CN101960011A - 源自Glaucocystophytes的质体转运肽的用途 - Google Patents

Abstract

在此提供了用于将多肽靶向到质体上的组合物和方法。组合物包括质体转运肽以及对此类转运肽及其变异体进行编码的核苷酸序列。组合物进一步包括DNA构建体，这些构建体含有对该质体转运肽进行编码的核苷酸序列，该质体转运肽可运作地与编码感兴趣的多肽的核苷酸序列相连。这些DNA构建体在对该感兴趣的多肽的表达以及将该感兴趣的多肽靶向到质体中找到了用途。组合物还包括表达盒、载体、转化的植物、转化的植物细胞、以及稳定转化的植物种子，其中通过本发明的质体转运肽将感兴趣的多肽靶向至质体上。

Description

源自Glaucocystophytes的质体转运肽的用途

相关申请

本申请要求于2008年1月30日提交的美国临时申请号61/024,844的优先权。本申请还要求于2008年4月24日提交的美国临时申请号61/047,692的优先权。

对电子提交的序列表的参引

遵照美国信息交换标准编码(ASCII)，与本说明书一起作为文本文件提交了序列表的正式文本，其文件名为“Sequence Listing 71999.txt”，创建日期2009年1月10日，并且大小为7.25KB。该序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其整体结合在此。

技术领域

本发明涉及植物的遗传修饰、特别是将感兴趣的多肽转运到植物质体(plastid)上。

发明背景

质体包含它自身的基因组。然而，在进化过程中，许多质体基因被转移到核基因组中。因此，已经发展了机制用于将核编码的质体蛋白转运回到质体上。这些蛋白是通过使用位于被转运蛋白的N端的转运肽序列来进行转运的。这些肽将这些蛋白引导(direct)到质体上并且可以随后被特异性的蛋白酶识别，这可能导致转运肽(transit peptid)的去除。

细胞生物学中的一个根本性问题是将由细胞质核糖体合成的蛋白精确并且有效的靶向到它们的适当的细胞内的位置上。对于其中在适当的细胞器中需要该转基因产物的转基因高等植物而言尤其是这样。本发明提供了将异源多肽有效地转运进入转基因高等植物的叶绿体中的质体转运肽。出人意料地，这可以使用源自Glaucocystophyte的蓝色小体(cyanelle)转运肽来完成。

发明概述

在此提供了用于将多肽靶向至叶绿体的组合物和方法。组合物包括转运肽以及编码转运肽(即，靶向质体的肽或运输肽(transport peptide))及其变异体的多个核苷酸序列。组合物进一步包括DNA构建体，这些构建体包括对该转运肽进行编码的核苷酸序列，该核苷酸序列与编码异源多肽的核苷酸序列可操作连接。这些DNA构建体在表达以及将异源多肽的靶向到质体中找到了用途。组合物还包括多个表达盒、载体、转化的植物、转化的植物细胞、以及稳定转化的植物种子，它们包含对异源多肽进行编码的多核苷酸，该异源多肽通过本发明的质体转运肽而靶向至叶绿体。

发明详细说明

本发明的质体靶向或转运肽介导了可运作地连接的多肽进入质体的靶向、定位、或转运。质体是在植物和藻类中发现的细胞器。质体负责光合作用、储存产物(如淀粉)，并且负责许多类别的分子(如脂肪酸、萜类、以及作为细胞构造单元(celluar building blocks)所需要的其它分子)的合成。质体有能力来分化、或再分化成几种形式，这取决于它们在细胞中的作用。未分化的前质体可以发展成为以下质体中的任何一种，包括叶绿体、色质体(chromoplasts)、白色体(leucoplasts)、造粉质体(amyloplasts)、平衡石(statoliths)、造油质体(elaioplasts)、以及蛋白质体(proteinoplasts)。

“叶绿体转运肽”或“质体运输肽”或“质体转运肽”或“靶向质体的肽”或“转运肽”或“靶向肽”是必要的并且足以协助将蛋白输入其天然宿主细胞的质体之中。该质体可以是蓝色小体或叶绿体。转运肽被定位于输入质体中的蛋白质的N端。转运肽协助将可运作地连接的多肽进入质体中的共翻译的或翻译后的转运。

这些转运肽一般包括40和100个之间的氨基酸。研究表明转运钛包含一些共同的特征。这些包括：它们几乎没有带负电的氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺；N端区域没有带电的氨基酸、并且没有如甘氨酸或脯氨酸的氨基酸；它们的中心区域包含非常高比例的碱性或羧基化的氨基酸，如丝氨酸或苏氨酸；并且，它们的C端区域富含精氨酸并且有能力形成两亲的β折叠二级结构。

根据一个权威著作(Cline and Henry，Annu Rev Cell Dev Biol 12：1-26(1996))，来自高等植物的叶绿体转运肽共享以下特征：(1)它们具有与线粒体的转运肽表面上类似的特性。即它们富含羧基化的残基并且缺少酸性残基。(2)它们为30-120个残基长。(3)N端的10-15个氨基酸没有甘氨酸、脯氨酸以及带电的残基。(4)可变的、中间的区域富含丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸和精氨酸。(5)C-近端区域包含用于蛋白分解过程的宽松保守的序列(Ile/Val-x-Ala/Cys*Ala)。(6)不存在延长的序列保护(conservation)或保守的二级结构基序。(7)理论上，它们采取主要是随机螺旋的构象。

存在着几种计算方法，它们使用以上特征来预测来自高等植物的叶绿体靶向序列。计算工具包括PSORT(Nakai and Kanehisa，Proteins 11(2)：95-110(1991)；Horton et al.，Proceedings of the 4^th Annual Asia PacificBioinformatics Conference APBC06，Taipei，Taiwan pp.39-48(2006)；http://www.psort.org)、ChloroP(Emanuelsson et al.，J Mol Biol 300：1005-1016(1999)；http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)或TargetP(Nielsen et al.，Protein Engineer 10：1-6(1997)；Emanuelsson et al.，J Mol Biol 300：1005-1016(2000)；http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/).

Glaucocystophytes是藻类的这样一家族，包含蓝色小体作为光合细胞器。在Glaucocystophyte中存在几个属，包括Cyanophora、灰胞藻属(Glaucocystis)和Gloeochaete。蓝色小体本质上是原始性质体。不同于其它真核的质体，蓝色小体具有肽聚糖层，该肽聚糖层据信是来自蓝细菌的质体的内共生起源的残遗物。Glaucocystophyte包含光合色素叶绿素a。与红藻类和蓝细菌一起，它们通过藻胆体(phycobilisomes)(主要由藻胆蛋白构成的)结构来收获光。绿藻类和陆生植物已经失去了这种色素。

在所有这些质体之中，Glaucocystophyte蓝色小体与自由生存的蓝细菌最接近的亲缘物。在蓝色小体的细胞壁中存在的肽聚糖层有可能是蓝色小体的蛋白输入机构的关键部分。参见Steiner and Loffelhardt，MolecularMembrane Biology 22(1-2)：123-132(2005)对于蓝色小体蛋白质转位的综述。高等植物的叶绿体已经失去了这种肽聚糖层并且因此在它们的膜结构上与蓝色小体不同。已经进一步证实，蓝色小体与高等植物的输入机构不同之处在于因为蓝色小体靶向的蛋白(铁氧还蛋白-NADP⁺-氧化还原酶)被输入分离的豌豆和菠菜叶绿体中(Steiner and Loffelhardt，Trends Plant Sci 7：72-77(2002))；然而，高等植物叶绿体靶向的蛋白与蓝色小体不能作用(Steiner and Loffelhardt Mol.Memb.Biol.22：123-132(2005))。

蓝色小体转运肽序列与靶向叶绿体基质的肽不同之处在于在其N端结构域中含有不变的苯丙氨酸残基，这对于通过蓝色小体的输入是关键性的。参见，例如Steiner and Loffelhardt Trends Plant Sci.7：72-77(2002)；和Steinerand Loffelhardt Mol.Memb.Biol.22：123-132(2005)。这种不变的苯丙氨酸残基对于蓝色小体以及藻红体(红藻质体)是独特的并且不是绿色谱系的生物体(绿藻、裸藻属(Euglena)、硅藻(diatoms)以及高等植物)中的质体转运肽的特征。蓝色小体转运序列与来自高等植物的靶向基质的肽类在它们的氨基酸组成、在它们的正的净电荷并且在它们的结构域结构方面对应。蓝色小体转运肽的N端显示了短的共有序列。参见Steiner et al.(2005)ThePlant J.44：646-652(2005)。尽管不受限于任何作用机理，据信N端的苯丙氨酸残基仅对于输入蓝色小体中是必要的，因此，这种残基在实践本发明时可以被修饰并且仍然将多肽有效地转运进入高等植物叶绿体中。

一起来看，以上数据对靶向蓝色小体的序列将异源蛋白引导至高等植物的叶绿体上的能力产生了疑问。尽管Cyanophora paradoxa的前-FNR分子能够进入从豌豆中分离的叶绿体中，但是并非必须能够得出该FNR转运肽在附接到异源蛋白时将能够与该高等植物分泌系统相互作用以将异源蛋白有效地靶向至叶绿体上。出人意料地，本申请描述了使用蓝色小体转运肽将异源蛋白靶向至高等植物中的叶绿体上的方法。

在本发明的一个实施方案中，该转运肽是来自Glaucocystophyte，它在可运作地连接至异源蛋白并且在转基因高等植物中表达时，将该异源蛋白靶向至该叶绿体。该Glaucocystophyte选自下组：Cyanophora、灰胞藻属(Glaucocystis)、Gloeochaete以及Cyanophora paradoxa。

本发明的另一个实施方案是将异源蛋白靶向至转基因高等植物的叶绿体的方法，该方法包括以下步骤：将来自Glaucocystophyte的转运肽可运作地连接至异源蛋白上并且产生含该异源蛋白的转基因植物，其中该异源蛋白在该转基因植物的叶绿体中被检出。该Glaucocystophyte选自下组：Cyanophora、Glaucocystis、Gloeochaete以及Cyanophora paradoxa。

这些组合物包括对转运肽连同其变异体进行编码的核苷酸序列。在一个实施方案中，该转运肽包括SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列或其片段及变异体，连同SEQ ID NO：1中列出的核苷酸序列及其变异体。组合物进一步包括DNA构建体，这些构建体含有编码转运肽的核苷酸序列，该核苷酸序列与编码异源多肽的核苷酸序列可操作连接。这些DNA构建体在表达以及将该异源多肽的靶向到质体中找到了用途。组合物还包括表达盒、载体、转化的植物、转化的植物细胞、以及稳定转化的植物种子，其中异源多肽通过本发明的转运肽靶向到质体上。

在本发明的一个实施方案中，这种转运肽是来自Glaucocystophyte，它在可运作地连接至异源蛋白并且在转基因高等植物中表达时，将该异源蛋白靶向至该叶绿体上。

