CN102137932A - 植物中提高的蛋白质产量和贮存 - Google Patents

Abstract

缺乏一种或多种植物种子贮藏蛋白的转基因双子叶植物，其还包含转基因多核苷酸构建体，所述构建体包含可操作地连接至贮藏蛋白启动子和ER信号序列的开放阅读框。多核苷酸构建体编码可以以高水平在种子中积累的蛋白质产物。还提供了在植物种子中产生异源蛋白质的方法。

Description

植物中提高的蛋白质产量和贮存

交叉参考相关申请

本申请要求对2008年6月28日提交的美国临时申请系列案61/076,616(其以其全文通过引用合并入本文)的优先权。

关于联邦政府资助的研究或开发的申明

本发明部分地在由USDA授予并且由University of Missouri，Columbia管理的专项研究基金#2006-06103下得到美国政府资助，并且得到USDA Agricultural Research Service的校内研究资助(项目号#3622-210000-025-00)。美国政府在本发明中可具有某些权利。

联合研究协议的名称和参与者

本发明由Donald Danforth Plant Science Center与美国政府(由U.S.Department of Agriculture，Agricultural Research Service(″USDA″)代表)之间的联合研究协议产生。因此，美国政府在本发明中可具有某些权利。

发明领域

本发明涉及植物遗传学领域。更具体地，本发明涉及基因构建体和使用所述构建体改良植物种子以产生提高量的目的蛋白质的方法。

发明背景

种子为人和牲畜提供了膳食蛋白质的重要来源。某些种类的种子例如大豆能够积累相对高水平的内源蛋白质，从而使大豆成为进行遗传修饰以产生引入的蛋白质的良好选择。尽管许多分子工具是可获得的，然而种子的遗传修饰通常受到工程改造的蛋白积累不足的限制。许多细胞内过程可影响总蛋白质积累，包括转录、翻译、蛋白质装配和折叠、甲基化、磷酸化、转运和蛋白质水解。一个或多个此类过程的干扰可增加在基因工程改造的种子中产生的蛋白质的量。

基因的引入可对植物生长和发育造成有害作用。在这样的情况下，基因的表达可能需要被限制于期望的靶组织。例如，可能必需以种子特异性方式表达氨基酸脱调控基因以避免可影响产量或其他农艺性状的不期望的表型。

大豆种子包含35％至43％的蛋白质(基于干重)；该蛋白质大部分为贮藏蛋白(storage protein)。存在两种主要的大豆种子贮藏蛋白：大豆球蛋白(也称为11S球蛋白)和β伴大豆球蛋白(也称为7S球蛋白)。它们总共占70至80％的种子总蛋白，或25至35％的种子干重。

大豆球蛋白是具有大约360kDa的分子量的大蛋白。其是由鉴定为G1、G2、G3、G4和G5的5个主要亚基的不同组合组成的六聚物。

β伴大豆球蛋白是具有范围在150至240kDa之间的分子量的异质糖蛋白。其由鉴定为α、α′和β的3个高度带负电荷的亚基的不同组合组成。

Kinney和Herman(″Cosuppression of the α Subunits ofbeta-conglycinin in Transgenic Soybean Seeds Induces theFormation of Endoplasmic Reticulum-Derived Protein Bodies″PlantCell 13：1165-1178(2001))报导，使用包含可转录成β伴大豆球蛋白5′非翻译前导序列的区域的构建体的转化导致β伴大豆球蛋白的α和α′亚基的减少。Kinney和Herman指出，″β伴大豆球蛋白的减少可明显地由大豆球蛋白和其他液泡蛋白在ER中的增加的积累补偿″，这使得他们推测，“可能通过共表达其他蛋白质，可能作为具有可切割间隔子的大豆球蛋白融合蛋白，可能能够改造大豆以高水平表达和积累需要ER介导的折叠和加工事件的外源蛋白。Kinney和Herman没有教导在大豆种子中减少β伴大豆球蛋白的表达，同时在大豆球蛋白启动子的控制之下表达融合至ER信号肽的外源蛋白。

Oulmassov等(美国专利申请2005/0079494)描述了在启动子例如大豆球蛋白启动子的控制下的突变的大豆球蛋白的表达。Oulmassov等还描述了反义介导的包含低含量的必需氨基酸，但在特定的组织中仍然以相对高水平表达的序列(例如β伴大豆球蛋白和大豆球蛋白)的抑制。Oulmassov等人没有教导减少β伴大豆球蛋白的表达对于在大豆球蛋白启动子的控制之下表达的蛋白质的表达和积累的任何可能后果，也没有教导在大豆种子中抑制β伴大豆球蛋白的表达，同时表达在大豆球蛋白启动子控制之下的融合至ER信号肽的外源蛋白的任何可能后果。

Wu(美国专利申请2007/0067871)描述了具有增加的种子β伴大豆球蛋白含量的大豆，其包括提供至少两个大豆球蛋白亚基的无义突变表型(null phenotype)的非转基因突变。Wu没有教导减少β伴大豆球蛋白或大豆球蛋白的表达或表达外源蛋白。

本领域中需要的是，使用大豆产生高水平的目的蛋白质(例如用于食品、燃料、饲料、工业酶、生物加工酶、疫苗、治疗性蛋白、抗体等的蛋白质)的方法。

发明概述

本文中提供的是在种子中产生增加量的目的异源蛋白质的方法。在一个实施方案中，遗传抑制种子蛋白的产生引起种子通过增加其他蛋白质的产量来重新平衡其蛋白质组成以维持正常的种子蛋白含量。可将该效应与基因的“等位基因模拟物(allele mimic)”的使用组合以驱动异源蛋白质的表达，所述基因被上调以重新平衡蛋白质含量。

在一个实施方案中，本文中提供的是转基因双子叶植物，所述植物缺乏一种或多种植物贮藏蛋白并且具有拥有可操作地连接至贮藏蛋白启动子和ER信号序列的开放阅读框的异源多核苷酸。任选地，异源多核苷酸还包含5′翻译增强子结构域(TED)和/或3′TED。任选地，异源多核苷酸还包含ER滞留序列以诱导异源多核苷酸在ER或ER衍生的小泡的腔中积累。

在另一个实施方案中，提供了转基因双子叶植物，所述植物缺乏一种或多种种子贮藏蛋白并且具有异源多核苷酸，所述异源多核苷酸具有种子贮藏蛋白启动子、具有ER信号序列、期望的蛋白质编码序列和ER滞留信号的开放阅读框，其中所述缺乏导致内源种子贮藏蛋白相对于野生型植物的种子贮藏蛋白减少至少50％，其中所述开放阅读框可操作地连接至种子贮藏蛋白启动子，并且其中转基因植物的种子能够以高于5％的种子总干重的水平产生异源蛋白质。异源多核苷酸还可具有5′翻译增强子结构域和/或3′翻译增强子结构域。ER滞留序列可诱导异源蛋白质在ER或ER衍生的小泡的腔中积累。双子叶植物可以是例如豆科(Fabaceae)，任选地豆目(Fabales)，任选地大豆属(soya genus)的成员。双子叶植物可以是大豆属(Glycine genus)的成员例如大豆。启动子可来源于例如Kunitz胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、免疫显性大豆变应原P34或Gly m Bd 30k、葡萄糖结合蛋白、种子成熟蛋白、大豆球蛋白或伴大豆球蛋白。翻译增强子结构域可来源于Kunitz胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、免疫显性大豆变应原P34或Gly m Bd 30k、葡萄糖结合蛋白、种子成熟蛋白、大豆球蛋白或伴大豆球蛋白。缺乏的贮藏蛋白可以是例如Kunitz胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、免疫显性大豆变应原P34或Gly m Bd 30k、葡萄糖结合蛋白、种子成熟蛋白、大豆球蛋白或伴大豆球蛋白中的一个或多个。在一个实施方案中，缺乏可以因例如编码种子贮藏蛋白的核酸的RNAi、反义或有义片段的存在而引起。

本文中提供的双子叶植物种子可具有例如种子内源贮藏蛋白的多于75％的缺乏。异源蛋白质可在双子叶植物的种子中积累至大于大约2％或大于大约4％或大于大约5％的种子总干重的水平。在另一个实施方案中，提供了转基因种子或获自所述种子的蛋白质。可纯化异源蛋白质。

在一个实施方案中，蛋白质编码序列编码酶或其片段。酶可以是纤维素分解酶例如β-葡糖苷酶、外切葡聚糖酶1、外切葡聚糖酶II、内切葡聚糖酶、木聚糖酶、半纤维素酶、木质酶、木质素过氧化物酶或锰过氧化物酶。在一个实施方案中，提供了商业上有用的酶组合物。

在一个实施方案中，本文中提供了转基因双子叶植物，所述植物缺乏一种或多种内源植物贮藏蛋白而具有异源多核苷酸，其中所述缺乏导致内源植物贮藏蛋白的水平相对于野生型植物减少至少50％，所述异源多核苷酸具有可操作地连接至开放阅读框的补偿蛋白的基因调控区，所述阅读框编码具有ER信号序列、期望的蛋白质编码序列和ER滞留信号的序列，其中转基因双子叶植物的种子能够以大于5％的种子总干重的水平产生异源蛋白质。

在另一个实施方案中，本文中提供了通过将酶贮藏在种子中而在使用之前稳定地贮藏酶的方法，所述种子来自缺乏一种或多种植物贮藏蛋白但具有异源多核苷酸的转基因双子叶植物，其中所述缺乏导致内源种子蛋白减少至少50％，所述异源多核苷酸具有种子贮藏蛋白启动子、开放阅读框，所述开放阅读框具有编码ER信号序列、目的酶和ER滞留信号的核酸，其中所述开放阅读框可操作地连接至种子贮藏蛋白启动子，并且其中转基因植物的种子能够以大于5％的种子总干重的水平产生酶，并且将酶贮藏在转基因双子叶植物的种子中。

在另一个实施方案中，本文中提供了在双子叶植物中产生提高量的异源蛋白质的方法，所述方法用多核苷酸(所述多核苷酸具有种子贮藏蛋白启动子、开放阅读框，所述开放阅读框具有ER信号序列、期望的蛋白质编码序列和ER滞留信号，其中所述开放阅读框可操作地连接至种子贮藏蛋白启动子)稳定地转化植物细胞，从稳定转化的植物细胞获得纯合植物品系，将稳定转化的植物品系种质渗入(introgress)至缺乏内源种子贮藏蛋白的植物，培养经种质渗入的转基因植物的种子，从种质渗入的转基因植物的种子获得异源蛋白质，其中所述缺乏导致内源种子贮藏蛋白相对于野生型植物的内源种子贮藏蛋白减少至少50％，其中种质渗入的转基因植物的种子能够以大于5％的种子总干重的水平产生异源蛋白质。内源种子贮藏蛋白的缺乏可因例如编码种子贮藏蛋白的核酸的RNAi、反义或有义片段的存在而引起。

在另一个实施方案中，提供了在双子叶植物中产生增加量的异源蛋白质的方法，其包括用多核苷酸稳定转化植物细胞，所述多核苷酸具有种子贮藏蛋白启动子、开放阅读框，所述开放阅读框包含ER信号序列、期望的蛋白质编码序列和ER滞留信号；其中所述开放阅读框可操作地连接至种子贮藏蛋白启动子；其中所述核苷酸还包含能够下调内源种子贮藏蛋白的RNAi序列；获得纯合植物品系，和培养植物的种子以获得异源蛋白质。

附图概述

图1是从内质网(ER)至蛋白质贮藏液泡或蛋白质体(protein body)(PB)的亚细胞定位的不同途径的模型。

图2是显示经设计用于抑制大豆球蛋白的RNAi构建体的示意图。大豆球蛋白基因和fad2(脂肪酸去饱和酶)基因的区段包括在RNAi构建体中。加入fad2区段作为构建体的任选特征，从而提供了用于另外的筛选的标记。

图3是电子显微照片，其显示来自种子蛋白缺乏品系″SP-″植物的细胞形成蛋白质贮藏液泡(PSV)(图框A)，所述蛋白质贮藏液泡在大小和外观上与在来自WT种子的细胞中形成的PSV(图框B)明显相似。PSV：蛋白质贮藏液泡；OB：油体；AV：自噬泡；ER：内质网；Nucl：细胞核；G：高尔基体。条棒相当于1μm。

图4是野生型(WT)品种″Jack″与SP-种子的蛋白质组之间的双向等电聚焦/十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF/SDS-PAGE)比较的照片。

图5是使用Affymetrix DNA阵列平台测定进行的SP-与WT品种″Jack″相比较的大规模转录组测定的散布图。

图6是显示WT(″Jack″)对SP-大豆品系的种子中种子蛋白质组成的变化的饼图。

图7是显示GFP-kdel构建体的详细情况的示意图。标示了大豆球蛋白启动子、大豆球蛋白5′UTR(″TED″)、ER信号序列、GFP编码序列、kdel ER滞留信号序列和大豆球蛋白3′UTR(″TED″)。标示了转录起始位点、翻译起始位点和翻译终止位点。

图8是显示两个纯合亲本品系和杂交的纯合后代的大豆种子的白光(图框A)和蓝光(图框B)图像的一组照片。显示的种子已被破裂，从而暴露子叶组织(图框A和B)。图框C和D是WT背景(图框C)和GFP-kdel x βCS(图框D)的种子中来自GFP-kdel(添加了C末端KDELER滞留标签的GFP蛋白)的贮藏薄壁组织细胞的伪彩色GFP图像。条棒相当于10μm。

