KR102630105B1 - Cel12A 단백질을 포함하는 셀룰로오스 분해용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Cel12A 단백질을 포함하는 셀룰로오스 분해용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 마이크로크리스탈린 셀룰로오스(microcrystalline cellulose; 이하 MCC) 비드(beads)와 결합되어 정제 가능한 Cel12A 효소는 높은 셀룰로오스 분해 활성을 나타내므로, 이를 효과적으로 리그노셀룰로오스(lignocellulose) 등을 분해하여 바이오에너지 자원을 획득하는 원천기술에 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 Cel12A 단백질을 포함하는 셀룰로오스 분해용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
식물 자원은 지구상에서 가장 풍부한 자원으로서, 천연에 존재하며, 재생 가능하다. 셀룰로오스는 이러한 식물의 세포벽을 이루는 대표적인 주성분으로 적절한 방법을 통하여 상업적으로 유용한 산물로 전환될 수 있는 중요한 원료이다. 구체적으로 한가지 예는 식물의 셀룰로오스를 발효가능한 당으로 전환시켜 생물 연료인 에탄올의 생산에 이용하는 것으로, 상기 과정 중 셀룰로오스를 발효 가능한 당으로 전환시키는 셀룰로오스 분해효소는 생물연료의 생산가능성이 가지는 산업적인 잠 재성 측면에서 커다란 주목을 받아왔다.
현재까지 식물의 셀룰로오스를 발효 가능한 당으로 전환하는 방법으로 대규모 발효에 의해서 생산되는 상업적인 효소를 많이 이용해 왔으나, 상기 효소의 생산에 막대한 비용이 소요되어 이를 일반적으로 이용하는 데는 많은 문제점이 있었다. 상기한 이유로 최근에는 적은 비용으로 대량의 셀룰로오스 분해효소를 생산하려는 다양한 시도가 이루어져 왔다.
특히 산업적인 측면에서 셀룰레이즈(cellulase) 생산 균주로는 트리코델마 리제이(Trichoderma reesei)가 대표적인 균주로 집중 연구되었으며, 자일란에이즈(xylanase)는 바실러스(Bacillus)속과 아스퍼질러스(Aspergillus)속의 미생물이 주로 연구되었다. 그러나 효소의 농도 및 활성이 산업화를 충족시킬 만큼 충분하지 못하다는 문제점이 있었으며, 이들 효소의 생산을 위한 기질로 유당(lactose)과 같은 값비싼 물질을 포함하는 고가의 정제배지를 사용하기 때문에 생산단가가 높은 문제점이 있었다.
유전공학적으로 형질전환된 식물은 최소한의 비용을 투입하여 대량의 효소를 생산할 수 있으므로, 산업적으로 또는 의학적으로 이용되는 대규모의 재조합 단백질 생산을 위한 가장 경제적인 시스템 중 하나이다. 최근, 셀룰레이즈의 생산비용을 낮추려는 노력의 일환으로 상기의 형질전환 식물 시스템을 도입하여 셀룰레이즈 유전자를 형질전환 식물에서 발현시키려는 시도들이 있어 왔으나, 발현정도가 낮았을 뿐만 아니라 식물로부터 발현된 재조합 셀룰레이즈를 정제하는 고비용의 단계가 포함되어 있어 실제적으로 셀룰로오스로부터 발효가능한 당으로의 전환에 소요되는 비용을 낮추는 것이 쉽지 않았다.
엔도글루카네이즈(endoglucanase)는 불용성의 섬유소를 효과적으로 분해하기 위해서 매우 중요한 효소이다. 현재, 섬유소 분해를 통해 경제적으로 바이오에탄올을 생산하기 위해서는 활성이 높은 엔도글루카네이즈가 필요하므로, 이를 확보하기 위하여 기존에 클로닝된 유전자를 개량하여 활성을 증가시키는 연구 등이 활발히 이루어지고 있으나, 아직까지 우수한 분해능을 가지는 셀룰레이즈의 개발은 더딘 실정이다.
