JP6354462B2 - Ｇｈファミリー１０に属する耐熱性キシラナーゼ - Google Patents

Description

本発明は、耐熱性キシラナーゼ、当該耐熱性キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性キシラナーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該耐熱性キシラナーゼを用いたリグノセルロース分解物の製造方法に関する。

輸送用エネルギー供給に関わる懸念に加え、地球温暖化や大気汚染などの環境上の問題から、近年、石油代替エネルギー開発は非常に重要な課題である。植物バイオマスは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源であり、石油代替資源として期待されている。植物バイオマスの主要構成要素（リグノセルロース）は、セルロースやヘミセルロース（キシラン、アラビナン及びマンナンを含む）等の多糖類、リグニン、その他ペクチン等である。これら多糖類は多様なグリコシド加水分解酵素によってグルコースやキシロース等の単糖に加水分解され、バイオ燃料や化成品原料として利用される。

複雑な構造を持つリグノセルロースは難分解性であり、単一の酵素では分解、糖化が難しい。このため、多糖類のうちセルロースの加水分解には、一般的に、グリコシド加水分解酵素のエンドグルカナーゼ（エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ ３．２．１．９１）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１）の３種の酵素が必要とされる。一方、ヘミセルロースはキシラン、アラビナン及びマンナン等を含み、その構成は植物の種類によって異なる。例えば、広葉樹や草本等はキシランが主要な構成成分となっている。キシランの加水分解には、キシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ ３．２．１．８）、β−キシロシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３７）が必要とされる。

従来のリグノセルロースを資源とするバイオエタノール製造では、エタノールの高エネルギー効率変換を目的として、高固体負荷（３０〜６０％ ｓｏｌｉｄ ｌｏａｄｉｎｇ）による糖化処理が試みられている。このような高固体負荷によるリグノセルロースの酵素糖化は、バイオマス糖化液の粘性が高く、リグノセルロースの加水分解反応が進み難い。そこで、耐熱性酵素を用いて、例えば８０℃以上の高温で酵素糖化処理を行うことにより、加水分解反応速度が上昇することに加えて、バイオマス糖化液の粘性が低下することから、糖化反応時間の短縮及び酵素量の削減が達成できると期待される。このため、各種グリコシド加水分解酵素について、より耐熱性に優れた酵素の開発が望まれている。

多くの耐熱性グリコシド加水分解酵素は、高温環境に生息する好熱性微生物を分離、同定し、これら培養分離された微生物から遺伝子をクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した後、大腸菌や糸状菌などにより発現させることにより得られてきた。特にヘミセルロースであるキシランの加水分解に必要なキシラナーゼについては、リグノセルロースの分解やパルプ処理などを目的として、これまでに好熱性細菌、糸状菌、アーキア等から多く分離されている。例えば、特許文献１には、アシドサーマス・セルロリィティカス（Acidothermus cellulolyticus）由来のキシラナーゼであって、６０〜８０℃で酵素活性を示すものが、特許文献２には、ニュージーランドの温泉から単離された嫌気性耐熱性菌由来のキシラナーゼであって、６０〜８０℃で酵素活性を示すものが、特許文献３には、土壌から単離されたバチルス属菌由来のキシラナーゼであって、至適温度が８０℃のものが、それぞれ開示されている。非特許文献４には、アクレモニウム・セルロリィティカス（Acremonium cellulolyticus）由来のキシラナーゼであって、至適温度が６０〜８０℃付近のものが報告されている。また、より耐熱性を向上させる試みもなされており、例えば、特許文献４〜７には、天然の酵素のアミノ酸を置換することにより耐熱性等を向上させたキシラナーゼが、特許文献８には、酵素活性ドメインと糖質結合モジュールとの間をリンカーで連結されている天然型のキシラナーゼから、糖質結合モジュール、又は糖質結合モジュールとリンカーを欠損させることによりホストでの酵素産生量を増大させられることが、それぞれ記載されている。これらの酵素のほとんどは至適温度が６０〜８０℃であり、さらなる高耐熱性化が望まれている。

一方で、超高耐熱性キシラナーゼとして、特許文献９、１０、非特許文献１〜３には、特定の細菌や糸状菌から単離されたキシラナーゼであって、至適温度が８５℃を超えるものが報告されている。特許文献９によれば、ロドサーマス・マリナス（Rhodothermus marinus）に由来する至適温度９０℃のキシラナーゼが報告されているが、比活性は、９０℃で約２６ｎｋａｔ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（＝約１．６Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、かなり低い。

米国特許第５９０２５８１号明細書 米国特許第６０８３７３３号明細書 特開２００４−１２１２５７号公報 米国特許第５７５９８４０号明細書 米国特許第５８６６４０８号明細書 米国特許第７０６０４８２号明細書 米国特許出願公開第２０１０／００６２５１１号明細書 米国特許出願公開第２００６／００１４２４７号明細書 米国特許第５３９５７６５号明細書 米国特許第５６８８６６８号明細書

Zhengqiang et al，Journal of Bioscience and Bioengineering，2001，vol.92，p.423-428. Winterhalter and Liebl，Applied and Environmental Microbiology，1995，vol.61, p.1810-1815. Yoon et al，Agricultural Chemistry and Biotechnology，2004，vol.47，p.157-160. Kishishita et al，Protein Expression and Purification，2014，vol.94，p.40-45.

