KR101802923B1

KR101802923B1 - 신규 베타-글루코시다제 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101802923B1
Application number: KR1020110060388A
Authority: KR
Inventors: 손정훈; 김용진; 윤정준; 김미진; 박현주; 성봉현; 이초룡
Original assignee: 한국생명공학연구원; 한국생산기술연구원
Priority date: 2011-06-21
Filing date: 2011-06-21
Publication date: 2017-12-01
Also published as: KR20120140565A

Abstract

본 발명은 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 베타-글루코시다제, 상기 베타-글루코시다제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 베타-글루코시다제를 생산하는 방법 및 상기 형질전환체를 이용하여 바이오 에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 베타-글루코시다제는 우수한 셀룰로오스 분해활성을 나타내므로, 목질계 바이오매스로부터의 바이오 에탄올 제조 등의 산업공정에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

신규 베타-글루코시다제 및 그의 용도{Novel beta-glucosidase and the Uses thereof}

본 발명은 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 베타-글루코시다제, 상기 베타-글루코시다제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 베타-글루코시다제를 생산하는 방법 및 상기 형질전환체를 이용하여 바이오 에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근 부각된 기후변화 및 에너지 위기 문제해결을 위하여 지속가능한 신재생에너지의 필요성이 대두되고 있다. 녹색연료로서 잠재적 가능성이 가장 큰 바이오에탄올은 석유에너지에 대한 의존도를 줄이고, 지구 온난화와 같은 심각한 환경문제를 동시에 해결할 수 있는 대체 연료로서 활용되고 있다.

전 세계적으로 약 800억 리터 정도의 바이오에탄올이 생산(바이오에너지 시장 분석 및 전망, 화학경제연구원, 2008)되고 있는데, 미국과 브라질이 대표적이다. 현재까지 바이오에탄올 생산은 주로 식량자원인 옥수수와 사탕수수 등에서 얻어지는 포도당을 발효시켜 얻은 알코올로서, 석유 유래의 가솔린을 부분적으로 대치함으로써 가솔린의 소비량을 줄이고, 환경오염물질의 배출량도 줄이고 있다. 이처럼 식량자원을 이용하여 생산되는 바이오에탄올을 일반적으로 1세대 바이오에탄올 연료라고 하는데, 급격한 수요증대로 인해 옥수수와 사탕수수와 같은 농작물의 가격이 폭등하고, 다른 곡물의 가격상승을 유발하여 에너지 문제의 해결을 위한 바이오에탄올이 또 다른 식량문제를 일으키는 원인이 되고 있다.

이러한 문제 때문에 2015년 이후부터는 1세대 바이오에탄올의 생산한계가 예상되며, 이에 대한 새로운 대안으로서 이른바 2세대 바이오 연료인 셀룰로오스 에탄올(cellulosic bioethanol)이 각광을 받고 있다. 셀룰로오스 에탄올이란 지구상에서 가장 풍부한 유기물인 식물 세포벽 주요 구성 물질인 셀룰로오스를 분해하여 포도당을 만들고, 이로부터 에탄올을 만드는 것이다. 따라서 2세대 셀룰로오스 에탄올은 현재 옥수수 녹말을 발효시켜 에탄올을 뽑아내는 1세대 방법과는 달리, 방치되거나 태워버렸던 옥수수의 잎, 줄기, 뿌리 등 모든 조직을 사용해서 바이오에탄올을 생산하는 방법이다. 이 방법은 옥수수 껍질, 쌀겨, 목초, 갈대, 억새, 목재 폐기물 등 모든 식물의 조직으로부터 바이오에탄올을 생산할 수 있게 된다.

녹말로부터 에탄올을 생산하는 과정과 비교하여 셀룰로오스로부터 에탄올을 생산하는 과정의 큰 차이점은, 식물 세포벽의 주요 구성물질인 셀룰로오스를 셀룰라제(cellulase)라는 효소를 이용하여 가수분해하여 포도당을 생산하는 당화 과정이다. 그러나, 식물세포벽의 셀룰로오스는 쉽게 분해되지 않는 안정된 구조로 결합된 고분자 물질일 뿐 아니라 리그닌(lignin), 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 펙틴(pectin) 등 다른 고분자들과 함께 결합된 복합 물질을 이루고 있기 때문에 이를 분해하기 위해서는 여러 가지 공정이 필요하다. 셀룰로오스로부터 바이오에탄올을 생산하는데 필요한 첫 번째 공정은 전처리(pretreatment) 공정으로 식물의 세포벽을 물리적, 화학적, 또는 생물학적 처리를 가하여 식물 자원으로부터 셀룰로오스 섬유소를 분리하는 공정이다. 두 번째 공정은 당화(saccharification) 공정이며 이는 분리된 셀룰로오스 섬유소를 화학적 또는 생물학적 처리를 가하여 포도당(glucose)을 생산하는 과정을 말한다.

셀룰로오스를 포도당과 같은 저분자 당으로 가수분해시키기 위해서는 셀룰라제라는 효소가 필요하며, 특히 단단한 식물의 섬유질 원료(셀룰로오스)를 효과적으로 분해하기 위해서는 활성이 높은 셀룰라제 효소가 필수적이다. 셀룰라제는 셀룰로오스를 분해하는 효소를 통칭하는 것으로 세 가지 효소로 분류할 수 있다. 셀룰로오스의 β-1,4 글리코시드 결합을 자르는 엔도-글루카나제(endo-glucanase, EC 3.2.1.4), 셀룰로오스 사슬의 양 말단에 작용하여 글루코오스 이량체(glucose dimer)인 짧은 사슬의 셀로바이오스(cellobiose)를 만드는 엑소글루카나제(exo-glucanase, EC 3.2.1.91) 및 셀로바이오스를 분해하여 포도당을 만드는 베타-글루코시다제(β-glucosidase, EC 3.2.1.21)가 있다.

베타-글루코시다제는 셀로바이오스의 축적이 가수분해 과정에 방해물로 작용하기에 셀로바이오스를 즉시 포도당으로 전환시켜줌으로써 방해작용을 최소화한다는 점에서 아주 중요한 역할을 수행한다. 현재, 섬유소 분해를 통해 경제적으로 바이오에탄올을 생산하기 위해서는 활성이 높은 베타-글루코시다제가 필요하므로, 이를 확보하기 위하여 기존에 클로닝된 유전자를 개량하여 활성을 증가시키는 연구등이 활발히 이루어지고 있으나 아직까지 우수한 분해능을 가지는 셀룰라제의 개발은 더딘 실정이다.

이에, 본 발명자들은 고활성의 셀룰라제를 확보하기 위하여 섬유소 분해활성을 가지는 곰팡이, 포마 마크로스토마(Phoma macrostoma) Y4 균주를 썩은 감귤로부터 분리한 다음, 상기 균주로부터 베타-글루코시다제 유전자를 클로닝한 후, 상기 유전자들을 효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주와 대장균(Escherichia coli)에 재조합 발현하여 베타-글루코시다제 활성이 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 15의 아미노산 서열을 가지는 베타-글루코시다제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 베타-글루코시다제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 상기 베타-글루코시다제를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 바이오 에탄올을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 베타-글루코시다제를 제공한다.