이에 본 발명자들은 BiP의 아미노 말단 부위의 일부분을 코딩하는 핵산 서열, 작은조개버섯(Gloeophyllum trabeum) 유래 Cel12A 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 태그 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 컨스트럭트를 구축하고, 이를 이용하여 식물을 형질전환함으로써 Cel12A 단백질을 생산하였으며, 이와 같이 생산된 Cel12A 효소의 셀룰로오스 분해 활성이 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 세포내 소포체로의 이동을 일어나게 하는 이동신호를 가진 신호 단백질 코딩 핵산 서열, 엔도글루카네이즈(endoglucanase) 코딩 핵산 서열, 및 태그 단백질 코딩 핵산 서열이 작동 가능하게 연결된 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포내 소포체로의 이동을 일어나게 하는 이동신호를 가진 신호 단백질 코딩 핵산 서열, 엔도글루카네이즈 코딩 핵산 서열, 및 태그 단백질 코딩 핵산 서열이 작동 가능하게 연결된 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 엔도글루카네이즈 생산용 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포내 소포체로의 이동을 일어나게 하는 이동신호를 가진 신호 단백질 코딩 핵산 서열, 엔도글루카네이즈 코딩 핵산 서열, 및 태그 단백질 코딩 핵산 서열이 작동 가능하게 연결된 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 셀룰로오스 분해용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 Cel12A 단백질을 포함하는 셀룰로오스 분해용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법은 BiP의 아미노 말단 부위의 일부분을 코딩하는 핵산 서열, 작은조개버섯(Gloeophyllum trabeum) 유래 Cel12A 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 태그 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 컨스트럭트를 구축함으로써 Cel12A 단백질의 셀룰로오스 분해 활성을 향상시킨다.
본 발명자들은 작은조개버섯에서 유래된 고활성의 엔도글루카네이즈(endoglucanase)인 Cel12A 효소를 분자농업 (molecular farming) 기술을 이용하여 담배 잎에서 대량생산하였고, 세포질(cytosol)에 존재하는 단백질 분해효소(proteases)에 의한 Cel12A 효소의 손실을 막기 위하여, 생산된 Cel12A 단백질을 담배 잎 세포의 소포체(endoplasmic reticulum)에 축적시키는 전략을 사용하였다. 담배 잎에서 생산된 Cel12A 효소가 높은 용해도(solubility)와 안정성(stability) 뿐만 아니라 효율적인 셀룰로오스 분해 활성을 보유하고 있음을 확인하였다.
또한 본 발명의 방법에 따라 제조된 Cel12A 효소는 마이크로크리스탈린 셀룰로오스(microcrystalline cellulose; 이하 MCC) 비드(beads)와 강하게 결합하는 성질을 이용하여 정제 가능하고, 높은 안정성 및 셀룰로오스 분해 활성을 나타내므로, 이와 같은 형태로 활용될 수 있다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 세포내 소포체로의 이동을 일어나게 하는 이동신호를 가진 신호 단백질 코딩 핵산 서열, 엔도글루카네이즈 코딩 핵산 서열, 및 태그 단백질 코딩 핵산 서열이 작동 가능하게 연결된 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터이다.
본 명세서상의 용어 “작동 가능하게 연결된”은 핵산 서열 또는 발현 인자가인 핵산 서열의 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 것을 의미한다.
본 발명에 있어서 발현 컨스트럭트는 프로모터로서 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)에서 유래한 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터 및 유비퀴틴 단백질 프로모터으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프로모터를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서상의 용어 “신호 단백질”은 세포내 특정 기관 또는 위치로의 이동을 일어나게 하는 이동신호를 발생시키는 단백질을 의미한다.