本発明は、少なくとも８５℃、ｐＨ６．０の条件下でキシラナーゼ活性を示す新規な耐熱性キシラナーゼ、当該耐熱性キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性キシラナーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体、及び当該耐熱性キシラナーゼを用いたリグノセルロース分解物の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、温泉高温土壌から直接ＤＮＡを抽出し、難培養性微生物叢の大規模メタゲノムシーケンスを行うことにより、新規アミノ酸配列を持つ耐熱性キシラナーゼの取得に成功し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明に係る耐熱性キシラナーゼ、グリコシド加水分解酵素混合物及びリグノセルロース分解物の製造方法は、下記［１］〜［１０］である。
［１］ （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ６．０の条件下でキシラナーゼ活性を有し、ｐＨ６．０における前記キシラナーゼ活性の至適温度が７５〜９５℃の温度範囲内にあるポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ６．０の条件下でキシラナーゼ活性を有し、ｐＨ６．０における前記キシラナーゼ活性の至適温度が７５〜９５℃の温度範囲内にあるポリペプチド、
からなるキシラナーゼ触媒領域を有することを特徴とする、耐熱性キシラナーゼ。
［２］ ｐＨ６．０、６０〜９０℃においてキシラナーゼ活性を示す、前記［１］の耐熱
性キシラナーゼ。
［３］ ｐＨ６．０、８０〜９０℃の温度範囲内において、少なくとも３００Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎのキシラナーゼ活性を示す、前記［１］の耐熱性キシラナーゼ。
［４］ ８５℃、ｐＨ５．０〜８．０の範囲内において、少なくとも５０Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎのキシラナーゼ活性を示す、前記［１］の耐熱性キシラナーゼ。
［５］ ｐＨ６．０、４０〜９５℃の温度範囲内において、少なくとも３０Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎのキシラナーゼ活性を示す、前記［１］の耐熱性キシラナーゼ。
［６］ 前記［１］〜［５］のいずれかの耐熱性キシラナーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
［７］ セルロースを含む材料を、前記［１］〜［５］のいずれかの耐熱性キシラナーゼ、又は前記［６］のグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、リグノセルロース分解物を生産することを含む、リグノセルロース分解物の製造方法。
［８］ 前記セルロースを含む材料を、前記耐熱性キシラナーゼ又は前記グリコシド加水分解酵素混合物に、６０〜９０℃、ｐＨ５．０〜７．０の条件下で接触させる、前記［７］のリグノセルロース分解物の製造方法。
［９］ 前記セルロースを含む材料を、前記耐熱性キシラナーゼ又は前記グリコシド加水分解酵素混合物に、８０〜９０℃、ｐＨ５．０〜７．０の条件下で接触させる、前記［７］のリグノセルロース分解物の製造方法。
［１０］ 前記セルロースを含む材料が、セルロース系バイオマスである、前記［７］〜［９］のいずれかのリグノセルロース分解物の製造方法。

本発明に係る耐熱性キシラナーゼは、少なくとも８５℃、ｐＨ６．０の条件下でキシラナーゼ活性を有する。このため、当該耐熱性キシラナーゼは、高温条件下におけるセルロースの糖化処理に好適である。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る耐熱性キシラナーゼの製造に好適に用いられる。

遺伝子クローンＡＲ１９Ｍ−１７７−２１がコードするポリペプチド（ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１）のアミノ酸配列（配列番号１）と細菌サーモトーガ門サーモトーガ・スピーシーズＲＱ２のエンド−１，４−β−キシラナーゼ（配列番号６）のアミノ酸配列アライメント図である。 実施例１において、ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＡＲ１９Ｍ−１７７−２１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｍ−１７７−２１タンパク質の各基質に対するキシラナーゼ活性の測定結果を示した図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｍ−１７７−２１タンパク質の各温度におけるキシラナーゼ活性（ｐＨ６．０）を計測した結果を示した図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｍ−１７７−２１タンパク質の各ｐＨにおけるキシラナーゼ活性（８５℃）を計測した結果を示した図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｍ−１７７−２１タンパク質が示す、熱変性に伴って引き起こされるＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅの蛍光強度変化を示した図である。

［耐熱性キシラナーゼ］
糸状菌、細菌、アーキアを含む多くの微生物は難培養性であり、土壌など微生物環境に生息する菌の９９％が未知の菌であるといわれている。特に、高温環境に生息する微生物の培養は極めて困難であり、現在の微生物培養技術では土壌中に生息する微生物の０．１％以下を単離・培養しているにすぎないと考えられている。この高温土壌微生物の難培養性が、耐熱性酵素の開発が進まない一因である。

近年、ギガ塩基対の大量配列解読を可能にした次世代ギガシーケンサーが開発されたことにより、土壌等に含まれる微生物叢のゲノムを丸ごと解読することが可能となった。この解析技術を利用して、土壌などの環境サンプルから微生物集団のゲノムＤＮＡを調製し、ゲノム構成が不均一、雑多な集団について直接ゲノムを網羅的に解読し、並列コンピュータにより解読データをアセンブルすることで微生物叢ゲノム配列を再構成するメタゲノム解析法が提案され、難培養性微生物のゲノム解読が急速に進展した。

本発明者らは、後記実施例１に示すように、採取した高温温泉土壌から微生物集団のゲノムＤＮＡ（メタゲノムＤＮＡ）を調製し、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンス及びアノテーションを行い、既知のキシラナーゼ酵素と類似したアミノ酸配列を持つオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を得た。これらのＯＲＦのうち、キシラナーゼ触媒領域が確認できたＯＲＦ３３個について、ＯＲＦの塩基配列情報に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、高温温泉土壌メタゲノムＤＮＡから遺伝子候補をクローニングした。ＰＣＲクローニングされたＤＮＡを大腸菌に組込み、当該塩基配列がコードするタンパク質を発現させ、キシラン分解活性アッセイによる機能スクリーニングを行った。最終的に、これらのＯＲＦの中からキシラナーゼ活性を持つ耐熱性キシラナーゼ（以下、「ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１」）を得た。ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１のアミノ酸配列を配列番号１に、塩基配列を配列番号２に、それぞれ表す。

後記実施例１＜９＞に示すように、ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１は、キシランに対し高い加水分解活性を示す一方、リン酸膨潤アビセル（ＰＳＡ）、結晶性セルロースであるアビセル、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、β−１，３結合とβ−１，４結合グルカンから成るリケナン（Ｌｉｃｈｅｎａｎ）、β−１，３結合とβ−１，６結合グルカンから成るラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉｎ）、ＰＮＰＸ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド）、及びＰＮＰＧ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド）に対し、ほとんど分解活性を示さない。

なお、本発明及び本願明細書において、キシラナーゼ活性とは、キシランを基質とし、キシランを加水分解する活性（キシラン加水分解活性）を意味する。

ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１のアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して検索したところ、最も配列同一性が高かったアミノ酸配列は、細菌サーモトーガ門サーモトーガ・スピーシーズＲＱ２（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ． ＲＱ２）のＧＨ１０ファミリーに属するエンド−１，４−β−キシラナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣＢ０９２２９．１）（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＥＹ９２９７２．１）（配列番号６）であり、その配列同一性（相同性）は、全長で６９％、キシラナーゼ触媒領域で７５％であった。基質特異性及び既知のタンパク質とのアミノ酸配列の配列同一性から、ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１は、ＧＨ１０ファミリーに属する新規なキシラナーゼであることが明らかとなった。

ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１は、少なくとも８５℃、ｐＨ６．０の条件下でキシラナーゼ活性を有する。実際に、後記実施例１＜１０＞に示すように、ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１は、４０〜９５℃の温度範囲内でキシラナーゼ活性を示し、８０〜９０℃の温度範囲内において強いキシラナーゼ活性を示す。より詳細には、ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１のキシラナーゼ活性は、ｐＨ６．０の条件下では、４０〜８５℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなるが、９５℃以上では急激に低下した。