본 발명에서 용어 "베타-글루코시다제"란 셀룰로오스를 분해하는 효소인 셀룰라제 중 하나로서, 글루코오스 이량체(glucose dimer)인 셀로바이오스(cellobiose)를 글루코스로(glucose)로 전환시키는 역할을 하며, 불용성의 섬유소를 효과적으로 분해하기 위하여 매우 중요한 효소이다.

본 발명의 베타-글루코시다제는 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 베타-글루코시다제 뿐만 아니라, 상기 베타-글루코시다제의 기능적 동등물도 포함한다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 본 발명의 베타-글루코시다제와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

바람직하게, 본 발명의 베타-글루코시다제는 포마 속 균주(Phoma sp .)로부터 발현된 베타-글루코시다제일 수 있으며, 보다 바람직하게는 포마 마크로스토마 Y4(Phoma macrostoma Y4)로부터 발현된 베타-글루코시다제일 수 있다.

본 발명의 구체적 실시예에서는, 셀룰라아제 활성을 나타내는 신규의 Phoma macrostoma Y4 균주를 분리 및 동정한 후(실시예 1), 이를 DNA 주형으로 표 1의 8개의 디제너레이트 프라이머의 조합을 만들고, 이들을 이용하여 베타-글루코시다제 유전자를 부분 증폭한 다음(실시예 2 및 도 1, 2), 증폭된 베타-글루코시다제 유전자를 pGEM-T Easy 벡터에 클로닝한 후, 염기서열을 분석하였다(실시예 3 및 도 3, 4).

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 베타-글루코시다제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"란, 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA(deoxyribonucleic acid) 또는 RNA(ribonucleic acid) 가닥을 의미한다. 본 발명에서는 상기 베타-글루코시타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미하는데, 상기 베타-글루코시다제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드 일 수 있다.

본 발명의 베타-글루코시다제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 베타-글루코시다제를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 베타-글루코시다제의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 베타-글루코시다제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 연결되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 하나의 유형인 "플라스미드"는 그 안에 추가적으로 DNA조각을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 말한다.

본 발명의 벡터는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는데, 이러한 벡터를 "발현 벡터"라고 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에 있어서 발현 벡터는 플라스미드 형태이다.

바람직하게, 본 발명의 발현벡터는 도 5의 개열지도를 갖는 발현벡터 YGa-ST19-Y4 BGL, 또는 도 10의 개열지도를 갖는 pET21a-Y4 BGL 또는 도 11의 개열지도를 갖는 pET24a-Y4-BGL 일 수 있다.

상기 발현벡터는 숙주세포에 따라, 사용가능한 발현벡터의 종류가 결정될 수 있는데, 효모를 숙주로서 사용하는 경우는, 발현벡터로서, 예를 들면 YEp13, YCp50, YGa계, pRS계, pYEX계 벡터 등이 이용가능하다. 프로모터로서는, 예를 들면 GAL프로모터, AOD프로모터 등을 사용할 수 있다.

아울러, 상기 발현벡터에는, 목적 유전자의 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 균체밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자, 난발현성 단백질에 적합한 맞춤형 융합인자 등을 추가로 포함할 수도 있다.

바람직하게, 상기 난발현성 단백질에 적합한 맞춤형 융합인자로서, 단백질융합인자(translational fusion partner : TFP)를 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "단백질 융합인자(translational fusion partner: TFP)"란 발현율이 낮은 단백질을 코딩하는 유전자와 융합되어 발현율이 낮은 단백질의 분비생산을 유도하는 유전자를 의미하는데, 이러한 단백질융합인자는 박테리아(예를 들어, 에스케리치아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 바실러스(Bacillus)종 등), 곰팡이(예를 들어, 효모, 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리엄(Penicillium), 라이조퍼스(Rhizopus), 트리코더마(Trichoderma) 종 등), 식물(예를 들어, 애기장대, 옥수수, 담배, 감자 등) 및 동물(예를 들어, 인간, 마우스,래트, 토끼, 개, 고양이 및 원숭이 등) 을 포함하는 모든 원핵 또는 진핵생물의 DNA로부터 선별될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에서 사용가능한 단백질융합인자는 한국특허 제0626753호, 제0798894호, 제0975596호에 개시되어 있는 단백질융합인자를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 STFP4, STFP13, STFP16, STFP19 또는 STFP22의 단백질융합인자를 사용할 수 있다.

본 발명에 의하면, 상기 발현벡터에 삽입되는 유전자는 상술한 베타-글루코시다제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 바람직하게는 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 베타-글루코시다제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 보다 바람직하게는 포마 속 균주로부터 발현되는 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 베타-글루코시다제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 구체적 실시예에서는, 베타-글루코시다제를 발현시키기 위하여 세포내재조합 방법을 이용하여 GAL10 프로모터 및 GAL7 터미네이터를 가지는 일반적 효모 발현 벡터인 YEp352 유래의 벡터에 단백질 분비융합인자(TFP)를 도입하여 YGa-ST19-Y4 BGL을 제작하였다(실시예 4 및 도 5).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 발현벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.

본 발명에서 형질전환 방법은 본 발명의 발현벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세 주사, 형질 도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposem-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질 감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 스페로플라스트법, 아세트산리튬법 등의 공지 방법으로 숙주세포에 도입하여 형질전환시킬 수 있다. 효모에의 재조합체 DNA의 도입방법으로서는, 예를 들면 전기침공법, 스페로플라스트법, 아세트산리튬법 등을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 형질전환에 사용되는 숙주 세포는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포는 어떤 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 베타-글루코시다제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입효율이 우수하고, 상기 도입된 폴리뉴클레오티드의 발현효율이 높은 숙주를 사용할 수 있는데, 예를 들어 박테리아, 곰팡이(예컨대, 효모), 식물 또는 동물(예컨대, 포유동물 또는 곤충) 세포를 포함할 수 있다.

바람직하게, 상기 숙주세포는 에탄올 발효능을 가지는 세포일 수 있으며, 보다 바람직하게 상기 에탄올 발효능을 가지는 세포는 자이모모나스, 효모, 바실러스 등이 될 수 있다.