본 발명에 있어서 신호 단백질 코딩 핵산 서열은 소포체(endoplasmic reticulum) 단백질인 BiP의 아미노 말단 부위의 일부분인 것일 수 있다. BiP는 단백질이 소포체로 이동할 수 있게 유도해 주는 단백질 이동 신호(targeting signal)를 발생시키고, BiP의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있다. BiP 코딩 핵산 서열은 서열번호 2로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 신호 단백질 코딩 핵산 서열의 C-말단 뒤에는 MP 도메인(M domain of the human receptor-type tyrosine-protein phosphatase C)이 위치할 수 있다. MP는 소포체에서 N-글루코실화(glycosylation) 됨으로써, 궁극적으로 단백질의 발현 효율을 높여준다고 알려져 있는 도메인이다. MP 도메인 코딩 핵산 서열은 서열번호 3으로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 MP 도메인의 C-말단 뒤에는 SUMO(Small ubiquitin-related modifier) 도메인이 위치할 수 있다. SUMO는 SENP1이라는 단백질 분해 효소가 결합하여 상기 SUMO 도메인(domain) 뒤에 붙어 있는 글리신-글리신(Glycine-Glycine) 서열의 바로 뒷부분을 절단한다. SUMO 뒤에 붙은 표적(target) 단백질을 얻기 위해 사용할 수 있다. 가끔 자가절단(self-cleavage)이 이루어지기도 한다. SUMO 코딩 핵산 서열은 서열번호 4로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 엔도글루카네이즈 코딩 핵산 서열은 작은조개버섯(Gloeophyllum trabeum)에서 유래한 것으로서, 이는 서열번호 5로 표시되는 것일 수 있다.
본 명세서상의 용어 “태그 단백질”은 표지로 사용 가능한 단백질로서, 특정 물질과의 친화성(affinity)으로 인하여 결합하거나, 형광 발광하거나, 항원-항체 반응하거나 또는 발색되는 성질을 갖는 단백질을 의미한다.
본 발명에 있어서 태그 단백질 코딩 핵산 서열은 엔도글루카네이즈 코딩 핵산 서열의 C-말단 뒤에 위치할 수 있고, CBM3(family 3 cellulose-binding domain)인 것일 수 있다. CBM3은 어피니티 태그(affinity tag)로 사용되고, 마이크로크리스탈린 셀룰로오스(microcrystalline cellulose; 이하 MCC) 비드(beads)와 강하게 결합한다. CBM3 코딩 핵산 서열은 서열번호 6으로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 컨스트럭트는 목적 단백질을 소포체에 머물게 할 수 있는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 또는 KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 암호화하는 염기서열이 추가적으로 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. HDEL 코딩 핵산 서열은 서열번호 7로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 세포내 소포체로의 이동을 일어나게 하는 이동신호를 가진 신호 단백질 코딩 핵산 서열, 엔도글루카네이즈 코딩 핵산 서열, 및 태그 단백질 코딩 핵산 서열이 작동 가능하게 연결된 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 엔도글루카네이즈 생산용 식물체이다.
상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배 나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류;로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는 세포내 소포체로의 이동을 일어나게 하는 이동신호를 가진 신호 단백질 코딩 핵산 서열, 엔도글루카네이즈 코딩 핵산 서열, 및 태그 단백질 코딩 핵산 서열이 작동 가능하게 연결된 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 셀룰로오스 분해용 조성물의 제조방법이다.
본 발명에 있어서 형질전환 단계는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커법(silicon carbide whiskers), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(polyethylenglycol)-매개성 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 형질전환 단계는 다음 단계를 포함하는 것일 수 있다:
재조합 벡터를 숙주세포에 도입하는 형질전환체 제조 단계; 및
형질전환체를 식물체에 침윤시키는 침윤 단계.
상기 형질전환체 제조 단계를 수행하기 위한 숙주세포로서는, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용할 수 있다.
상기 침윤 단계는 화학 전지법, 진공 침윤 방법 및 주사기 침윤 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 셀룰로오스 분해용 조성물의 제조방법은 형질전환된 식물체로부터 엔도글루카네이즈를 정제하는 정제 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 정제 단계는 식물체 추출물 또는 분쇄물에 셀룰로오스 비드를 첨가하여 결합시킴으로써 수행되는 것일 수 있다.