转运肽是源自将靶向至该Glaucocystophyte的蓝色小体的蛋白进行编码的核酸序列。转运肽可以在已知的要在宿主细胞的细胞核中被编码但是在翻译时将被靶向至该宿主细胞的光合细胞器的基因中发现，并且可以选自下组，其组成为：二磷酸核酮糖酯羧化酶/加氧酶，5-烯醇丙酮酸莽草酸-3磷酸合成酶、乙酰乳酸合成酶、叶绿体核糖体蛋白CS17、Cs蛋白、铁氧还蛋白、质体蓝素、二磷酸核酮糖羧化酶活化酶、色氨酸合成酶、酰基载体蛋白、质体伴侣素-60、细胞色素C552、22-kDA热休克蛋白、33-kDA放氧增强蛋白1(oxygen-evolving enhancer protein 1)、ATP合成酶γ亚基、ATP合成酶ω亚基、叶绿素-a/b-结合蛋白II-1、放氧增强蛋白2、放氧增强蛋白3、光系统I P21、光系统I P28、光系统I P30、光系统I P35、光系统I P37、甘油-3-磷酸乙酰转移酶、叶绿素a/b结合蛋白、CAB2蛋白、羟甲基-胆色烷合成酶(hydroxymethyl-bilane synthase)、丙酮酸-正磷酸二激酶、CAB3蛋白、质体铁蛋白、铁蛋白、早期光诱导蛋白、谷氨酸-1-半醛转氨酶、原叶绿素还原酶、淀粉-粒子结合型淀粉酶合成酶、光系统II的集光叶绿素a/b-结合蛋白、主要花粉变应原Lol p 5a、质体ClpB ATP依赖性蛋白酶、超氧化物歧化酶、铁氧还蛋白NADP氧化还原酶、28-kDa核糖核蛋白、31-kDa核糖核蛋白、33-kDa核糖核蛋白、乙酰乳酸合成酶、ATP合成酶CF0亚基1、2、3或4；细胞色素f、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、谷酰胺合成酶、谷酰胺合成酶2、碳酸酐酶、GapA蛋白、热休克蛋白hsp 21、磷酸转运体、质体CIpAATP依赖性蛋白酶、质体核糖体蛋白CL24、质体核糖体蛋白CL9、质体核糖体蛋白PsCL18、质体核糖体蛋白PsCL25、DAHP合成酶、淀粉磷酸化酶、根酰基载体蛋白11、甜菜碱-醛脱氢酶、GapB蛋白、谷酰胺合成酶2、磷酸核酮糖激酶、亚硝酸盐还原酶、核糖体蛋白L12、核糖体蛋白L13、核糖体蛋白L21、核糖体蛋白L35、核糖体蛋白L40、磷酸丙糖-3-磷酸甘油酸磷酸转运体、铁氧还蛋白依赖性谷氨酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、NADP依赖性苹果酸酶、以及NADP苹果酸脱氢酶。表1识别了含有质体靶向序列的另外的核编码的基因。在本发明的一个实施方案中，转运肽是来自Cyanophora pardoxa、具体来自C.pardoxa铁氧还蛋白-NADP⁺-氧化还原酶并且包括SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列。

表1：对靶向到质体上的蛋白进行编码的核基因。参考文献以其全文通过引用结合在此。

本发明的转运肽包括多个不同的或经修饰的序列。此类序列具有被改变的氨基酸序列而仍保有将所连接的多肽转运进入质体中的能力。尽管用于在多肽序列中将氨基酸残基取代的方法是已知的，但是在此认识到与整个叶绿体靶向蛋白相比在转运肽中是富含的丝氨酸和苏氨酸已经被识别出。天冬氨酸和谷氨酸已经被报道为表示在转运肽中。当构建变异体转运肽时可以将此类考虑以及以上讨论的那些纳入考虑。然而，如下面详细说明的，普通技术人员可以通过测试在质体中可运作地连接的多肽的存在来测试变异体转运肽是否能够完成可运作地连接的多肽的转运。

如在此使用的，术语“核酸分子”是旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。该核酸分子可以是单链的或双链的，但优选是双链DNA。

由“作物植物”或“高等植物”一词是指出于生产人们为口服消费、或者为在工业的、药物的、或商业的过程中使用而寻求的植物材料的目的而栽培的任何植物。本发明可以适用于多种植物中的任何一种，包括但不限于：玉米、小麦、稻、大麦、大豆、棉花、高粱、燕麦、烟草、芒草(Miscanthusgrass)、柳枝稷(Switch grass)、树、一般豆类、油菜/芸苔、苜蓿、亚麻、向日葵、红花、粟、黑麦、甘蔗、甜菜(sugar beet)、可可、茶、芸苔(Brassica)、棉花、咖啡、甘薯、亚麻、花生、三叶草；蔬菜类如莴苣、番茄、葫芦(cucurbits)、木薯、马铃薯、胡萝卜、萝卜、豌豆、滨豆(lentils)、甘蓝、花椰菜、西兰花、孢子甘蓝(Brussels sprouts)、胡椒、和菠萝；树生水果(tree fruits)如柑橘、苹果、梨、桃、杏、核桃(walnuts)、鳄梨(avocado)、香蕉、坚果和椰子；以及花如兰花、康乃馨、玫瑰等等。

如在此使用的，术语“植物部分”或“植物组织”包括植物细胞、植物原生质体、植物可以由之再生的植物细胞组织培养、植物愈伤组织、植物菌落、以及在植物或以下植物的部分中完整的植物细胞，这些植物的部分是如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核、穗、穗轴、苞叶(husk)、茎/柄(stalk)、根、根尖、花药、等等。

在此使用的冠词“一种/一个”是指一个或多于一个(即，至少一个)的该冠词的合乎语法的对象。作为举例，“元件”是指一种或多种元件。贯穿本说明书，单词“包括”或其变体如“包括了”或“包括”应被理解为是指包括所述要素、整数或步骤，或一组要素、整数或步骤，但是不排除任何其它要素、整数或步骤，或要素组、整数组或步骤组。

转运肽组合物

如所指出的，本发明的组合物包括能够将可运作地连接的多肽转运进入质体中的转运肽。术语“肽”广义是指氨基酸链，它包括天然氨基酸、合成氨基酸、遗传编码的氨基酸、非遗传编码的氨基酸、以及它们的组合。肽可以包括L型和D型两种氨基酸。

代表性的非遗传编码的氨基酸包括但不限于：2-氨基己二酸；3-氨基己二酸；β-氨基丙酸；2-氨基丁酸；4-氨基丁酸(γ-氨基丁酸)(piperidinic acid)；6-氨基己酸(6-aminocaproic acid)；2-氨基庚酸(2-aminoheptanoic acid)；2-氨基异丁酸；3-氨基异丁酸；2-氨基庚二酸；2，4-二氨基丁酸；锁链素(desmosine)；2，2′-二氨基庚二酸(2，2′-diaminopimelic acid)；2，3-二氨基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；羟基赖氨酸；别羟基赖氨酸(allo-hydroxylysine)；3-羟基脯氨酸；4-羟基脯氨酸；异锁链素；别异亮氨酸；N-甲基甘氨酸(肌氨酸)(sarcosine)；N-甲基异亮氨酸；N-甲基缬氨酸；正缬氨酸；正亮氨酸；以及鸟氨酸。

代表性的衍生氨基酸包括，例如其中游离的氨基基团已经衍生形成胺盐酸盐(amine hydrochlorides)、对甲苯磺酰基基团(p-toluene sulfonylgroups)、卞氧羰基基团(carbobenzoxy groups)、叔丁氧羟基基团、氯乙酰基基团或甲酰基基团的那些分子。游离的羧基可以衍生形成盐类、甲基或乙基酯类或其它类型的酯类或肼类。游离的羟基可以衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以衍生形成N-亚氨-苄基组氨酸(N-im-benzylhistidine)。

该质体转运肽一般是与待转运进质体的多肽进行N端融合。在此认识到另外的氨基酸残基可以是该质体转运肽的N端。该质体转运肽一般是在定位到质体上时从感兴趣的多肽上切下。剪切的位置在植物的物种之间可以略微变化。

在本发明的转运肽包括来自Cyanophora铁氧还蛋白-NADP⁺-氧化还原酶的转运肽、具体地该转运肽来自Cyanophora pardoxa铁氧还蛋白-NADP⁺-氧化还原酶，更具体地在SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列。本发明还包含本发明的肽的生物学活性的变异体。此类变异体应该保有将可运作地连接的多肽转运进入细胞质体中的能力。优选地，该变异体具有与天然分子至少相同的活性。将多肽转运进入质体中的能力可以通过本领域中的方法来测量。例如，编码该转运肽的核苷酸序列可以连接至报告基因如氯霉素乙酰转移酶(CAT)和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)，并且被引入到植物中。在转化的植物的亚细胞部分中的CAT和GUS活性的分析指示该转运肽是否能够将这些报告蛋白靶向至这些质体。参见例如Silva-Filho et al.(1997)J BiolChem 272：15264-15269and US Patent Application No.20080168580。

合适的生物学活性的变异体可以是片段和衍生物。通过“片段”一词是指仅由完整的转运肽序列和结构的一部分组成的肽，并且可以是氨基酸的C端缺失或N端缺失、或者在C-和N-端都缺失。通过“衍生物”一词是指转运肽或多肽片段的任何适当的修饰，涵盖氨基酸残基中任何改变，只要保持转运活性。例如，而不受限制，可以使用蓝色小体转运肽上无变化的苯丙氨酸残基来识别蓝色小体转运肽序列；然而，该残基可以转变成另一种氨基酸以产生衍生物，该衍生物在转基因高等植物中也起作用来将异源蛋白靶向至叶绿体。

肽的变异体通常将具有至少70％、优选至少80％、更优选约90％至95％或更多、约96％、约97％、并且最优选约98％、约99％或更多的与参比肽分子的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。变异体可以相差少至5、4、3、2、或甚至1个氨基酸残基。用于测定序列之间的同一性的方法在本领域中是熟知的。参见，例如ALIGN程序(Dayhoff(1978)in Atlas of Protein Sequenceand Structure 5：Suppl.3)(华盛顿，全国生物医学研究基金会)以及WisconsinSequence Analysis Package，Version 8(自Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin可得的)中的程序，例如GAP程序。出于这两种序列的最佳比对的目的，该变异体的氨基酸序列的连续区段(contiguous segment)相对参比分子的氨基酸序列可以具有另外的氨基酸残基或缺失的氨基酸残基。用于与参比氨基酸序列比较的连续区段将包括至少二十(20)个连续核苷酸，并且可以是约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约15、约20、约25、约30、约40或更多个核苷酸。可以通过分配空位罚分来对增大的序列同一性(这与该变异体的氨基酸序列中包括空位相关联)进行校正。序列比对的方法在本领域中是熟知的。