상기 효모는 특별히 이에 제한되지 않으나, 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로이야(Yarrowia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 사카로마이콥시스(Saccharomycopsis), 슈완니오마이세스(Schwanniomyces), 아르술라(Arxula) 종을 포함하고, 보다 바람직하게는 캔디다 유틸리스(Candida utilis), 캔디다 보이디니(Candida boidinii), 캔디다 알비칸스(Candida albicans ), 클루이베로마이세스락티스(Kluyveromyces lactis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아스티피티스(Pichia stipitis), 스키조카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fiburigera), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로이야 리포폴리티카(Yarrowia lipolytica), 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 아르술라 아데니니모란스(Arxula adeninivorans) 등을 사용하며, 가장 바람직하게는 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces maxianus), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fiburigera)일 수 있다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 상기 베타-글루코시다제를 코딩하는 유전자를 세포내 재조합 방법을 이용하여 사카로마이세스 세레비지아에 도입하여 발현시켰다(도 6).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 형질전환체를 배양하고, 이의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 상기 베타-글루코시다제를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 베타-글루코시다제의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 형질전환체를 배양하기 위한 배지 및 배양조건은 숙주 세포에 따라 적절히 선택 이용할 수 있다. 영양배지는 숙주세포의 생육에 필요한 탄소원 무기질소원 또는 유기질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로는 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 수크로오스, 및 메탄올 등이 예시된다. 무기질소원 또는 유기질소원으로는 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘스팁 리쿼(corn steep liquer), 펩톤, 카제인, 소 추출물, 대두백, 및 감자추출물 등이 예시된다. 필요에 따라 다른 영양소, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘 같은 무기염, 비타민류, 및 항생물질(테트라사이클린, 네오마신, 암피실린, 및 카나마이신)등을 포함할 수 있다. 배양시는 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양 시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 신규한 베타-글루코시다제 단백질을 확인하기 위해 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅을 실시하였다(실시예 5). 보다 상세하게, Y2805 균주에 발현벡터 YGa-ST19-Y4 BGL이 도입되어 형성된 24개 형질전환체들의 배양상등액을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 결과, 베타-글루코시다제 단백질을 확인하였다(도 7 및 8).

또한, pNPG 분석방법을 통해 각 발현벡터를 함유한 균주의 베타-글루코시다제의 활성을 확인하였다(표 2). 이를 대장균에서 생산 및 발현시켰으며(실시예 6), 베타-글루코시다제 활성을 가지는 단백질이 세포 밖으로 분비되었고, 대장균 균주에서는 세포내에서 가용한 형태로 존재하는 것을 확인하였다(도 9).

상기 베타-글루코시다제를 회수하는 단계는 통상적인 생화학 분리 기술에 의하거나 단백질의 한 부분 또는 다른 부분에 대한 항체를 사용하는 면역친화적인 방법으로 엔도글루카나제를 분리, 정제할 수 있다. 또 다른 방법은 단백질 서열에 태그(tag)를 가하여, 항체 또는 이러한 태그에 대하여 적절하게 높은 친화성을 갖는 기타 물질을 이용하는 친화 방법에 의해 정제할 수도 있다. 통상적인 생화학 분리 기술로는 단백질 침전제의 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등이 있고, 통상적으로 이들을 조합, 사용하여 순도가 높은 단백질을 분리할 수 있다.

본 발명에서는 상기 베타-글루코시다제를 회수하기 위하여, 배양물로부터 수득한 배양균체 또는 배양상등액을 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 단백질 침전, 투석 등의 공지된 정제방법을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 수행하였고, 회수된 목적 단백질의 확인은 SDS-PAGE, 웨스턴 블럿 등의 공지된 통상의 방법을 이용하여 수행하였다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 베타-글루코시다제 기질의 존재하에 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 바이오 에탄올을 회수하는 단계를 포함하는, 바이오 에탄올의 생산방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 바이오 에탄올의 생산방법은 (ⅰ) 상기 발현벡터를 에탄올 발효능을 가지는 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체를 수득하는 단계; (ⅱ) 상기 수득한 형질전환체를 베타-글루코시다제의 기질을 포함하는 배양액에서 배양하는 단계; 및 (ⅲ) 상기 단계 (ii)에서 수득한 배양물 또는 배양 상등액으로부터 바이오 에탄올을 회수하는 단계를 포함한다.

이때, 상기 에탄올 발효능을 가지는 숙주세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 에탄올 발효능을 갖는다고 알려진 자이모모나스(Zymomonas Mobilis) 균주, 효모균주, 바실러스 균주 등을 사용함이 바람직하다.

상기 베타-글루코시다제의 기질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 베타-글루코시다제에 의해 분해될 수 있는 배당체(glucoside) 또는 올리고당(oligosaccharide)을 사용함이 바람직하며, 보다 바람직하게는 말토오스, 트레할로오스, 수크로스, 투라노스, 락토스,셀룰로오스, 셀로비오스, 말토트리오스, 라피노스 및 케스토오스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.

배양방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다.

본 발명의 신규한 베타-글루코시다제는 우수한 셀룰로오스 분해활성을 나타내므로, 목질계 바이오매스로부터의 바이오 에탄올 제조 등의 산업공정에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 기존에 클로닝된 GH 패밀리 3에 속하는 다른 균류 베타-글루코시다제 유전자서열들의 보존된 아미노산 서열을 바탕으로 8개의 디제너레이트 프라이머(degenerate primer)를 제작한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 디제너레이트 프라이머를 이용한 베타-글루코시다제 유전자의 부분 증폭한 후, 이를 전기영동한 사진이다.
도 3은 부분 증폭된 베타-글루코시다제 유전자의 염기서열을 NCBI BLAST의 검색엔진을 이용하여 염기서열상의 유사한 정보를 검색한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 Phaeosphaeria avenaria f. sp . triticae , Periconia sp. BCC 2871 유래 베타-글루코시다제 서열간의 상동성 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에서 분리한 Y4 유래 BGL 유전자 발현 벡터를 나타낸 모식도이다.
도 6은 Y4-BGL 유전자를 24종의 효모 단백질 분비융합인자(TFP) 와 GAL100 프로모터에 연결하여 사카로마이세스 세레비지에 균주에 도입을 위한 PCR 및 세포내재조합 과정을 나타낸 모식도이다.
도 7은 Y2805균주에 Y4-BGL이 도입되어 형성된 24개 형질전환체들의 배양상등액을 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 Y2805균주에 Y4-BGL이 도입되어 형성된 24개 형질전환체들의 배양상등액을 웨스턴 블롯팅 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 9는 E. coli BL21에 형질전환하여 발현된 베타-글루코시다제 단백질을 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은 대장균에서의 베타-글루코시다제 유전자 발현 벡터를 나타낸 모식도이다.
도 11은 대장균에 도입된 히스티딘 결합 베타-글루코시다제 유전자를 포함하는 발현벡터를 나타낸 모식도이다.
도 12는 형질전환된 대장균에서 발현된 히스티딘 결합 베타-글루코시다제 단백질을 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 13은 형질전환된 대장균에서 발현된 히스티딘 결합 베타-글루코시다제 단백질을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 나타낸 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 곰팡이 Y4 의 배양 및 염색체 DNA 분리

베타-글루코시다제 활성을 보이는 곰팡이 Y4 균주의 전배양을 위해 PDA(Potato Dextrose Agar, Difco) 플레이트 상에서 7일간 배양하였고, 5 mm 직경의 아가(agar) 균사체를 잘라 100㎖ PDB(Potato Dextrose Broth, Difico)에 1% 카복시메틸셀룰로오스(CMC)가 첨가된 배지에 접종하여 25℃에서 5일간 진탕 배양하였다. 배양을 마친 곰팡이 균사체를 필터페이퍼(Watman 10μm)로 걸러 액체 질소를 가해 잘게 분쇄한 다음 Al-Samarrai 와 Schmid (Lett Appl Microbiol. 30, 53-56, 2000)가 사용한 방법에 따라서 곰팡이로부터 염색체 DNA를 추출하였다.