상기 셀룰로오스 비드는 카르복실 메틸 셀룰로오스(carboxyl methyl cellulose, CMC), 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose, MC), 무정형 셀룰로오스(amphous cellulose, AMC), 히드록시 에틸 셀룰로오스(hydroxy ethyl cellulose, HEC) 및 히드록시 프로필 메틸 셀룰로오스(hydroxy propyl methyl cellulose, HPMC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 Cel12A 단백질을 포함하는 셀룰로오스 분해용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 마이크로크리스탈린 셀룰로오스(microcrystalline cellulose; 이하 MCC) 비드(beads)와 결합되어 정제 가능한 Cel12A 효소는 높은 셀룰로오스 분해 활성을 나타내므로, 이를 효과적으로 리그노셀룰로오스(lignocellulose) 등을 분해하여 바이오에너지 자원을 획득하는 원천기술에 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 Cel12A 단백질 컨스트럭트의 제조를 위하여 구축된 백본(backbone)의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 담배 잎으로부터의 Cel12A 단백질 발현량을 보여주는 웨스턴 블로팅 결과 사진이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 Cel12A 단백질의 분획 검출 여부를 확인한 웨스턴 블로팅 결과 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 Cel12A 단백질을 마이크로크리스탈린 셀룰로오스(microcrystalline cellulose; 이하 MCC) 비드(beads)를 이용하여 정제하여 확인한 웨스턴 블로팅 결과 사진이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 Cel12A 효소의 셀룰로오스 분해 활성을 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 Cel12A 효소의 셀룰로오스 분해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 담배 잎으로부터의 Cel12A 단백질 발현량을 보여주는 웨스턴 블로팅 결과 사진이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 Cel12A 단백질의 분획 검출 여부를 확인한 웨스턴 블로팅 결과 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 Cel12A 단백질을 마이크로크리스탈린 셀룰로오스(microcrystalline cellulose; 이하 MCC) 비드(beads)를 이용하여 정제하여 확인한 웨스턴 블로팅 결과 사진이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 Cel12A 효소의 셀룰로오스 분해 활성을 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 Cel12A 효소의 셀룰로오스 분해 활성을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: Cel12A 단백질 발현 컨스트럭트의 제조
GtCel12A는 작은조개버섯(Gloeophyllum trabeum) 유래 Cel12A로 매우 효율적인 엔도글루카네이즈(endoglucanase) 활성을 나타낸다. Cel12A 단백질을 발현시키기 위하여 BiP-MP-SUMO-GtCel12A-CBM3-HDEL로 표시되는 컨스트럭트(Construct)를 제조하였다.
구체적으로, 컨스트럭트의 제조를 위하여 CaMV(Cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터(promotor) 및 HSP 터미네이터(terminator)를 포함하는 도 1의 백본(backbone)을 구축한 다음, Xba1/EcoR1 제한 효소를 이용하여 절단한 후, pCAMBIA 1300 벡터(vector)의 Xba1/EcoR1 사이트(sites)에 삽입하였다. 컨스트럭트의 제조에 사용된 서열은 하기 표 1과 같다.
| 서열 번호 |
명칭 | 서열 |
| 1 | BiP 아미노 말단 부위 일부 | MARSFGANSTVVLAIIFFGCLFALSSAIEEATKL |
| 2 | BiP 아미노 말단 부위 일부 코딩 서열 (intron도 일부 포함) | ATGGCTCGCTCGTTTGGAGCTAACAGTACCGTTGTGTTGGCGATCATCTTCTTCGGTGAGTGATTTTCCGATCTTCTTCTCCGATTTAGATCTCCTCTACATTGTTGCTTAATCTCAGAACCTTTTTTCGTTGTTCCTGGATCTGAATGTGTTTGTTTGCAATTTCACGATCTTAAAAGGTTAGATCTCGATTGGTATTGACGATTGGAATCTTTACGATTTCAGGATGTTTATTTGCGTTGTCCTCTGCAATAGAAGAGGCTACGAAGTTA |