当考虑氨基酸序列同一性的百分数时，由于保守的氨基酸替换，一些氨基酸残基的位置可以不同，这并不影响蛋白质功能的特性。在这些情况下，可以将百分比序列同一性向上调整以解释保守替换的氨基酸中的相似性。这样的调整在本领域中是熟知的。参见，例如Meyers and Miller(1988)Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17。

例如，优选地，可以进行保守的氨基酸替换。“非必需的”氨基酸残基是可以被改变而不会改变生物活性的残基，而“必需的”氨基酸残基是生物活性所要求的。“保守的氨基酸替换”是其中用具有相似侧链的氨基酸残基替换该氨基酸残基的替换。

本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。参见，例如Sambrook J.，and Russell，D.W.(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)以及Innis，et al.(1990)PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，NY)。

本发明的肽可以经受不同的改变、替换、插入、以及缺失，其中此类改变在其使用中提供了某些优点。因此，术语“肽”涵盖了各种形式的肽衍生物中的任何，包括例如酰胺类、与蛋白的偶联物、环肽类、聚合肽类、保守替换的变异体类、类似物类、片段类、化学修饰的肽类、以及肽模拟物类。在本发明的实践中可以使用具有所希望的转运特征的任何肽。

通过“转运”、“靶向”或“转移”一词是指本发明的转运肽能够将在细胞的核中表达的多肽转运、转移或运送进细胞质体中，例如(而不限于)叶绿体中。在一些实施方案中，本发明的转运肽能够将100％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％的可运作地连接的多肽转运进入质体中。

“被分离”是指“通过人工”从其天然状态被改变；即如果它在自然界中发生，则它已经被改变从其原始环境取出，或两者并举。例如，在活的动物中以其天然状态而天然存在天然发生的多核苷酸或者多肽是未“被分离的”，但是按照在此采用的术语，从其天然状态的共存物质中分离出的同一多核苷酸或多肽则是“被分离的”。例如，就多核苷酸而言，术语被分离的是指它从其天然发生在其中的染色体和细胞中被分离出。假如将序列天然从它在其中发生的染色体和细胞中分离出但是将其插入它并不在其中天然发生的遗传背景、染色体、或细胞中，则该序列也是被分离的。

本发明的一个方面涉及包括编码转运肽或其生物学活性部分的核苷酸序列的分离的核酸分子。如在此使用的，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。这种核酸分子可以是单链的或双链的，但优选是双链DNA。

本发明还涵盖了核酸分子，它们是这些编码转运肽的核苷酸序列的片段。通过“片段”一词是指编码转运肽的核苷酸序列的一部分。作为转运肽核苷酸序列的片段的核酸分子包括至少约15、约20、约50、约75、约100、约125、约150、约175、约180、约185、约190、约195个连续核苷酸。通过“连续的”(contiguous)核苷酸一词是指彼此直接相邻的核苷酸残基。

本领域技术人员将进一步理解可以通过突变向本发明的核苷酸序列中引入改变，由此导致编码的转运肽的氨基酸序列上的改变，而不改变转运。因此，通过向在此公开的相应的核苷酸序列中引入一种或多种核苷酸取代、添加、或缺失可以产生不同的被分离的核酸分子，使得一种或多种氨基酸置换、添加或缺失被引入所编码的肽中。通过标准技术可以引入突变，如定向诱变和PCR介导的诱变。本发明也可以涵盖此类变异体核苷酸序列。

本发明的组合物可以用来从其它生物体中识别并且分离出相应的转运肽。在方法中，该序列可以用于杂交测试中来寻找与本发明的序列具有基本的同源性的序列。如在此使用的，术语“杂交”用于指多核苷酸链的互补的配对(包括以上讨论的部分互补的)。杂交和杂交强度(即多核苷酸链之间的关联强度)受本领域中熟知的许多因素的影响，这些因素包括：多核苷酸链之间的互补程度；受诸如盐浓度这样的条件影响的相关的条件的严格性；形成的杂交体的解链温度(Tm)；其它组分的存在；杂交链的摩尔浓度；以及，多核苷酸链的G:C含量。

因此，本发明涵盖能够将多肽转运进入质体中并且在严格条件下杂交到在此公开的序列上的分离的序列、或者其片段。此类序列将与所公开的这个或这些序列是至少约40％到50％同源的，约60％、65％、或70％同源的，甚至至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源的。即，序列的序列同一性可能在如下范围，共享至少约40％到50％，约60％、65％、或70％，甚至至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

如在此使用的，“Tm”和“解链温度”是可互换的术语，是双链多核苷酸分子总数的50％离解成单链的温度。用于计算多核苷酸的Tm的方程式在本领域中是熟知的。例如，可以通过以下方程式来计算Tm：Tm＝69.3+0.41×(G+C)％-650/L，其中L是探针的核苷酸长度。杂合多核苷酸的Tm也可以使用源自1M盐中的杂交测试的公式来估算、并且常用于计算PCR引物的Tm：[(A+T的数目)×2℃+(G+C的数目)×4℃.]，参见例如Newton et al.(1997)PCR 2nd Ed.(Springer-Verlag，New York)。本领域中存在其它更复杂的计算，它们将结构的连同序列的特性考虑在内用于Tm的计算。所计算的Tm仅是估算；最适温度常以经验为主进行确定。

典型地，严格的条件是这些：其中盐浓度小于约1.5M Na离子、典型地在pH 7.0至8.3下约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)温度为至少30℃而对于长探针(例如，大于50个核苷酸)至少约60℃。通过添加去稳定剂(例如甲酰胺)也可以达到严格的条件。示例性的低严格条件包括用30％至35％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液中在37℃下杂交，并且在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M枸橼酸钠(trisodium citrate))中在50至55℃下洗涤。示例性的中严格条件包括在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交，并且在0.5X至1X SSC中在55至60℃下洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交，并且在0.1XSSC在60至65℃下洗涤。可任选地，洗涤缓冲液可以包括约0.1％至约1％的SDS。杂交的持续时间一般小于约24小时、通常是约4至约12小时。洗涤时间的持续时间将是至少足以达到平衡的时间长度。

还可以通过PCR反应来识别相应的序列。参见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。还参见Innis et al.，eds.(1990)PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis and Gelfand，eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；以及Innis and Gelfand，eds.(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，NewYork)。本发明的引物可以使用本领域中已知的技术来制备，包括但不限于：适当的序列的克隆和消化以及直接的化学合成。

可以用来制备本发明的引物的化学合成方法包括但不限于：Narang etal.，Methods in Enzymology，68：90(1979)描述的磷酸三酯法、Brown et al.，Methods in Enzymology，68：109(1979)描述的磷酸二酯法、Beaucage et al.，Tetrahedron Letters，22：1859(1981)公开的二乙基氨基磷酸酯法以及美国专利号4,458,066中描述的固体支撑法。在此也考虑使用自动寡核苷酸合成仪来制备本发明的合成的寡核苷酸引物。另外，若希望的话，可以使用本领域中已知的并描述在下面的技术来对这些引物进行标记。

植物表达盒

如所讨论的，与感兴趣的多肽可操作连接的本发明的质体转运肽将所连接的多肽转运进入质体中。因此，当组装进DNA构建体中并且用来转化植物时，该转运肽在表达后将感兴趣的多肽引导进入所转化的植物细胞、植物以及种子中的质体。因此，本发明的这些组合物还包括用于在感兴趣的植物细胞的质体中转化并且表达并且积聚感兴趣的多肽的核酸序列。这些核酸序列可能存在于DNA构建体或表达盒中。如此处使用的“表达盒”是指能够在适当的宿主细胞中指引特定核苷酸序列的表达的核酸分子，包含与感兴趣核苷酸序列(即，编码感兴趣的多肽的核苷酸序列)(它可运作地与终止信号相关连)可操作连接的启动子。它还典型地包括用于核苷酸序列的适当翻译所要求的序列。包含这种感兴趣的核苷酸序列的表达盒可能是嵌合体的，意味着它的至少组分对于它的至少其它组分是异源的。该表达盒也可以是天然发生的但已经是以可用于异源表达的重组体形式获得的表达盒。然而，典型地，该表达盒对于宿主是异源的，即，该表达盒的特殊DNA序列不天然发生于该宿主细胞内，并且必须已通过转化事件而被引入该宿主细胞或该宿主细胞的前体中。在该表达盒中核苷酸序列的表达可能处于组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，该启动子只有在该宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激时才引发转录。另外，该启动子对于特别的组织或器官或发育阶段也可以是特异性的。

本发明涵盖了具有表达盒的植物的转化，这些表达盒能够在植物细胞的质体中引导感兴趣的多肽的表达和积聚。该表达盒将在转录的5′-3′方向上包括转录和翻译的引发区(即，启动子)、编码质体转运肽的多核苷酸、以及编码感兴趣的多肽的多核苷酸。该表达盒可以任选地包括在植物中起作用的转录和翻译终止区(即终止区)。

除了对该质体转运肽进行编码的多核苷酸序列之外，该构建体可以进一步包括另外的调节元件来协助感兴趣的多肽的转录、翻译、或转运。该表达构建体的调节序列与感兴趣的多核苷酸可操作连接。通过“可操作连接”一词是指在调节元件与第二序列之间的功能性连接，其中该调节元件引发和/或介导了与第二序列相对的DNA序列的转录、翻译、或易位。总体上，可运作地连接意味着被连接的核苷酸序列是连续的。这些调节元件包括对于将细胞质合成的蛋白靶向至该植物细胞的质体的有用的启动子、增强子、以及信号序列。在一个实施方案中，该构建体在转录的5′到3′的方向上包括一个转录和翻译的引发区(即，启动子)、编码质体转运肽的多核苷酸、以及编码感兴趣的多肽的多核苷酸。

在本发明的实践中可以使用任何能够在感兴趣的植物中驱动表达的启动子。该启动子可以是天然的或类似的或外来的或与该植物宿主是异源的。当在此用来提及核酸序列(例如，DNA或RNA序列)或基因时，术语“异源的”和“外源的”是指源自对于特定的宿主细胞是外来的来源、或者如果源自相同的来源是自其原始形式被修饰的序列。因此，宿主细胞中的异源基因包括对于该特定宿主细胞是内源性的但是已经通过例如使用DNA改组而修饰的基因。这些术语还包括天然发生的DNA序列的非天然发生的多拷贝。因此，这些术语是指DNA区段，它是外来的或与该细胞异源的或与该细胞同源的但是处于该宿主细胞核酸的位置中，其中通常找不到该元件。表达了外源DNA区段以产生外源性多肽。

“同源的”核酸(如DNA)序列是与它被引入其中的宿主细胞自然地相关联的核酸(例如DNA或RNA)序列。

有待包括的启动子的选择取决于几个因素，包括但不限于：效率、可选择性、诱导性、希望的表达水平、以及细胞-或组织-优先的表达。对于本领域的技术人员而言，通过适当地选择并且相对于该序列来定位启动子以及其它的调节区而调整该序列的表达是常规的事务。