섬유소 분해활성을 갖는 Y4 균주의 동정을 위해서 염기서열 분석방법에 근거한 분자분류 방법을 활용하였으며, ITS 영역의 염기서열을 분석한 후 각 서열을 진뱅크(GenBank)에 수록된 다양한 곰팡이 균주의 염기서열 데이타 베이스와 비교분석하였다. 실험결과 곰팡이 Y4 균주로부터 총 501 bp 길이의 ITS 영역 염기서열(서열번호 1)이 분석되었으며, 블라스트(Blast) 검색 결과, Phoma macrostoma var. incolorata strain CBS 300.36과 100% 일치하였다.

실시예 2: 디제너레이트 프라이머를 이용한 베타- 글루코시다제 유전자의 부분 증폭

기존에 클로닝된 GH 패밀리 3에 속하는 다른 균류 베타-글루코시다제 유전자서열들의 보존된 아미노산 서열을 바탕으로 8개의 디제너레이트 프라이머(degenerate primer)를 제작하였다 (도 1). 상기 디제너레이트 프라이머의 구체적인 염기서열은 하기의 표 1에 나타내었다.

디제너레이트 프라이머의 염기서열

패밀리	프라이머 명칭	염기서열	서열번호
GH3 패밀리	BG1F : EKVNLTT	5'-GARAAGGTSAAYCTSACSAC-3'	2
	BG2F : PLGVRFA	5'-CCYCTSGGHGTSCGYTTYGC-3'	3
	BG3F : HELYLW	5'-CAYGARCTSTAYCTSTGG-3'	4
	BG1R : GEGYITVD	5'-TCWACWGTRATRTADCCYTCDCC-3'	5
	BG2R : NVS/TAIL/VWA	5'-GCCCAVAWRATNGCWGSWACRTT-3'	6
	BG3R : FGFGLSY	5'-TAWGSWAGDCCRAADCCRAA-3'	7
	GH3R1 : VLLKND/E	5'-NTCRTTYTTYARYARBAC-3'	8
	GH3R2 : GR/KL/TPF/VT	5'-RGTRAMSGGVARYYTRCC-3'	9

실시예 1에서 분리한 Y4 염색체 DNA를 주형으로 15가지 프라이머 조합 (BG1F/BG1R, BG1F/BG2R, BG1F/BG3R, BG1F/GH3R1, BG1F/GH3R2, BG2F/BG1R, BG2F/BG2R, BG2F/BG3R, BG2F/GH3R1, BG2F/GH3R2, BG3F/BG1R, BG3F/BG2R, BG3F/BG3R, BG3F/GH3R1, BG3F/GH3R2)으로 PCR을 수행하였다.

PCR 조건은 95℃ 5분 반응 후 96 ℃ 20초, 50 ℃ 30초, 72 ℃ 2분 조건으로 25회 반응하고 72 ℃에서 10분간 추가 반응하였다.

아가로스 겔에 전기영동하여 PCR 산물을 분석한 결과, BG1F/BG3R 프라이머 조합에서 1.3 kb 크기의 단편과 BG2F/BG2R 프라이머 조합에서 3 kb 크기의 단편이 증폭되었다(도 2). 증폭된 베타-글루코시다제 유전자를 pGEM-T Easy 벡터에 클로닝 후, NCBI 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 두 개의 유전자 단편이 베타-글루코시다제 서열과 상동성을 나타내었고, 지금까지 보고된 유전자 중에서 동일한 서열은 발견되지 않았다(도 3). 따라서, 상기한 베타-글루코시다제 유전자는 신규할 가능성이 높은 유전자임을 확인할 수 있었다.

실시예 3: RACE PCR 이용한 베타- 글루코시다제 유전자 클로닝

확보된 베타-글루코시다제 부분 유전자를 이용하여 전체 유전자를 확보하기 위하여 Total RNA 추출 kit (RNeasy Plant Mini kit, Qiagen)를 사용하여 Totla RNA를 분리하였다. 분리된 Total RNA로부터 mRNA 정제 kit (Oligotex mRNA Mini Kit, Qiagen)를 사용하여 폴리아데닐화된 mRNA를 분리하였다.

상기 분리한 mRNA는 SMARTerTM RACE cDNA Amplification kit (Clontech)를 사용하여 RACE 법에 의해 cDNA를 증폭하였다.

확보된 베타-글루코시다제 유전자 서열을 사용하여 5', 3' -RACE에 대한 특이적 프라이머를 디자인하여 키트에 포함되어있는 Universal Primer Mix(UPM)와 MJ 156 프라이머(서열번호 10)를 이용하여 5' 말단까지 서열과 Universal Primer Mix(UPM)와 MJ 140(서열번호 11) 프라이머를 이용하여 3' 말단까지 서열을 확인하였다.

MJ156: 5'-cagcccagaggacagcggtgacgttctcagagttgt-3' (서열번호 10)

MJ140: 5'-cgagaagtggactgctgtctttggcgagga-3' (서열번호 11)

염기서열 분석 결과, 베타-글루코시다제 유전자의 클로닝 하고자 하는 부위가 증폭되었고 확인된 전체 서열을 이용하여 프라이머 MJ 202(서열번호 12), MJ 151 프라이머(서열번호 13)를 제작하고, 다시 이 프라이머를 이용하여 전체 유전자를 획득하여 pGEM-T Easy vector (Invitrogen)에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.

MJ202: 5'-atgcatcggacgctcgcgcaaacattactg-3' (서열번호 12)

MJ151: 5'-ctatagggagatcttcttggggtactcggt-3' (서열번호 13)

클로닝된 Y4 유래의 베타-글루코시다제 유전자 (Y4-BGL)는 2562 bp 뉴클레오타이드(서열번호 14)로 구성되어 있고, 854개의 아미노산(서열번호 15)의 ORF(Open reading frame)를 갖는 것으로 분석되었다. N-말단 부위에서 최초 17개 아미노산 잔기들은 온라인 프로그램인 SignalP 분석(http://www/cbs/dtu/dk/services/SignalP/)에 의해 시그널 펩타이드인 것으로 추정되었다.

본 발명에서 분리한 베타-글루코시다제 아미노산 서열을 다른 단백질들의 서열과 비교분석하기 위해 BLASTX 데이터 베이스를 검색하였다. 계통 분석 결과, 글리코실하이드롤라아제(glycosyl hydrolase, GH) 패밀리 3에 속하는 것으로 확인되었고, GH 패밀리 3에 속하는 다른 균류 베타-글루코시다제 중 Phaeosphaeria avenaria f. sp . triticae 유래의 베타-글루코시다제와 79 %, Phaeosphaeria nodorum 유래 베타-글루코시다제와 78 %, Periconia sp . BCC 2871 유래 베타-글루코시다제와 77% 아미노산 유사성을 나타내었다 (도 4).