| 3 | MP 도메인 코딩 서열 | ATGGCAAACATCACTGTGGATTACTTATATAACAAGGAAACTAAATTATTTACAGCAAAGCTAAATGTTAATGAGAATGTGGAATGTGGAAACAATACTTGCACAAACAATGAGGTGCATAACCTTACAGAATGTAAAAATGCGTCTGTTTCCATATCTCATAATTCATGTACTGCTCCTGAT |
| 4 | SUMO 도메인 코딩 서열 | CATATTAATTTGAAAGTGAAGGGACAGGACGGAAACGAGGTTTTCTTCCGTATCAAAAGATCAACACAACTCAAGAAACTCATGAATGCTTACTGCGATAGACAAAGCGTGGACATGACAGCTATAGCTTTCCTATTTGATGGGAGAAGGTTGAGAGCGGAACAGACTCCGGATGAGCTTGAAATGGAAGATGGAGATGAGATTGACGCAATGTTACATCAGACTGGTGCCGGCGGT |
| 5 | GtCel12A 코딩 서열 | ATGTTCCGCTTCATCTCTGCTTTGCCCTTTGCCTTGGGCGCATTAAAGCTTGCATCCGCGGCGACCGTGCTCACTGGTCAATACACCTGTGACACTGCTGGAGATTATACCCTCTGCAATGACCAGTGGGGTATTGCCAACGGTGTGGGCTCCCAGACCTCGACTTTGATCAGTGCTTCTGGCAGCACCATCTCCTGGTCGACCAACTACACTTGGGCTAACAACCCGAATGACGTCAAGACCTATGCCAATGTTCTCTCCAACACCGCCAAGGGAGTGCAGATCAGTCAAATTAGCAGCTTCCCCACCACCTGGGATTGGTACTACGAGACTCAGTCGTCTGGCCTCCGCGCTGATGTTTCGTACGACATGTGGACCGGTACTGCGCAGACCGGCACAGCTGCCAGTTCCTCTTCATCCTACGAGATCATGATCTGGCTTTCCGGCAAGGGCGGAATCCAACCCGTTGGCTCTCTGAAGACCTCTGGAATCAGTCTTGCCGGCTATACCTGGAACTTGTGGAGCGGAACCACCGAGACCTGGACCACCCTGTCCTTCGTTTCGGCTGACGGGGATATCACTAGCTTCAACGCCGAGCTGACTCCCTTCTTCCAGTACTTGGTCGAGAATGAGGGTGTCTCCGCCAGCCAGTATATCCAGGCCATTCAGACCGGCACGGAAGCCTTCACTGGCACTGCTGAGCTTGTCACTACCTCGTTCAGCGTCAGCTTGAGCGGG |
| 6 | CBM3 코딩 서열 | GTATCAGGTAACCTTAAGGTGGAGTTTTACAACTCGAACCCTTCTGATACAACTAACTCAATAAACCCACAGTTCAAAGTTACAAACACAGGCAGCTCTGCGATCGATTTGTCTAAATTAACCCTCAGATACTATTATACGGTTGATGGACAGAAGGACCAGACTTTCTGGTGTGATCATGCAGCTATCATTGGTTCTAACGGTAGCTACAACGGAATTACATCAAACGTGAAGGGCACTTTCGTTAAGATGTCCTCTAGCACTAACAACGCAGACACATATTTGGAGATCAGTTTTACGGGGGGAACCCTTGAACCAGGTGCTCACGTCCAGATTCAAGGAAGATTCGCTAAAAACGACTGGTCGAACTATACCCAAAGTAATGATTACAGTTTTAAATCCGCCTCACAATTTGTTGAGTGGGATCAGGTCACTGCTTACCTGAACGGGGTTCTAGTGTGGGGAAAGGAACCTGGT |
| 7 | HDEL 코딩 서열 | CATGACGAGCTT |
실시예 2: Cel12A의 단백질 발현 정도의 확인
상기 실시예 1과 같이 제조된 컨스트럭트가 삽입된 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium) 매개 방법(Agro-infiltration)으로 담배 잎(Nicotiana benthamiana)에 형질변환(transformation)시켰다.
구체적으로, 컨스트럭트를 아그로박테리움 EHA105 균주(strain)에 전기천공법(electroporation)을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환된 아그로박테리움을 배양한 후 10 mM MES (pH 5.6), 10 mM MgSO4, 100 umol 아세토시린곤(acetosyringone)이 포함된 용액에 풀어준 후 주사기(syringe)를 이용하여 5 내지 6주 사이의 담배 잎에 삽입하였다. 이후 담배는 온도 23℃, 습도 60%, 빛은 long-day (18h light / 6h dark) 조건으로 배양하였다.
이후 형질변환된 담배를 3, 5 및 7일(dpi) 동안 배양한 후에, 단백질을 추출하기 위해서 0.2 g의 잎을 액체 질소로 얼린 후 막자와 막자 사발을 이용하여 갈았다. 곱게 갈린 잎에 추출(extraction) 용액(50 mM Tris-Cl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% TritonX-100, 1x protease inhibitor cocktail) 1 ml을 넣고 잘 섞었다. 잘 섞인 추출물(extracts)을 4℃에서 15분간 인큐베이션(incubation)한 후 85℃에서 10분간 열처리하였다.