一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。つまり、ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１に対しても、キシラナーゼ活性をはじめとするグリコシド加水分解活性を失わせることなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。

すなわち、本発明に係る耐熱性キシラナーゼは、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかからなるキシラナーゼ触媒領域を有する、耐熱性グリコシド加水分解酵素である。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（すなわち、ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１）、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ６．０の条件下でキシラナーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ６．０の条件下でキシラナーゼ活性を有するポリペプチド。

本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が欠失する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸の一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が置換する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸が別のアミノ酸に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が付加される」とは、ポリペプチド中に新たなアミノ酸が挿入されることを意味する。

前記（Ｂ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。

前記（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８０％以上１００％未満であることが好ましく、８５％以上１００％未満であることがより好ましく、９０％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９５％以上１００％未満であることがよりさらに好ましく、９８％以上１００％未満であることが特に好ましい。

なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。

前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１等のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。

前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、後記の本発明に係るポリヌクレオチドを用いて、タンパク質発現系によって生産してもよい。また、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。

前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、少なくとも８５℃、ｐＨ６．０の条件下でキシラナーゼ活性を有する。このため、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドをキシラナーゼ触媒領域として有することにより耐熱性キシラナーゼが得られる。

本発明に係る耐熱性キシラナーゼは、キシランを基質とする。当該耐熱性キシラナーゼは、キシラン以外のその他のβグルカン等を基質としてもよい。本発明に係る耐熱性キシラナーゼが基質とし得るものとしては、例えば、ＰＮＰＸ、ＰＮＰＧ、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｌ−アラビノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−マンノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；リケナン（Ｌｉｃｈｅｎａｎ）等のβ−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカン；アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）、結晶性バクテリアセルロース(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＢＭＣＣ)、濾紙などの結晶性セルロース、非結晶性セルロースのリン酸膨潤アビセル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ ｓｗｏｌｌｅｎ Ａｖｉｃｅｌ、ＰＳＡ）、ＣＭＣ、セロビオース等のβ−１，４結合からなるグルカン；ラミナリン等のβ−１，３結合とβ−１，６結合からなるグルカン；β−１，３結合からなるグルカン；ゲンチオビオース等のβ−１，６結合からなるグルカン等が挙げられる。

本発明に係る耐熱性キシラナーゼは、少なくともｐＨ６．０の条件下で、キシラナーゼ活性を、８０〜９０℃の温度範囲内で示すことが好ましく、７０〜９０℃の温度範囲内で示すことがより好ましく、６０〜９０℃の温度範囲内で示すことがさらに好ましく、５０〜９５℃の温度範囲内で示すことがよりさらに好ましく、４０〜９５℃の温度範囲内で示すことがより特に好ましい。本発明に係る耐熱性キシラナーゼの至適温度は、７５〜９５℃の範囲内にあることが好ましく、８０〜９０℃の範囲内にあることがより好ましい。

本発明に係る耐熱性キシラナーゼの至適ｐＨは、反応温度に依存して変化するものの、ｐＨ５．０〜７．０の範囲内にある。本発明に係る耐熱性キシラナーゼとしては、少なくともｐＨ５．０〜８．０の範囲内においてキシラナーゼ活性を示すものが好ましい。

本発明に係る耐熱性キシラナーゼは、キシラナーゼ活性以外のグリコシド加水分解活性を有していてもよい。その他のグリコシド加水分解活性としては、エンドグルカナーゼ活性、β−キシロシダーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性、又はセロビオハイドロラーゼ活性等が挙げられる。

本発明に係る耐熱性キシラナーゼは、前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかからなるキシラナーゼ触媒領域のみからなる酵素であってもよく、その他の領域を含んでいてもよい。その他の領域としては、公知のキシラナーゼが有する、キシラナーゼ触媒領域以外の領域が挙げられる。例えば、本発明に係る耐熱性キシラナーゼには、公知のキシラナーゼに対し、キシラナーゼ触媒領域を前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドに置換することによって得られる酵素も含まれる。

本発明に係る耐熱性キシラナーゼは、その他にも、そのＮ末端又はＣ末端に、細胞内の特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドや、細胞外へ分泌するシグナルペプチドを有していてもよい。このようなシグナルペプチドとして、例えば、アポプラスト移行シグナルペプチド、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、又は分泌型シグナルペプチド等がある。小胞体保留シグナルペプチドとして、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等がある。本発明に係る耐熱性キシラナーゼが、そのＮ末端又はＣ末端にシグナルペプチドを有している場合には、形質転換体中で発現させた耐熱性キシラナーゼを、細胞外へ分泌させたり、細胞中の小胞体等に局在させることができる。

また、本発明に係る耐熱性キシラナーゼは、その他にも、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えば当該耐熱性キシラナーゼのＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現又は精製において汎用されているタグを用いることができる。

［耐熱性キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド］
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係る耐熱性キシラナーゼをコードする。当該耐熱性キシラナーゼは、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。

具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｅ)のいずれかの塩基配列からなるキシラナーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチドである。

（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ６．０の条件下でキシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ６．０の条件下でキシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ６．０の条件下でキシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ６．０の条件下でキシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。

なお、本願及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が欠失する」とは、ポリヌクレオチドを構成しているヌクレオチドの一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が置換する」とは、ポリヌクレオチドを構成している塩基が別の塩基に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が付加される」とは、ポリヌクレオチド中に新たな塩基が挿入されることを意味する。

本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。

前記（ａ）〜（ｅ）の塩基配列においては、縮重コドンは、宿主のコドン使用頻度の高いものを選択することが好ましい。例えば、前記（ａ）の塩基配列としては、配列番号２で表される塩基配列であってもよく、配列番号２で表される塩基配列を、コードするアミノ酸配列は変更せずに、宿主において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。コドンの改変は、公知の遺伝子配列変異技術又は人工遺伝子合成によって行うことができる。

配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、塩基配列情報に基づいて化学的に合成してもよく、ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１をコードする遺伝子（「ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１遺伝子」ということがある。）の全長若しくはキシラナーゼ触媒領域を含む部分領域（配列番号１中の３１位のトレオニン（Ｔ）から３４４位のロイシン（Ｌ）までの３１４アミノ酸残基からなる部分領域をコードする領域）を遺伝子組換え技術によって自然界から取得したものであってもよい。ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１遺伝子の全長又はその部分領域は、例えば、自然界から微生物を含むサンプルを取得し、当該サンプルから回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列に基づいて常法により設計したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。当該サンプルから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型としてもよい。なお、鋳型となる核酸を回収するサンプルは、温泉土壌等の高温環境下から採取されたサンプルであることが好ましい。