图9是来自βCS种子(β伴大豆球蛋白被抑制的；图框A)、GFP-kdel种子(图框B)和GFP-kdel x βCS种子(图框C)的蛋白质裂解物的2D IEF-PAGE分离以及针对GFP进行探测的重复裂解物凝胶的免疫印迹(图框D)的一组照片。GFP-kdel(图框B和C)或GFP对照蛋白质点包封在所标记的盒中。GFP-kdel性状至βCS品系内的种质渗入导致增加的GFP-kdel的积累。使用商业单克隆抗体探针通过印迹上的免疫反应性来确定GFP点的身份(identity)(图框D)。

图10显示βCS、WT中的GFP-kdel或GFP-kdel x βCS的荧光显微镜检查(图框A)、1D PAGE(图框B)和β伴大豆球蛋白免疫印迹(图框C)。

图11是从βCS、WT中的GFP-kdel或GFP-kdel x βCS种子制备并且使用商业GFP作为对照标准进行测定的种子裂解物中GFP-kdel丰度的荧光分析的条形图。

图12是显示WT(″Jack″)、βCS和GFP-kdel x βCS中大豆球蛋白的加工的分级分离的种子蛋白质的单向PAGE的照片。扫描所获得的染色的凝胶，并显示总计的前大豆球蛋白(proglycinin)的前大豆球蛋白级分、大豆球蛋白A4、大豆球蛋白酸性亚基和大豆球蛋白碱性亚基的相对分布。结果显示大豆球蛋白群体的前大豆球蛋白级分的大于3倍的降低。标示了分子量标记和贮藏蛋白同种型。

图13是SP-植物(图框A)、在WT背景中转化的GFP-kdel(图框B)和用GFP-kdel种质渗入的SP-植物(图框C)中蛋白质产量的2-D凝胶分析的照片。

图14是从SP-植物、用GFP-kdel转化的WT植物和GFP-kdel x SP-杂种的种子制备的种子裂解物中GFP-kdel丰度的荧光分析的条形图。商业GFP用作对照标准。

图15是显示βCS x GFP-kdel植物的晚熟种子细胞的细胞质中蛋白质体的丰度的电子显微照片。图框A：蛋白质体包含分散的基质并且被ER膜包围。图框B：显示蛋白质体的ER来源的图像。PSV；蛋白质贮藏液泡；OB＝油体。条棒相当于1μm。

发明详述

本文中提供的是经遗传改良的双子叶植物，其具有产生大量的异源目的蛋白质的种子。在某些实施方案中，种子缺乏至少一种内源种子贮藏蛋白，从而允许在其中产生增加量的外源蛋白质。可将编码异源蛋白的核酸序列可操作地连接至来自种子蛋白质的调控区。在一些实施方案中，该调控区来源于响应内源种子蛋白的缺乏而天然上调的种子蛋白。

在一些实施方案中，可将双子叶植物中的遗传编程(geneticprogramming)成功地用于产生目的蛋白质，例如在质量和数量上优良的蛋白质(例如，重组蛋白)。

在一些实施方案中，修饰植物的遗传背景以便一种或多种贮藏蛋白的量(例如按重量计)存在缺乏。通过使用一种或多种贮藏蛋白启动子来驱动靶蛋白质的转录，植物的重新平衡机制可导致特别高水平的异源蛋白质产量。

在该实施方案中，不希望受理论束缚，响应引起主要种子贮藏蛋白丧失的遗传缺陷，种子通过增加其他种子贮藏蛋白的产量来“重新平衡”。通过将目的异源基因连接至被上调以重新平衡种子中蛋白质的总量的内源种子蛋白的基因调控元件，可在种子中产生高水平的异源蛋白质。由于外源蛋白质的该高水平的积累，该“等位基因模拟物”法可用于在大豆或其他双子叶植物种子中产生蛋白质，特别是具有商业价值的蛋白质。

此外，异源蛋白质至ER的任选靶向允许其稳定地以甚至更高的水平在种子中积累。可在异源蛋白质上对信号进行工程改造，这可导致靶蛋白被扣留在ER衍生的小泡中，无论植物是否天然产生生理学上的蛋白质体。此类ER衍生的小泡令人惊讶地不含其他蛋白质例如蛋白酶、糖苷酶等，从而以较少被降解或较不可降解的形式积累更高水平的蛋白质。如本文中所使用的，使用下列缩写和定义。

术语″大豆球蛋白″意指也称为11S球蛋白的主要种子贮藏蛋白，其存在于大豆种子中。

术语″β伴大豆球蛋白″意指也称为7S球蛋白的主要种子贮藏蛋白，其存在于大豆种子中。

术语“GBP”意指葡萄糖结合蛋白。

术语″KTI″意指Kunitz胰蛋白酶抑制剂。

术语″LE″意指大豆凝集素。

术语″P34″意指免疫显性大豆变应原P34或Gly m Bd 3。

缩写″fad2″意指编码″脂肪酸去饱和酶″基因的一部分的序列。

如本文中所使用的，术语“植物”包括植物细胞、植物原生质体、植物胼胝体、植物块(plant clump)和在植物或植物部分例如花粉、花、胚、种子、荚果、叶、茎等中完整的植物细胞。

术语″PB″意指蛋白质体。此类单层膜小泡能够贮藏蛋白，并且直接来源于内质网(与下面描述的PSV相反)。

术语″PSV″意指蛋白质贮藏液泡。在种子中，这些小泡通常在种子的成熟和干燥过程中通过液泡的分隔形成。因此，通常存在于液泡中的降解蛋白质的酶也可存在于PSV中。在正常大豆种子中，大多数积累的蛋白质位于这些细胞器中。

术语″SMP″意指种子成熟蛋白。

术语″贮藏蛋白″意指特异性在植物例如种子中积累的蛋白质。

缩写″BBI″意指″包曼-毕尔克抑制剂(bowman birk inhibitor)″，其是丝氨酸蛋白酶抑制剂。

术语″βCS″意指只缺乏贮藏蛋白β伴大豆球蛋白的植物。

术语″SP-″意指贮藏蛋白敲低，即，缺乏大豆球蛋白和β伴大豆球蛋白的植物。

术语″种子″通常包括种子本身(proper)、种皮和/或种壳或其任何部分。

″种子成熟″意指始于受精且终止于种子干燥的时期，在此期间中可代谢的贮藏物例如淀粉、糖、寡糖、酚类化合物、氨基酸和蛋白质沉积至种子的不同组织，从而导致种子增大、种子填充(seed filling)。

术语″WT″意指野生型和意指植物的天然存在的背景，或，根据使用的上下文很明显地，WT可以指具有天然存在的遗传背景但用于本发明的基因操作的植物。

术语″ORF″意指开放阅读框；即编码肽(例如，“靶蛋白质”)的序列。一般地，该序列不被编码氨基酸序列的起始密码子与终止密码子之间的内含子中断。

术语″异源多核苷酸″通常意指除了作为转化事件的结果外不同等地存在于宿主植物中的多核苷酸。术语″异源DNA″、″异源基因″或″外源DNA″意指DNA，通常意指DNA编码序列(“异源编码序列”)，其已被从另一个来源(即，非植物来源或来自另一个植物物种，或被置于通常控制另一个编码序列的植物启动子的控制之下的相同物种的编码序列)引入植物细胞。

术语″内源″基因意指通常在其基因组的天然位置上发现的天然基因，并且不是分离的。″外源″基因意指通常不在宿主生物中发现而是通过基因转移引入的基因。

术语″编码序列″或″编码区″意指编码特定蛋白质的DNA序列。

在本发明的说明书中，″嵌合基因″或″表达盒″意指可操作地连接至编码期望的基因产物的DNA序列的启动子序列和优选地转录终止序列。在优选实施方案中，嵌合基因还包含在启动子与基因产物编码序列之间与基因产物编码序列符合翻译框地可操作地连接的信号肽编码区。该信号序列帮助将蛋白质定位至ER。所述序列还可包含转录调控元件，例如上述转录终止信号以及翻译调控信号例如终止密码子。

″可操作地连接″意指表达盒的组分被连接以用作表达异源蛋白质的单位。例如，可操作地连接至编码蛋白质的异源DNA的启动子促进相应于异源DNA的功能性mRNA的产生。

″RNA转录物″意指因RNA聚合酶催化的DNA序列的转录而产生的产物。

术语″信使RNA(mRNA)″通常意指可被细胞翻译成蛋白质的RNA。

术语″有义″RNA通常意指包括mRNA的RNA转录物。术语″反义RNA″意指与靶初级转录物或mRNA的全部或一部分互补并且可抑制靶基因的表达的RNA转录物。反义RNA的互补性可针对特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列。术语″反义抑制″意指能够阻止靶蛋白质的表达的反义RNA转录物的产生。

术语″RNAi″或″RNA干扰″通常意指通过将RNA片段引入细胞来抑制蛋白质的表达的方法。RNA可由整合入基因组的DNA片段编码。RNAi还可通过本领域已知的任何其他方法来制备。RNAi片段可以是任何适当的长度，可以是单链或双链。

通常，″调控序列″是在内源或异源(嵌合)基因中位于蛋白质编码区的上游(5′)、内部或下游(3′)的核苷酸序列。此类调控序列或“调控区”可调控转录和/或翻译。

″转录调控区″或″启动子″意指影响和/或促进转录的起始的核酸序列。启动子通常被认为包括调控区例如增强子或诱导子元件(inducerelement)。

术语″上游调控区″通常意指在蛋白质翻译起始密码子上游的区域。因此，“上游调控区”可包括例如启动子，或其可包括启动子和5′UTR。上游调控区还可意指远在经典启动子序列上游的区域，例如“增强子元件”。

术语″TED″意指翻译增强子结构域。

5′TED(或5′非翻译区(UTR))通常意指编码位于翻译起始位点5′端(上游)的mRNA的区域。因此，所述区域在转录起始位点与翻译起始位点之间。5′TED可以是“上游调控区”的一部分。

3′TED(或3′非翻译区(UTR))通常意指mRNA上的位于蛋白质编码序列的终止密码子的下游的区域。该区域可包含例如多腺苷酸化信号和/或能够影响mRNA加工或基因表达的任何其他调控信号。

″起始密码子″和″终止密码子″意指编码序列中分别指定蛋白质序列的起始和链终止的3个相邻核苷酸的单位。

下面利用不同的实施例，任选的技术特征和一般教导来举例说明本发明的范围。

贮藏蛋白

许多植物物种的种子包含贮藏蛋白。已基于其大小和可溶性对此类蛋白进行了分类(Higgins，T.J.(1984)Ann.Rev.Plant Physiol.35：191-221)。虽然并非每一个种类都发现于每一个物种中，但大多数植物物种的种子包含多于1个种类的蛋白质。特定可溶性或大小种类中的蛋白质通常在结构上与其他物种中相同种类的成员比与相同物种中不同种类的成员更相关。在许多物种中，给定种类的种子蛋白通常由多基因家族编码，有时所述家族是这样复杂以至其可基于序列同源性分成亚类。

大豆种子具有相对高的蛋白质含量，其主要由两种贮藏蛋白(β伴大豆球蛋白和大豆球蛋白)组成。在野生型种子中，β伴大豆球蛋白占大约15-20％的总大豆蛋白质。这两种蛋白质都由来源于基因家族的多个同种型组成。

关键贮藏蛋白(Pivotal storage protein)在本文中已被鉴定为参与植物的程序化发育。然而，本领域技术人员现可通过功能、结构或序列同源性容易地鉴定其他靶植物中的其他贮藏蛋白。在鉴定此类贮藏蛋白后，此处描述的敲低实验可鉴定参与蛋白质重新平衡的其他贮藏蛋白。根据本发明，调控元件(例如，启动子、TED等)可用于产生高水平的期望的蛋白质。因此，本文中显示的许多实例现可用于对商业或人类具有潜在重要性的其他植物。

遗传缺陷

本发明的植物包含缺陷例如遗传缺陷，从而导致显著部分的植物内源种子贮藏蛋白含量的减少。例如，在各种特定的实施方案中，植物的种子可包含小于大约75％、70％或小于大约60％或小于大约50％或小于大约40％或小于大约25％或小于15％的量的种子中总可溶性蛋白。

在其他特定实施方案中，遗传缺陷导致这样的量的特定种子贮藏蛋白，其小于通常存在于WT大豆种子中的内源种子贮藏蛋白的量的大约1％、大约2％、大约5％、大约10％、大约25％、大约50％、大约75％或大约85％。

例如，本发明的植物可缺乏大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、KTI、LE、P34、GBP和SMP或其他种子贮藏蛋白中的1种或2种或3种或4种或更多种。

在一个实施方案中，可利用方法例如共抑制、反义、RNAi或其他方法实现产生种子贮藏蛋白的缺乏的基因操作。美国专利5,190,931描述了使用反义构建体下调基因的示例性方法。美国专利5,231,020描述了使用有义核酸构建体下调基因的示例性方法。通过使用双链mRNA来遗传抑制基因产物的表达公开于美国专利6,506,559中。

在其他实施方案中，聚集物中特定的一种或多种种子贮藏蛋白的缺乏可通过常规育种方法，然后就低水平的一种或多种种子蛋白进行筛选而获得。种子贮藏蛋白的缺乏还可通过天然突变或引入的突变，然后通过鉴定具有低水平的一种或多种种子贮藏蛋白的植物的筛选方法来获得。在另一个实施方案中，缺乏种子贮藏蛋白的植物可以例如从公共可获得的种子库或种子储库(repository)获得。

种子中一种蛋白质的遗传缺陷导致通过其他种子蛋白来补偿(重新平衡)

如本文中所描述的，一种种子蛋白的抑制可导致通过其他种子蛋白的产量的增加来补偿，这称为“补偿”或“重新平衡”。本文中在缺乏大豆球蛋白和β伴大豆球蛋白的植物品系(″SP-″；实施例1)中和在只缺乏β伴大豆球蛋白的植物(实施例11)中显示了该重新平衡。