상기 추출물에 대하여 CBM3 항체(㈜바이오앱)를 이용한 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 형질전환 여부를 검증하였다. 대조군은 RbcL(Ribulose bisphosphate carboxylase large chain)로 적용하였다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, 담배 잎에서 Cel12A가 발현되는 것을 확인하였다.
실시예 3: Cel12A 단백질의 용해도 확인
Cel12A 단백질의 용해도(solubility)를 알아보기 위해서 실시예 2에 따라 추출된 단백질들을 14,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리 전(총 단백질; T), 상등액(soluble fraction, 수용성 분획; S) 및 펠릿(pellet, 불용성 분획; P)으로 나누어 재차 웨스턴 블로팅을 수행하였다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, 많은 Cel12A 단백질이 수용성 분획에서 검출(detection)되는 것을 확인하였다. 더욱이, SUMO 뒷부분에서 자가절단(self-cleavage)이 일어나 용해도가 매우 높은 GtCel12A-CBM3를 얻을 수 있었다.
실시예 4: Cel12A 단백질의 정제
실시예 2에서 발현된 Cel12A 단백질을 마이크로크리스탈린 셀룰로오스(microcrystalline cellulose; 이하 MCC) 비드(beads)를 이용하여 정제 (purification) 하였다.
구체적으로, 수용성 분획(Soluble fraction)으로부터 비드를 이용하여 정제(Unbound fraction 제거)한 샘플을 버퍼(wash buffer)를 이용하여 순차적으로 3회 세척(wash)(W1, W2 및 W3: 순서대로 세척 시 상층 용액 일부)하고, 이에 다시 새로운 버퍼를 넣고 끓여서 MCC 비드로부터 단백질을 분리하여 최종적으로 결합 분획(bound fraction)을 정제하였다. 각각의 샘플에 대하여 웨스턴 블로팅을 수행하였다.
도 4에서 확인할 수 있듯이, 수용화 된 Cel12A는 MCC 비드를 이용하여 99% 이상 정제해 낼 수 있으며, 정제된 Cel12A는 안정한 형태로 비드와 결합한 채 존재하고 있다.
실시예 5: 담배 잎에서 생산된 Cel12A 효소의 엔도글루카네이즈 활성 확인
실시예 2에서 발현된 Cel12A 단백질의 엔도글루카네이즈(endoglucanase) 활성을 확인하였다.
구체적으로, 전체 용액의 1%(w/v)의 카복시메틸 셀룰로오스(Carboxymethyl cellulose; 이하 CMC)가 포함된 pH 3의 글리신-HCl(glycine-HCl) 용액에 50 ng의 정제된 Cel12A 단백질을 넣고 50℃의 온도에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 용액의 일부분(10%)를 디니트로살리실산(Dinitrosalicylic acid; DNS)과 섞은 후 100℃에서 5분간 끓였다. 끓인 샘플들을 얼음에 10분간 두어 식힌 후 550 nm의 흡광 값을 이용하여 반응시킨 각 샘플들의 흡광도를 측정하였다.
이 때 CMC를 넣지 않은 샘플, MCC 비드만을 넣은 샘플, 및 Cel12A 대신 탄산무수화효소(Carbonic anhydrase; CAH)를 넣은 샘플을 각각 음성 대조군(negative control)으로 사용하였다. 글루코스(Glucose)만을 넣은 것은 Cel12A의 활성에 의해서 CMC가 분해되면 환원당이 형성되기에 환원당 중 하나인 글루코스를 DNS와 반응시켜 양성 대조군(positive control)으로서 그리고 효소(enzyme)의 활성 값을 구하기 위한 표준(standard curve)을 위한 용도로 사용하였다.
도 5에서 확인할 수 있듯이, DNS는 환원당과 결합 시 노란 계열의 색에서 붉은 계열의 색으로 변하기에 Cel12A를 처리한 샘플들에서는 색의 변화가 나타났다. 결국 엔도글루카네이즈 활성을 가진 Cel12A 샘플들이 550 nm 흡광 값에서 음성 대조군 대비 흡광도의 차이를 나타내었다.