一些适当的启动子仅仅或者主要在某些细胞类型中启动转录。因此，如在此所用的，细胞类型-或组织-优先的启动子是优选在靶组织中驱动表达、但也可以在其它细胞类型或组织中导致某种表达的启动子。用于在植物基因组DNA中识别并表征启动子区的方法包括例如以下文献中描述的那些：Jordano，et al.，Plant Cell，1：855-866(1989)；Bustos，et al.，Plant Cell，1：839-854(1989)；Green，et al.，EMBO J.7，4035-4044(1988)；Meier，et al.，Plant Cell，3，309-316(1991)；以及Zhang，et al.，Plant Physiology 110：1069-1079(1996)。

为了驱动绿色组织(如叶和茎)中的转录而在光合组织中活跃的启动子是本发明特别感兴趣的。最适合的是仅仅或主要在此类组织中驱动表达的启动子。该启动子可以遍及该植物一致地(constitutively)、或对于绿色组织差异性地、或对于其中发生表达的绿色组织的发育阶段差异性地、或响应外部刺激来提供表达。

此类启动子的实施例包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子，如来自北美落叶松(美洲落叶松)的RbcS启动子、松树cab6启动子(Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35：773-778)、来自小麦的Cab-1基因启动子(Fejes etal.(1990)Plant Mol.Biol.15：921-932)、来自菠菜的CAB-1启动子(Lubberstedtet al.(1994)Plant Physiol.104：997-1006)、来自稻的cab1R启动子(Luan et al.(1992)Plant Cell 4：971-981)、来自玉米的丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)启动子(Matsuoka et al.(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90：9586-9590)、烟草Lhcb1*2启动子(Cerdan et al.(1997)Plant Mol.Biol.33：245-255)、拟南芥SUC2蔗糖-H+共输送体(symporter)启动子(Truemit et al.(1995)Planta 196：564-570)、以及来自菠菜的类囊体膜蛋白质启动子psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS)。在美国专利申请号2007/0006346中描述了在茎、叶和绿色组织中驱动转录的其它启动子，通过引用将该申请以其全部内容结合在此。

Hudspeth&Grula(Plant Molec Biol 12：579-589(1989))已经描述了编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。使用标准分子生物技术，用于这种基因的启动子可以用来在转基因植物中以绿色组织-特定的方式驱动任何基因的表达。

在本发明的其它一些实施方案中，诱导型启动子可能是令人希望的。诱导型启动子驱动响应外部刺激(如化学试剂或环境刺激)的转录。例如，诱导型启动子可以响应激素类(如赤霉酸或乙烯)、或响应光或干旱提供转录。

可以得到许多种转录终止子用于表达盒中。这些负责在该转基因及其正确的mRNA聚腺苷化之外的转录的终止。该终止区可以是与该转录引发区天然在一起的、可以于感兴趣的可运作地连接的DNA序列天然在一起、可以与该植物宿主天然在一起、或者可以是源自另一种来源(即，外来的或与该启动子、该感兴趣的DNA序列、该植物宿主、或它们的任何组合是异源的)。适当的转录终止子是已知在植物中发挥作用的那些，并且包括CAMV35S终止子、tml终止子、胭脂碱合成酶终止子以及豌豆rbcS E9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物中使用。此外，可以使用基因的天然转录终止子。

在某些实施方案中，该表达盒将包括选择性标记基因用于选择转化的细胞。利用选择性标记基因来选择转化的细胞或组织。

已经发现众多序列增强了从转录单元中的基因表达并且这些序列可以与本发明的基因结合使用来增大它们在转基因植物中的表达。

已经显示不同的内含子序列增强了特别是在单子叶植物的细胞中的表达。例如，已经发现玉米Adhl基因的内含子当引入玉米细胞中时显著增强了在其同源启动子下野生型基因的表达。已经发现内含子1是特别有效的并且增强了在与氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中的表达(Callis et al.，Genes Develop.1：1183-1200(1987))。在同一个实验体系中，来自玉米青铜色1基因的内含子在增强表达方面具有相似的效果。常规地已经将内含子序列加入植物转化载体中，典型地在未翻译的前导序列中。

也已知许多源自病毒的未翻译的前导序列增强了表达，并且这些在双子叶植物的细胞中是特别有效的。确切地说，已经显示来自烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)、以及苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列在增强表达方面是有效的(例如，Gallie et al.Nucl.Acids Res.15：8693-8711(1987)；Skuzeski et al.Plant Molec.Biol.15：65-79(1990))。本领域中已知的其它前导序列包括但不限于：细小核糖核酸病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Encephalomyocarditis 5′noncodingregion)(Elroy-Stein，O.，Fuerst，T.R.，and Moss，B.PNAS USA 86：6126-6130(1989))；马铃薯Y病毒属前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Allison et al.，1986)；MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)；病毒学154：9-20；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列(Macejak，D.G，andSamow，P.，Nature 353：90-94(1991))；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的未翻译的前导序列(AMV RNA 4)(Jobling，S.A.，and Gehrke，L.，Nature325：622-625(1987))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie，D.R.et al.，Molecular Biology ofRNA，pages 237-256(1989))；以及玉米萎黄病斑点病毒前导序列(Maize Chlorotic Mottle Virus leader)(MCMV)(Lommel，S.A.et al.，Virology 81：382-385(1991)。还参见Della-Cioppa et al.，Plant Physiology84：965-968(1987)。

如所指出的，质体转运肽可运作地连接至有待转运计入该质体的多肽上。用于感兴趣的性状的多肽包括主要有益于种子公司、栽培者、或谷物处理器的农学性状，例如，除草剂抗性、病毒抗性、细菌性病原体抗性、昆虫抗性、线虫抗性、以及真菌抗性。参见例如美国专利号5,569,823、5,304,730、5,495,071、6,329,504、以及6,337,431。感兴趣的性状还可以是提高植物活力或产量(包括允许植物在不同的温度、土壤条件以及日光和沉淀水平下生长的性状)的性状、或是允许识别展现了感兴趣性状的植物的性状(例如，选择性标记基因、种皮颜色等)。有益于产生具有所希望的次要性状的植物的过多基因在本领域中是可得到的。

感兴趣的抗除草剂的基因包括编码乙酰乳酸合成酶(ALS)的前体(参见例如美国专利号5,013,659)、突变的乙酰乳酸合成酶、3-烯醇丙酮酸莽草酸-5-磷酸合成酶(EPSP合成酶)(参见例如美国专利号4,971,908和6,225,114)、修饰发生在质体中的生理学过程(包括光合作用)的酶类、脂肪酸、氨基酸、油、类胡萝卜素、萜类、以及淀粉等等的那些。其它感兴趣的基因包括但不限于编码玉米黄素环氧酶、胆碱单氧合酶、亚铁螯合酶、ω-3脂肪酸去饱和酶、谷氨酰胺合成酶、淀粉修饰酶、必需氨基酸、维生素原A、激素类、Bt毒素蛋白类等等的那些。用于此类多肽的核苷酸序列在本领域中是可得的。

植物

在本发明中有用的植物包括对于至少编码感兴趣的质体靶向的多肽的多核苷酸是转基因的植物。此类植物将包括编码转运肽的多核苷酸，该转运肽与编码感兴趣的多肽的多核苷酸可运作地连接。本领域的普通技术人员将认识到感兴趣的多肽序列将与一种或多种感兴趣的次级性状相关联或促成这些性状。这些多肽是细胞质地表达的、并靶向到质体上。

所选择的植物的类型取决于多种因素，包括例如：收获的植物原料的下游使用、植物物种对转化的适应性、以及植物将要生长、收割、和/或加工的所处条件。普通技术人员将进一步认识到用于选择用于本发明适当的植物种类的另外的因素包括：高产量潜力、良好的茎(stalk)强度、对特殊病的抵抗力、耐旱性、快速干燥以及足以允许储存和输送至市场而具有最小损失的谷物质量。

进一步考虑到本发明的构建体可以被引入具有改进的对于具体的下游使用是适合的或最佳的特性的植物种类中。在本发明中有用的植物包括但不限于：单子叶和双子叶植物，特别是作物植物，如玉米、大豆、小麦、稻子、芸苔及类似物。感兴趣的植物种类的实施例包括但不限于：玉米(玉蜀黍)(Zea mays)、芸苔属(例如，芜青甘蓝、芜青、芥菜)(Brassica sp.(e.g.，B.napus，B.rapa，B.juncea))，特别是作为种子油来源的有用的那些芸苔物种，紫花苜蓿(紫苜蓿)(alfalfa(Medicago sativa))、稻(亚洲栽培稻)(Oryzasativa)、黑麦(黑麦)(Secale cereale)、高粱(高梁、Sorghum vulgare)(Sorghumbicolor，Sorghum vulgate)、粟(例如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(稷)(proso millet(Panicum miliaceum))、小米(梁)(foxtail millet(Setaria italica))、龙爪稷(穇))(finger millet(Eleusine coracana))、向日葵(向日葵)(Helianthusannuus)、红花(红花)(safflower(Carthamus tinctorius))、小麦(普通小麦)(Triticum aestivum)、大豆(Glycine may)、烟草(烟草)(Nicotiana tabacum)、马铃薯(阳芋)(Solanum tuberosum)、棉花(海岛棉，陆地梯)(Gossypiumbarbadense，Gossypium hirsutum)、甘薯(番薯)(Ipomoea batatus)、木薯(木薯)(Manihot esculenta)、咖啡(咖啡.)(Coffea spp.)、椰子(椰子)(Cocos nucifera)、菠萝(风梨)(Ananas comosus)、柑桔树(柑桔)(citrus trees(Citrus spp.))、可可(可可)(Theobroma cacao)、茶(茶)(Camellia sinensis)、香蕉(香蕉.)(Musaspp.)、鳄梨(鳄梨)(Persea americana)、无花果(无花果)(Ficus casica)、番石榴(番石榴)(Psidium guajava)、芒果(芒果)(Mangifera indica)、橄榄(油橄榄)(Olea europaea)、番木瓜(番木瓜)(Carica papaya)、腰果树(腰果)(Anacardiumoccidentale)，澳洲坚果(澳洲坚果)(Macadamia integrifolia)、杏almond(甜扁桃)(Prunus amygdalus)、甜菜(甜菜)(Beta vulgaris)、甘蔗(甘蔗)(Saccharumspp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物、和松柏类植物(conifers)。