由序列介导的基因沉默导致的种子蛋白β伴大豆球蛋白的抑制通过大豆球蛋白的增加的丰度来补偿(实施例11)。也如实施例11中所述，β伴大豆球蛋白α/α′抑制还可使用RNAi技术来实现。该方法导致a/a′β伴大豆球蛋白的完全沉默。部分增加产生的大豆球蛋白以其前体前大豆球蛋白的形式保持并且被扣留在PB中。蛋白质在蛋白质体而非PSV中的积累显示2个重要的点：1)ER衍生的PB可在大豆种子中被诱导，并积累蛋白质以及，2)内源贮藏蛋白的抑制导致增加的另一种贮藏蛋白的积累以补偿质量损失。该现象维持大豆种子的总蛋白质含量至-40％，并且被称为‘重新平衡’。

如实施例1中所示，制备缺乏β伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的植物品系(″SP-″)。在β伴大豆球蛋白和大豆球蛋白中都具有遗传缺陷的这类种子中，蛋白质的损失由其他蛋白质的产生来补偿。蛋白质产量的变化可见于图4，该图是WT(″Jack″)的种子蛋白质提取物与SP-品系的种子蛋白质提取物相比较的IEF-PAGE。图5显示两个品系之间的转录组的差异。图6是显示存在于WT(″Jack″)对SP-品系的大豆种子中的几种主要贮藏蛋白的百分比的饼图。SP-种系中种子蛋白β伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的除去明确地导致由其他蛋白质来补偿。

重新平衡现象可用于在种子中产生大量外源蛋白质

本文中提供的是具有内在生物学(intrinsic biology)的种子，其通过使外源蛋白质参与重新平衡过程和通过将外源蛋白质积累在稳定的PB群体中而可被开发为蛋白质生产平台的基础。总之，这是将双子叶植物种子开发为蛋白质生产平台的基础。

因此，在一些实施方案中，如上所述减少一种(或多种)种子贮藏蛋白，并且在种子中产生期望的异源蛋白质。在一个实施方案中，将任何适当的启动子可操作地连接至编码异源蛋白的序列。在另一个实施方案中，编码异源蛋白的序列是种子特异性启动子。启动子可以例如选自大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、KTI、LE、P34、GBP或SMP的启动子。

在优选实施方案中，当异源蛋白的基因序列可操作地连接至编码蛋白质(其在大豆种子中响应上述遗传缺陷而被上调)的基因的启动子时，可发生增加的异源蛋白质表达。对于从种子中除去的每一种特定蛋白质，另一种(或多种)蛋白质可代替其产生。通过使用该“补偿”蛋白质的基因调控区(例如启动子、终止子和任选地其他区域)来驱动目的异源基因的表达，可在种子中获得甚至更高水平的蛋白质产量。

因此，在一个实施方案中，被抑制的种子蛋白质是β伴大豆球蛋白，同时异源蛋白质的表达受到大豆球蛋白的调控区的至少一部分控制。在一个实施方案中，该调控区在异源序列的上游。在另一个实施方案中，调控区在异源序列的下游或3′端。在一个实施方案中，调控区包含大豆球蛋白启动子。在一个实施方案中，调控区是大豆球蛋白上游调控区，其可包括例如启动子和/或5′UTR。在另一个实施方案中，大豆球蛋白调控区还包括大豆球蛋白3′调控区。

在另一个实施方案中，被抑制的种子蛋白质是β伴大豆球蛋白和大豆球蛋白两者，同时异源蛋白质受到来自KTI、LE、P34、GBP或SMP之一的调控区的至少一部分(5′、3′或两者)控制。

通过构建具有报告蛋白GFP的转基因(其侧翼于ER转运信号序列和滞留信号序列(KDEL)，处于大豆球蛋白元件的调控下)来测试蛋白质重新平衡和蛋白质在PB中的扣留的概念框架(实施例9)。通过将GFP-kdel构建体置于大豆球蛋白基因元件之下，GFP-kdel转录物的表达将模拟大豆球蛋白基因转录物的表达和调控，从而可能参与牵涉大豆球蛋白基因的上调的营养分配。表达该转基因的大豆在种子中积累了1.6％的GFP-kdel。然而，当将GFP-kdel植物在遗传上与βCS植物杂交时，GFP-kdel表达的水平在种子中增加几乎4倍，达到大约7％(实施例12)。因此，βCS种子中GFP-kdel积累的增加显示，模拟参与蛋白质重新平衡的基因的等位基因可导致目的异源蛋白的积累的大量增加。

因此，在实施方案中，可在种子中产生大量目的蛋白质。例如，异源蛋白质的表达在种子中可达到大约1％、2％、5％、7％、10％、12％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％或更多的总可溶性蛋白质。

此外，在一个实施方案中，表达的异源蛋白质的干重可达到，大约0.5％、1％、2％、4％、5％、7％、10％、12％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的种子总干重。可以例如以大约50、100、150、200、250或更多毫克蛋白质/种子的量产生异源蛋白质。

在一个实施方案中，可基于每颗植物测量产生的异源蛋白的量。可以例如以大约3g、6g、8g、10g、15g或20g或更多的异源蛋白质/植物的量产生异源蛋白质。

可以例如以每季每英亩大约25、50、100、200、300、400、500、600、700、850、1,000、1,500、2,000或更多磅的量产生异源蛋白质。实际产量可取决于许多参数例如每英亩植物、植物品种、土壤质量、栽培措施、植物胁迫以及待产生的异源蛋白质的纯度水平。

启动子

在一个实施方案中，本文中提供的异源多核苷酸包括获自或源自植物贮藏蛋白基因的启动子。在多种实施方案中，启动子源自与用本发明的构建体转化的植物相同目、科、属或种的植物。

可使用任何适当的启动子。在一个实施方案中，启动子是种子特异性启动子。在另一个实施方案中，启动子是早期种子特异性启动子。在另一个实施方案中，启动子是晚期种子特异性启动子。在另一个实施方案中，启动子来自补偿种子蛋白遗传缺陷的基因。

启动子序列可终止于起始密码子或其附近并且包括上游(5′)的连续核苷酸。启动子序列可以是至少大约500个核苷酸或至少大约1000个核苷酸或至少大约1500个核苷酸。虽然确切长度对于本发明不是至关重要的，但本领域技术人员可容易地确定和优化启动子长度(例如，通过测量和比较转录水平)。

在一个实施方案中，上游调控序列或启动子序列可与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8之一的至少部分具有至少80％、85％、90％、95％、97％、99.5％或更高的核酸同一性。

在具体的实施方案中，如下所述包含启动子和5′UTR的上游调控区选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7。SEQ ID NO：1和2来源于大豆球蛋白，而SEQ ID NO：3-8分别代表伴大豆球蛋白、KTI、LE、P34、GBP和SMP的上游调控区。

UTR翻译增强子结构域

本发明的异源多核苷酸任选地包含来自植物贮藏蛋白的翻译增强子结构域(TED)。在一些实施方案中，这是mRNA转录物的非翻译区。此类非翻译区可以在基因的5′(上游)或3′(下游)端。TED或UTR的序列还可来源于另一种生物或可以是完全合成的序列。

5′UTR(或“5′TED”)：本发明的构建体可包含来自编码植物贮藏蛋白例如大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、KTI、LE、P34、GBP或SMP的mRNA的5′区的5′TED。5′TED通常可在植物贮藏蛋白的启动子与起始密码子之间被鉴定。5′TED可以是至少大约5、10、25、30、35、40或更多个核苷酸或至少大约50个核苷酸、或至少大约100个核苷酸、或至少大约150个核苷酸。虽然确切长度对于本发明不是至关重要的，但本领域技术人员可容易地确定和优化终止子长度(例如，通过测量和比较翻译水平)。在具体的实施方案中，公开于SEQ ID NO：1(大豆球蛋白)、SEQ ID NO：2(可选择的大豆球蛋白序列)、SEQ ID NO：3(伴大豆球蛋白)、SEQ ID NO：4(KTI)、SEQ ID NO：5(LE)、SEQ ID NO：6(P34)、SEQ ID NO：7(GBP)和SEQ ID NO：8(SMP)中的上游调控序列的3′末端的部分分别包含5′UTR序列。

3′UTR(或″3′TED″或″终止子″)：TED可源于例如编码植物贮藏蛋白例如大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、KTI、LE、P34、GBP或SMP的mRNA的3′区。这样的3′TED可始于终止密码子或其附近并且包括下游(3′)的连续核苷酸。3′TED可以是至少大约10、25、40、50、75、100、150个核苷酸或至少大约250个核苷酸或至少大约500个核苷酸。虽然确切长度对于本发明不是至关重要的，但本领域技术人员可容易地确定和优化终止子长度(例如，通过测量和比较翻译水平)。

在一个实施方案中，终止子序列选自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21。这些序列分别代表大豆球蛋白、可选择的大豆球蛋白终止子序列、β伴大豆球蛋白、可选择的β伴大豆球蛋白终止子序列、KTI、LE、P 34、GBP和SMP的3′TED序列。

在一个实施方案中，终止子序列可以与SEQ ID NO：13-21之一具有至少80％、85％、90％、95％、97％、99.5％或更高的核酸同一性。

在另外的实施方案中，嵌合构建体还可包含远在目的基因的上游或下游的基因调控序列例如增强子序列。例如，转录“增强子”区域可远在目的基因的上游或下游。例如，增强子区域可距序列的5′(上游)末端1,000-2,000个核苷酸或甚至1个或更多个kb，或也可存在于基因的转录区的下游1,000-2,000个核苷酸或甚至1个或更多个kb的位置。因此，在一些实施方案中，植物贮藏蛋白例如大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、KTI、LE、P34、GBP和SMP的此类更远的增强子序列也存在于嵌合序列中。在某些实施方案中，此类增强子序列的存在增加在种子中产生的异源蛋白质的量。

内质网

植物的内质网(ER)是内膜系统(真核生物中高度保守的系统)的一部分。将蛋白质靶向ER是非常有益的，因为ER中产生的蛋白质被运输至其他细胞器并且也与ER本身保持结合。ER衍生的区室具有不同的功能，例如贮藏蛋白、油以及用于响应病原体攻击的水解酶。贮藏蛋白运输至ER的机制的日益增加的知识已导致植物用作蛋白质生物工厂的用途的改进。除了其他内膜区室外，植物还可在ER中贮藏外源蛋白质。

ER衍生的小泡-蛋白质体对蛋白质贮藏液泡

图1显示导致蛋白质在大豆种子的蛋白质体或蛋白质贮藏液泡中的定位的不同亚细胞蛋白质运输途径的示意图。在许多植物物种中，但非大豆中，ER衍生的PB允许非糖基化蛋白质的稳定积累，因为所述蛋白质不遵循从ER至高尔基体，然后至前液泡(prevacuole)的典型内膜途径。

相比之下，在WT大豆植物中，大多数种子蛋白在蛋白质贮藏液泡(PSV)中积累。然而，被靶向大豆种子的蛋白质贮藏液泡(PSV)或前液泡(其然后靶向PSV)的蛋白质很可能被快速降解，因为液泡通常包含许多裂解酶。

相反地，如本文中关于转基因大豆种子所公开的，使用C末端ER靶向序列(KDEL)的蛋白质的ER滞留时间诱导大量外源蛋白质运输至从头产生的PB。因此，可将蛋白质扣留在大豆种子的ER衍生的PB中。所获得的蛋白质体是保持通过种子成熟并且保留在干燥成熟种子中的稳定的细胞器群体。在本文中这一点可利用27kDa报告蛋白绿色荧光蛋白(GFP-kdel)来证明，如实施例9中显示的。

在本发明的任选实施方案中，异源序列还包含诱导异源多肽在ER或ER衍生的小泡的腔中积累的ER滞留序列。此类ER或ER衍生的小泡包括ER、PB、PSV、转运小泡等。此类小泡在结构上可被鉴定为包含膜(例如脂双层膜)、腔，其中靶蛋白是至少部分存在于腔中的可溶性或不溶性成分。不期望受理论束缚，据信目的蛋白质的ER或ER衍生的小泡定位是在根据本发明的植物中产生的高水平的异源蛋白质的部分原因。在一个实施方案中，异源多肽在高尔基体或高尔基小泡中积累。

ER信号序列

在一些实施方案中，异源多核苷酸包含ER信号序列。ER信号序列是编码允许蛋白质被内质网上的信号识别颗粒识别(从而导致蛋白质转位至ER腔内)的氨基酸序列的任何多核苷酸序列。该序列通常存在于蛋白质的N末端区域。

在一些实施方案中，可向天然不具有ER靶向序列的蛋白质添加ER信号序列。然而，异源蛋白质可能已具有ER信号序列。需要时，该信号序列可用另一种ER信号序列例如下面表1中所示的那些替代。可选择地，可使用蛋白质的原始信号序列。还可使用完全合成的信号序列。指导新合成的蛋白质至植物细胞的内质网的信号序列的实例包括来自大麦凝集素(Dombrowski等人，1993，Plant Cell 5：587-596)、大麦液泡巯基蛋白酶(aleurain)(Holwerda等人，1992，Plant Cell 4：307-318)、甘薯sporamin(Matsuoka等人，1991，Proc.Natl.Acad.SciUSA 88：834-838)、patatin(Sonnewald等人，1991，Plant J.1：95-106)、大豆营养贮藏蛋白(Mason等人，1988，Plant Mol.Biol.11：845-856)和β-果糖苷酶(Faye等人.1989，Plant Physiol.89：845-851)的序列。

虽然本领域技术人员可容易地确定有用的ER信号序列，但其他实例示于表1：

表1

ER信号序列的其他实例由Emanuelsson等人(J.Mol.Biol.300，1005-1016(2000))描述。

ER滞留序列

任选地，异源多核苷酸还包含ER滞留序列。已发现，当这样的序列被加至还包含ER信号序列的异源多核苷酸时，蛋白质产物将保留在ER衍生的小泡中，在小泡中产物被扣留而不进行某些加工作用例如蛋白质水解降解。令人惊讶地，本构建体将异源多核苷酸蛋白质产物靶向称为“蛋白质体”的ER衍生的小泡，无论宿主植物是否天然产生蛋白质体。因此，现可以稳定异源多肽产物并且以更高水平进行积累。