도 5의 결과 중 일부를 수치화하여 표 2 및 도 6으로 나타내었다.
| MCC 비드 | BiP-MP-SUMO-CAH-CBM3-HDEL | BiP-MP-SUMO-GtCel12A-CBM3-HDEL | |
| 효소 특이적 활성 (Specific activity, U/mg) |
2.6 | 4.0 | 238.78 |
표 2 및 도 6에서 확인할 수 있듯이, 1 단위(unit)의 GtCel12A 효소가 CMC로부터 1 umol의 글루코스를 분해하였다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY
<120> Composition containing Cel12A protein for decomposing cellulose
and method for manufacturing the thereof
<130> PN200340
<160> 7
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BiP
<400> 1
Met Ala Arg Ser Phe Gly Ala Asn Ser Thr Val Val Leu Ala Ile Ile
1 5 10 15
Phe Phe Gly Cys Leu Phe Ala Leu Ser Ser Ala Ile Glu Glu Ala Thr
20 25 30
Lys Leu
<210> 2
<211> 272
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BiP
<400> 2
atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60
tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120
ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180
ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240
tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt ta 272
<210> 3
<211> 183
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MP domain
<400> 3
atggcaaaca tcactgtgga ttacttatat aacaaggaaa ctaaattatt tacagcaaag 60
ctaaatgtta atgagaatgt ggaatgtgga aacaatactt gcacaaacaa tgaggtgcat 120
aaccttacag aatgtaaaaa tgcgtctgtt tccatatctc ataattcatg tactgctcct 180
gat 183
<210> 4
<211> 237
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SUMO domain
<400> 4
catattaatt tgaaagtgaa gggacaggac ggaaacgagg ttttcttccg tatcaaaaga 60
tcaacacaac tcaagaaact catgaatgct tactgcgata gacaaagcgt ggacatgaca 120
gctatagctt tcctatttga tgggagaagg ttgagagcgg aacagactcc ggatgagctt 180
gaaatggaag atggagatga gattgacgca atgttacatc agactggtgc cggcggt 237
<210> 5
<211> 738
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Gloeophyllum trabeum
<400> 5
atgttccgct tcatctctgc tttgcccttt gccttgggcg cattaaagct tgcatccgcg 60
gcgaccgtgc tcactggtca atacacctgt gacactgctg gagattatac cctctgcaat 120
gaccagtggg gtattgccaa cggtgtgggc tcccagacct cgactttgat cagtgcttct 180
ggcagcacca tctcctggtc gaccaactac acttgggcta acaacccgaa tgacgtcaag 240
acctatgcca atgttctctc caacaccgcc aagggagtgc agatcagtca aattagcagc 300
ttccccacca cctgggattg gtactacgag actcagtcgt ctggcctccg cgctgatgtt 360
tcgtacgaca tgtggaccgg tactgcgcag accggcacag ctgccagttc ctcttcatcc 420
tacgagatca tgatctggct ttccggcaag ggcggaatcc aacccgttgg ctctctgaag 480
acctctggaa tcagtcttgc cggctatacc tggaacttgt ggagcggaac caccgagacc 540
tggaccaccc tgtccttcgt ttcggctgac ggggatatca ctagcttcaa cgccgagctg 600
actcccttct tccagtactt ggtcgagaat gagggtgtct ccgccagcca gtatatccag 660
gccattcaga ccggcacgga agccttcact ggcactgctg agcttgtcac tacctcgttc 720
agcgtcagct tgagcggg 738
<210> 6
<211> 477
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBM3
<400> 6
gtatcaggta accttaaggt ggagttttac aactcgaacc cttctgatac aactaactca 60
ataaacccac agttcaaagt tacaaacaca ggcagctctg cgatcgattt gtctaaatta 120
accctcagat actattatac ggttgatgga cagaaggacc agactttctg gtgtgatcat 180