蔬菜包括番茄(蕃茄)(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如，莴苣)(e.g.，Lactuca sativa)、菜豆(菜豆)(Phaseolus vulgaris)、扁白豆(大菜豆)lima beans(Phaseolus limensis)、豌豆(香豌豆)(Lathyrus spp.)、以及香瓜属的成员例如黄瓜(黄瓜)(C.sativus)、罗马甜瓜(歹马甜瓜)(C.cantalupensis)、以及香甜瓜(甜瓜)musk melon(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(杜鹃花)(Phododendronspp.)、八仙花(八仙花)(Macrophylla hydrangea)、木槿(木槿)(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(玫瑰)(Rosa spp.)、郁金香(郁金香)(Tulipa spp.)、水仙花(水仙)daffodils(Narcissus spp.)、喇叭花(碧冬茄)petunias(Petunia hybrida)、康乃馨(麝香石竹)carnation(Dianthus caryophyllus)、猩猩木(一品红)poinsettia(Euphorbia pulcherrima)、以及菊花。

感兴趣的植物包括花椰菜(甘蓝)(Brassica oleracea)、朝鲜蓟(菜敬蓟)(Cynara scolvmus)、以及红花(红花属例如红花)(Carthamus，e.g.tinctorius)；水果如苹果(苹果属，如苹果)(Malus，e.g.domesticus)、香蕉(芭蕉属，如小果野蕉)(Musa，e.g.acuminata)、浆果(如无核小葡萄干，茶子属，例如红醋栗)(such as the currant，Ribes，e.g.rubrum)、樱桃(如甜樱桃，李属，例如欧洲甜樱桃)(such as the sweet cherry，Prunus，e.g.avium)、黄瓜(黄瓜属，例如黄瓜)(Cucumis，e.g.sativus)、葡萄(葡萄属，例如葡萄)(Vitis，e.g.vinifera)、柠檬(黎檬)(Citrus limon)、甜瓜(甜瓜)(Cucumis melo)、坚果(如胡桃，胡桃属，例如胡桃；花生，落花生)(such as the walnut，Juglans，e.g.regia；peanut，Arachis hypoaeae)、橙(柑桔属，例如柚)(Citrus，e.g.maxima)、桃(李属，例如桃)(Prunus，e.g.persica)、梨(梨属，例如西洋梨)(Pyra，e.g.communis)、胡椒(茄属，例如珊瑚樱)(Solanum，e.g.capsicum)、李子(李属，例如欧洲李)(Prunus，e.g.domestica)、草莓(草霉属，例如麝香草莓)(Fragaria，e.g.moschata)、番茄(番茄属，例如番茄)(Lycopersicon，e.g.esculentum)；叶类，如苜蓿(苜蓿属，例如紫苜蓿)(Medicago，e.g.sativa)、甘蔗(甘蔗属)(Saccharum)、卷心菜(如甘蓝)(such as Brassica oleracea)、苣荬菜(菊苣属，例如菊苣)endive(Cichoreum，e.g.endivia)、韭(葱属，例如韭葱)(Allium，e.g.porrum)、莴苣(莴苣属，例如莴苣)(Lactuca，e.g.sativa)、菠菜(菠菜属，例如菠菜)(Spinacia e.g.oleraceae)、烟草(烟草属，例如烟草)(Nicotiana，e.g.tabacum)；根类，如竹芋(竹芋属，例如竹芋)(Maranta，e.g.arundinacea)、甜菜(甜菜属，例如甜菜)(Beta，e.g.vulgaris)、胡萝卜(胡萝卜属，例如野胡萝卜)(Daucus，e.g.carota)、木薯(木薯属，例如木薯)(Manihot，e.g.esculenta)、芜菁(芸苔属，例如芫青)(Brassica，e.g.rapa)、萝卜(萝卜属，例如萝卜)(Raphanus，e.g.sativus)、山药(薯蓣属，例如甘功薯)(Dioscorea，e.g.esculenta)、番薯(番薯)(Ipomoea batatas)；种子类，如菜豆(菜豆属，例如菜豆)(Phaseolus，e.g.vulgaris)、豌豆(豌豆属，例如豌豆)(Pisum，e.g.sativum)、大豆(大豆属，例如大豆)(Glycine，e.g.max)、小麦(小麦属，例如普通小麦)(Triticum，e.g.aestivum)、大麦(大麦属，例如大麦)(Hordeum，e.g.vulgare)、玉米(玉蜀黍属，例如玉蜀黍)(Zea，e.g.mays)、稻(稻属，例如亚洲栽培稻)(Oryza，e.g.sativa)；草类，如芒草(芒属，例如奇岗)和柳枝稷(黍属，例如柳枝稷)(such asMiscanthus grass(Miscanthus，e.g.，giganteus)and switchgrass(Panicum，e.g.virgatum))；树类，如白杨(杨属，例如欧洲山杨)(Populus，e.g.tremula)、松树(松属)(Pinus)；灌木类，如棉花(例如，陆地棉)(e.g.，Gossypium hirsutum)；以及块茎类，如大头菜(芸苔属，例如甘蓝)(Brassica，e.g.oleraceae)、马铃薯(茄属，例如阳芋)(Solanum，e.g.tuberosum)、及类似物。

植物转化

在此描述的表达构建体能以几种本领域公认的方式引入植物细胞中。术语“引入”在多核苷酸(例如，感兴趣的核苷酸构建体)的背景下是意指以这样一种方式将多核苷酸呈现在植物中即该多核苷酸得到了到植物细胞的内部的途径。在有待引入多于一个多核苷酸时，这些多核苷酸可以作为单个核苷酸构建体的一部分、或作为分离的核苷酸构建体来组装，并且可以位于相同的或不同的转化载体上。因此，这些多核苷酸可以在单一的转化事件中、在多个分离的转化事件中、或者例如在植物中作为育种试验计划的一部分被引入感兴趣的宿主细胞中。本发明的方法并不依赖于用于将一个或多个多核苷酸引入植物中的具体的方法，只要这个或这些多核苷酸得到了到该植物的至少一个细胞的内部的途径。用于将多核苷酸引入植物中的方法在本领域中是已知的，包括但不限于：瞬时转化法、稳定转化法、以及病毒介导法。

“瞬时转化”在多核苷酸的背景下意指多核苷酸被引入植物中而并不整合到该植物的基因组中。

在被引入植物中的多核苷酸的背景下，通过“稳定引入”或“被稳定地引入”一词是指被引入的多核苷酸被稳定地整合到该植物基因组中，并且因此该植物用该多核苷酸被稳定地转化。

“稳定的转化”或“被稳定地转化”是意指被引入植物中的多核苷酸(例如，在此描述的核苷酸构建体)整合到该植物的基因组中并且能够被其子代、更具体地说是被多个连续世代的子代遗传。

可用于植物转化的众多转化载体对于植物转化领域的普通技术人员来说是已知的，并且与本发明相关的基因可以与任何这样的载体结合使用。载体的选择将取决于优选的转化技术以及用于转化的目标物种。对于某些目标物种，不同的抗生素或除草剂选择标记物可能是优选的。在转化中常规使用的选择标记物包括nptll基因，它赋予了对卡那霉素及相关抗生素的抗性(Messing&Vierra.Gene 19：259-268(1982)；Bevan et al.，Nature304：184-187(1983))；bar基因，它赋予了对于除草剂草丁膦的抗性(White etal.，Nucl.Acids Res 18：1062(1990)；Spencer et al.Theor.Appl.Genet 79：625-631(1990))；hph基因，它赋予了对抗生素潮霉素的抗性(Blochinger&Diggelmann，Mol Cell Biol 4：2929-2931)；以及dhfr基因，它赋予了对于氨甲蝶呤的抗性(Bourouis et al.，EMBO J.2(7)：1099-1104(1983))；EPSPS基因，它赋予了对草甘膦的抗性(美国专利号4,940,935和5,188,642)；以及甘露糖-6-磷酸异构酶基因，它提供了使甘露糖代谢的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629)。

用于植物再生的方法在本领域中也是熟知的。例如，已经将Ti质粒载体用于外源DNA的递送连同直接DNA摄入、脂质体、电穿孔、微注射、以及微弹。此外，可以将来自农杆菌属的细菌用来转化植物细胞。以下是对用于转化双子叶和单子叶植物两者的代表性技术、连同代表性的质体转化技术的说明。

可得到使用根瘤土壤杆菌用于转化的许多载体。这些典型地携带至少一个T-DNA边界序列，并且包括如pBIN19的载体(Bevan，Nucl.Acids Res.(1984))。对于在农杆菌转化中有用的载体的构建，参见例如美国专利申请公开文件号2006/0260011，该公开通过引用结合在此。

不使用根瘤土壤杆菌的转化回避了在选择的转化载体中对T-DNA序列的要求，并且因此除了例如以上描述的含有T-DNA序列的载体之外，可以使用缺乏这些序列的载体。不依赖于农杆菌的转化技术包括通过粒子轰击、原生质体摄入(例如，PEG和电穿孔)以及微注射的转化。载体的选择主要取决于对被转化的物种的优先选择。对于在农杆菌转化中有用的载体的构建，参见例如美国专利申请公开文件号20060260011，该公开通过引用结合在此。

对于本发明的核苷酸序列在植物质体中的表达，使用了质体转化载体pPH143(WO 97/32011，实施例36)。将该核苷酸插入pPH143中由此替换PROTOX编码序列。然后将这种载体用于质体转化并且选择对大观霉素具有抗性的转化体。可替代地，将该核苷酸序列插入pPH143中这样它替换了aadH基因。在此情况下，选择转化体用于抗PROTOX抑制剂。

对于双子叶植物的转化技术在本领域中是普遍已知的并且包括基于农杆菌的技术以及不要求农杆菌的技术。非农杆菌技术涉及通过原生质体或细胞直接摄入外源性遗传物质。这可以通过PEG或电穿孔介导的摄入、粒子轰击介导的递送、或微注射来实现。这些技术的实施例描述由Paszkowskiet al.，EMBO J.3：2717-2722(1984)；Potrykus et al.，Mol.Gen.Genet.199：169-177(1985)；Reich et al.，Biotechnology 4：1001-1004(1986)；以及Klein etal.，Nature 327：70-73(1987)进行了描述。在各自情况下，使用本领域中已知的标准技术将这些转化的细胞再生为整个植物。

农杆菌介导的转化因为其高转化效率以及具有许多不同物种的宽实用性而是用于双子叶植物的转化的优选技术。农杆菌转化典型地涉及将携带感兴趣的外源DNA(例如，pCIB200或pCIB2001)的二元载体转移到合适的农杆菌菌株，这可能依赖于由宿主农杆菌菌株或者在共同存在的Ti质体上或染色体地携带的补充的vir基因(例如，用于pCIB200和pCIB2001的菌株CIB542(Uknes et al.Plant Cell 5：159-169(1993)))。将重组二元载体转移到农杆菌是通过三亲本交配方法实现的，即使用携带该重组二元载体的大肠杆菌、辅助大肠杆菌的菌株，该辅助菌株携带质粒如pRK2013以及能够将该重组二元载体移动到目标农杆菌菌株的菌株。可替代地，该重组二元载体可以通过DNA转化转移到农杆菌(Hofgen&Willmitzer，Nucl.Acids Res.16：9877(1988))。