ER滞留序列是编码已知导致给定的蛋白质滞留在内质网或与内质网结合的氨基酸序列的任何多核苷酸序列，例如编码氨基酸(由单字母氨基酸代码表示)KDEL(SEQ ID NO：23)、KHDEL(SEQ ID NO：25)、HDEL(SEQ ID NO：26)、KEEL(SEQ ID NO：27)、SEKDEL(SEQ ID NO：28)和SEHDEL(SEQ ID NO：29)的序列。编码KDEL或KHDEL的示例性核酸分别示于SEQ ID NO：22和24。通常，这些序列在小泡蛋白(vesicularprotein)的C末端并且通常在ORF的3′端。

可选择地，任选的ER滞留序列来源于液泡蛋白(vacuolar protein)的C末端区域(其中此类序列在将液泡蛋白递送至植物液泡中发挥作用)。此类液泡序列的非限定性实例示于通过引用合并入本文的美国专利6,054,637中。其他序列可由本领域技术人员通过使用功能测定来容易地鉴定。

待表达的异源多核苷酸的开放阅读框

根据本发明的异源多核苷酸包含开放阅读框(ORF)。编码待在种子中表达的目的蛋白质的ORF可以是任何ORF。通常，本发明的ORF可编码部分或完整的种子贮藏蛋白、脂肪酸途径酶、生育酚生物合成酶、纤维质降解酶、疫苗、治疗性肽、用于化妆品的蛋白质或肽、氨基酸生物合成酶或淀粉分支酶。通常，ORF包括例如编码目的靶蛋白的核酸以及N末端区域上的侧翼ER信号序列和羧基末端序列上的ER滞留信号序列。

任选地，ORF是就密码子使用的优选模式最优化的植物密码子。就植物中最佳密码子使用对ORF进行修饰描述于美国专利5,689,052中。

待表达的蛋白质的选择

由嵌合构建体编码的目的蛋白质可以是任何期望的蛋白质。蛋白质可以是全长蛋白质，或可以是全长蛋白质的片段。序列可来源于例如植物来源、动物来源、真菌来源、病毒来源、细菌来源或其可以是完全或部分合成的序列。

任何期望的蛋白质可以使用本文中描述的系统来工程改造，无论其物种来源或其正常细胞定位。可在本文描述的系统中产生的蛋白质的示例性种类包括但不限于激酶、结构蛋白、蛋白酶、酶、淀粉酶、纤维素分解酶、抑制剂、具有增加的营养价值的蛋白质、药物蛋白质、用于化妆品的蛋白质或蛋白质片段、用于生物加工的蛋白质、商业上有用的蛋白质、抗体或其片段、膜蛋白、核蛋白、运输蛋白、信号转导蛋白、贮藏蛋白、受体蛋白、激素前体、激素、肽和完全合成的蛋白质、多肽或肽序列。

编码目的蛋白质的合成的基因包括但不限于工业酶、治疗性酶和蛋白质，可将疫苗和抗体插入本文中描述的大豆种子特异性基因表达盒，所述表达盒包含来自大豆球蛋白、KTI、P34、SBP、SMP或LE的5′和3′调控元件。

在一个实施方案中，为了利用蛋白质补偿机制来实现增加的蛋白质表达，可将大豆球蛋白调控元件用于驱动蛋白质在βCS背景中表达。在一个实施方案中，KTI、P34、SBP、SMP或LE的调控元件可用于驱动蛋白质在SP-背景中表达。本文中描述的构建体可诱导蛋白质参与由伴大豆球蛋白和/或大豆球蛋白的抑制而引起的蛋白质重新平衡过程，从而增加蛋白质的合成和积累。

在一些实施方案中，ORF具有融合至基因的5′端的编码来自拟南芥属(Arabidopsis)壳多糖酶基本基因的ER靶向信号序列的核苷酸序列和融合至基因的3′端的编码羧基末端KDEL ER滞留序列的核苷酸序列。一些待表达的蛋白质具有其自己固有的ER信号序列；如果这样的话，需要时，此类序列可用本文中公开的ER信号序列替换。

质粒还可包含在来源于马铃薯泛素3基因的强组成型启动子控制之下的潮霉素抗性标记以用于选择转化子。可如本文中所述进行包含目的基因的纯合品系的转化和产生。可将转基因植物种质渗入至SP-、βCS或另一种缺乏种子贮藏蛋白的品系。

在一个实施方案中，待表达的蛋白质是可用于生物燃料工业的纤维素分解酶。生物燃料工业正快速成熟。然而，获得许多各种生物燃料生产过程所需的酶的成本可令人望而生畏。然而，从大豆或其他双子叶作物获得酶可导致与生物燃料生产相关的更低成本，并且还可比获得此类酶的常规方法更加有利于环境。

例如，本文中所述的转基因大豆植物可用于产生“生物工厂”以生产参与纤维质乙醇生产的许多蛋白质。因此，在一个实施方案中，待表达的蛋白质是纤维素酶(cellulosic enzyme)。此类酶的实例包括但不限于β-葡糖苷酶、外切葡聚糖酶1、外切葡聚糖酶II、内切葡聚糖酶、木聚糖酶、半纤维素酶和木质酶(例如木质素过氧化物酶或锰过氧化物酶)等。待表达的蛋白还可以是可用于生物燃料工业的任何其他酶。

在一个实施方案中，待表达的蛋白质是β-葡糖苷酶。可使用来自任何物种的β-葡糖苷酶的核酸序列或氨基酸序列。示例性β-葡糖苷酶属于蛋白质家族EC＝3.2.1.21。该酶的序列可来源于任何适当的物种例如来自曲霉属(Aspergillus)的种，例如黑曲霉(Aspergillus niger)。示例性β-葡糖苷酶的核酸和氨基酸序列示于SEQ ID NO.35-42中。

在一个实施方案中，待表达的蛋白质是来自白曲霉(Aspergilluskawachii)的β-葡糖苷酶，例如SEQ ID NO.36中显示的，或来自白曲霉的β-葡糖苷酶的修饰形式，例如SEQ ID NO.37、38和39中显示的。在另一个实施方案中，待表达的蛋白质是来自黑曲霉的β-葡糖苷酶(SEQ ID NO.40)。在另一个实施方案，待表达的蛋白质是来自土曲霉(Aspergillus terreus)的β-葡糖苷酶(例如，XM-00121222；SEQ IDNO.42)。

在一个实施方案中，待表达的蛋白质是外切葡聚糖酶1，例如蛋白质家族EC＝3.2.1.91中的酶，也称为外切纤维二糖水解酶I，CBHl，或1，4-β-纤维二糖水解酶。该酶的序列可来源于任何适当的来源，例如里氏木霉(Trichoderma reesei)(红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))。示例性外切葡聚糖酶I的氨基酸序列示于SEQ ID NO.43和44。

在一个实施方案中，待表达的蛋白质是外切葡聚糖酶II，例如蛋白质家族(EC＝3.2.1.91)中的酶，也称为外切纤维二糖水解酶II，CBHII，CBH2和1，4-β-纤维二糖水解酶。该酶的序列可来源于任何适当的来源，例如里氏木霉(红褐肉座菌)。示例性外切葡聚糖酶II的氨基酸序列示于SEQ ID NO.45和46。

在一个实施方案中，待表达的蛋白质是内切葡聚糖酶。内切葡聚糖酶通常属于蛋白质家族EC＝3.2.1.4，也称为内-1，4-β-葡聚糖酶E1、纤维素酶E1和内切纤维素酶E1。该酶的序列可来源于任何适当的来源，例如解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)。示例性内切葡聚糖酶的氨基酸序列示于SEQ ID NO.47。

在一个实施方案中，待表达的蛋白质是木聚糖酶。某些木聚糖酶，例如属于酶家族EC 3.2.1.8(1，4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶)的酶，可催化木聚糖中的(1，4)-β-D-木糖苷键的内切水解。一些木聚糖酶例如1，3，-β木聚糖酶(EC 3.2.1.32)催化1，3，-β-D-糖苷键的降解。来自黑曲霉的示例性木聚糖酶核酸序列示于SEQ ID NO：48中。来自黑曲霉的示例性木聚糖酶蛋白质序列示于SEQ ID NO：49中。

在一个实施方案中，待表达的蛋白质是半纤维素酶。该酶的序列可来源于任何适当的来源。

在一个实施方案中，待表达的蛋白质是木质酶。此类酶催化来自植物细胞壁的木质素的降解。该酶的序列可来源于任何适当的来源，例如降解木质素的担子菌(basidiomycete)，例如黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。来自黄孢原毛平革菌的示例性木质酶氨基酸序列示于SEQ ID NO.50。

在一个实施方案中，待表达的蛋白质是木质酶，例如锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)。该酶的蛋白质序列可来源于任何适当的来源，例如变色栓菌(Trametes versicolor)。示例性锰过氧化物酶氨基酸序列示于SEQ ID NO.51。

另一种类型的降解木质素的酶是木质素过氧化物酶(例如，酶家族EC 1.11.1.14)，可催化许多木质素化合物中的C-C键和醚(C-O-C)键的氧化断裂的血红素蛋白。该酶可催化下列反应：1，2-双(3，4-二甲氧基苯基)丙烷-1，3-二醇+H₂O₂＝3，4-二甲氧基苯甲醛+1-(3，4-二甲氧基苯基)乙烷-1，2-二醇+H₂O。来自微生物黄孢原毛平革菌的示例性木质素过氧化物酶氨基酸序列(登录号P49012)示于SEQ ID NO.52。

在一个实施方案中，待表达的蛋白质可与上述序列之一具有至少80％、85％、90％、95％、97％、99.5％的同一性。可选择地，待表达的蛋白质可以是任何其他适当的目的蛋白质。

稳定转化植物的方法

可将核酸整合入重组核酸构建体(通常DNA构建体)，所述构建体能够被稳定地引入植物细胞。

为了实施本发明，如例如在Sambrook等人(eds.)(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，ColdSpring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，N.Y.，和Ausubel等人，eds.(1992)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York中所述，使用用于制备和使用载体和宿主细胞的常规组合物和方法。

适合于稳定转化植物细胞或建立转基因植物的许多载体已描述于例如Pouwels等人(1985，supp.1987)Cloning Vectors：A LaboratoryManual；Weissbach等人，(1989)Methods for Plant MolecularBiology，Academic Press：New York；和Gelvin等人(1990)PlantMolecular Biology Manual，Kluwer Academic Publishers中。通常，植物表达载体包括例如一个或多个在5′和3′调控序列的转录控制之下的克隆的植物基因和显性可选择标记。此类植物表达载体还可包含启动子调控区(例如，控制诱导型或组成型、环境或发育调节性、或者细胞或组织特异性表达的调控区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。

存在将目的构建体稳定地转化入植物基因组的几种方法。示例性方法包括但不限于微粒轰击、电穿孔、农杆菌介导的转化和通过原生质体进行的直接DNA摄入。

基于电穿孔的转化方法可利用细胞悬浮培养物、胚性愈伤组织，或组织例如未成熟胚或其他植物组织的直接转化。还可将原生质体用于植物的电穿孔转化(Lazzeri等人，1985，″A procedure for plantregeneration from immature cotyledon tissue of soybean，″PlantMol.Biol.Rep.，3：160-167)。

通过微粒轰击进行的转化

用于递送转化性DNA区段至植物细胞的特别有效的方法称为微粒轰击。该方法已成功用于转化许多植物物种。在该方法中，颗粒用核酸包被并且通过推进力递送入细胞。示例性颗粒包括由钨、铂或金组成的颗粒。为了进行轰击，将悬浮的细胞浓缩在滤器或固体培养基上。可选择地，可将未成熟的胚或其他靶细胞排列在固体培养基上。

可将许多类型的颗粒轰击系统用于转化过程。在典型的颗粒轰击方案中，将金或钨颗粒用目的DNA构建体包被，并且置于平台上，在所述平台中强力(通常气体)用于加速颗粒进入等待细胞(其已被放置好以接受DNA包被的颗粒)。一个示例性系统是Biolistics ParticleDelivery System(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。

利用微粒轰击进行的成功转化通常需要靶细胞活跃分裂，易于微粒进入，可在体外培养并且是全能的，即能够再生以产生成熟的有繁殖力的植物。适当的微粒轰击法描述于例如美国专利5,100,792、美国专利5,179,022和美国专利5,204,253。此外，美国专利5,015,580描述了通过轰击大豆种子的胚轴进行的颗粒介导的大豆植物的转化的方法。

用于微粒轰击的靶组织可包括但不限于单个细胞、细胞的聚集体、未成熟的胚、来自未成熟胚的幼小胚性愈伤组织、小孢子、小孢子来源的胚和顶端分生组织。

在一个实施方案中，转化方法包括与体细胞胚发生组合的微粒轰击，如例如于Schmidt等人，(2008)，In Vitro Cellular &Developmental Biology Plant，44：162-168中描述的。体细胞胚发生描述于Bailey，1993，In Vitro Cellular and Developmental BiologyPlant 29(3)：102-108中。另外的方法描述于Parrott等人，2004，Transgenic soybean.In：J.E.Specht和H.R.Boerma(eds).Soybeans：Improvement，Production，and Uses，第3版.-AgronomyMonograph No.16.ASA-CSA-SSSA，Madison，WI.pp 265-302中。

