进一步证实转基因已整合入转基因植物的基因组中。找到了转基因的1-3个整合拷贝。
图1b显示转基因稻米植物的Southern印迹。用EcoRI消化所选的原代转化子(泳道1-12)和非转基因植物(泳道W)的基因组总DNA(10mg)，与DIG标记的LRPcDNA探针杂交(位于图1a的探针1)。标出了DNA分子质量标记的位置。如图所示，可用设计的能与LRP编码序列杂交的探针来检测这些提取物。
在温室中，大多数转基因植物均表现出正常表型，对成熟种子作进一步分析和繁殖。利用PCR分析和潮霉素抗性检验T1一代中的转基因分离。大多数转基因品系的转基因阳性与阴性秧苗的比率约为3∶1(数据未显示)，表明在所分析的转基因品系中发生了简单的转基因基因座整合。对T1和T2植物进行这种分离的分析后，筛选各原代转化子的含有纯合转基因的T2品系。
实施例3
在转基因稻米种子中表达融合蛋白基因
为了评估引入的融合蛋白基因的表达，首先利用分离自5原代转基因稻米植物发育种子的总RNA来检测该融合蛋白基因的转录情况。
如图2所示，对5种转化子每一种的12-15DAP发育种子(泳道FB1、2、5、6和8)和非转基因稻米(泳道W)的总RNA(5μg)进行电泳，印迹到尼龙膜上，与DIG标记的LRPcDNA(分图a)或Gt1基因(分图b)杂交。将溴乙锭染色的核糖体RNA置于UV光下来评估相同RNA样品的凝胶加载情况(分图c)。
该分析显示当与LRPcDNA探针杂交时，在转基因品系中只检测到一种稳态转录物，该转录物的分子量正如预期那样。在“野生型”对照稻米栽培品种(分图a)中未检测到这类转录物。当将同一凝胶与稻米Gt1探针杂交时，所有选择的转基因品系(分图b)显示有两种转录物。一种分子量低，在非转化植物中也存在，代表天然稻米谷蛋白基因转录物；而另一种分子量较高，仅在转基因品系中检测到，代表该融合蛋白基因的转录物。
Northern印迹分析显示该引入的融合蛋白基因转录正常，还显示转录物含量在不同的独立转基因品系中存在差异。此种差异与转基因拷贝数没有关系，可能是由于转基因的位置效应所致。在所有转基因稻米品系中融合蛋白基因的稳态转录水平均低于天然谷蛋白转录物(分图b)。
实施例4
融合蛋白在转基因稻米成熟种子中的高度积累
如图3所示，可经SDS-PAGE分离后考马斯蓝染色和免疫印迹分析来检测转基因植物种子中融合蛋白的稳定表达和高度积累。
将每种植物的成熟种子碾磨和碾碎成粉末，用1.5ml提取缓冲液(125mMTris-Cl、pH6.8、4Murea、4％SDS和5％2-巯基乙醇)提取100mg稻米粉的种子总蛋白质(Yamagata，H.等，PlantPhysiol.(1982)70：1094-1100)。离心粗提取物，取上清液进行SDS-PAGE，然后作Western印迹分析。为了定量测定转基因稻米种子中表达的融合蛋白，将标准蛋白牛血清白蛋白(BSA)和稻米种子总蛋白质提取物同时加到同一凝胶上。电泳后，作蛋白质染色，扫描输入GS690成像密度计扫描(ImagingDensitometerscan，BioRad)仪的计算机中，用分子分析仪软件进行分析。将凝胶中的蛋白质电泳转移到硝基纤维素膜上用兔抗LRP血清进行探查，进行Western印迹分析。采用与碱性磷酸酶偶联的山羊抗兔IgG检测Gt:LRP融合蛋白。
抽提原代转化子FB2(泳道1-4)和野生型对照(泳道W)各种仁的种子总蛋白质，在10％SDS-PAGE上进行分析。经考马斯蓝染色(块图a)和用LRP抗体(分图B)进行Western印迹分析后显示泳道1、3和4的种仁中存在Gt:LRP。经SDS-PAGE分离后，对提取自不同独立转基因FB品系含纯合转基因(泳道1-12)和野生型对照(泳道W)的种子总蛋白进行的考马斯蓝染色分析见分图c所示。(表达的Gt:LRP融合蛋白和稻米主要储藏蛋白质用右边的箭头标出。)分子量标记在分图b和c之间示出。