通过重组农杆菌转化目标植物物种通常涉及该农杆菌与来自该植物的外植体的共培养，并且遵循本领域中熟知的科学试验计划。将转化的组织在存在于二元质粒T-DNA边界之间的携带有抗生素或除草剂抗性标记物的可选择的培养基上再生。

另一种用基因转化植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上注入惰性的或生物学活性的粒子。美国专利号4,945,050、5,036,006、以及5,100,792(都是授予Sanford等人)中公开了这种技术。总体上，这种方法涉及在细胞上在有效穿透该细胞的外表面并提供合并在其内部中的条件下注入惰性的或生物学活性的粒子。当使用惰性粒子时，可以通过用含所希望的基因的载体包被这些粒子来将该载体引入细胞中。可替代地，目标细胞可以被该载体环绕使得该载体通过唤醒该粒子而被带入该细胞中。也可以将生物学活性的粒子(例如，干酵母细胞、干细菌或噬菌体，各自包含被寻求引入的DNA)注入植物细胞组织中。

多数单子叶植物物种的转化现在也已经变成了常规操作。优选的技术包括使用PEG或电穿透技术的直接基因转移进入原生质体、以及粒子轰击进入愈伤组织。用单一DNA种类或多种DNA种类(即，共转化)可以进行转化，并且这两种技术都适合用于本发明中。共转化可能具有避免完全型载体构建以及生成对于感兴趣的基因与选择性标记具有非伴性基因座的转基因植物的优点，能够在随后的世代中去除该选择性标记(如果这被认为是令人希望的)。然而，使用共转化的一个缺点是小于100％的频率，使用该频率分离的NDA种类整合到基因组中的(Schocher et al.Biotechnology 4：1093-1096(1986))。

专利申请EP 0292435、EP 0392225、以及WO 93/07278描述了从原种近交系玉米用于制备愈伤组织和原生质体、使用PEG或电穿孔转化原生质体、以及从转化的原生质体再生玉米植物的技术。Gordon-Kamm等人(Plant Cell 2：603-618(1990))以及Fromm等人(Biotechnology 8：833-839(1990))已经发表了使用粒子轰击用于转化源于A188的玉米系的技术。此外，WO 93/07278和Koziel等人(Biotechnology11：194-200(1993))描述了通过粒子轰击用于转化原种近交系玉米的技术。这种技术利用了从授粉14-15天之后的玉米穗切除的1.5-2.5mm长未成熟玉米胚以及用于轰击的一台PDS-1000He Biolistics装置。

稻的转化也可以通过利用原生质体或粒子轰击的直接基因转移技术来进行。原生质体介导的转化已经对Japonica型和Indica型进行了描述(Zhanget al.Plant Cell Rep 7：379-384(1988)；Shimamoto et al.Nature 338：274-277(1989)；Datta et al.Biotechnology 8：736-740(1990))。两种类型也是使用粒子轰击常规地可转化的(Christou et al.Biotechnology 9：957-962(1991))。此外，WO 93/21335描述了通过电穿孔用于转化稻的技术。

专利申请EP 0332581描述了用于产生、转化以及再生早熟禾亚科(Pooideae protoplasts)原生质体的技术。这些技术允许转化鸭茅属(Dactylis)和小麦。此外，Vasil等人(Biotechnology 10：667-674(1992))使用粒子轰击进入C型长期可再生愈伤组织的细胞，以及还有Vasil等人(Biotechnology 11：1553-1558(1993))和Weeks等人(Plant Physiol.102：1077-1084(1993))使用离子轰击未成熟胚和未成熟胚来源的愈伤组织，已经描述了小麦转化。然而，用于小麦转化的优选的技术涉及通过离子轰击未成熟胚的小麦转化并且在基因送递之前包括高蔗糖或高麦芽糖步骤。在轰击之前，将任意数目的胚(长度为0.75-1mm)装在具有3％蔗糖(Murashiga&Skoog，Physiologia Plantarum 15：473-497(1962))以及3mg/l 2，4-D的MS培养基上用于诱导体细胞坯，这允许在黑暗中进行。在选择进行轰击的那天，将胚从诱导培养基中取出并且放置在渗压剂上(即，以希望的浓度(典型地是15％)添加有蔗糖或麦芽糖的诱导培养基)。允许这些胚质壁分离2-3小时并然后进行轰击。每个靶板二十个胚是典型的，尽管不是关键性的。使用标准方法使适当的携带基因的质粒(如pCIB3064或pSOG35)沉淀在微米大小的金颗粒上。使用约1000psi的爆破压力，使用标准的80目网筛，用DuPont

氦装置射击每个板的胚。在轰击之后，将这些胚放回到黑暗中恢复约24小时(仍在渗压剂上)。24小时后，从渗压剂上取出这些胚并将其放回到诱导培养基上，在这里在再生之前它们停留约1个月。约1个月之后，将具有发育中的胚胎发生的愈伤组织的胚外植体转移到再生培养基中(MS+1mg/升NAA、5mg/升GA)，该再生培养基进一步包含适当的选择剂(在pCIB3064的情况下是10mg/l的basta而在pSOG35的情况下是2mg/l的甲氨蝶呤)。约1个月之后，将发育的嫩枝转移到更大的被称为“GA7”的灭菌容器中，这些容器包含半浓度的MS、2％的蔗糖、以及相同浓度的选择剂。

也已经描述了使用农杆菌转化单子叶植物。参见WO 94/00977和美国专利号5,591，616、以及Negrotto et al.，Plant Cell Reports 19：798-803(2000)。

例如，稻(亚洲栽培稻)可以用于产生转基因植物。可以使用不同的稻培养品种(Hiei et al.，1994，Plant Journal 6：271-282；Dong et al.，1996，MolecularBreeding 2：267-276；Hiei et al.，1997，Plant Molecular Biology，35：205-218)。还有，以下描述的各种培养基组分可以在量上变化或者被替换。开始胚胎发生的响应和/或通过在MS-CIM培养基(MS基础盐，4.3g/升；维生素B5(200X)，5ml/升；蔗糖，30g/升；脯氨酸，500mg/升；谷氨酰胺，500mg/升；酪蛋白水解物，300mg/升；2，4-D(1mg/ml)，2ml/升；用1N KOH调节pH到5.8；植物凝胶，3g/升)上培养由成熟的胚建立培养物。将或者在培养物响应的初始阶段成熟的胚或已建立的培养系进行接种并且与含有希望的载体构建的根瘤土壤杆菌菌株LBA4404(农杆菌)进行共同培养。在28℃下将来自甘油储备的农杆菌在固体YPC培养基上(100mg/L大观霉素以及任何其它适宜的抗生素)培养大约2天。将农杆菌再悬浮在液体MS-CIM培养基中。将该农杆菌培养物稀释至OD600为0.2-0.3，并且添加乙酰丁香酮直到最终浓度为200uM。在将该溶液与这些稻子培养物混合之前添加乙酰丁香酮以诱导农杆菌用于DNA转移到植物细胞中。为了接种，将这些植物培养物浸入细菌悬浮液中。去除该液体的细菌悬浮物并将接种过的培养物放在共培养培养基上并且在22℃下培养2天。然后将这些培养物转移到具有替卡西林(400mg/升)来抑制农杆菌的生长的MS-CIM培养基中。对于使用PME选择性标记基因的构建体(Reed et al.，In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant37：127-132)，在7天后将培养物转移到含有甘露糖作为碳水化合物来源(具有2％的甘露糖、300mg/升的替卡西林的MS)的选择培养基中，并且在黑暗中培育3-4周。然后将抗性的菌落转移到再生诱导培养基(不具有2，4-D、0.5mg/升的IAA、1mg/升的玉米素、200mg/升的特美汀(timentin)、2％的甘露糖以及3％的山梨糖醇的MS)中并且在黑暗中生长14天。然后将增殖中的菌落转移到另一轮的再生诱导培养基中并且移到光照生长室中。将再生的嫩枝转移到带有GA7-1培养基(不含激素以及2％的山梨糖醇的MS)的GA7容器中持续2周并且然后在它们足够大并具有足够的根时将其移到温室中。将植物移植到温室中的土壤中(T0代)生长至成熟期，并收获T1种子。

通过用本发明的核酸序列的转化得到的植物可以是任何各种各样的植物物种，包括单子叶植物和双子叶植物的那些；然而，本发明的方法中所使用的植物优先选自以上列出的农学上重要的目标作物的列举。本发明的基因的表达与对于产量和质量重要的其它特征结合可以通过育种并入植物系中。育种方法和技术在本领域是已知的。参见例如，Welsh J.R.，Fundamentals of Plant Genetics and Breeding，John Wiley&Sons，NY(1981)；Crop Breeding，Wood D.R.(Ed.)American Society of Agronomy Madison，Wis.(1983)；Mayo O.，The Theory of Plant Breeding，Second Edition，ClarendonPress，Oxford(1987)；Singh，D.P.，Breeding for Resistance to Diseases andInsect Pests，Springer-Verlag，NY(1986)；以及Wricke and Weber，QuantitativeGenetics and Selection Plant Breeding，Walter de Gruyter and Co.，Berlin(1986)。

对于质体的转化，将烟草“Xanthienc”的种子是在T琼脂培养基上在1″圆形排列中每个板发芽7个，并且在播种12-14天后用1um钨粒子进行轰击(M10，Biorad，Hercules，Calif.)，这些粒子包被有基本上如所描述的来自pPH143和pPH145的DNA(Svab，Z.and Maliga，P.(1993)PNAS 90，913-917)。将轰击过的幼苗在T培养基上培育2天，在此之后切除叶子并远轴侧向上地放在亮光下(350-500umol光子/m2/s)放在含500μg/ml的盐酸壮观霉素(Sigma，St.Louis，Mo.)的RMOP培养基(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P. and Maliga，P.(1990)PNAS 87，8526-8530)的板上。将轰击后三到八周出现在褪色的叶子下面出现的抗性嫩枝亚克隆到相同的选择性培养基上，允许其形成愈伤组织、并将次级嫩枝分离出并进行亚克隆。通过DNA印迹的标准技术(Sambrook et al.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor)对在独立的亚克隆中完全分离转化的质体基因组拷贝(同质性)进行评估。BamHI/EcoRI-消化的总的细胞的DNA(Mettler，I.J.(1987)Plant Mol Biol Reporter 5，346349)在1％的氨基丁三醇硼酸(TBE)琼脂糖胶上进行分离，将其转移到尼龙膜(Amersham)并用sup.32P-标记的随机引物DNA序列进行探测，该引物序列对应于来自含rps7/12质体转运序列的一部分的pC8的0.7kb BamHI/HindIII DNA片段。使同质的嫩枝在含大观霉素的MS/IB培养基上无菌地生根(McBride，K.E.et al.(1994)PNAS 91，7301-7305)并转移到温室中。