农杆菌介导的稳定转化也可用于产生包含目的转基因的稳定转化的植物。农杆菌介导的植物整合载体将DNA引入植物细胞的用途在本领域内是公知的(Fraley等人，1985；美国专利5,563,055)。使用基于农杆菌的系统转化大豆的方法已描述于美国专利5,569,834中，其公开内容以其全文通过引用合并入本文。美国专利5,932,782描述了使用包被在用于微粒轰击的微粒上的农杆菌构建体的转化方法。美国专利申请US2006260012描述了使用基于农杆菌的方法转化大豆细胞或组织的方法。

植物原生质体的转化还可使用多种其他方法例如磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔和这些处理的组合来实现(Potrykus等人，1985，Direct gene transfer to protoplasts：an efficient and generallyapplicable method for stable alterations of plant genomes，UCLASym Mol Cell Biol，35：181-199)。此外，通过基于电穿孔的至花粉的基因转移进行的植物转化描述于美国专利5,629,183中。

可选择的标记

在本发明的实施方案中，可选择的标记基因用于检测已成功地完成了外源基因构建体的转化的细胞。通常，在转化过程后数天至数周内就成功的转化筛选细胞。可通过共转化一个或多个转基因表达盒与选择标记表达盒，并方便地通过针对培养物中或培养板上的可选择标记筛选经由转化过程获得的愈伤组织细胞来最快速地筛选成功的转化子。

将选择标记表达盒中的可选择标记基因可操作地连接至可选择标记调控元件(包括启动子和终止子)。可选择标记基因在转基因植物细胞中的表达通常编码赋予对抗生素或除草剂的抗性的蛋白质。常用的选择标记基因包括例如nptII/卡那霉素抗性基因(用于在含卡那霉素的培养基中进行选择)，草胺膦(phosphinothricin)乙酰转移酶基因(用于在含草胺膦(PPT)的培养基中进行选择)或hph潮霉素磷酸转移酶基因(用于在含潮霉素B的培养基中进行选择)。其他可选择标记包括博来霉素抗性标记基因和草丁膦(glufosinate)抗性标记基因。

在一个实施方案中，可选择标记是潮霉素磷酸转移酶。示例性潮霉素磷酸转移酶序列示于SEQ ID NO：33。在另一个实施方案中，可选择标记序列侧翼于马铃薯泛素3上游调控元件(SEQ ID NO：30)。在另外的实施方案中，可选择标记序列侧翼于马铃薯泛素3终止子序列(例如SEQ ID NO：31和32中显示的序列)。

经转化的植物的再生

可使用用于再生转化的植物材料的任何适当的方法。体细胞胚发生的一般方法描述于Parrott等人，1994，″Somatic embryogenesis inlegumes，″pp 199-227.In Y.P.S.Bajaj(ed)Biotechnology inAgriculture and Forestry.Somatic embryogenesis，第31卷.Springer Verlag，Berlin & Heidelberg中。

任何公知的再生培养基可用于从遗传转化的材料再生植物。如本文中所使用的，“植物培养基”意指在本领域内用于支持植物细胞或组织的活力和生长或用于完整植物样品的培养的任何培养基。此类培养基通常包括确定的成分，包括但不限于：提供氮、磷、钾、硫、钙、镁和铁的营养源的大量营养物化合物；微量营养物例如硼、钼、锰、钴、锌、铜、氯和碘；碳水化合物；维生素；植物激素；选择剂(用于转化的细胞或组织，例如抗生素或除草剂)；和胶凝剂(例如，琼脂、Bactoagar、琼脂糖、Phytagel、Gelrite等)。培养基可以是固体或液体。适当的培养基和再生方法描述于例如Schmidt等人，2005，″Towardsnormalization of soybean somatic embryo maturation，″Plant CellRep.24：383-391中。

一旦鉴定到推定的转化的植物，则可测试组织以确认转基因已被稳定地转化入植物基因组。

具有异源基因的纯合品系的产生通常需要几个另外的杂交步骤。在一些实施方案中，将转化的组织培养成成熟植物或″初始转化株(primary transformant)″(T0)，然后将其自交。培养来自该自交的种子(T1代)并且鉴定阳性转化株，使之自交。然后将这些种子培养成成熟植物(T2代)，并进行筛选以鉴定转化的序列的纯合存在，从而产生纯合植物品系。

双子叶植物

本文中提供的双子叶植物(dicotyledon plant或dicot)可以是任何双子叶植物。任选地，双子叶植物是豆目的成员。任选地，双子叶植物是豆科(通常称为豆荚科(legumes))的成员。任选地，双子叶植物是大豆(soybean)，例如大豆(Glycine max)。

可用于本文中提供的组合物和方法的双子叶植物的实例是：相思子属(Abrus Adans.)(例如，相思子)，金合欢属(Acacia P.Mill.)(例如，刺槐)，海红豆属(Adenanthera L.)(例如，海红豆)，合萌属(Aeschynomene L.)(例如，合萌)，缅茄属(Afzelia Smith)(例如，桃花心木)，合欢属(Albizia Durazz.)(例如，合欢)，骆驼刺属(AlhagiGagnebin)(例如，骆驼刺)，链荚豆属(Alysicarpus Neck.ex Desv.)(例如，便士草)，紫穗槐属(Amorpha L.)(例如，紫穗槐，紫槐)，Amphicarpa)，两型豆属(Amphicarpaea Ell.ex Nutt.)(例如，两型豆，同株二型豆(hogpeanut))，阿那豆属(Anadenanthera Speg.)(例如，阿那豆)，甘蓝豆属(Andira Juss.)(例如，甘蓝豆)，绒毛花属(Anthyllis L.)(例如，愈伤绒毛花)，土圞儿属(Apios Fabr.)(例如，落花生)，花生属(例如，花生)，Aspalathus L.(例如，aspalathus)，Aspalthium Medik.)，黄芪属(Astragalus L.)(例如，astragales，黄芪属的种，疯草，疯草的种，紫云英)，杂色豆属(Baphia Lodd.)(例如，杂色豆)，野靛草属(Baptisia Vent.)(例如，野靛草，紫穗槐，野生靛蓝)，Barbieria DC.(例如，barbieria)，羊蹄甲属(Bauhinia L.)(例如，羊蹄甲)，Bituminaria Heister ex Fabr.(例如，bituminaria)，Bonaveria Scop.)，Brongniartia Kunth(例如，greentwig)，Brya P.Br.(例如，coccuswood)，紫铆属(Butea Roxb.ex Willd.)(例如，紫铆)，云实属(Caesalpinia L.)(例如，云实，nicker，金凤花)，Caiandra Benth.)，木豆属(Cajanus Adans.)(例如，木豆)，朱缨花属(Calliandra Benth.)(例如，朱缨花，毛叶朱缨花，stickpea)，毛蔓豆属(Calopogonium Desv.)(例如，毛蔓豆)，亚麻荠属(Camelinasp.)(例如，亚麻荠(″false flax″))，Canavaia Adans.Mut.Dc，刀豆属(Canavalia Adans.)(例如，刀豆)，锦鸡儿属(CaraganaFabr.)(例如，锦鸡儿)，决明属(Cassia L.)(例如，山扁豆，决明属的种)，距瓣豆属(Centrosema(DC.)Benth.)(例如，蝴蝶豆，距瓣豆)，长角豆属(Ceratonia L.)(例如，长角豆)，假紫荆属(Cercidium L.R.Tulasne)，紫荆属(Cercis L.)(例如，紫荆)，决明属(Chamaecrista(L.)Moench)(例如，敏感豆)，树苜蓿属(Chamaecystis Link)(例如，树苜蓿)，Chamaesenna(Dc.)Raf.Ex Pittier)，Chapmannia Torr.&Gray(例如，chapmannia)，蝙蝠草属(Christia Moench)(例如，islandpea)，鹰嘴豆属(Cicer L.)(例如，鹰嘴豆)，香槐属(Cladrastis Raf.)(例如，香槐)，蝶豆属(Clitoria L.)(例如，蝶豆(clitoria)，蝶豆(pigeonwing s))，舞草属(Codariocalyx Hassk.)(例如，车轴草)，Cojoba Britt.& Rose(例如，cojoba)，Cologania Kunth(例如，cologania)，鱼鳔槐属(Colutea L.)(例如，鱼鳔槐)，骨湃香脂树属(Copaifera L.)(例如，骨湃香脂树)，小冠花属(Coronilla L.)(例如，小冠花)，Corynella DC.(例如，corynella)，Coursetia DC.(例如，babybonnets，coursetia)，Cracca Benth.)，猪屎豆属(Crotalaria L.)(例如，猪屎豆)，Crudia Schreb.)，Cullen Medik.(例如，scurfpea)，瓜儿豆属(Cyamopsis DC.)(例如，瓜儿豆)，喃喃果属(Cynometra L.)(例如，喃喃果)，Cytiscus Linnaeus)，金雀儿属(Cytisus Desf.)(例如，金雀儿)，黄檀属(Dalbergia L.f.)(例如，印度玫瑰木)，Dalea L.(例如，dalea，dalea spp.，prairie clover，prairieclover，prairieclovers)，Daniellia Bennett(例如，daniellia)，凤凰木属(Delonix Raf.)(例如，凤凰木)，鱼藤属(Derris Lour.)(例如，鱼藤)，合欢草属(Desmanthus Willd.)(例如，合欢草)，山蚂蝗属(DesmodiumDesv.)(例如，perennial legumes，tick trefoil，tickclover，ticktrefoil)，摘亚木属(Dialium L.)(例如，摘亚木)，代儿茶属(Dichrostachys(DC.)Wight & Arn.)(例如，代儿茶)，Dioclea Kunth(例如，dioclea)，Diphysa Jacq.(例如，diphysa)，Dipogon Lieb.(例如，dipogon)，二翅豆属(Dipteryx Schreber)(例如，二翅豆)，Ebenopsis Britt.& Rose(例如，德州乌木)，Entada Adans.(例如，callingcard vine)，象耳豆属(Enterolobium Mart.)(例如，象耳豆)，鸡头薯属(Eriosema(DC.)D.Don)(例如，沙豌豆)，Errazurizia Phil.(例如，dunebroom)，刺桐属(Erythrina L.)(例如，刺桐)，格木属(Erythrophleum Afzel.ex R.Br.)(例如，格木)，EysenhardtiaKunth(例如，kidneywood)，Faidherbia A.Chev.(例如，刺槐)，Falcataria(Nielsen)Barneby & Grimes(例如，peacocksplume)，千斤拔属(Flemingia Roxb.ex Ait.f.)(例如，千斤拔)，乳豆属(Galactia P.Br.)(例如，乳豆)，山羊豆属(Galega L.)(例如，professor-weed)，染料木属(Genista L.)(例如，金雀儿)，Genistidium I.M.Johnston(例如，brushpea，genistidium)，皂荚属(Gleditsia L.)(例如，皂荚，洋槐)，格力豆属(Gliricidia Kunth)(例如，quickstick)，田菁属(Glottidium Desv.)(例如，田菁)，大豆(Glycine max)(例如，大豆)，大豆属(Glycine Willd.)(例如，大豆)，甘草属(Glycyrrhiza L.)(例如，甘草)，Gymnocadus Lam.)，肥皂荚属(Gymnocladus Lam.)(例如，咖啡树)，采木属(Haematoxylum L.)(例如，采木)，铃铛刺属(Halimodendron Fischer ex DC.)(例如，铃铛刺)，Havardia Small(例如，havardia)，岩黄蓍属(Hedysarum L.)(例如，岩黄蓍，岩黄芪)，马掌巢菜属(Hippocrepis L.)(例如，马掌巢菜)，灯心草豆属(Hoffmannseggia Cav.)(例如，灯心草豆(hoffmanseggia)，灯心草豆(rushpea)，灯心草豆属的种，Hoffmanseggia Cavanilles)，Hoita Rydb.(例如，leather-root)，孪叶豆属(Hymenaea L.)(例如，孪叶豆)，木蓝属(Indigofera L.)(例如，木蓝)，黎豆属(Inga P.Mill.)(例如，黎豆)，Inocarpus J.R.& G.Forst)，Kanaloa D.H.Lorence & K.R.Wood(例如，kanaloa)，鸡眼草属(Kummerowia Schindl.)(例如，鸡眼草)，扁豆属(LablabAdans.)(例如，扁豆)，毒豆属(Laburnum Medik.)(例如，金链树)，山黧豆属(Lathyrus L.)(例如，豌豆，山黧豆，山黧豆种)，Lens P.Mill.(例如，lentil)，胡枝子属(Lespedeza Michx.)(例如，胡枝子属，胡枝子(perennial lespedeza))，银合欢属(Leucaena Benth.)(例如，银合欢树)，醉鱼豆属(Lonchocarpus Kunth)(例如，鱼藤酮)，罗顿豆属(Lotononis(DC.)Ecklon & Zeyh.)(例如，罗顿豆)，百脉根属(LotusL.)(例如，鹿野豌豆，鹿野豌豆的种，三叶草)，羽扇豆属(LupinusL.)(例如，羽扇豆(lupine)，羽扇豆(lupins))，Lysiloma Benth.(例如，false tamarind，lysiloma)，马鞍树属(Maackia Rupr.)(例如，马鞍树)，Machaerium Pers.(例如，machaerium)，大翼豆属(Macroptilium(Benth.)Urban)(例如，矮菜豆，大翼豆)，硬皮豆属(Macrotyloma(Wight & Amort)Verdc.)(例如，硬皮豆)，Marina Liebm.(例如，false prairie-clover，marina)，苜蓿属(Medicago L.)(例如，紫花苜蓿)，Meibomia Heist.Ex Fabr.)，草木樨属(Melilotus P.Mill.)(例如，草木樨(sweet clover，sweetclover))，含羞草属(Mimosa L.)(例如，银白金合欢花，含羞草)，黧豆属(Mucuna Adans.)(例如，黧豆)，Myrospermum Jacq.(例如，myrospermum)，南美槐属(Myroxylon L.f.)(例如，南美槐)，新罗顿豆属(Neonotonia Lackey)(例如，新罗顿豆)，Neorudolphia Britt.(例如，neorudolphia)，假含羞草属(Neptunia Lour.)(例如，假含羞草，puff)，山黧豆属(Nissolia Jacq.)(例如，山黧豆，yellowhood)，Olneya Gray(例如，olneya)，驴食草属(Onobrychis P.Mill)(例如，驴食草)，芒柄花属(Ononis L.)(例如，芒柄花)，Orbexilum Raf.(例如，leather-root，orbexilum)，红豆属(Ormosia G.Jackson)(例如，红豆)，鸡足豆属(Ornithopus L.)(例如，牛角花)，Oxyrhynchus Brandeg.(例如，oxyrhynchus)，棘豆属(Oxytropis DC.)(例如，黄花棘豆，疯草)，豆薯属(Pachyrhizus L.C.Rich，ex DC.)(例如，豆薯)，Paraserianthes I.Nielsen(例如，paraserianthes)，球花豆属(Parkia R.Br.)(例如，球花豆)，扁轴木属(Parkinsonia L.)(例如，paloverde，扁轴木)，Parryella Torr.& Gray ex Gray(例如，parryella)，Pediomelum Rydb.(例如，beadroot，Indian breadroot，pediomelum，scurfpea)，盾柱木属(Peltophorum(T.Vogel)Benth.)(例如，盾柱木)，Pentaclethra Benth.(例如，pentaclethra)，Pericopsis Thwaites)，Peteria Gray(例如，peteria)，菜豆属(Phaseolus Linnaeus)，菜豆属(例如，菜豆，野菜豆)，毒扁豆属(Physostigma Balf.)(例如，毒扁豆)，Pickeringia Nutt.ex Torr.&Gray(例如，沙巴拉豆)，Pictetia DC.(例如，pictetia)，毒鱼豆属(Piscidia L.)(例如，毒鱼豆)，豌豆属(Pisum L.)(例如，豌豆)，Pitcheria Nutt.)，猴耳环属(Pithecellobium Mart.)(例如，blackbead，猴耳环)，Poitea Vent.(例如，wattapama)，PongamiaVentenat)，牧豆树属(Prosopis L.)(例如，牧豆树)，四棱豆属(Psophocarpus Necker ex DC.)(例如，四棱豆)，补骨脂属(PsoraleaLinnaeus)，Psoralidium Rydb.(例如，食用补骨脂，scurfpea)，Psorothamnus Rydb.(例如，dalea，黄栌)，紫檀属(PterocarpusJacq.)(例如，紫檀)，葛属(Pueraria DC.)(例如，葛)，Retama Raf.，nom.cons.)，鹿霍属(Rhynchosia Lour.)(例如，snoutbean)，刺槐属(Robinia L.)(例如，刺槐)，Rupertia J.Grimes(例如，rupertia)，Sabinea DC.(例如，sabinea)，雨树属(Samanea Merr.)(例如，鸳鸯茉莉)，粘叶豆属(Schizolobium Vogel)(例如，Brazilian firetree)，棘荚草属(Schrankia Willd.)(例如，schrankia)，山蚂蝗属(Scorpiurus L.)(例如，scorpion′s-tail)，Secula Small)，SennaP.Mill.(例如，senna)，田菁属(Sesbania Scop.)(例如，riverhemp，田菁)，槐属(Sophora L.)(例如，necklacepod，槐)，鹰爪豆属(Spartium L.)(例如，金雀儿)，苦马豆属(Sphaerophysa DC.)(例如，苦马豆)，Sphenostylis E.Meyer(例如，sphenostylis)，Sphinctospermum Rose(例如，sphinctospermum)，SphinotospermumRose)，Stahlia Bello(例如，stahlia)，Strongylodon Vogel(例如，strongylodon)，Strophostyles Ell.(例如，fuzzy bean，fuzzybean，野菜豆)，Stryphnodendron C.Martius(例如，stryphnodendron)，笔花豆属(Stylosanthes Sw.)(例如，铅笔花)，Sutherlandia R.Br.(例如，sutherlandia)，苦马豆属(Swainsonia Salisb.)，酸豆属(Tamarindus L.)(例如，酸豆)，Taralea Aublet(例如，taralea)，灰毛豆属(Tephrosia Pers.)(例如，hoarypea，灰毛豆)，软荚豆属(Teramnus P.Br.)(例如，软荚豆属)，Tetragonolobus Scop.(例如，tetragonolobus)，野决明属(Thermopsis R.Br.ex Ait.f.)(例如，goldenbanner，goldenpea spp.(golden banner)，thermopsis)，Ticanto Adans.(例如，gray nicker)，车轴草属(Trifolium L.)(例如，三叶草，三叶草种，trèfles)，胡卢巴属(Trigonella L.)(例如，胡芦巴)，荆豆属(Ulex L.)(例如，荆豆)，Vexillifera)，野豌豆属(Vicia L.)(例如，野豌豆，野豌豆种)，豇豆属(Vigna Savi)(例如，豇豆(cowpea)，豇豆(vigna))，紫藤属(Wisteria Nutt.)(例如，紫藤)，Zapoteca H.Hernández(例如，white stickpea)，丁癸草属(Zornia J.F.Gmel.)(例如，丁癸草)等。