前記（ｄ）の塩基配列において、配列番号２で表される塩基配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９８％以上１００％未満であることがよりさらに好ましい。

なお、塩基配列同士の配列同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明における塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。

例えば、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、１又は２以上の塩基を欠失、置換若しくは付加することによって人工的に合成することができる。また、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列としては、ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１遺伝子のホモログ遺伝子の全長配列又はその部分配列であってもよい。ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１遺伝子のホモログ遺伝子は、塩基配列が既知の遺伝子のホモログ遺伝子を取得する際に用いられる遺伝子組換え技術によって取得することができる。

本発明に係るポリヌクレオチドは、キシラナーゼ触媒領域をコードする領域のみを有するものであってもよく、当該領域に加えて、セルロース結合モジュール、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ等をコードする領域を有していてもよい。

［発現ベクター］
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも８５℃、ｐＨ６．０の条件下でキシラナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明に係るポリヌクレオチドが、前記本発明に係る耐熱性キシラナーゼを発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、前記本発明に係るポリヌクレオチド、及びターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットが、発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことができる。ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組み込みでは、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。

本発明及び本願明細書において、発現ベクターとは、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、外来ＤＮＡを組込むための配列を有するＤＮＡ、及びターミネーター配列を有するＤＮＡを含むベクターである。

当該発現ベクターとしては、大腸菌等の原核細胞へ導入されるものであってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞へ導入されるものであってもよい。これらの発現ベクターとしては、それぞれの宿主に応じて通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。

本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された細胞と形質転換されていない細胞の選抜を容易に行うことができるためである。当該薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びビアラホス耐性遺伝子等がある。

［形質転換体］
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、本発明に係る耐熱性キシラナーゼを発現させ得る。発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る耐熱性キシラナーゼを、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた耐熱性キシラナーゼを生産し得る。

発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換体を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。当該方法として、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、宿主が植物細胞である場合には、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。

宿主として、原核細胞、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、又は哺乳培養細胞等を用いた場合には、得られた形質転換体は、一般的には、形質転換前の宿主と同様にして、常法により培養することができる。

［耐熱性キシラナーゼの製造方法］
本発明に係る耐熱性キシラナーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性キシラナーゼを生産する方法である。前記本発明に係るポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る耐熱性キシラナーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に耐熱性キシラナーゼを発現させる。

形質転換体によって生産された耐熱性キシラナーゼは、当該形質転換体内に留めた状態で使用してもよく、当該形質転換体から抽出・精製してもよい。

形質転換体から耐熱性キシラナーゼを抽出又は精製する方法は、耐熱性キシラナーゼの活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。当該方法として、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、耐熱性キシラナーゼを抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。当該抽出バッファーとしては、界面活性剤等の可溶化剤を含有するものが好ましい。形質転換体が植物である場合には、抽出バッファーに浸す前に、予め当該形質転換体を細断又は粉砕しておいてもよい。また、抽出液と固形残渣を分離する方法としては、例えば、濾過方法、圧縮濾過方法、又は遠心分離処理方法等の公知の固液分離処理を用いることができ、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を搾ってもよい。抽出液中の耐熱性キシラナーゼは、塩析法、限外濾過法、又はクロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。

本発明に係る耐熱性キシラナーゼを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便に耐熱性キシラナーゼを含む溶液を得ることができる。また、本発明に係る耐熱性キシラナーゼが、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、当該タグを利用したアフィニティクロマトグラフィ法により、抽出液や培養上清中の耐熱性キシラナーゼを簡便に精製することができる。

すなわち、本発明に係る耐熱性キシラナーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性キシラナーゼを生産すること、及び所望により前記形質転換体から前記耐熱性キシラナーゼを抽出し精製することを含む。

［グリコシド加水分解酵素混合物］
前記本発明に係る耐熱性キシラナーゼ、又は前記本発明に係る耐熱性キシラナーゼの製造方法によって製造された耐熱性キシラナーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を含むグリコシド加水分解酵素混合物として使用することもできる。前記本発明に係る耐熱性キシラナーゼの製造方法によって製造された耐熱性キシラナーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出又は精製されたものであってもよい。本発明に係る耐熱性キシラナーゼを、その他のグリコシド加水分解酵素との混合物として多糖類の加水分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。

当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記耐熱性キシラナーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、リグノセルロースの加水分解活性を有するものであれば特に限定されるものではない。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記耐熱性キシラナーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、例えば、β−キシロシダーゼ等のヘミセルラーゼ、セロビオハイドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、又はエンドグルカナーゼ等が挙げられる。本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物としては、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼの少なくとも一方を含むものが好ましく、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼを両方含むものがより好ましい。中でも、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上のグリコシド加水分解酵素を含むものが好ましく、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びエンドグルカナーゼを全て含むものがより好ましい。

当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれるその他のグリコシド加水分解酵素は、少なくとも８５℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましく、７０〜９０℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることがより好ましい。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる全ての酵素が耐熱性であることにより、当該グリコシド加水分解酵素混合物によるリグノセルロースの分解反応を高温条件下で効率よく行うことができる。すなわち、当該グリコシド加水分解酵素混合物が耐熱性グリコシド加水分解酵素のみを含む場合、当該グリコシド加水分解酵素混合物をリグノセルロース糖化処理に用いることにより、糖化温度７０〜９０℃の高温環境下でリグノセルロース加水分解反応を行うことが可能になる。この高温糖化により、酵素量と糖化時間を著しく減らすことができ、糖化コストが大幅に削減される。

［リグノセルロース分解物の製造方法］
本発明に係るリグノセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る耐熱性キシラナーゼによりへミセルロースを加水分解して、オリゴ糖を産生することによってリグノセルロース分解物を得る方法である。具体的には、ヘミセルロース若しくはセルロースを含む材料を、本発明に係る耐熱性キシラナーゼ、本発明に係る形質転換体、本発明に係る耐熱性キシラナーゼの製造方法によって製造された耐熱性キシラナーゼ、又は本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、ヘミセルロース若しくはセルロース分解物を生産する。

ヘミセルロース、若しくはセルロースを含む材料としては、ヘミセルロース、若しくはセルロースが含まれていれば特に限定されるものではない。当該材料としては、例えば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマス、又は古紙等が挙げられる。当該セルロースを含む材料は、本発明に係る耐熱性キシラナーゼと接触させる前に、破砕若しくは細断等の物理的処理、酸若しくはアルカリ等による化学処理、又は適当なバッファーへの浸漬又は溶解処理等を行っておくことが好ましい。