도 5에서는 본 발명에서 분리한 Y4 유래 BGL 유전자 발현벡터를 도식화하였다.

실시예 4: 단백질융합인자 ( TFP ) 도입을 통한 베타- 글루코시다제 분비 생산

실시예 3에서 분리한 베타-글루코시다제 유전자를 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 발현하기 위하여 분비시그널을 제외한 Y4-BGL로부터 프라이머 MJ 205(서열번호 16), MJ 213 프라이머(서열번호 17)로 1차 PCR 하였다.

MJ205: 5'-tcgccttagataaaagacagacgtacccaaacttc-3' (서열번호 16)

MJ213: 5'-gtgatggtgatggtgatgtagggagatcttcttggg-3' (서열번호 17)

PCR 조건은 94℃ 5분 1회. 94℃ 30초 55℃ 1분 72℃ 2분 30초 25회, 72℃ 10분 1회 수행하였다.

1차 PCR 후 만들어진 유전자를 주형으로 24개 STFP 벡터와 forward 프라이머에 상보성을 갖는 LNK39(서열번호 18) 프라이머와 Y4-BGL의 C 말달에 6개의 히스티딘 태크와 상보성을 갖는 His GT50R(서열번호 19) 프라이머를 사용하여 1차 PCR 조건과 동일하게 증폭한 후, 단백질 분비발현을 도와주는 24종의 단백질분비융합인자(한국특허 제0975596호) 벡터에 세포내재조합을 통하여 Y2805(Mat a pep4::HIS3 prb1 can1 his3-200 ura3-52)균주에 도입하였다.

LNK39: 5'-ggccgcctcggcctctgctggcctcgccttagataaaaga-3' (서열번호 18)

HisGT50R: 5'-gtcattattaaatatatatatatatatattgtcactccgttcaagtcgacttagt gatggtgatggtgatg-3'(서열번호 19)

형질전환 균주는 SC-URA(0.67% Yeast nitrogen base with out amino acd, 2% 글루코스 및 우라실을 제외한 각종 아미노산) 배지를 이용하여 선별하였다. LNK39(서열번호 18)와 HisGT50R(서열번호 19) 프라이머로 증폭한 중합효소 연쇄반응 산물은 40베이스 이상의 벡터와 동일한 서열을 포함하고 있기 때문에 선형화된 벡터와 함께 효모세포로 도입하면 세포 내에서 교차가 일어나서 원형의 플라스미드 벡터가 만들어지게 된다 (도 6).

도 6은 Y4-BGL 유전자를 24종의 효모 단백질 분비 융합인자(TFP) 와 GAL100 프로모터에 연결하여 사카로마이세스 세레비지에 균주에 도입을 위한 PCR 및 세포내 재조합 과정을 나타낸 모식도이다.

각각 형질전환체를 YPDG 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1% 글루코스, 1% 갈락토스)에서 40시간 진탕 배양한 후 원심분리하여 균체를 제거하고 남은 배양액 0.6㎖l을 취하여 0.4㎖ 아세톤을 첨가하였다. -20℃에서 2시간 방치 후 13,000 rpm에서 15분간 원심분리 하고 아세톤과 배지를 완전히 제거한 후 건조시켜 남은 펠렛을 1X SDS-PAGE 샘플 버퍼에 현탁함으로써 배지에 존재하는 단백질을 농축하였다. SDS-PAGE 겔은 12% 글라이신 겔을 사용하였고, 80V에서 약 2시간 정도 전개하였다. 전개가 끝난 겔은 Phastgel TMBlue R(GE healthcare, Sweden)을 이용하여 제조된 염색 용액으로 한 시간 동안 염색 후 탈색 버퍼(10% acetic acid, 30% methanol)을 이용하여 탈색하였다(도 7).

도 7에서 보는 바와 같이, SDS-PAGE 상에서 베타-글루코시다제의 밴드는 확인되지 않았으며, 3개의 N-글리코실화 유발 서열을 함유하고 있어서 N-글리코실화에 의해 단백질에 당의 부가로 인하여 고분자량측에 밴드가 베타 글루코시다제 단백질일 것으로 추측되어진다.

실시예 5: 베타- 글루코시다제 단백질의 웨스턴 블로팅법에 의한 발현 확인

분비 발현된 베타-글루코시다제 단백질 확인을 위하여 웨스턴 블로팅을 실시하였다. SDS-PAGE 겔로 전개된 단백질을 니트로 셀룰로오스막으로 옮기기 위하여 일렉트로트랜스퍼 키트(Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 300mA에서 50분간 전이 하였다. 1차 항체로는 항 His 태크(Millipore)를 사용하였고, 2차 항체로는 항 마우스 IgG (Sigma)를 사용한 후, BCIP 발색시약으로 발색반응을 하여 발현된 베타-글루코시다제 밴드를 확인하였다.

그 결과, 도 8에서 당쇄부가에 의해 고분자량측에 밴드를 확인할 수 있었지만, TFP 종류에 따라 베타-글루코시다제의 분비된 정도는 상당한 차이를 보였다. 고효율 분비생산하는 TFP로는 4, 13, 16, 19, 22번이 강하게 밴드로 보였다.

분비된 단백질의 활성을 확인하기 위하여 0.1㎖의 효소 용액을 0.9㎖의 기질용액(100mM 구연산-인산완충용액(pH5.0), 1mM의 p-나이트로페닐 글루코피라노사이드(p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; pNPG)과 50℃에서 10분간 반응하였다. 반응용액과 동량의 30% 탄산 나트륨을 첨가해 반응을 멈추고, 410nm에서 흡광도를 측정한 결과, ST19-Y4-BGL 균주의 활성이 가장 높은 것을 확인하였다 (표 2).

표 2는 각 발현 벡터를 함유한 균주의 베타-글루코시다제 활성분석결과를 보여준 것이다. 이때, 효소 활성은 1분에 1μM의 p-나이트로페놀(p-Nitrophenol)을 생성할 수 있는 효소량을 1 유닛(unit)으로 정하였다.

STFP No.	β-glucosidase activity (u/ml)
ST4	20.15
ST13	22.45
ST16	19.17
ST19	23.15

실시예 6 : 베타- 글루코시다제 단백질의 대장균에서의 생산 및 발현

베타-글루코시다제 효소를 생산하기 위해서 발현 벡터로 pET21a 플라스미드(말토오즈 결합 단백질 tag)와 pET24a(히스티딘 결합 단백질 tag)를 사용하였고, E. coli BL21을 숙주로 사용하였다.

우선, PCR과 관련해서 말토오즈 결합 베타-글루코시다제 유전자는 상기 ST19-Y4 BGL의 DNA를 주형으로 하고, 정방향 프라이머 PHJ113(서열번호 20)와 역방향 프라이머 PHJ110(서열번호 21)을 사용한 PCR에 의하여 수득하였고, 히스티딘 결합 베타-글루코시다제 유전자는 상기 ST19-Y4 BGL의 DNA를 주형으로 하고, 정방향 프라이머 PHJ108(서열번호 22)와 역방향 프라이머 PHJ109(서열번호 23)를 사용한 PCR에 의하여 수득하였다(94℃ 5분; 94℃ 30초, 55℃ 1분 및 72℃ 2분 30초 조건으로 25회 반복; 72℃ 10분).