蛋白质加工

由本文中公开的方法产生的蛋白质可从种子中提取并且直接用于商业加工。可选择地，可将蛋白质部分或完全纯化，然后贮存或直接使用。此外，可从转基因植物制备大豆“膳食”或研碎物(grindate)，并且可将材料贮存直至需要时。

蛋白质分离、纯化和分析

可使用标准蛋白质组学方法测定蛋白质水平。可以例如使用基于Bradford法的测定来确定总蛋白质含量(Bradford，1976，AnalyticalBiochem.，72：248-254)。

可按照公知的方法进行蛋白质分析。可以例如通过使用基于凝胶的测定、免疫印迹和质谱法来确认蛋白质身份。可以例如使用高效液相色谱来测定蛋白质的大小。

粗制材料或纯化的酶的比重(specific mass)酶促活性可使用用于测定目的酶的标准方案来测量。还可使用标准方法来测定酶的酶稳定性、温度曲线、pH曲线和有用的半衰期。

可将目的转基因蛋白纯化至进一步使用所需的任何程度。所需的纯化程度可取决于许多参数，例如成本、纯化的蛋白质对保留在种子中的蛋白质的稳定性、下游需要、污染物的去除、蛋白质进一步加工的要求(即，正确的蛋白质折叠或翻译后修饰)等。分离和纯化大豆种子中产生的蛋白质的方法的实例示于实施例16中。

在本发明的实施方案中，可以例如通过碾磨或研磨加工大豆种子。可通过加入液体并且搅拌一段时间，然后任选地过滤以除去大颗粒来制备研磨材料的粗制提取物。可选择地，在一些实施方案中，可能根本不必纯化目的蛋白质--可直接使用含有目的蛋白质和大豆种子的其余物质的种子研碎物。

酶联免疫吸附测定(ELISA)

在一些实施方案中，可将本领域公知的ELISA法用于分析表达的蛋白质。以大豆中的β-葡糖苷酶的产生为例，可使用下列方案。用兔抗β-葡糖苷酶抗体包被多孔板，然后将大豆种子提取物和对照样品加入板的单独的孔，并在35℃下温育1小时。然后向各孔中加入抗兔辣根过氧化物酶缀合物并且于35℃下温育1小时，然后加入四甲基联苯胺底物(Sigma，USA)并且在室温下温育3分钟。通过向各孔中加入1N H₂SO₄来终止反应。在Microplate Reader(Bio-Rad，model 3550)中于450nm处读取板，并利用例如MICROPLATE MANAGER^TM III(Bio-Rad)处理数据。测量几个纯合品系的分析结果以测定每颗种子表达的蛋白质的量。

在大豆种子中贮存转基因蛋白

本文中公开的转基因大豆种子还可用作天然蛋白质贮存容器。可将含有转基因蛋白质的成熟干燥大豆种子贮存在室温下或更低温度下直至需要时。因此，可延迟蛋白质的进一步加工直至使用时。该方法可以是贮存待用于商业加工的转基因酶的有效且廉价的方法。

本发明的出人意料的技术特征

令人惊讶地，本发明导致具有优良特性的植物。例如，本发明允许产生在自然界中天然存在的目的蛋白质，在天然蛋白质上进行修饰的目的蛋白质，合成的(新设计的)目的蛋白质或具有上述的组合的蛋白质。可将其产生为具有期望的物理化学性质(例如在不同条件下的溶解性或稳定性)的蛋白质；可将其产生为连接至有助于纯化或增强其应用性的残基的融合蛋白。

本发明特别地可用于产生否则对降解敏感的蛋白质，并且所述蛋白质通过本文中教导的由区室化产生的扣留作用可显示惊人的稳定性。

本发明特别地可用于产生需要低湿度来保持功能的蛋白质。可以例如将此类蛋白质靶向种子中的ER衍生的小泡并且贮存数月或数年，并且保持营养价值、酶促活性或期望的性质。

本发明特别地可用于产生可以以未纯化的形式或部分纯化的形式商业使用(由于种子或其他植物部分中的高水平的丰度)的蛋白质。在一些实施方案中，可加入提供或预防聚集的部分。

可将本发明的构建体与其他有用的特征(例如允许通过瞬时或外部信号打开或关闭基因的另外的调控元件)组合。有用的实施方案的实例示于表2中。

表2-示例性嵌合序列

实施例

使用标准技术进行下列实施例，除了另外详细描述的外，所述技术对于本领域技术人员来说是公知的和常规的。实施例是举例说明性的，不限定本发明。

实施例1

贮藏蛋白敲低品系″SP-″的产生

使用基因枪转化方案(Parrott等，2004，″Transgenic soybean，″In：J.E.Specht和H.R.Boerma(eds).Soybeans：Improvement，Production，and Uses，第3版-Agronomy Monograph No.16.ASA-CSA-SSSA，Madison，WI.pp 265-302)，将根据图2设计的抑制种子中贮藏蛋白含量的RNAi构建体转移至大豆。通过倒转特异于这类开放阅读框的序列(其侧翼于内含子，在大豆球蛋白启动子和3′终止子控制下)来产生特异性同时抑制内源大豆贮藏蛋白和FAD2-1ω-6脂肪酸去饱和酶的RNAi盒。将大豆球蛋白AlbB2基因的331bp区域(SEQ ID NO：55)紧邻FAD2-1a基因的128bp区域(SEQ ID NO：57)放置。然后将该459bp的异源DNA以反向重复置于内含子周围。合成来源的内含子获自沉默载体p3UTR12850S的一部分。然后将该盒(SEQ ID NO：56)置于大豆球蛋白的调控元件之下(图2)。作为构建体的任选特征，加入FAD2RNAi以提供用于高油(high-oleic)表型的另外的筛选标记和维持与之前的伴大豆球蛋白敲低(其也包括FAD2敲低)的一致性(Kinney和Herman(″Cosuppression of the αSubunits of beta-conglycinin inTransgenic Soybean Seeds Induces the Formation of EndoplasmicReticulum-Derived Protein Bodies，″Plant Cell 13：1165-1178(2001)。

利用1D SDS/PAGE就总蛋白质分布，并且利用免疫印迹测定就与抗大豆球蛋白和抗伴大豆球蛋白抗体的交叉反应性筛选再生的体细胞胚和T0种子。

回收的转基因品系不仅展示被抑制的大豆球蛋白含量的表型，而且还展示伴大豆球蛋白的α/α′-和β-亚基的基本上完全的敲低。本文中产生的具有大豆球蛋白和伴大豆球蛋白的敲低的品系将称为SP-(贮藏蛋白敲低)。

实施例2

SP-中蛋白质和油的含量

将SP-品系再生成大豆植物。所得的植物生长和结实与对照相比较差异不显著。将T0种子破裂以测定表型，使SP-种子再生长并且再选择两次以产生纯合群体。SP-表型在各随后世代中都很稳定，未检测到α/α′和β伴大豆球蛋白亚基并且大豆球蛋白水平大大降低。SP-种子中油酸水平高于94％，表明也存在FAD2筛选标记敲低。

在温室中生长的SP-的休眠种子的平均146mg的干燥大小和重量与温室中生长的野生型(WT)品种″Jack″的休眠种子(平均163mg)相似。SP-的总蛋白质和油含量(40.2％，19.1％)与WT品种″Jack″(37.5％，20.5％)相似。因此，该测定表明，相应于大部分大豆总蛋白的蛋白质的敲低导致大豆蛋白质组成重新平衡至几乎相同的蛋白质/油含量和种子大小。

实施例3

电子显微镜检查和免疫金免疫细胞化学

用Balzer′s高压装置(Bal-Tech，Principality of Liechtenstein)冷冻固定组织样品，用丙酮/OsO4冷冻置换，将其包埋在epon塑料中。用饱和醋酸双氧铀水溶液和柠檬酸铅(33mg/ml)将超薄切片染色，然后观察。然后进行免疫细胞化学分析。冷冻固定平行样品，然后在无固定剂存在的情况下通过冷冻置换进行处理。将经置换的样品转移至Lowicryl HM-20树脂(其通过UV光照射而聚合)。用抗-GFP MAb(Clontech)或之前由本实验室产生的兔多克隆抗-大豆球蛋白标记薄切片。用抗-IgG(兔或小鼠)-10nm胶体金(Sigma)间接标记切片，然后在EM观察之前用5％醋酸双氧铀增加对比度。所有TEM都用LEO 912AB显微镜进行，使用以蒙太奇模式操作的2k x 2k CCD照相机捕捉图像。