工程化进入以上描述的转基因的种子以及植物中的遗传特性通过有性生殖或营养生长被传递，并且可以因此被维持并在子代植物中繁殖。一般而言，维持和繁殖使用了已知的为满足特定的目的(如耕种、播种或收割)而开发的农业方法。

可以进一步在植物育种中使用根据本发明的转基因植物和种子的有利的遗传特性。取决于所希望的特性，可以采取不同的育种措施。相关的技术在本领域中是已知的并且包括但不限于：杂交、近交、回交育种、多系育种、品种共混、种间杂交、非整倍体技术，等等。因此，根据本发明的转基因的种子和植物可以用于改进的植物株系的育种，这些株系(例如)提高了常规方法如除草剂或杀虫剂处理的效率、或这因为它们的经过修饰的遗传特性而允许人们免除所述方法。

所有的公布、专利和专利申请都通过引用结合在此。尽管在前面的说明书中本发明已经就其某些优选的实施方案进行了描述，并且为说明的目的已经陈述了许多细节，但是本领域的普通技术人员将清楚的是，本发明允许加入另外的实施方案并且在此描述的某些细节可以进行相当大改变而不背离本发明的基本原则。

以下实施例是作为说明而并不作为限制而提供的。

实验

在此使用的标准的重组DNA和分子克隆技术在本领域中是熟知的并且由E.F.Fritsch and T.Maniatis，在Molecular Cloning：A Laboratory manual，Cold Spring Harbor laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)中；并且由T.J.Silhavy，M.L.Berman，and L.W.Enquist，在Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1984)中；并且由Ausubel，F.M.et al.，在Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)出版的Current Protocols in Molecular Biology中进行了描述。

实施例1：识别来自Glaucocystophyte的叶绿体转运肽序列的生物化学方法

基本上按照Bayer and Schenk，在Curr Genet 16：311-313(1989)中的描述来生长Glaucocystophyte(Glaucocystophyte)。将在24℃以及4％的二氧化碳下用连续光照使培养物生长。将蓝色小体细胞器分离(基本上按照Bayerand Schenk，Curr Genet 16：311-313(1989)所描述的)，这是通过首先通过离心收集这些细胞接着通过渗压休克进行细胞器分离(Zook and Schenk，Endocyt Cell Res 3：203-211(1986))。进一步用DNasI处理分离的蓝色小体并且随后在含1mM氯化镁以及1mM氯化钙的磷酸盐缓冲盐水中进行洗涤。

将通过用溶菌酶(每微升的以上磷酸盐缓冲盐水溶液0.5微克)溶解纯化过的蓝色小体而回收蓝色小体蛋白。通过在水中脱盐并使用标准技术浓缩产生的溶菌产物来从溶菌产物(lysate)中纯化蓝色小体蛋白。

对这些蓝色小体蛋白进行末端测序以得到这些蛋白质的氨基端部分序列。将该蛋白序列与包含基因组DNA序列的数据库进行比较以识别在编码该蓝色小体靶蛋白的核DNA中的候补开放阅读框。通过比较所分离的蛋白的氨基端序列与该核基因的编码区从而识别作为蓝色小体转运肽序列的氨基端的延伸而得到该蓝色小体转运肽序列。

实施例2：植物转化

2.A.玉米转化：

未成熟的玉米胚的转化基本上如在Negrotto et al.，2000，Plant CellReports 19：798-803(2000)中所说明进行。可以将那里描述的不同的培养基组分替换掉。

使包含该植物转化质粒的农杆菌菌株LBA4404(Invitrogen)在YEP(酵母提取物(5g/L)、蛋白胨(10g/L)、NaCl(5g/L)、15g/l琼脂，pH 6.8)固体培养基上、在28℃生长2至4天。将大约0.8X 10⁹个农杆菌悬浮于补充有100μM乙酰丁香酮(As)的LS-inf培养基中(LSAs培养基)(Negrotto等人，，PlantCell Rep 19：798-803(2000))。在这个培养基中对细菌预诱导30至60分钟。

将来自玉米系A188或其它适宜的玉米基因型的未成熟胚从8至12天大的穗中切除放到液体LS-inf+100μM As(LSAs)中。将胚涡流搅拌5秒并用新鲜的感染培养基漂洗一次。除去感染培养基并然后添加农杆菌溶液，并将胚涡流搅拌30秒并允许其与细菌一起沉降5分钟。然后，将这些胚盾片侧向上转移至LSA培养基中并在黑暗中培养两至三天。随后，将每佩特里(petri)培养皿20和25之间的胚转移至补充有头孢噻肟(250mg/l)以及硝酸银(1.6mg/l)(Negrotto et al.，Plant Cell Rep 19：798-803(2000))的LSDc培养基中并在黑暗中在28℃下培养10天。

将产生胚胎发生的愈伤组织的未成熟胚转移至LSD1M0.5S培养基(具有0.5mg/l 2，4-D代替麦草畏(Dicamba)的LSDc，10g/l甘露糖、5g/l蔗糖，并且没有硝酸银)中。在大约3周采用的传代培养的步骤在这种培养基上对培养物进行选择，持续大约6周。将残存的愈伤组织或者转移到LSD1M0.5S培养基中以大量生产或转移到Reg1培养基(如Negrotto et al.，Plant Cell Rep19：798-803(2000)中所描述的)中。在光照中(16小时光照/8小时黑暗控制)进行培养之后，然后将绿色组织转移至没有生长调节剂的Reg2培养基(如Negrotto et al.，Plant Cell Rep 19：798-803(2000)中所描述的)，并孵育大约1至2周。将这些小植株转移至包含Reg3培养基(如Negrotto et al.2000中描述的)的Magenta GA-7盒(Magenta Corp，Chicago Ill.)中并使其在光照中生长。将对表达盒的任何组分是PCR阳性的植物转移至土壤中并使其在温室中生长。

通过+/-PCR分析或通过Taqman拷贝数分析测定了该表达盒的任意组分的存在。

2.B.烟草转化：

使用包括含表达盒的转化载体的根瘤土壤杆菌菌株LBA4404来感染烟草c.v.Petit Havana(SR1)的叶外植体。最初，将这些烟草叶切成1-2mm宽的薄片，暴露于农杆菌中5分钟，并放在无菌纸上以吸掉过剩的液体并然后在共培养培养基上放3天。将这些叶薄片移至含有适当的选择剂的选择/再生培养基。将抗选择剂的嫩枝移植到土壤中。使这些植物自交或与来自非转基因的SR1植物的花粉进行异型杂交以生产种子。通过+/-PCR分析或通过Taqman拷贝数分析测定了该表达盒的任意组分的存在。

实施例3：玉米中的Cyanophora paradoxa的FNR叶绿体转运肽序列以及cZsGreen

产生克隆载体，由此该FNR转运肽框内融合到由夜香树黄化曲叶病毒(Cestrum Yellow LeafCurl viral)启动子以及NOS基因终止子驱动表达的报告基因(cZsGreen)上。将这个表达盒连接进植物转化二元载体并且随后用于发生农杆菌介导的转基因玉米事件(基本上如实施例2中所述)。

T0-玉米事件的蛋白印迹分析发现报道基因被表达并且该报道基因蛋白被剪切至成熟的大小。随后，从来自转基因的和非转基因的玉米植物两者中的绿叶组织中分离叶绿体。荧光显微法(λ＝496nm激发，λ＝506nm发射)揭示了在从转基因事件中而不是从负对照的非转基因的叶绿体中分离的叶绿体中的自身荧光证实了被表达的报道基因蛋白靶向至该叶绿体。

实施例4：玉米和烟草中的Cyanophora paradoxa FNR叶绿体转运肽序列以及葡聚糖内切酶

4.A：表达盒构建

为单子叶植物和双子叶植物两者优化的葡聚糖内切酶设计了能够引导葡聚糖内切酶在转基因植物中的表达的表达载体。烟草表达载体使用了构成型启动子夜香树黄化曲叶病毒(CYLCV)启动子来驱动双子叶植物优化的葡聚糖内切酶基因的表达。该葡聚糖内切酶的质体靶向是通过来自融合到N端的Cyanophora paradoxa的铁氧还蛋白-NADP+还原酶(FNR)的转运肽(SEQID NO：2)(FEBS Letters 1996：381，153-155)。

使用玉米PepC启动子(The Plant Journal 1994：6(3)，311-319)来驱动单子叶植物优化的的葡聚糖内切酶的玉米叶特异性表达。质体靶向的构建体包含如实施例3中所述的FNR转运肽。将所有的表达盒亚克隆到二元载体中用于使用本领域中已知的重组DNA技术转化进烟草和玉米中。

4.B：转基因玉米植物的表征

从来自非转基因和转基因的植物的大约100-500mg的叶组织或100mg的由玉米种子产生的粉中得到了蛋白质提取物。将叶片材料放在含小钢球的96个深孔板中并在干冰上预冷却。使用一台Geno/Grinder(SPEC/CertiPrep，Metuchen，New Jersey)将样品研磨成细粉末。通过倒入约10-20颗种子并使用一台KLECO研磨器(Gracia Machine Company，Visalia，California)研磨成细粉末制备了粉状样品。

用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及蛋白印迹分析的样品的制备是通过以下步骤实现的，即在250-500μl的蛋白印迹提取缓冲液(WEB＝12.5mM硼酸钠，pH10；2％BME；以及1％SDS)或测验缓冲液中提取50-100mg叶片物质，如以下说明的，在室温下持续约30分钟，接着在13,000rpm下离心5分钟。

通过将100μl of WEB样品转移到eppendorf管中并且加入25μl4XBioRad LDS或经修饰的BioRad加样缓冲液(4X BioRad LDS∶BME比率为2∶1)来进行SDS-PAGE。将样品在70℃下加热10分钟然后立即放在冰上5分钟。简单旋转样品，并且转移回冰上。使样品提取物(5-10μl)在使用MOPS缓冲液的BioRad 4-12％Bis/Tris蛋白凝胶(18孔)上跑胶。

通过将SDS-PAGE凝胶转移到硝酸纤维素膜上(使用冷硬的Nupage转移缓冲液(Invitrogen)，在100伏特下持续30分钟)进行免疫印迹分析。使用丽春红染色(Sigma)使转移到印迹上的总蛋白可见。在丽春红染色之后，将该膜在封闭缓冲液中孵化30分钟(在具有3％的奶粉的TBST洗涤缓冲液(30mMTris-HCL；pH 7.5；100mM NaCl；以及0.05％Tween 20))，然后在TBST中洗涤三次，每次5分钟。在带有3％奶的TBST洗涤缓冲液中以1ug/ml添加多克隆的山羊或兔子的一抗，并将该印迹孵化2小时至过夜。在过夜孵化之后，将该印迹在TBST洗涤缓冲液中洗涤三次，每次5分钟。将二抗(Rabbit-AP或Goat-AP)稀释到1∶8000(在TBST中)并添加到印迹中持续30分钟。在二抗中孵化之后，再次将该印迹洗涤三次，每次5分钟。通过添加Moss BCIP/NBT-碱性磷酸酶底物来实现免疫的反应条带的显像。在BCIP/NBT底物中孵化之后将这些印迹在水中彻底漂洗并允许风干。