例如，在转基因品系FB2中，有一条强的额外条带，大小约为70kDa与融合蛋白的估计大小一致，在3/4的T1成熟种子中清晰可见。用LRP抗体进行免疫印迹证实它就是融合蛋白(分图a和b)。所分析的12种原代转基因品系中，11种品系显示结果与FB2类似。在所有检测的T1种子中只有一种品系(FB12)未显示有融合蛋白的表达。
这些结果证明该融合蛋白可以稳定翻译和在转基因稻米植物的种子中积累，也证实了转基因可在它们的子代中正常分离。
进一步从每种原代转基因品系中选出一种T2纯合品系以检测其成熟种子中融合蛋白的表达水平。如图3的分图c所示，融合蛋白的表达水平在不同的转基因品系中差异显著，FB1和FB2中最高。通过扫描分析SDS-PAGE中的染色蛋白质，估计转基因稻米种子中融合蛋白的含量达到胚乳干重的0.2-2.7％，根据种子总蛋白质含量占亲本稻米变种成熟干燥种子的8-10％计，占FB1品系种子总蛋白质的30％。
在正常稻米的种子中，谷蛋白先合成为57kDa的前谷蛋白原前体，转移到液泡内，在那里被部分蛋白水解加工成酸性和碱性亚基。转基因稻米种子中的融合蛋白表达只能产生一种稳态蛋白质，具有完整融合蛋白的分子量，表明该前融合蛋白原在转基因稻米的胚乳中未经加工，Gt:LRP融合蛋白中保存了谷蛋白的酸性与碱性亚基之间的加工位点。
除了此融合蛋白的额外条带外，在几种转基因稻米品系如FB1、FB2和FB10的种子中也观察到总蛋白质表达模式的明显改变，包括其它储藏蛋白的表达水平降低和谷蛋白前体的加工效力降低。这些蛋白质转录水平降低进一步证实了它们的水平发生改变(数据未显示)。然而，在积累了高水平融合蛋白的一些转基因品系如FB5和FB8中没有或几乎没有观察到其它储藏蛋白模式的改变(图3，分图c)。
选择显示有高水平融合蛋白的3种纯合转基因品系FB1、FB2和FB8，通过田间、品质和动物饲养试验作进一步评估。
实施例5
转基因稻米种子的营养组成
为了检测Gt:LRP融合蛋白对转基因稻米种子营养含量的贡献，在相同的田间条件下培养纯合转基因稻米品系和它们的非转基因亲本到成熟。碾磨成熟种子样品，分析它们的氨基酸和总蛋白质水平(表1)。转基因种子中的蛋白质总含量与非转基因亲本的含量相当或略低。如表1所示，例如，转基因品系FB8成熟种子的粗蛋白质总水平与非转基因对照类似，而转基因品系FB1和FB2的粗蛋白质总水平分别低13.5％和7.9％。这些数据显示其它种子蛋白质水平降低以补偿融合蛋白在转基因种子中的高度积累。
为了分析转基因种子的总蛋白质和氨基酸组成，采用因子为5.95的Kjeldahl方法测定总氮量计算碾碎的转基因种子的粗蛋白质总含量。110℃用6NHCl水解24小时后，在贝克曼(Beckman)6300氨基酸分析仪上用离子交换色谱测定氨基酸浓度。
表1
3种纯合转基因品系和非转基因野生型成熟稻米种子的氨基酸组成和蛋白质总含量(碾碎种子干重％)
*数值表示3次重复的平均值加减标准误差。
如表1所示，与总蛋白质组成的变化一致，种子氨基酸的分布有显著差异，尤其是赖氨酸。高水平积累融合蛋白的转基因植物干燥种子赖氨酸含量比野生型显著提高。这种提高与融合蛋白的表达水平正相关，在纯合转基因品系FB2中，可以达到比对照高出45％。转基因种子总蛋白质中的赖氨酸含量也比野生型对照高得多，转基因品系中高出10-60％的水平明显高于以种子干重为基础的水平。这种提高还伴有少数其它氨基酸浓度的某些改变，如转基因植物中，天冬氨酸、苏氨酸和异亮氨酸的含量显著提高，而酪氨酸和精氨酸的水平有些下降。然而，这些氨基酸的变化范围比赖氨酸低得多。
因此，通过表达Gt:LRP融合蛋白，其赖氨酸含量提高表示稻米种子蛋白质的总体营养质量得到非常显著的提高。
实施例6
田间表现和谷物质量的评价