实施例4

SP-的正常总体形态学

为了检查SP-的细胞结构以与WT相比较，通过高压冷冻固定制备两者的成熟子叶，并且用丙酮/OsO4对所得的样品进行冷冻置换，然后将其包埋在Epon塑料中，如上所述进行处理。SP-大豆形成PSV(图3A)，其在大小和外观上与WT种子中形成的PSV(图3B)明显相似。SP-中的PSV具有大豆典型的充满蛋白质的无定型基质(amorphous matrix)。

实施例5

双向蛋白质分析

如Joseph等人，(2006)，″Evaluation of Glycine germplasm fornulls of the immunodominant allergen P34/Gly m Bd 30k，″CropScience 46：1755-1763中所述，从成熟大豆种子分离总蛋白质。简而言之，将总共150ug的蛋白质加载至11cm的固定pH梯度(IPG)的凝胶条上(pH 3-10NL)(BioRad，Hercules CA)，然后水化过夜。使用ProteanIEF Cell(BioRad)进行等电聚焦(IEF)，进行总共40kVh，然后在第二向SDS-PAGE凝胶(8-16％线性梯度)上电泳。将凝胶在于40％(v/v)甲醇和10％(v/v)乙酸中的0.1％考马斯蓝中染色过夜，同时如Joseph等人(同上)中所述，使用GFP单克隆抗体(Clontech Inc，Mountain View，CA)进行印迹，然后进行免疫检测。在一式三份的凝胶上对各样品进行电泳，然后在Phoretix 2D Evolution(版本2005；Nonlinear DynamicsLtd.)上进行扫描和分析。在免疫印迹上鉴定的GFP点允许将相应的点定位在重复的凝胶上，将这些点的体积针对整个蛋白质组的点的体积标准化以测定整个可溶性大豆种子蛋白质组中GFP蛋白的百分比体积。

实施例6

因SP-而以增加的水平表达的蛋白质的鉴定

SP-大豆的蛋白质组分析显示，其他贮藏蛋白可补偿贮蓄蛋白质多肽的不存在。

与WT相比较，SP-的双向(2D)IEF/SDS-PAGE分级分离显示因贮藏蛋白的敲低而引起的蛋白质的点分布的显著变化。

图4显示使用宽范围，pH 3-10，第二向2D胶进行的WT和贮藏蛋白敲低之间的比较。总蛋白质染色显示，SP-中存在蛋白质分布的大规模变化，不存在的贮藏蛋白被其他丰富的蛋白质点取代。

贮藏蛋白的敲低进一步通过用特异于伴大豆球蛋白和大豆球蛋白贮藏蛋白级分的抗体探测重复的免疫印迹来确证，其显示不存在伴大豆球蛋白亚基和同种型以及大豆球蛋白亚基和同种型的显著减少。通过总蛋白质的点体积来评估一式三份的SP-2D凝胶(与野生型相比较)。借助于凝胶扫描/点体积软件，通过目视检查来给显著改变的蛋白质评分。切取选择的蛋白质点，将其经历胰蛋白酶片段化，然后利用串联MS/MS质谱法进行分析。选择用于质谱分析的编号的蛋白质点的图谱示于图4C。

来自图4C中的蛋白质点的汇编的蛋白质组数据示于表3中。大部分蛋白质含量重新平衡因Kunitz胰蛋白酶抑制剂(KTI)、大豆凝集素(LE)(也称为″凝集素″)和免疫显性大豆变应原P34或Gly m Bd 30k的增加的含量而引起。具有增加的含量的其他蛋白质包括葡萄糖结合蛋白(GBP)和种子成熟蛋白(SMP)。蛋白质组学和质谱鉴定显示，重新平衡贮藏蛋白的不足通过仅少数蛋白质的增加的积累而产生。

表3

图6显示饼图，其显示WT(″Jack″)大豆种子对SP-种子中不同蛋白质的量。该图清楚地显示重新平衡或补偿过程，其中当其他蛋白在种子中减少时，发生某些蛋白质的增加。

实施例7

SP-种子以发育修正形态学和模式形成PSV

双子叶植物种子例如大豆的蛋白质贮藏液泡(PSV)通过细分中央液泡(与贮藏蛋白的合成和沉积协同)而形成。这导致充满种子(其正在积累贮藏蛋白)的大部分细胞质的填充了蛋白质的PSV。

具有大豆球蛋白和β伴大豆球蛋白贮藏蛋白敲低的植物的贮藏薄壁组织细胞(例如上文实施例中论述的SP-品系中的贮藏薄壁组织细胞)显示只包含PSV。这表明，补偿性PSV蛋白质在液泡中并且保持在液泡中，而未将蛋白质重定向至ER衍生的蛋白质体中。所有其他亚细胞细胞器和结构的结构和分布在SP-和WT对照中显示是相同的。

相反地，伴大豆球蛋白的单独敲低，无论其通过下文(例如实施例11)所示的基因工程还是天然发生的突变，都导致大部分大豆球蛋白以前体前大豆球蛋白的形式保持，该形式在ER衍生的蛋白质体中积累。

实施例8

SP-大豆种子显示极少的转录变化

使用Affymetrix DNA基因芯片，利用生物学重复和技术重复将晚熟SP-大豆与WT(野生型)相比。对于阳性相关比率，使用相对严格的2倍升高/降低截断值，分析所得的转录组数据，其显示极少的转录物上调或下调。

Affymetrix基因芯片基于Shoemaker等人，2002，A compilationof soybean ESTs：generation and analysis，Genome，45(2)：329-38提供的大豆EST，大部分此类EST未注释超过正在表达的基因。值得注意的是，在未显示任何显著变化的转录物中，有一些是在SP-种子蛋白质组中确实显示增加的蛋白质丰度的蛋白质(即，KTI、P34和LE)的转录物。

编码与油体、油质蛋白相关的主要蛋白质的转录物是在SP-种子中没有变化的转录物。大豆种子蛋白质组的大部分被重塑，其与转录组的结果基本不平行。在图5中显示的散布图举例说明了SP-和WT转录物的阵列数据的密切相似性。

实施例9

由大豆球蛋白启动子驱动的GFP-KDEL

为了显示本方法如何可以用于在种子中产生高水平的蛋白质，制备构建体，所述构建体具有由大豆球蛋白启动子驱动的编码GFP以及ER信号肽和示例性ER滞留信号″KDEL″的异源多核苷酸的ORF和源自大豆球蛋白的3′TED(参见图7)。如Trick等人1997，″Recent advancesin soybean transformation，″Plant Tissue Culture and Biology，3(1)：9-26)中所述，利用基因枪进行大豆(Glycine max WT品种″Jack″)的体细胞胚转化，如Schmidt等人，2004，″Towards normalization ofsoybean somatic embryo maturation，″Plant Cell Reports 24：383-391中所述，进行再生。将处于马铃薯泛素3调控元件(Garbarino和Belknap，1994，″Isolation of a ubiquitin-ribosomal proteingene(ubi3)from potato and expression of its promoter intransgenic plants，″Plant Mol Biol.24(1)：119-127)的控制之下的潮霉素抗性基因用作组织培养物中的选择标记。将可商购获得的GFP(Clontech Inc.，Mountain View，CA)开放阅读框(SEQ ID NO：34)(除去起始密码子和终止密码子)置于包含种子特异性大豆球蛋白调控元件(Nielsen等人，1989，″Characterization of the glycinin genefamily in soybean，″Plant Cell，1(3)：313-328)、来自拟南芥属壳多糖酶基因的21个氨基酸的ER-信号序列(SEQ ID NO：12)和KDEL滞留标签(SEQ ID NO：23)的盒中，如Moravec等人，2007，″Production ofEscherichia coli heat labile toxin(LT)B subunit in soybean seedand analysis of its immunogenicity as an oral vaccine，″Vaccine，25(9)：1647-57所描述的。该构建体示于图7中。

收获成熟干燥的种子，使用蓝光(450nm)进行激发，在荧光解剖显微镜下目视观察GFP-kdel的表达。将GFP-kdel阳性植物培养至T1代以获得纯合种子。使用双光子激发Zeiss LSM 510显微镜，使用512nm发射滤光片，利用488nm处的激发光在细胞水平上检查GFP-kdel种子。

通过基因枪转化将构建体引入大豆，然后选择和再生植物。将GFP-kdel阳性种子再培养至T1和T2代，从而产生表达种子特异性GFP-kdel的种子的纯合品系。

亲本纯合种子中GFP-KDEL的表达导致1.6％GFP-kdel在大豆中积累(这通过来自2D IEF/SDS-PAGE的点体积比较和通过对种子裂解物的测定(使用荧光计测定和使用商购获得的GFP得到的标准曲线对照)来测定)。荧光显微图像显示，GFP-kdel PB分布在整个细胞质中。使用特异于GFP的商业Mab的GFP-kdel PB的TEM-免疫金测定标记0.2-0.3um直径的ER-结合的PB-样结构，如之前观察到的。

实施例10

SP-品系中由大豆球蛋白启动子驱动的GFP-kdel

在于SP-中发生的蛋白质重新平衡过程的背景中进一步测试对外源蛋白质的表达的影响。通过基因枪转化将包含由大豆球蛋白启动子驱动的GFP-kdel的构建体引入大豆，然后选择和再生植物，如实施例9所述。将GFP-kdel阳性种子再培养至T1和T2代，从而产生表达种子特异性GFP-kdel的种子的纯合品系。

亲本纯合种子中GFP-kdel的表达导致1.6-2％GFP-kdel在大豆中积累(这通过来自2D IEF/SDS-PAGE的点体积比较和通过对种子裂解物的测定(使用荧光计测定和使用商购获得的GFP得到的标准曲线对照)来测定)。这些数据示于图13和图14(与种质渗入的SP-植物中产生的数据相比较)。

荧光显微检查显示，GFP-kdel PB分布在整个细胞质中。使用特异于GFP的商业Mab的GFP-kdel PB的TEM-免疫金测定标记0.2-0.3um直径的ER-结合的PB-样结构，如之前观察到的。

实施例11

βCS大豆品系的产生

为了进一步显示降低种子贮藏蛋白的水平的方法，通过两个不同类型的基因敲低来制备缺乏β伴大豆球蛋白的α/α亚基的转基因大豆品系(″βCS″)。在一个方法中，用使用β伴大豆球蛋白启动子驱动FAD2基因表达的“有义”构建体转化植物。这导致β伴大豆球蛋白的抑制。

在另一个实例中，通过用设计用于抑制β伴大豆球蛋白的RNAi构建体转化大豆植物来制备大豆的βCS品系。为了制备RNAi构建体，将来自β伴大豆球蛋白基因(genbankAB030495)的序列片段(SEQ ID NO：53)置于来自FAD2基因的128bp片段(SEQ ID NO：57)邻近。然后将整个256bp区域以反向重复置于内含子周围，所述内含子使用pKannibal载体按照Wesley等人，(2001)″Construct design for efficient，effective and high-throughput gene silencing in plants，″PlantJ.27，581-590中所述的方法进行克隆。完整的盒序列示于SEQ ID NO：54。

发现使用该序列的转化抑制大豆种子中的β伴大豆球蛋白水平，导致a/a′β伴大豆球蛋白的完全沉默。一部分增加的大豆球蛋白的产量以其前体前大豆球蛋白的形式存在，并且被扣留在PB中。

实施例12

βCS大豆品系中由大豆球蛋白启动子驱动的GFP-kdel

将外源蛋白质表达为外来基因产物(extrinsic gene product)应当相对独立于蛋白质含量重新平衡的内在过程。设计选择的外源蛋白质(经修饰包括KDEL ER滞留序列的GFP)以在ER中积累，从而形成ER衍生的蛋白质体，所述蛋白质体是惰性细胞器，从头产生的，并且通常不在大豆中发现。因为GFP-kdel小体在整个种子成熟过程中稳定地积累(Schmidt和Herman 2008)，所以可定量GFP-kdel以测量其在整个种子成熟过程中的积累。

将GFP-kdel品系种质渗入至因基因敲低而缺乏β伴大豆球蛋白的α/α亚基的转基因大豆品系(″βCS″)。目视筛选所得的杂种，就GFP-kdel的表达分析成熟干燥的种子。

图8显示大豆中GFP-kdel表达的白光(图框A)和蓝光(图框B)影像。将大豆破裂，水化，并且用于分析GFP-kdel的亚细胞分布(使用双光子激发Zeiss LSM 510显微镜，使用512nm发射滤光片，利用488nm处的激发光)。图8(下部图框)显示WT遗传背景(图框C)和βCS背景(图框D)中的GFP-kdel。

水化的碎片的剩余部分用于产生2D宽范围IEF/SDS-PAGE凝胶。参考图9，来自βCS种子的蛋白质裂解物示于图框A中，来自在WT背景中表达的GFP-kdel的种子蛋白质裂解物示于图框B中，来自βCS xGFP-kdel的蛋白质裂解物示于图框C中，将重复的裂解物凝胶的免疫印迹(图框D)用于鉴定哪些点为GFP-kdel(加框标示的)。

GFP-kdel在WT背景中占大约2％的种子蛋白质组，并且当杂交入βCS背景时，其增加至大于7％的种子蛋白质组。

如图10(图框A)中所示，利用荧光显微术显现水化的碎片的部分，所得的图像显示，GFP-kdel在βCS背景中相对于WT背景以更高的水平表达。

然后利用1D PAGE分级分离种子碎片的裂解物。图10(图框B)显示在WT背景(与βCS背景相比)中表达GFP-kdel的转化的纯合植物的蛋白质的1D凝胶。图10(图框C)是使用抗β伴大豆球蛋白抗体的免疫印迹，其确认在βCS和βCS x GFP-kdel种子裂解物中缺乏β伴大豆球蛋白。