本発明に係る耐熱性キシラナーゼによるヘミセルロースの加水分解反応の反応条件は、当該耐熱性キシラナーゼがキシラナーゼ活性を示す条件であればよい。例えば、６０〜９０℃、ｐＨ５．０〜８．０で反応を行うことが好ましく、７０〜９０℃、ｐＨ５．０〜７．０で反応を行うことがより好ましく、８０〜９０℃、ｐＨ５．０〜７．０で反応を行うことがさらに好ましい。前記加水分解反応の反応時間は、加水分解に供されるセルロースを含む材料の種類、前処理の方法、又は量等を考慮して適宜調整される。例えば、１０分間〜１００時間、セルロース系バイオマスを分解する場合には、１〜１００時間の反応時間で前記加水分解反応を行うことができる。

リグノセルロースの加水分解反応には、本発明に係る耐熱性キシラナーゼに加えて、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を用いることも好ましい。その他のグリコシド加水分解酵素としては、前記グリコシド加水分解酵素混合物に含められるグリコシド加水分解酵素と同様のものを用いることができ、少なくとも８５℃で、好ましくは少なくとも７０〜９０℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましい。また、当該リグノセルロース分解物の製造方法には、本発明に係る耐熱性キシラナーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る耐熱性キシラナーゼの製造方法によって製造された耐熱性キシラナーゼに代えて、前記グリコシド加水分解酵素混合物を用いてもよい。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］温泉土壌からの新規耐熱性キシラナーゼのクローニング
＜１＞ 温泉土壌からのＤＮＡ抽出と全ゲノムシーケンス（Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＷＧＳ）
７０〜９０℃で活性を示す新規耐熱性キシラナーゼの遺伝子探索を目的として、中性〜弱アルカリ性温泉から土壌ＤＮＡを採取し、これらの土壌を構成する微生物叢メタゲノムＤＮＡの塩基配列解読を行った。
中性〜弱アルカリ性温泉土壌サンプルとして、野外にて高温の温泉が噴き出している日本国内の３ヶ所、５地点（メタゲノムＤＮＡサンプルＮ２、ＡＲ１９、ＡＲ１５、ＯＪ１、及びＨ１）から、土壌、泥、バイオマットを含む温泉水を採取した。これらの温泉土壌サンプルは、採取時の温度５８〜７８℃、ｐＨ７．２〜８のレンジにあった。

採取した温泉土壌サンプル各１０ｇから、ＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＩＬ Ｌａｒｇｅ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ ｖｅｒ．２、ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製）を使い、ＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡに対して、ロシュダイアグノスティックス社製のＧＳ ＦＬＸ Ｔｉｔａｎｉｕｍ ４５４及びイルミナ社製Ｈｉｓｅｑ２０００を用いて、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンスを行った。４５４シーケンサーには抽出されたＤＮＡ５μｇを用い、Ｈｉｓｅｑ２０００シーケンサーには、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ Ｖ２ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて増幅した産物を用いて、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行った。Ｈｉｓｅｑ２０００によるシーケンスでは、イルミナ社製のｃＢｏｔを用いてＤＮＡライブラリー及び試薬をフローセルに流し込み、ＤＮＡ１分子から、自動的に同一配列をもつクラスターをフローセル内に形成させた。Ｈｉｓｅｑ２０００を用いて１０１ｂｐのペアエンドシーケンスを行い、メタゲノムシーケンスデータを得た。
温泉土壌サンプルＡＲ１９について、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行い、４５４シーケンサーにおいては平均リード長３９６ｂｐ、総リード数２，７６６,３３２個、総ゲノム解読量１，１０６，２４３，２８０ｂｐを得、Ｈｉｓｅｑ２０００シーケンサーにおいては平均リード長９２．６５ｂｐのペアエンドで、総リード数８９４，２３８，０９６個、総ゲノム解読量８３，１１２，１６８，７５５ｂｐを得、合計して８４．２Ｇｂｐの全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）データセットを得た。

＜２＞ 温泉メタゲノムデータのアセンブルと統計量
４５４シーケンサー及びＨｉｓｅｑ２０００シーケンサーで読みとられた塩基配列に対して、ＣＬＣｂｉｏ社製のＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ｖｅｒ５．５．１）を用いてクオリティーフィルタリング及びＤｅｎｏｖｏアセンブリングを行った。クオリティーフィルタリング後には、４５４シーケンサーで得られたリードの総リード長は１，０８４，４００，５７６ｂｐとなり、Ｈｉｓｅｑ２０００シーケンサーで得られた塩基配列データの総リード長は８１，３２３，６９２，５６３ｂｐとなった。アセンブリング後には、５００ｂｐ以上の長さを持つコンティグの数は９６７，９２５個、総全長は４１９，７８７，６０３ｂｐとなり、このうち最大コンティグ長は２８７，６４１ｂｐであった。

＜３＞ キシラナーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測
ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（http://www.uniprot.org/）からＥＣ番号が３．２．１．４（セルラーゼ）、３．２．１．２１（β−グルコシダーゼ)、３．２．１．３７（β−キシロシダーゼ) 、３．２．１．９１（セルロース １，４−β−セロビオシダーゼ)、３．２．１．８（エンド１，４−β−キシラナーゼ）の配列をダウンロードし（アクセス日：２０１１／１２／９）、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。アノテーションソフトウェアＭｅｔａｇｅｎｅ（Noguchi et al., DNA Research，2008,15(6)）を使用して、前記＜２＞で得たコンティグ配列から、遺伝子領域（＝オープンリーディングフレーム）を推定した（Ｍｅｔａｇｅｎｅ ｏｐｔｉｏｎ：−ｍ）。推定されたＯＲＦからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌａｓｔａｌｌ ｖｅｒ. ２．２．１８）を使い、前記ローカルデータベースに参照した。ＢＬＡＳＴＰのｏｐｔｉｏｎ条件は、「Ｆｉｌｔｅｒ ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ｆａｌｓｅ」、「Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ（Ｅ）＜１ｅ^−２０」［以下、デフォルト値：Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ａ ｇａｐ＝−１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｇａｐ＝−１、Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝０、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｆｏｒ ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｈｉｔｓ＝０、Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ＝ｄｅｆａｕｌｔ］とし、ヒットしたＯＲＦ配列をグリコシド加水分解酵素遺伝子として収集した。収集された塩基配列は、セルラーゼ、エンドヘミセルラーゼ、脱分岐酵素等のグリコシド加水分解酵素を含んでいた。