PHJ113: 5'-cccaagctttagggagatcttcttggggta-3' (서열번호 20)

PHJ110: 5'-cgaattcgatgacgatgacaagcagacgtacccaaacttc-3' (서열번호 21)

PHJ108: 5'-ccgctcgagtagggagatcttcttggggta-3' (서열번호 22)

PHJ109: 5'-ggaattccatatgcagacgtacccaaacttc-3' (서열번호 23)

상기 수득한 PCR 각각의 PCR 산물을 아가로스 겔에 전기영동하여 PCR 산물을 분석한 결과, 2.5 kb 크기의 단편이 증폭되었다. 말토오즈 결합 베타-글루코시다제는 HindⅢ 와 EcoRⅠ의 제한효소를 사용하여 절단하였고, 히스티딘 결합 베타-글루코시다제는 XhoⅠ과 NdeⅠ의 제한효소를 사용하여 절단한 뒤 정제되었다. 증폭된 DNA는 재조합 벡터로 사용된 pET21a와 pET24a 플라스미드의 T7 프로모터의 다운스트림으로 삽입되었다.

형질전환 E. coli BL21는 암피실린(100㎍/mL)이 포함된 LB배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 0.5% NaCl)에서 흡광도(0.D₆₀₀)가 0.6으로 될 때까지 배양한 후, 아이피티지(IPTG, 0.1 mM)를 첨가하여 18℃에서 20 시간 동안 배양하였다. 배양된 균체를 원심분리(6,000×g, 10분)를 통해 회수하였고, Tris-HCl 버퍼(50 mM, pH 7.5)에 현탁한 뒤, 현탁 된 세포를 얼음 내에서 초음파 분쇄법으로 파쇄하여 원심분리(10,000× g, 10분)를 통해 세포추출액을 얻었다.

SDS-전기영동은 12% glycine gel을 사용하였고, 80V에서 약 2시간 정도 전개하였다. 전개가 끝난 겔은 Phastgel TMBlue R(GE healthcare, Sweden)을 이용하여 제조된 염색 용액으로 한 시간 동안 염색 후 탈색 버퍼(10% acetic acid, 30% methanol)를 이용하여 탈색하였다(도 9).

도 9에서 전기영동 분석 결과, 베타-글루코시다제(92 kDa)와 말토오즈 결합 단백질(40 kDa)이 합쳐진 대략 132kDa에 해당하는 단백질이 분리되었으며, 주로 용융성 부분(상등액)형태로 존재한다는 것을 확인하였다. M은 마커이고, U는 uninduced 단백질, S는 soluble 단백질, I는 inclusion body 단백질을 나타낸다.

한편, 히스티딘 결합 베타-글루코시다제를 발현시키도록 구성된 재조합 벡터 pET24a-Y4-BGL를 구성하고, 이를 대장균에 도입하여 형질전환체를 제조하였다(도 11). 도 11은 대장균에 도입된 히스티딘 결합 베타-글루코시다제 유전자를 포함하는 발현벡터를 나타낸 모식도이다.

그런 다음, 상기 형질전환체를 배양하여 약 92kDa의 크기를 가지는 단백질을 분리하여, 그의 특성을 분석하였다(도 12 및 도 13). 도 12는 형질전환된 대장균에서 발현된 히스티딘 결합 베타-글루코시다제 단백질을 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이고, 도 13은 형질전환된 대장균에서 발현된 히스티딘 결합 베타-글루코시다제 단백질을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 나타낸 사진으로서, 상기 도 12 및 13에서 M은 마커이고, U는 uninduced 단백질, S는 soluble 단백질, I는 inclusion body 단백질을 나타낸다. 상기 도 12 및 도 13에서 보듯이, 발현된 히스티딘 결합 베타-글루코시다제 단백질은 대부분 불용성 형태로 존재함을 알 수 있었다.

실시예 7: 대장균에서 발현된 베타- 글루코시다제 단백질의 활성 분석

대장균에서 발현된 베타-글루코시다제 단백질의 활성을 확인하기 위하여 0.1㎖의 효소 용액을 0.9㎖의 기질용액(100mM 구연산-인산완충용액(pH5.0), 1mM의 p-나이트로페닐 글루코피라노사이드(p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; pNPG)과 50℃에서 10분간 반응하였다.

표 3은 대장균에서 발현된 베타-글루코시다제 단백질의 활성분석 결과를 나타낸 것으로, 반응용액과 동량의 30% 탄산 나트륨을 첨가해 반응을 멈추고 410nm에서 흡광도를 측정한 것이다.

그 결과, 10.2, 12.3 unit/ml의 효소활성을 확인하였다 (표 3). 이때, 효소 활성은 1분에 1μM의 p-나이트로페놀(p-Nitrophenol)을 생성할 수 있는 효소량을 1 유닛(unit)으로 정하였다.