gcagctatca ttggttctaa cggtagctac aacggaatta catcaaacgt gaagggcact 240
ttcgttaaga tgtcctctag cactaacaac gcagacacat atttggagat cagttttacg 300
gggggaaccc ttgaaccagg tgctcacgtc cagattcaag gaagattcgc taaaaacgac 360
tggtcgaact atacccaaag taatgattac agttttaaat ccgcctcaca atttgttgag 420
tgggatcagg tcactgctta cctgaacggg gttctagtgt ggggaaagga acctggt 477
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<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HDEL
<400> 7
catgacgagc tt 12
Claims (14)
- 세포내 소포체로의 이동을 일어나게 하는 이동신호를 가진 서열번호 2로 표시되는 신호 단백질 코딩 핵산 서열,
상기 신호 단백질 코딩 핵산 서열의 C-말단 뒤에 위치하는 서열번호 3으로 표시되는 MP 도메인(M domain of the human receptor-type tyrosine-protein phosphatase C) 코딩 핵산 서열,
상기 MP 도메인 코딩 핵산 서열의 C-말단 뒤에 위치하는 서열번호 4로 표시되는 SUMO(Small ubiquitin-related modifier) 코딩 핵산 서열,
상기 SUMO 코딩 핵산 서열의 C-말단 뒤에 위치하는 서열번호 5로 표시되는 엔도글루카네이즈(endoglucanase) 코딩 핵산 서열,
상기 엔도글루카네이즈 코딩 핵산 서열의 C-말단 뒤에 위치하는 서열번호 6으로 표시되는 태그 단백질 코딩 핵산 서열, 및
목적 단백질을 소포체에 머물게 할 수 있는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 코딩 핵산 서열
이 작동 가능하게 연결된 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 세포내 소포체로의 이동을 일어나게 하는 이동신호를 가진 서열번호 2로 표시되는 신호 단백질 코딩 핵산 서열,
상기 신호 단백질 코딩 핵산 서열의 C-말단 뒤에 위치하는 서열번호 3으로 표시되는 MP 도메인(M domain of the human receptor-type tyrosine-protein phosphatase C) 코딩 핵산 서열,
상기 MP 도메인 코딩 핵산 서열의 C-말단 뒤에 위치하는 서열번호 4로 표시되는 SUMO(Small ubiquitin-related modifier) 코딩 핵산 서열,
상기 SUMO 코딩 핵산 서열의 C-말단 뒤에 위치하는 서열번호 5로 표시되는 엔도글루카네이즈(endoglucanase) 코딩 핵산 서열,
상기 엔도글루카네이즈 코딩 핵산 서열의 C-말단 뒤에 위치하는 서열번호 6으로 표시되는 태그 단백질 코딩 핵산 서열, 및
목적 단백질을 소포체에 머물게 할 수 있는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 코딩 핵산 서열
이 작동 가능하게 연결된 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 엔도글루카네이즈 생산용 식물체. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제5항에 있어서, 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배 나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 및 장미, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류;로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 엔도글루카네이즈 생산용 식물체.
- 세포내 소포체로의 이동을 일어나게 하는 이동신호를 가진 서열번호 2로 표시되는 신호 단백질 코딩 핵산 서열,
상기 신호 단백질 코딩 핵산 서열의 C-말단 뒤에 위치하는 서열번호 3으로 표시되는 MP 도메인(M domain of the human receptor-type tyrosine-protein phosphatase C) 코딩 핵산 서열,
상기 MP 도메인 코딩 핵산 서열의 C-말단 뒤에 위치하는 서열번호 4로 표시되는 SUMO(Small ubiquitin-related modifier) 코딩 핵산 서열,
상기 SUMO 코딩 핵산 서열의 C-말단 뒤에 위치하는 서열번호 5로 표시되는 엔도글루카네이즈(endoglucanase) 코딩 핵산 서열,
상기 엔도글루카네이즈 코딩 핵산 서열의 C-말단 뒤에 위치하는 서열번호 6으로 표시되는 태그 단백질 코딩 핵산 서열, 및
목적 단백질을 소포체에 머물게 할 수 있는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 코딩 핵산 서열
이 작동 가능하게 연결된 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 셀룰로오스 분해용 조성물의 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제10항에 있어서, 형질전환 단계는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커법(silicon carbide whiskers), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(polyethylenglycol)-매개성 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 제조방법.
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2020
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