＜４＞ 遺伝子のグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリー分類
前記＜３＞で収集された塩基配列について、タンパク質の機能領域配列データベースｐｆａｍ ＨＭＭｓ（Ｐｆａｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ２３．０ ａｎｄ ＨＭＭＥＲ ｖ２．３；Finn et al.，Nucleic Acids Research Database，2010，Issue 38，p.D211-222)を基準に、機能分類を行った。具体的には、タンパク質モチーフ検索プログラムＨＭＭＥＲ（Durbin et al.，‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998，Cambridge University Press.；ｈｍｍｐｆａｍ（Ｖｅｒ．２．３．２）、Ｅ−ｖａｌｕｅ ｃｕｔｏｆｆ＜１ｅ^−５; Ｄａｔａｂａｓｅ＝Ｐｆａｍ＿ｆｓ（ｍｏｄｅｌｓ ｔｈａｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｆｉｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．))を用いて、Ｐｆａｍ領域データベースとの相同性から、前記＜３＞で収集された各塩基配列についてグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリーを決定した。なお、ＧＨ触媒ドメインの配列を７０％以上カバーしているものを、各ファミリーに属する酵素遺伝子としてカウントした。

メタゲノムＡＲ１９シーケンスデータを用いたＢＬＡＳＴＰによる相同性検索及びＨＭＭＥＲにより、３３個のＯＲＦ（完全長ＯＲＦが２９個、不完全長ＯＲＦが４個）がキシラナーゼ遺伝子と予測された。これらのＯＲＦのＧＨファミリー分類を表１に示す。表１に示すように、ＧＨファミリー１０に属するキシラナーゼ完全長ＯＲＦ１７個と、ＧＨファミリー１１に属する完全長ＯＲＦ７個と、ＧＨファミリー４３に属する完全長ＯＲＦ４個と、が、メタゲノムＡＲ１９から得られた。キシラナーゼと推定された全てのＯＲＦについて、プライマーを設計し、温泉土壌メタゲノムＤＮＡからＰＣＲにより遺伝子をクローニングした。この結果、ＧＨファミリー１０に属し、キシラナーゼ配列を持つオープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−１７７からキシラナーゼ遺伝子が単離された。

＜５＞ オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−１７７
オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−１７７は、３５５アミノ酸残基からなるポリペプチド（配列番号１）をコードし、１位のアミノ酸残基がメチオニンから開始し、３’末端が終始コドンで終わる完全長配列（配列番号２）であった。シグナル配列予測ソフトウェアＳｉｇｎａｌＰ ４．１を使った解析によれば、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−１７７は、１位のメチオニン（Ｍ）から２９位のグリシン（Ｇ）までの２９アミノ酸残基が分泌シグナルであった。また、モチーフの配列相同性から、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−１７７は、３１位のトレオニン（Ｔ）から３４４位のロイシン（Ｌ）までの３１４アミノ酸残基がＧｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ １０の触媒ドメインをコードしていると推測された。当該ＯＲＦは、細菌サーモトーガ門サーモトーガ・スピーシーズＲＱ２のＧＨ１０ファミリーに属するエンド−１，４−β−キシラナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣＢ０９２２９．１）と全長で６９％、ＧＨ１０触媒領域について７５％のアミノ酸配列同一性を示す、新規な配列であった。配列相同性は、いずれもＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムにより算出した。

＜６＞ 遺伝子クローニング
配列番号５で表される塩基配列からなるフォワードプライマー（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＣＧＴＧＡＡＡ−３’：配列番号３で表される塩基配列の５’末端側に４塩基（ＣＡＣＣ）付加したもの。５’側に付加したＣＡＣＣは、ベクターに挿入するための配列である。）と配列番号４で表される塩基配列からなるリバースプライマー（５’−ＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＣ−３’）を用い、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ Ｖ２ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＧＥヘルスケア社製）で増幅した温泉土壌ＤＮＡをテンプレートにして、ＰＣＲを行った。配列番号３で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の１〜２１位の塩基からなる部分配列と相同的な（同一の）塩基配列である。また、配列番号４で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の１，０４８〜１，０６８位の塩基からなる部分配列と相補的な塩基配列である。増幅したＰＣＲ産物は、Ｃｈａｍｐｉｏｎ ｐＥＴ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）のｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入し、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０株に形質転換した。コロニーＰＣＲによりポジティブクローンを選抜し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃、２００ｒｐｍで１７〜２０時間培養した後、ミニプレップキット（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標） ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、ライフテクノロジーズ社の３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサーを用いて配列確認を行った。

ＰＣＲクローニングにより、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−１７７から遺伝子クローンＡＲ１９Ｍ−１７７−２１を得た。キシラナーゼ候補遺伝子ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１の塩基配列は、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−１７７（配列番号２）と完全に同一であり、３５５アミノ酸残基からなるポリペプチド（ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１）（配列番号１）をコードしていた。

図１に、遺伝子クローンＡＲ１９Ｍ−１７７−２１のアミノ酸配列と細菌サーモトーガ門サーモトーガ・スピーシーズＲＱ２のエンド−１，４−β−キシラナーゼのアミノ酸配列（配列番号６）のアライメントを示す。図１中、黒白反転のアミノ酸は、これらの全アミノ酸配列において同一アミノ酸残基（identical）を示し、「−」は欠失（ギャップ）を示す。

＜７＞ 遺伝子発現及びキシラナーゼ酵素タンパクの精製
シーケンス確認後、目的遺伝子をもつプラスミドを、ヒートショック法によりタンパク質発現用大腸菌へ導入した。形質転換用コンピテントセルは、Ｃｈａｍｐｉｏｎ（登録商標） ｐＥＴ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）に付属するＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株を用いた。目的の遺伝子をもつ大腸菌を１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、ＯＤ_６００＝０．２〜０．８程度まで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、さらに５〜２０時間培養することによって、目的タンパク質の発現誘導を行った。培養後、遠心分離を行って大腸菌を回収し、培養液の１／１０容量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ａｓｔｒａｓｏｎ３０００（ＭＩＳＯＮＩＸ社製）を用いて、５分間破砕−５分間休止工程を７〜８回繰り返し、目的タンパク質を含む遺伝子組換え大腸菌の粗抽出物を得た。当該遺伝子組換え大腸菌粗抽出物をフィルター（孔径φ＝０．４５μｍ、ミリポア社製）で濾過し、得られた濾液を遺伝子組換え大腸菌破砕上清とした。

当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したイオン交換カラムＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、中高圧液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ ｄｅｓｉｇｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜５０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。キシラナーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｔｅｄｉｍ社製）によって７５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）へ溶液交換した。溶液交換後のキシラナーゼ活性分画を、同液で平衡化した疎水性相互作用分離カラムＨｉＴｒａｐ Ｐｈｎｅｎｙｌ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を分画した。キシラナーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後に、液量が８ｍＬ程度になるまでＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０を用いて濃縮した。濃縮したサンプルは、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したゲル濾過カラムＨｉｌｏａｄ２６／６０ ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、カラム体積の１〜１．５倍容の同バッファーを流速２〜３ｍＬ／ｍｉｎで流すことによって分画した。キシラナーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、終濃度約１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を得た。

遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認した。遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素のＳＤＳ電気泳動は、ミニプロティアンＴＧＸステインフリーゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて行った。前記上清又は精製酵素を、それぞれＴｒｉｓ−ＳＤＳ βＭＥ処理液（コスモバイオ社製）と１：１で混合した泳動用サンプルを、１００℃で１０分間処理した後、１サンプルあたり、遺伝子組換え大腸菌破砕上清は１０μＬ、精製酵素は１μｇをそれぞれ泳動させた。泳動終了後、ＣＢＢ染色によってタンパク質のバンドを可視化した。

図２に、ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１遺伝子を導入した形質転換大腸菌から調製された遺伝子組換え大腸菌破砕上清及び当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清から精製された精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。レーン１はタンパク質質量指標、レーン２は遺伝子組換え大腸菌破砕上清、レーン３は精製酵素の電気泳動パターンである。この結果、前記遺伝子組換え大腸菌破砕上清（レーン２）において、アミノ酸配列（配列番号１）から予想される質量４１．１ｋＤａ近傍に強いバンドが認められ、精製酵素（レーン３）では、当該バンドに対応する単一バンドが認められた（図中、矢印）。

＜８＞ キシラナーゼ活性測定（キシラン加水分解活性）
キシラナーゼ活性測定には、キシラン（Ｘｙｌａｎ）（ブナ材由来、Ｓｉｇｍａ社製）を基質として用いた。キシランを水で溶かし、１質量％となるように調整したものを、基質溶液として用いた。なお、以降の実験に用いたキシラン基質溶液は、全て当該方法により調製した１質量％のキシラン水溶液を用いた。

ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１）のキシラナーゼ活性を調べた。具体的には、１質量％のキシラン水溶液を１００μＬと、２００ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ６．０）を５０μＬと、前記＜７＞で得られた遺伝子組換え大腸菌破砕上清を５０μＬ、又は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で希釈した精製酵素（０．１ｍｇ／ｍＬ）を２μＬ及び精製水を４８μＬと、からなる混合液を、４０〜９９℃で１５分間反応させた。反応中、キシランの沈殿を防ぐため、エッペンドルフ社のサーモミキサー（１４００ｒｐｍ）を用いて攪拌した。全ての計測において、遺伝子組換え大腸菌破砕上清又は精製酵素の代わりに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。また、基質溶液と酵素（遺伝子組換え大腸菌破砕上清又は精製酵素）は、反応温度で５分間それぞれ別々に保温した後に混合し、反応開始とした。反応終了後は、各混合液に対して等量の３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＮＳ溶液）を加えて１００℃で５分間加熱処理し、５分間の冷却後に遠心し、上清を得た。上清中の還元糖量を、分光光度計を用いて５４０ｎｍの吸光度を計測し、キシロースで作成した検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。

この結果、遺伝子組換え大腸菌破砕上清を用いた場合と精製酵素を用いた場合の両方とも、キシラナーゼ活性があることが確認された。

＜９＞ ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１の基質特異性
ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１）に対して、様々なセルロース基質とヘミセルロース基質に対する加水分解活性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素（約１ｍｇ／ｍＬ）を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で希釈した精製酵素溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。また、基質として、ＰＳＡ、アビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）、ＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ社製）、キシラン（ブナ材由来、Ｓｉｇｍａ社製）、リケナン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、ラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ由来、Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＸ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＧ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
ＰＳＡはリン酸溶液でアビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）を一旦溶解させた後に滅菌蒸留水を加えて析出させた後、ｐＨが５以上になるまで洗浄することによって調製した。なお、以降の実験に用いたＰＳＡは全て当該方法により調製した。

具体的には、まず、反応液として、５０μＬの２００ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ６．０）と、２μＬの精製酵素溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）と、４８μＬの精製水とからなる混合液を８５℃で５分間プリインキュベーションした後、さらに８５℃で保温した１００μＬの各基質溶液（ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ、キシラン、リケナン、及びラミナリンは１質量％水溶液、ＰＮＰＸ及びＰＮＰＧは２０ｍＭ水溶液）を添加し、得られた混合液を８５℃で１５分間インキュベートすることにより酵素反応を行った。反応中、不溶性基質の沈殿を防ぐため、サーモミキサー（エッペンドルフ社製）により混合液に１４００ｒｐｍの振動を加えて撹拌した。

反応終了後、ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ、キシラン、リケナン、又はラミナリンを基質とした反応においては、前記＜８＞のＡＲ１９Ｍ−１７７−２１のキシラナーゼ活性を調べた場合と同様にして、反応後の混合液の上清の５４０ｎｍの吸光度を測定し、加水分解によって生成した還元糖量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。ただし、キシラン以外の基質の加水分解によって生成した還元糖量については、グルコースで作成した検量線を用いて求めた。ＰＮＰＧ又はＰＮＰＸを基質とした反応においては、反応終了後は、各混合液に対して等量の０．２Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３溶液を加えて撹拌することにより反応を停止させた後、それを遠心し、上清を得た。上清中のｐ−ニトロフェノール量は、分光光度計を用いて４２０ｎｍの吸光度を計測し、予め作成していたｐ−ニトロフェノール量と４２０ｎｍの吸光度の検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求めた。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。

各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準偏差を求めた。測定結果を図３に示す。この結果、ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１はキシランに対し高い加水分解活性を示した。一方、その他の基質に対しては、ほとんど分解活性は示さなかった。

＜１０＞ キシランを基質としたキシラナーゼ活性の温度及びｐＨ依存性
ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１）のキシラナーゼ活性の温度依存性及びｐＨ依存性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素（約１ｍｇ／ｍＬ）を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素溶液を用いた。

精製したＡＲ１９Ｍ−１７７−２１のキシラナーゼ活性の温度依存性の測定は、反応温度を４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は９９℃で行った以外は、前記＜８＞と同様に行い、加水分解によって生成した還元糖量を求め、キシラナーゼ活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。

精製したＡＲ１９Ｍ−１７７−２１のキシラナーゼ活性のｐＨ依存性の測定は、１００μＬの１質量％ キシラン水溶液と、５０μＬのマッキルベインバッファー（ｐＨ３〜８）と、４８μＬの精製水と、２μＬの精製酵素溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）からなる混合液を、８５℃で１５分間反応させた以外は、前記＜８＞と同様に行い、加水分解によって生成した還元糖量を求め、キシラナーゼ活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。