	β-glucosidase activity (unit/ml)
2805/Y4-BGL	10.2
2805/Y4-BGL	12.3

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KOREA INSTITUTE OF INDUSTRIAL TECHNOLOGY <120> Novel beta-glucosidase and the Uses thereof <130> PA110445/KR <160> 23 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 501 <212> DNA <213> Y4 ITS <400> 1 aaggatcatt acctagagtt gtaggctttg cctgctatct cttacccatg tcttttgagt 60 accttcgttt cctcggcggg tccgcccgcc gattggacaa tttaaaccat ttgcagttgc 120 aatcagcgtc tgaaaaaact taatagttac aactttcaac aacggatctc ttggttctgg 180 catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtagtgtga attgcagaat tcagtgaatc 240 atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcccct tggtattcca tggggcatgc ctgttcgagc 300 gtcatttgta ccttcaagct ctgcttggtg ttgggtgttt gtctcgcctc tgcgcgtaga 360 ctcgcctcga aacaattggc agccggcgta ttgatttcgg agcgcagtac atctcgcgct 420 ctgcactcat aacgacgacg tccaaaagta catttttaca ctcttgacct cggatcaggt 480 agggataccc gctgaactta a 501 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 garaaggtsa ayctsacsac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccyctsgghg tscgyttygc 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 caygarctst ayctstgg 18 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tcwacwgtra trtadccytc dcc 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcccavawra tngcwgswac rtt 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tawgswagdc craadccraa 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ntcrttytty aryarbac 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 rgtramsggv aryytrcc 18 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cagcccagag gacagcggtg acgttctcag agttgt 36 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cgagaagtgg actgctgtct ttggcgagga 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 atgcatcgga cgctcgcgca aacattactg 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ctatagggag atcttcttgg ggtactcggt 30 <210> 14 <211> 2562 <212> DNA <213> beta-glucosidase <400> 14 atgcatcgga cgctcgcgca aacattactg gccattggct tggtccaggc ccagacgtac 60 ccaaacttca cgaaccctac caatagctcg agtcctctgg aaaacgcgga aagcccgccg 120 ttctacccca gtccatggat gcaaccagtg actggtgact gggccgcagc ttatgctaag 180 gcccaagcct ttgttagcca attgactctt ctcgagaagg tcaacctcac aactggcact 240 ggctgggaga gtgacaattg cgtcggcaac gtaggcgaga tccctcgtct tggcttcaag 300 gctctgtgta tgcaggacag ccctctcggt gttcgctttg ccgactacgt ctctgccttc 360 cctgctggcg gcagtgttgc tgcatcatgg gaccgtggcg agttctaccg tcgaggatac 420 cagatgggct cagagcaccg aggcaaaggt gttgatgtcc agcttggtcc tgtcgttggt 480 ccacttggcc gcaaccctaa gggtggccgc aactgggagg ggttctcgcc tgacccatac 540 ctctcaggtc atgctgttgc tgagaccgtt aagggtattc aggacgccgg ggtcatcgct 600 tgcaccaagc actacatcct gaacgagcag gagcacttcc gccagcctgg agactttgag 660 aattttggct tcgtcgatgc aatcagctcg aaccttgctg acaagactct gcatgagttg 720 tacctctggc ccttcgccga cgctgtacgc gctggcacag gctccatcat gtgctcttat 780 aacaaggcaa acaactccca gctctgccag aactcatacc tccagaacta cattctcaag 840 ggcgagcttg gcttccaggg ttttatcatg tctgattggg atgctcagca cagcggtgtc 900 tcctccaccc aggctggtct tgacatgact atgcccggag acacatcctt caactctggc 960 ttctccttct ggggaaccaa ccttaccatc tctattctca acggtactgt tcctcagtgg 1020 cgtcttgacg acgctgcaac acgtatcatg gcagcctact acctcgtcgg tcgcgacaag 1080 gaccccatcg agaccaactt caacagctgg actcgcgata catacggcta ccgcaacttc 1140 tatggcaaga acgactacga gcttgtcaac cagcacatcg acgtacgtga tgatcacttc 1200 cgtgccatcc gttcctcggc cgccaagtcc acagtcttgt tgaagaacaa cggcgttctt 1260 cctcttaagg gtaacgagaa gtggactgct gtctttggcg aggatgctgg cgagaacata 1320 tacggcccca acggctgctc tgaccgcggc tgtgataacg gcactctcgc catgggctgg 1380 ggctccggaa ctgctgattt cccctacctc atcactcctc ttgaggctat taagcgccag 1440 gtcactgaca acgatggtgt tctcacatct gtcaccgaca attacgcgta cgcccagatc 1500 cagacgaacg ctgctcaagc tagcgttgcc attgtttttg tcaacgcaga ctctggtgag 1560 ggctacatca ccgtcgacgg caacgccggt gaccgcaaca acctcactat ctggcacgac 1620 ggcgagacac tggttcaaaa cgtctcttcg ctttgtaaca acaccatcgt tgtcatccat 1680 tctgttggcc ccgtccttgt caactctttc gacaactctg agaacgtcac cgctgtcctc 1740 tgggctggtc tgcccggcca agagtctggt aacgccattg ccgacgtact ctacggccgc 1800 gtcaaccccg gcggcaagct gcccttcacc ttcggcgccg acgccgctga gtacggaccc 1860 aatctgatct acgagcccgt caatggccac aactcgcccc aagacaactt tgaagagggt 1920 gtcttcattg attaccgcgc cttcgacaag aagaacatca cacccgtcta cgagttcggc 1980 ttcggactgt catacaccac attctcgtac tcgaacctga acgtcgagaa gaagaacgcg 2040 ggcaagtaca ctcccaccac gggccagacc attgccgcgc ctaccttggg caactacagc 2100 cgtgacctca acgagtacca gtggcccgcc aacctgacgc gctacggcac cttcatctac 2160 ccgtacctga acagcaccaa cctggccgag gcgtccttcg acccagagta cggtctgaac 2220 tacacctggc ccgccggctc gtccgacggc tcgcctcagc cacgcatcgc cgctggtggt 2280 gcgccgggag gaaaccccca gctgtgggac gttttgttca ctgtgaccgc gagcatcacc 2340 aacaacggca cactccccgg tgacgaggtc cctcagctgt acctttccct tggtggacct 2400 gatgatccag ctgttatcct ccgtggcttt gacaggttga gcatccagcc taaccagacc 2460 gtcactttct cgactgatat cctgcgtcgt gatgtaagca attgggagac tgagacccag 2520 aactgggtca tcaccgagta ccccaagaag atctccctat ag 2562 <210> 15 <211> 853 <212> PRT <213> beta-glucosidase <400> 15 Met His Arg Thr Leu Ala Gln Thr Leu Leu Ala Ile Gly Leu Val Gln 1 5 10 15 Ala Gln Thr Tyr Pro Asn Phe Thr Asn Pro Thr Asn Ser Ser Ser Pro 20 25 30 Leu Glu Asn Ala Glu Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser Pro Trp Met Gln 35 40 45 Pro Val Thr Gly Asp Trp Ala Ala Ala Tyr Ala Lys Ala Gln Ala Phe 50 55 60 Val Ser Gln Leu Thr Leu Leu Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr Gly Thr 65 70 75 80 Gly Trp Glu Ser Asp Asn Cys Val Gly Asn Val Gly Glu Ile Pro Arg 85 90 95 Leu Gly Phe Lys Ala Leu Cys Met Gln Asp Ser Pro Leu Gly Val Arg 100 105 110 Phe Ala Asp Tyr Val Ser Ala Phe Pro Ala Gly Gly Ser Val Ala Ala 115 120 125 Ser Trp Asp Arg Gly Glu Phe Tyr Arg Arg Gly Tyr Gln Met Gly Ser 130 135 140 Glu His Arg Gly Lys Gly Val Asp Val Gln Leu Gly Pro Val Val Gly 145 150 155 160 Pro Leu Gly Arg Asn Pro Lys Gly Gly Arg Asn Trp Glu Gly Phe Ser 165 170 175 Pro Asp Pro Tyr Leu Ser Gly His Ala Val Ala Glu Thr Val Lys Gly 180 185 190 Ile Gln Asp Ala Gly Val Ile Ala Cys Thr Lys His Tyr Ile Leu Asn 195 200 205 Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Pro Gly Asp Phe Glu Asn Phe Gly Phe 210 215 220 Val Asp Ala Ile Ser Ser Asn Leu Ala Asp Lys Thr Leu His Glu Leu 225 230 235 240 Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala Gly Thr Gly Ser Ile 245 250 255 Met Cys Ser Tyr Asn Lys Ala Asn Asn Ser Gln Leu Cys Gln Asn Ser 260 265 270 Tyr Leu Gln Asn Tyr Ile Leu Lys Gly Glu Leu Gly Phe Gln Gly Phe 275 280 285 Ile Met Ser Asp Trp Asp Ala Gln His Ser Gly Val Ser Ser Thr Gln 290 295 300 Ala Gly Leu Asp Met Thr Met Pro Gly Asp Thr Ser Phe Asn Ser Gly 305 310 315 320 Phe Ser Phe Trp Gly Thr Asn Leu Thr Ile Ser Ile Leu Asn Gly Thr 325 330 335 Val Pro Gln Trp Arg Leu Asp Asp Ala Ala Thr Arg Ile Met Ala Ala 340 345 350 Tyr Tyr Leu Val Gly Arg Asp Lys Asp Pro Ile Glu Thr Asn Phe Asn 355 360 365 Ser Trp Thr Arg Asp Thr Tyr Gly Tyr Arg Asn Phe Tyr Gly Lys Asn 370 375 380 Asp Tyr Glu Leu Val Asn Gln His Ile Asp Val Arg Asp Asp His Phe 385 390 395 400 Arg Ala Ile Arg Ser Ser Ala Ala Lys Ser Thr Val Leu Leu Lys Asn 405 410 415 Asn Gly Val Leu Pro Leu Lys Gly Asn Glu Lys Trp Thr Ala Val Phe 420 425 430 Gly Glu Asp Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Gly Pro Asn Gly Cys Ser Asp 435 440 445 Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met Gly Trp Gly Ser Gly Thr 450 455 460 Ala Asp Phe Pro Tyr Leu Ile Thr Pro Leu Glu Ala Ile Lys Arg Gln 465 470 475 480 Val Thr Asp Asn Asp Gly Val Leu Thr Ser Val Thr Asp Asn Tyr Ala 485 490 495 Tyr Ala Gln Ile Gln Thr Asn Ala Ala Gln Ala Ser Val Ala Ile Val 500 505 510 Phe Val Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Thr Val Asp Gly Asn 515 520 525 Ala Gly Asp Arg Asn Asn Leu Thr Ile Trp His Asp Gly Glu Thr Leu 530 535 540 Val Gln Asn Val Ser Ser Leu Cys Asn Asn Thr Ile Val Val Ile His 545 550 555 560 Ser Val Gly Pro Val Leu Val Asn Ser Phe Asp Asn Ser Glu Asn Val 565 570 575 Thr Ala Val Leu Trp Ala Gly Leu Pro Gly Gln Glu Ser Gly Asn Ala 580 585 590 Ile Ala Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn Pro Gly Gly Lys Leu Pro 595 600 605 Phe Thr Phe Gly Ala Asp Ala Ala Glu Tyr Gly Pro Asn Leu Ile Tyr 610 615 620 Glu Pro Val Asn Gly His Asn Ser Pro Gln Asp Asn Phe Glu Glu Gly 625 630 635 640 Val Phe Ile Asp Tyr Arg Ala Phe Asp Lys Lys Asn Ile Thr Pro Val 645 650 655 Tyr Glu Phe Gly Phe Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Ser Tyr Ser Asn 660 665 670 Leu Asn Val Glu Lys Lys Asn Ala Gly Lys Tyr Thr Pro Thr Thr Gly 675 680 685 Gln Thr Ile Ala Ala Pro Thr Leu Gly Asn Tyr Ser Arg Asp Leu Asn 690 695 700 Glu Tyr Gln Trp Pro Ala Asn Leu Thr Arg Tyr Gly Thr Phe Ile Tyr 705 710 715 720 Pro Tyr Leu Asn Ser Thr Asn Leu Ala Glu Ala Ser Phe Asp Pro Glu 725 730 735 Tyr Gly Leu Asn Tyr Thr Trp Pro Ala Gly Ser Ser Asp Gly Ser Pro 740 745 750 Gln Pro Arg Ile Ala Ala Gly Gly Ala Pro Gly Gly Asn Pro Gln Leu 755 760 765 Trp Asp Val Leu Phe Thr Val Thr Ala Ser Ile Thr Asn Asn Gly Thr 770 775 780 Leu Pro Gly Asp Glu Val Pro Gln Leu Tyr Leu Ser Leu Gly Gly Pro 785 790 795 800 Asp Asp Pro Ala Val Ile Leu Arg Gly Phe Asp Arg Leu Ser Ile Gln 805 810 815 Pro Asn Gln Thr Val Thr Phe Ser Thr Asp Ile Leu Arg Arg Asp Val 820 825 830 Ser Asn Trp Glu Thr Glu Thr Gln Asn Trp Val Ile Thr Glu Tyr Pro 835 840 845 Lys Lys Ile Ser Leu 850 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tcgccttaga taaaagacag acgtacccaa acttc 35 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gtgatggtga tggtgatgta gggagatctt cttggg 36 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ggccgcctcg gcctctgctg gcctcgcctt agataaaaga 40 <210> 19 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gtcattatta aatatatata tatatatatt gtcactccgt tcaagtcgac ttagtgatgg 60 tgatggtgat g 71 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cccaagcttt agggagatct tcttggggta 30 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 cgaattcgat gacgatgaca agcagacgta cccaaacttc 40 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ccgctcgagt agggagatct tcttggggta 30 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ggaattccat atgcagacgt acccaaactt c 31