为了进一步评估GFP-kdel丰度，制备种子裂解物，使用商业GFP作为对照标准，利用荧光计进行测定。图11中所示的结果确认了GFP-kdel荧光(图10，图框A)和点体积丰度(图9)的视觉印象：种质渗入至βCS植物的GFP-kdel构建体导致GFP-kdel的积累增加大约3.5至4.0倍(与用GFP-kdel转化的WT植物相比较)。

累积以形成ER衍生的蛋白质体的前大豆球蛋白和GFP-kdel的共产生和积累导致形成两种不同的ER结合的蛋白质体群体。从头形成的ER-衍生的蛋白质体和转基因产物的ER扣留增强了否则翻译后不稳定的蛋白质的稳定性。大豆的β伴大豆球蛋白的α/α亚基敲低产生前大豆球蛋白蛋白质体，也产生蛋白质体的GFP-kdel品系的种质渗入导致形成GFP-kdel蛋白质体，其在数量和大小上与GFP-kdel亲本中的蛋白质体相比更丰富。密切相关的蛋白质例如α和γ-玉米醇溶蛋白共积累，形成单个蛋白质体群体。这不同于前大豆球蛋白和GFP-kdel(当表达时，其形成两种不同的蛋白质体，GFP-kdel易于在蛋白质体中积累)的结果。这表明蛋白质在形成蛋白质体的ER中的积累是依赖于蛋白质种类的过程，即使超过一种的被蛋白质体扣留的蛋白质被合成，也形成只具有一种类型的蛋白质的蛋白质体。这对于使用蛋白质体形成作为生物技术的平台是潜在有利的，因为其确保被扣留在堆积物(accretion)中的蛋白质是相对纯的。然后可从裂解物直接分离蛋白质体，从而大大简化了下游纯化途径。

实施例13

异源蛋白质在βCS大豆品系中的加工

在WT和βCS大豆植物中检查编码大豆球蛋白的异源多核苷酸的加工。

如图12(泳道1)中所示，在WT(非转基因)大豆中，在种子中未能检测到前大豆球蛋白。泳道2显示在βCS植物中，升高水平的大豆球蛋白以前大豆球蛋白的形式贮藏在蛋白质体中。前大豆球蛋白/大豆球蛋白的百分比为大约24％。

实施例14

β-葡糖苷酶在大豆种子中的产生

可将本文中描述的构建体用于在大豆种子中产生酶例如β-葡糖苷酶。例如，可将白曲霉β-葡糖苷酶序列(SEQ ID NO：35)插入具有大豆的大豆球蛋白调控序列以及ER信号和滞留序列的基因构建体。然后可使用基因枪轰击将所述构建体转化入大豆组织，再生植物，使之杂交，并获得稳定的纯合植物。然后将这些植物种质渗入至βCS大豆品系。然后测定来自这些植物的目的蛋白质的产量。选择具有高表达水平的β-葡糖苷酶的植物用于目的蛋白质的扩大生产。

实施例15

外切纤维二糖水解酶I在大豆种子中的产生

可将本文中描述的构建体用于在大豆种子中产生酶例如外切纤维二糖水解酶I。例如，可对修饰的里氏木霉序列外切纤维二糖水解酶I(登录号P26294)进行修饰以包括拟南芥属壳多糖酶ER信号序列和KDEL滞留信号序列，如SEQ ID NO：22中所示。可将来自KTI的基因调控区(或经发现补偿具有遗传缺陷的大豆品系中减少的蛋白质的另一种蛋白质的基因调控区)用于驱动蛋白质的表达。然后可使用基因枪轰击将构建体转化入大豆组织，然后再生植物至纯合群体以进行酶的表达。然后可用纯合SP-植物对表达所述酶的纯合植物进行种质渗入以形成对于外切纤维二糖水解酶I和SP-性状是纯合的植物。然后测定来自这类植物的外切纤维二糖水解酶I的产量。优选选择具有高表达水平的外切纤维二糖水解酶I的植物用于蛋白质的扩大生产。

实施例16

来自种子的目的蛋白质的加工

可直接利用蛋白质，不从大豆种子膳食纯化蛋白质，或可部分或充分纯化目的蛋白质。提取方法将取决于所产生的蛋白质的类型，以及所需的纯度。例如，可通过将大豆种子研碎物与0.35M NaCl(于75g/L的PBS中)在室温下混合2.5小时来从成熟干燥的大豆提取目的转基因蛋白质。然后可将提取物通过数层干酪包布(cheesecloth)，以12,000g在4℃下离心1小时。然后回收上清液，将NaCl浓度调整至0.4M(pH8.0)。在第二次离心(以12,000g于4℃下离心10分钟)后，可收集上清液，并通过0.45μm硝酸纤维素膜进行过滤。可将滤液加载至SPSEPHAROSE^TM柱(Bio-Rad，Hercules，Calif.)上，所述柱子之前用0.4M的于50mM磷酸钠pH 8.0中的NaCl(结合缓冲液)以5ml/分钟的流速进行平衡。用结合缓冲液洗涤柱子直至不再洗脱污染物。然后通过线性梯度洗脱目的蛋白质，接着针对PBS进行透析。然后纯化的蛋白质可例如通过SDS-PAGE和/或免疫印迹进行分析，并贮藏于-80℃，或可选择地，进行冷冻干燥并贮藏于室温或更低温度下直到需要时。

实施例17

其他酶在大豆种子中的产生

可将编码选择的目的工业酶的合成基因插入本文中描述的大豆种子特异性基因表达盒，所述表达盒包含来自大豆球蛋白、KTI、P34、SBP、SMP或LE的5′和3′调控元件。KTI、P34、SBP、SMP或LE的调控元件用于驱动工业酶例如β-葡糖苷酶在SP-背景中的表达。构建体诱导工业酶参与因伴大豆球蛋白和/或大豆球蛋白的抑制而引起的蛋白质重新平衡过程，从而提高工业酶的合成和积累。

ORF优选具有融合至基因的5′端的编码来自拟南芥属壳多糖酶基本基因的ER靶向信号的核苷酸序列和融合至基因的3′端的编码羧基端KDEL ER滞留序列的核苷酸序列。质粒还可包含潮霉素抗性标记以用于选择转化子。如本文中所述，进行包含目的基因的纯合品系的转化和产生。然后将转基因植物种质渗入至SP-、βCS或缺乏另一种种子贮藏蛋白的品系。然后测定种子中转基因蛋白质的量。具有高表达水平的目的工业蛋白的植物可用于所述蛋白质的扩大生产。通过使用该方法，可获得增加量的目的工业蛋白。

实施例18

人抗体片段在大豆种子中的产生

本文中描述的方法可用于在大豆种子中产生抗体片段。例如，选择待产生的抗体片段。然后如本文中所述，将编码抗体片段的核酸插入具有大豆球蛋白的上游和下游调控元件的载体构建体。然后使用电穿孔将构建体转化入大豆种子。然后再生和杂交转化的植物，并获得稳定的纯合植物。然后将这类植物种质渗入至βCS品系。确认抗体片段的产生。培养植物以扩大生产目的蛋白质。然后从成熟大豆种子分离和纯化抗体片段。

根据上述内容应理解，虽然为了举例说明目的已在本文中描述了本发明的特定实施方案，但可进行各种变动而不背离本发明的精神和范围。本文中引用的全部参考资料都以其全文通过引用合并入本文。

表4核酸和蛋白质序列

Claims (27)

1.一种转基因双子叶植物，其包含：

a.一种或多种种子贮藏蛋白的缺乏，其中所述缺乏导致内源种子贮藏蛋白相对于野生型植物的所述贮藏蛋白减少至少50％；和

b.异源多核苷酸，其包含种子贮藏蛋白启动子、开放阅读框，所述开放阅读框包含ER信号序列、期望的蛋白质编码序列和ER滞留信号；其中所述开放阅读框可操作地连接至所述种子贮藏蛋白启动子；和

其中所述转基因植物的种子能够以大于5％的种子总干重的水平产生异源蛋白质。

2.权利要求1的双子叶植物，其中所述异源多核苷酸还包含5′翻译增强子结构域和/或3′翻译增强子结构域。

3.权利要求1的双子叶植物，其中所述ER滞留序列诱导异源蛋白质在ER或ER衍生的小泡的腔中积累。

4.权利要求1的双子叶植物，其中所述双子叶植物是豆科，和任选地豆目，和任选地大豆属(soya genus)的成员。

5.权利要求4的双子叶植物，其中所述双子叶植物是大豆属(Glycine genus)的成员。

6.权利要求5的双子叶植物，其中所述双子叶植物是大豆。

7.权利要求1的双子叶植物，其中所述启动子源自Kunitz胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、免疫显性大豆变应原P34或Gly m Bd 30k、葡萄糖结合蛋白、种子成熟蛋白、大豆球蛋白或伴大豆球蛋白。

8.权利要求2的双子叶植物，其中所述翻译增强子结构域源自Kunitz胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、免疫显性大豆变应原P34或Gly mBd 30k、葡萄糖结合蛋白、种子成熟蛋白、大豆球蛋白或伴大豆球蛋白。

9.权利要求1的双子叶植物，其中缺乏的贮藏蛋白是Kunitz胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、免疫显性大豆变应原P34或Gly m Bd 30k、葡萄糖结合蛋白、种子成熟蛋白、大豆球蛋白或伴大豆球蛋白中的一种或多种。

10.权利要求9的双子叶植物，其中所述双子叶植物种子具有种子内源贮藏蛋白的多于75％的缺乏。

11.权利要求1的双子叶植物，其还包含5′翻译增强子结构域和3′翻译增强子结构域，并且其中所述启动子以及所述3′和5′翻译增强子结构域源自相同的贮藏蛋白。

12.权利要求1的双子叶植物，其中所述异源蛋白质在双子叶植物的种子中积累至大于大约2％或大于大约4％或大于大约5％的种子总干重的水平。

13.权利要求1的双子叶植物的种子。

14.获自权利要求13的种子的转基因蛋白质。

15.权利要求14的转基因蛋白质，其中所述异源蛋白质已被纯化。

16.权利要求1的双子叶植物，其中靶蛋白编码序列编码酶或其片段。

17.权利要求16的双子叶植物，其中所述酶是纤维素分解酶。

18.权利要求17的双子叶植物，其中所述纤维素分解酶源自真菌来源、细菌来源、动物来源或植物来源。

19.权利要求17的双子叶植物，其中所述纤维素分解酶是β-葡糖苷酶、外切葡聚糖酶1、外切葡聚糖酶II、内切葡聚糖酶、木聚糖酶、半纤维素酶、木质酶、木质素过氧化物酶或锰过氧化物酶。

20.包含权利要求14的蛋白质的产物。

21.包含权利要求14的蛋白质的商业上有用的酶组合物。

22.权利要求1的双子叶植物，其中所述一种或多种种子贮藏蛋白的缺乏由编码种子贮藏蛋白的核酸的RNAi、反义或有义片段的存在而引起。

23.一种转基因双子叶植物，其包含：

a.一种或多种内源植物贮藏蛋白的缺乏，其中所述缺乏导致所述内源植物贮藏蛋白相对于野生型植物减少至少50％；和

b.异源多核苷酸，其包含可操作地连接至开放阅读框的补偿蛋白的基因调控区，所述开放阅读框编码包含ER信号序列、期望的蛋白质编码序列和ER滞留信号的序列；

其中所述转基因双子叶植物的种子能够以大于5％的种子总干重的水平产生异源蛋白质。

24.在使用前稳定地贮存酶的方法，其通过将所述酶贮存在来自转基因双子叶植物的种子中，所述转基因双子叶植物包括：

a.一种或多种植物贮藏蛋白的缺乏，其中所述缺乏导致内源种子蛋白减少至少50％；和

b.异源多核苷酸，其包含种子贮藏蛋白启动子、开放阅读框，所述开放阅读框包含编码ER信号序列、目的酶和ER滞留信号的核酸；其中所述开放阅读框可操作地连接至种子贮藏蛋白启动子；和

其中所述转基因植物的种子能够以大于5％的种子总干重的水平产生所述酶；和

将所述酶贮存在所述转基因双子叶植物的种子中。

25.在双子叶植物中产生增加量的异源蛋白质的方法，其包括：

a.用多核苷酸稳定地转化植物细胞，所述多核苷酸包含种子贮藏蛋白启动子、开放阅读框，所述开放阅读框包含ER信号序列、期望的蛋白质编码序列和ER滞留信号；其中所述开放阅读框可操作地连接至种子贮藏蛋白启动子；

b.从所述稳定转化的植物细胞获得纯合植物品系；

c.将所述稳定转化的植物品系种质渗入至缺乏内源种子贮藏蛋白的植物，其中所述缺乏导致所述内源种子贮藏蛋白相对于野生型植物的所述贮藏蛋白减少至少50％；

d.培养所述种质渗入的转基因植物的种子；和

e.从所述种质渗入的转基因植物的种子获得异源蛋白质，

其中所述种质渗入的转基因植物的种子能够以大于5％的种子总干重的水平产生异源蛋白质。

26.权利要求25的方法，其中所述内源种子贮藏蛋白的缺乏因编码种子贮藏蛋白的核酸的RNAi、反义或有义片段的存在而引起。

27.在双子叶植物中产生增加量的异源蛋白质的方法，其包括：

a.用多核苷酸稳定地转化植物细胞，所述多核苷酸包含种子贮藏蛋白启动子、开放阅读框，所述开放阅读框包含ER信号序列、期望的蛋白质编码序列和ER滞留信号；其中所述开放阅读框可操作地连接至种子贮藏蛋白启动子；其中所述多核苷酸还包含能够下调内源种子贮藏蛋白的RNAi序列；

b.从所述稳定转化的植物细胞获得纯合植物品系；

c.培养所述纯合植物品系的种子；和

d.从所述纯合植物的种子获得异源蛋白质。

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