計測結果を図４及び５に示す。図４は、横軸を温度として、各温度における精製酵素ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１のキシラナーゼ活性（ｐＨ６．０）を計測した結果を示した図であり、図５は、横軸をｐＨとして、各ｐＨにおける精製酵素ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１のキシラナーゼ活性（８５℃）を計測した結果を示した図である。ｐＨは、基質とバッファーと酵素の混合液の実測値をプロットした。

精製酵素ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１は、温度範囲４０〜９５℃においてキシラナーゼ活性を示した（図４）。最も高い活性を示した至適温度（Ｔ_ｏｐｔ）は、ｐＨ６．０で８５℃であった。ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１のキシラナーゼ活性は、酵素反応温度を９５℃以上にした場合には、キシラナーゼ活性は急激に減少した。

また、精製酵素ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１は、反応温度８５℃において、ｐＨ５．０〜８．０の範囲においてキシラナーゼ活性を示した。精製酵素ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１の至適ｐＨは、８５℃でｐＨ６．１（基質、バッファーと酵素の混合液の実測値）であった。

＜１１＞ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙによるキシラナーゼの熱安定性測定
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ （ＤＳＦ）は、蛍光色素とリアルタイムＰＣＲ装置を用いて、タンパク質の熱変性を計測する方法の一つであり、様々なタンパク質に応用可能である。ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ等、ＤＳＦに使われる蛍光色素は、疎水性部位と結合する無極性条件下で蛍光を発し、一方、水に溶けた極性条件下では発光が抑えられる。通常、タンパク質はその熱変性温度において折畳み構造が解け、内部にある疎水性部位がタンパク質表面に露出する。この露出した疎水性部位にＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇが結合すると、波長４７０〜４８０ｎｍの励起光により、波長５９５ｎｍ付近にピークを持つ強い蛍光を発する。タンパク質溶液の温度を一定間隔で段階的に上昇させ、蛍光強度を計測することにより、熱崩壊温度（＝蛍光強度の変化点）が算出される。

計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。
具体的には、９６穴ＰＣＲプレート（Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ ９６ Ｗｅｌｌ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅ ＭＬＬ−９６５１、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）のウェルに１００倍希釈したＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（ライフテクノロジーズ社製）を２μＬ、濃度１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を１μＬ、２００ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ６．０）を５μＬ、精製水を１２μＬ加え、各ウェルの容積を２０μＬとした。ＰＣＲプレートはＯｐｔｉｃａｌ ８連フラットキャップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）でシールし、リアルタイムＰＣＲ装置（ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で０．２℃ずつ、３０℃から１００℃までウェルの温度を上昇させ、ターゲット温度が達成されてから１０秒間経過した後、各ウェルの蛍光強度を同時計測した。波長帯域４５０〜４９０ｎｍの光発光ダイオード（ＬＥＤ）によりＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅを励起し、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ放射光は５６０〜５８０ｎｍレンジの帯域通過フィルターを通し、ＣＣＤカメラで蛍光強度の計測を行い、蛍光強度変化を温度の関数としてプロットした。リアルタイムＰＣＲに付属の解析ソフトウェアＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製)を使い、データ解析を行った。各計測は、３回の独立した試行により行った。

図６には、ＤＳＦ法により計測したＡＲ１９Ｍ−１７７−２１酵素タンパク質が示す、熱変性に伴って引き起こされるＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅの蛍光強度変化を示す。図６の上段グラフは実測データであり、図６の下段グラフには、図６の上段グラフの蛍光強度変化曲線の１階微分「−ｄ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）／ｄｔ」を示している。熱変性温度（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｔｍ値）は、温度関数である蛍光強度曲線の１階微分（図６の下段グラフのＹ軸に示した「−ｄ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）／ｄｔ」の極大値として定義した。蛍光強度曲線の一階微分から求めた。ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１酵素タンパク質の蛍光強度の一階微分は、９０℃付近にピークを示し、この温度で熱変性が起こることが示唆された。ＡＲ１９Ｍ−１７７−２１酵素タンパク質の熱変性温度の平均値Ｔｍは、９０．４℃±０．０（ｎ＝３）であり、キシラナーゼ活性から求めた当該酵素の至適温度Ｔ_ｏｐｔ＝８５℃に近い値を示した。

本発明に係る耐熱性キシラナーゼは、８５℃、ｐＨ６．０の条件下でキシラナーゼ活性を有しており、高温条件下におけるセルロース含有バイオマスの糖化処理に好適である。このため、当該耐熱性キシラナーゼ及びその生産に用いられるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、例えば、セルロース含有バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。

Claims (10)

1. （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
   （Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ６．０の条件下でキシラナーゼ活性を有し、ｐＨ６．０における前記キシラナーゼ活性の至適温度が７５〜９５℃の温度範囲内にあるポリペプチド、又は
   （Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ６．０の条件下でキシラナーゼ活性を有し、ｐＨ６．０における前記キシラナーゼ活性の至適温度が７５〜９５℃の範囲内にあるポリペプチド、
   からなるキシラナーゼ触媒領域を有することを特徴とする、耐熱性キシラナーゼ。
2. ｐＨ６．０、６０〜９０℃においてキシラナーゼ活性を示す、請求項１に記載の耐熱性キシラナーゼ。
3. ｐＨ６．０、８０〜９０℃の温度範囲内において、少なくとも３００Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎのキシラナーゼ活性を示す、請求項１に記載の耐熱性キシラナーゼ。
4. ８５℃、ｐＨ５．０〜８．０の範囲内において、少なくとも５０Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎのキシラナーゼ活性を示す、請求項１に記載の耐熱性キシラナーゼ。
5. ｐＨ６．０、４０〜９５℃の温度範囲内において、少なくとも３０Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎのキシラナーゼ活性を示す、請求項１に記載の耐熱性キシラナーゼ。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の耐熱性キシラナーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
7. セルロースを含む材料を、請求項１〜５のいずれか一項に記載の耐熱性キシラナーゼ、又は請求項６に記載のグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、リグノセルロース分解物を生産することを含む、リグノセルロース分解物の製造方法。
8. 前記セルロースを含む材料を、前記耐熱性キシラナーゼ又は前記グリコシド加水分解酵素混合物に、６０〜９０℃、ｐＨ５．０〜７．０の条件下で接触させる、請求項７に記載のリグノセルロース分解物の製造方法。
9. 前記セルロースを含む材料を、前記耐熱性キシラナーゼ又は前記グリコシド加水分解酵素混合物に、８０〜９０℃、ｐＨ５．０〜７．０の条件下で接触させる、請求項７に記載のリグノセルロース分解物の製造方法。
10. 前記セルロースを含む材料が、セルロース系バイオマスである、請求項７〜９のいずれか一項に記載のリグノセルロース分解物の製造方法。