Claims

서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 베타-글루코시다제.
제1항에 있어서,
상기 베타-글루코시다제는 포마(Phoma) 속 균주로부터 발현되는 것인 베타-글루코시다제.
제1항 또는 제2항의 베타-글루코시다제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제3항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 것인 폴리뉴클레오티드.
제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제5항에 있어서,
단백질융합인자(translational fusion partner: TFP)를 추가로 포함하는 것인 발현벡터.
제5항의 발현벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 형질전환체.
제7항에 있어서,
상기 숙주세포는 에탄올 발효능을 가지는 것인 형질전환체.
제7항의 형질전환체를 배양하고, 이의 배양물 또는 배양상등액으로부터 베타-글루코시다제를 회수하는 단계를 포함하는, 베타-글루코시다제의 생산방법.
(ⅰ) 제5항의 발현벡터를 에탄올 발효능을 가지는 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체를 수득하는 단계;
(ⅱ) 상기 수득한 형질전환체를 베타-글루코시다제의 기질을 포함하는 배양액에서 배양하는 단계; 및
(ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)에서 수득한 배양물 또는 배양상등액으로부터 바이오 에탄올을 회수하는 단계를 포함하는, 바이오 에탄올의 생산방법.
제10항에 있어서,
상기 에탄올 발효능을 가지는 숙주세포는 자이모모나스(Zymomonas Mobilis)균주, 효모 균주 또는 바실러스 균주인 바이오 에탄올의 생산방법.
제10항에 있어서,
상기 기질은 배당체(glucoside) 또는 올리고당(oligosaccharide)인 바이오 에탄올의 생산방법.
제10항에 있어서,
상기 기질은 말토오스, 트레할로오스, 수크로스, 투라노스, 락토스, 셀룰로오스, 셀로바이오스, 말토트리오스, 라피노스 및 케스토오스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 바이오 에탄올의 생산방법.