2003年早期中国农业部批准了该转基因稻米的田间评价。在中国江苏扬州大学的实验农场上培育了4种稻米材料，包括3种纯合转基因稻米的T3代，FB1、FB2和FB8以及它们的非转化野生型栽培品种武香粳9进行试验。将稻米种子播种到苗床内培育1个月后移植到隔离良好的安全田地上。每种试验材料安排3份复制，每份复制种植4种试验品系作为随机小试验田。每块小试验田的大小为12.4m2，种上400株植物(每穴一棵植物)。接着进行标准化的正常农业作业，在实验过程中仔细研究主要农业特性。种子成熟后，分别收割每块小试验田的稻米谷粒，根据中国粮谷质量国家标准对它们的质量进行评估。
在不同的转基因品系与未转化对照中或它们之间，均未观察到整个植株以及圆锥花序的形态学特性有统计学差异(表2)。这些稻米品系中，种仁形状(如，种仁长度和宽度)和谷物理化质量(如，淀粉组成和加工性能)也无明显差异(数据未显示)。但是，在FB2转基因品系中观察到对谷物的外观性状和重量有负面影响，其中与未转化对照相比可观察到不透明胚乳表型。如表2所示，谷物白粉化(chalkiness)程度，即影响稻米外观品质的因素，FB2转基因品系比未转化对照高得多。在野生型对照中，不到一半的谷物胚乳呈现某种程度的白粉化，白粉化胚乳内只有少量区域不透明。在几乎所有的转基因品系FB2谷物中观察到白粉化外观，每个胚乳中的白粉化面积有所扩大。在高表达和积累融合蛋白的天然种子蛋白分布模式发生改变的几种其它转基因品系如FB1、FB5和FB10中也可观察到这种现象。
这些数据显示负面外观表型与融合蛋白的高表达和种子蛋白分布模式后续变化有关。FB2转基因品系白粉化程度增加导致的谷物重量比未转化对照轻，进而引起产量降低。
表2
田间试验的转基因和非转基因稻米品系的农业性状和谷物白粉化(中国扬州，2003)
括号内为标准误差。
然而，也有例外，因为我们仍可鉴定和选择到几种转基因品系，其谷物的外观和重量不因它们高表达融合蛋白而受影响，如表2的FB8品系显示的那样。与野生型相比，转基因品系FB8在其天然种子蛋白的表达分布模式、各谷物组分和产量未显示有任何显著差异，然而，其稻谷中高表达了此融合蛋白而营养价值显著提高。
实施例7
动物饲养试验
在饲养试验中用转基因稻米喂养大鼠以评估其营养价值的提高。碾磨作为上述田间试验一式二份的混合物(来自3块小试验田)的每种稻米品系谷粒，碾碎，然后用作动物饲养研究的唯一淀粉和蛋白质来源。食物成分采用美国营养研究学会推荐的AIN-93G配方(Reeves，P.G.等，J.Nutr.(1993)123：1939-1951)，由850g/kg碾碎稻米粉、35g/kg无机盐混合物(AIN-93-MX)、10g/kg维生素混合物(AIN-93G-VX)、40g/kg纤维质、60g/kg大豆油、3g/kg胱氨酸、2.5g/kg胆碱酒石酸氢盐和14mg/kg叔丁基氢醌组成。用纯化玉米淀粉代替稻米粉和胱氨酸制备无蛋白质食物，进行氮平衡估计。
将体重70-80g的四周龄雄性斯普拉-道来(Sprague-Dawley)大鼠圈养在不锈钢网底代谢笼内，分别收集粪便和尿液。每种食物随机选择6只大鼠作为一组，在整个30天实验过程中，每只动物自由获取水和食物。仔细记录每只大鼠食物摄取量和体重增加量。
如表3所示，与非转基因食物相比，大鼠消耗了更多的转基因种子食物。每只大鼠每天摄入12克以上的转基因食物，相比只摄入9.5克非转基因食物。观察到转基因食物的纯蛋白质消化率、生物值和蛋白质净利用率均有统计学显著提高。接收转基因稻米种子作为其唯一氮源的大鼠比非转基因对照组增重更为显著。
表3
通过饲养大鼠评估转基因和非转基因稻米的营养价值
稻米 体重增加(BWG)(克/天/大鼠) 食物摄取(DI)(克/天/大鼠) 饲养效率(克BWG/克DI) 蛋白质效率(克BWG/克蛋白质摄入) 纯蛋白质消化率(N摄入％) 生物利用值(吸收N％) 蛋白质净利用率(N摄入％)
WT 1.07(0.13) 9.50(0.83) 0.113(0.013) 1.25(0.15) 94.34(1.17) 89.82(2.63) 84.73(2.21)
FB2 2.19(0.21) 12.21(0.86) 0.179(0.012) 2.04(0.13) 96.81(0.87) 94.11(1.16) 91.10(0.99)
FB8 2.16(0.24) 12.90(0.87) 0.168(0.011) 1.80(0.12) 97.05(0.46) 92.58(2.99) 90.01(3.05)
FB1 1.95(0.29) 11.87(1.16) 0.164(0.011) 2.00(0.13) 97.27(0.67) 94.03(2.12) 91.46(2.26)
括号中为标准误差。

Claims (14)

1.一种融合蛋白，其氨基酸序列包含至少一种稻米谷蛋白酸性或碱性亚基的氨基酸序列和所需蛋白质的氨基酸序列，所述所需蛋白质插入谷蛋白的所述一个或两个亚基的氨基酸序列，所述所需蛋白质是治疗蛋白或用来增强哺乳动物、鸟类和鱼类生理机能或代谢的蛋白。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所需蛋白质富含9种必需氨基酸：组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和/或缬氨酸中的一种或多种。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所需蛋白质富含赖氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和/或色氨酸。
4.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由植物产生，所需蛋白质中的组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和/或缬氨酸含量高于所述植物蛋白质中的相应氨基酸含量。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所需蛋白质由植物产生，其赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸和/或半胱氨酸含量提高。
6.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所需蛋白质的赖氨酸含量高于所述植物蛋白质的赖氨酸含量。
7.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所需蛋白质是四棱豆来源的富含赖氨酸的蛋白质。
8.一种核酸，包含编码权利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列。
9.一种可在植物细胞中操作的表达系统，包含权利要求8所述的核苷酸序列，操作性地相连于能影响其在植物细胞内表达的控制序列。
10.一种包含权利要求9所述表达系统的载体。
11.如权利要求10所述的载体，其特征在于，其包含在农杆菌中。
12.一种产生包含谷蛋白的至少一亚基和所需蛋白质的氨基酸序列的融合蛋白的方法，所述方法包括在能产生所述融合蛋白的条件下培养包含权利要求9的表达系统的细胞、植物或植物部分。
13.一种包含权利要求1所述融合蛋白的食物或食品。
14.如权利要求13所述的食品，其特征在于，其用于饲养牲畜。
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