将约15天大的T0转基因植物的大约100-150mg的新鲜叶片组织提取到2至10ml的以下缓冲液之一中：(A)100mM乙酸钠；0.02％Tween；0.02％叠氮化钠，pH 4.75；1％PVP以及完全蛋白酶抑制剂混合片剂(Roche)；或者(B)100mM乙酸钠；0.02％Tween；以及0.02％叠氮化钠，pH 4.75；以及完全蛋白酶抑制剂混合片剂(Roche)；或者(C)1mM乙酸钠；0.02％Tween-20；0.02％NaN₃。用于从叶片中提取蛋白质的可替代的缓冲液在本领域中是普遍已知的。将样品放在台式离心机上30-60分钟然后在3000rpm下离心10分钟。对于新鲜的叶片样品，通过产品说明书中指出的Pierce BCA科学试验方案来测量总提取蛋白质的量。使用以下底物中的进行葡聚糖内切酶活性测定：pNP-乳糖苷、甲基伞形酮基-乳糖苷(MUL)、羧甲基纤维素(CMC)、燕麦-μ葡聚糖、磷酸处理过的纤维素(PASC)、微晶粉末纤维素(Avicel)、或其它可得到的底物。可以使用其它底物用于遵循之前发布的试验方案测量纤维素酶的活性(Methods in Enzymology，Vol 160)。

以下描述了用于从叶片组织中提取并测定转基因地表达的葡聚糖内切酶的方法。这种方法以μmol/min/mg蛋白为单位以在羧甲基纤维素(0.5％)上在40℃、pH 4.75上生产的释放的葡萄糖的方式测量了葡聚糖内切酶。在这种测定中使用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶(GOPOD)化学相对于标准曲线来测量葡萄糖。这种基于葡萄糖的测定方法是比色测定，其中GOPOD与葡萄糖在40℃下反应生成从亮到暗的粉红色生色团。这种测定由4个基本步骤组成：(1)研磨/碾磨转基因组织，(2)称重磨碎的组织样品，(3)在乙酸钠缓冲液中提取酶，以及(4)对酶的活性/蛋白质定量进行测定。

对于表达葡聚糖内切酶的转基因玉米植物的酶数据以及蛋白质印迹数据概述在表2中。表3概述了如以上所描述而得到的转基因烟草数据。表2和3中生成的酶数据是如上所述使用CMC作为底物完成的。

表2：表达与来自Cyanophora paradoxa的FNR叶绿体转运肽序列可操作连接的葡聚糖内切酶的T0转基因玉米植物

n.d.＝未测出

表3：对于与来自Cyanophora paradoxa的FNR叶绿体转运肽序列可操作连接的葡聚糖内切酶的T0转基因烟草葡聚糖内切酶活性数据

转基因烟草系        Avg，nmol/min/mgTSP            STDev

T001A               12.91                          0.33

T004A               14.45                          5.47

T007A               5.54                           0.24

T011A               5.42                           0.73

T013B               19.80                          0.72

T017A               3.82                           0.09

T018A               8.61                           0.54

T019A阴性对照       -1.01                          1.82

T021A               0.54                           4.50

T023B               11.83                          0.61

非转基因            0.78                           0.28

4.C叶绿体靶向

将使用上述转基因玉米和烟草植物使用叶绿体分离试剂盒(Sigma)遵循厂商说明书分离叶绿体。用肽酶、嗜热菌蛋白酶对分离的叶绿体进行处理，以除去结合在分离的叶绿体的外膜上的蛋白质。使用标准技术从经处理的叶绿体中分离总蛋白，并且基本上按照实施例4中所述的测量葡聚糖内切酶的活性。

实施例5：源自Cyanophora paradoxa的另外的叶绿体转运肽序列

将在转基因的玉米植物中评估另外的蓝色小体转运肽。将蓝色小体转运肽Rieske1(SEQ ID NO：3的转运肽)、Rieske2(玉米优化的编码序列SEQ IDNO：4以及转运肽序列SEQ ID NO：5)以及来自Cyanophora paradoxa的细胞色素c6(玉米优化的编码序列SEQ ID NO：6以及转运肽序列SEQ ID NO：7)克隆到报道基因的5’端使得该蓝色小体转运肽是在报道基因的编码的多肽的氨基端。该报道基因可以是选择性标记、GUS、CzsGreen或AmCyan(SEQ IDNO：8)。将SEQ ID NOs：6和8的多核苷酸序列克隆到选择性标记、GUS、CzsGreen或AmCyan的5’端使得该转运肽是在该编码的多肽的氨基端。该报道基因可以是选择性标记、GUS、CzsGreen或AmCyan。

将以上描述的编码序列克隆到表达盒中使得该编码序列与夜香树(cestrum)启动子可操作连接。将该表达盒克隆进含有用于植物转化作为选择性标记的PPO基因的转化载体中。使用标准的转化技术生成转基因的玉米或烟草植物。通过设计用来检测该表达盒中的任一种组分的Taqman分析来确认转基因事件。

表4：Cyanophora paradoxa的蓝色小体转运序列

使用蛋白质印迹(免疫印迹法)和荧光两者评估这些转运肽。如下一段中描述的制备来自转基因植物叶片组织的全部植物提取物并在8-16％氨基丁三醇-甘氨酸凝胶上跑胶。将该凝胶印迹并然后用该报道基因的抗体进行探测(即AmCyan的抗体)。预期两条带对应于该蛋白的经过处理(不带有转运肽的AmCyan)和未经处理(转运肽和AmCyan)的形式。由此，使用叶绿体分离试剂盒(Sigma)通过从该转基因叶片组织中分离叶绿体来制备叶绿体制剂。将经纯化的叶绿体溶解并将得到的溶解产物在8-16％的氨基丁三醇-甘氨酸凝胶上跑胶、印迹并用该报道基因的抗体(如抗-AmCyan的抗体)进行探测。我们期望找到带，其大小对应于该蛋白的经处理的形式，并且没有带会与该蛋白的未经处理的形式相对应。

通过将叶片组织的3个穿孔物放在微量离心管中并且添加100μl的Laemmli缓冲液来实现全部提取物的蛋白质(western)印迹法。然后使用研棒将穿孔物磨碎并且然后使制剂在100℃沸腾10分钟。然后在13000rpm将该样品进行离心(Eppendorf Centrifuge 5417R)并将10ml的上清液上样凝胶(8-16％的氨基丁三醇甘氨酸，Invitrogen)上。在150V下跑该凝胶60分钟。然后通过(350mA，60分钟)电泳将分离的蛋白转移到PVDF膜上。在25℃下在5％的奶中封闭该膜1小时。将封闭的膜放在PBST(带有0.1％吐温20的PBS)中1∶5000的一抗溶液中并在25℃下在振荡器上放2小时。从第一溶液中取出该膜、在PBST(在25℃下在振荡器上洗涤5、10分钟)中洗涤并放在第二抗体溶液(1∶5000稀释，在PBST中)中在25℃下在振荡器上持续2小时。洗涤该膜(在25℃下在振荡器上5、10分钟洗涤)并在BCIP中显像。用自来水终止该BCIP反应并允许将显像的印迹在室温下干燥。

当使用AmCyan作为报道基因时，我们可以使用共聚焦显微镜(Zeiss，LSM 710)来分析与该细胞中的内源性的自身荧光相关的报告蛋白(AmCyan)。对于我们的实验，我们期望当该转运肽如预期的进行时AmCyan荧光和叶绿素自身荧光共同集中(co-localize)在该细胞中。

本说明书中提到的所有公开物以及专利申请都表明了本发明涉及的领域内的普遍技术人员的水平。所有公开物和专利申请都通过引用以相同程度结合在此，如同各个单独的公开物或专利申请都专门地并且个别地表明要通过引用进行结合。

尽管已经为了清楚理解的目的通过解释和实施例详细地描述了以上发明，显而易见的是在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和变更。

Claims (28)

1.分离的核酸，该核酸包括编码来自Glaucocystophytes的质体转运肽的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列与编码异源多肽的第二核苷酸序列可操作连接。

2.如权利要求1所述的分离的核酸，其中该Glaucocystophytes是Cyanophora 。

3.如权利要求1所述的分离的核酸，其中该Glaucocystophytes是Cyanophora paradoxa。

4.如权利要求1所述的分离的核酸，其中该质体转运肽选自下组：SEQ ID NOs：2、3、5和7。

5.转基因植物，包括编码来自Glaucocystophytes的质体转运肽第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列与编码异源多肽的第二核苷酸序列可操作连接，其中所述异源多肽靶向叶绿体。

6.如权利要求5所述的转基因植物，其中该Glaucocystophytes是Cyanophora。

7.如权利要求5所述的转基因植物，其中该Glaucocystophytes是Cyanophora paradoxa。

8.如权利要求6所述的转基因植物，其中该植物是单子叶植物。

9.如权利要求7所述的转基因植物，其中该植物是双子叶植物。

10.如权利要求5-9任何一项所述的转基因植物，其中该质体转运肽编码选自下组的多肽：SEQ ID NOs：2、3、5和7。

11.如权利要求8所述的转基因植物，其中该单子叶植物是玉米或甘蔗植物。

12.如权利要求9所述的转基因植物，其中该双子叶植物是大豆或甜菜植物。

13.用于在植物中稳定地表达异源多肽的方法，所述方法包括向所述植物中引入DNA构建体，该构建体包括编码来自Glaucocystophyte的质体转运肽的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列与编码所述异源多肽的第二核苷酸序列可操作连接。

14.如权利要求13所述的方法，其中该Glaucocystophyte是Cyanophora。

15.如权利要求13所述的方法，其中该Glaucocystophyte是Cyanophora paradoxa。

16.如权利要求14所述的方法，其中该植物是单子叶植物。

17.如权利要求15所述的方法，其中该植物是双子叶植物。

18.如权利要求13-17中任一项所述的方法，其中该质体转运肽编码选自下组的多肽：SEQ ID NOs：2、3、5和7。

19.如权利要求16所述的方法，其中该单子叶植物是玉米或甘蔗植物。

20.如权利要求17所述的方法，其中该双子叶植物是大豆或甜菜植物。

21.分离的多肽，包括来自Glaucocystophyte的、与异源多肽可操作连接的质体转运肽。

22.如权利要求21所述的分离的多肽，其中该Glaucocystophyte是Cyanophora。

23.如权利要求21所述的分离的多肽，其中该Glaucocystophyte是Cyanophora paradoxa。

24.如权利要求21-23中任一项所述的分离的多肽，其中该植物是单子叶植物。

25.如权利要求21-23中任一项所述的分离的多肽，其中该植物是双子叶植物。

26.如权利要求21-23中任一项所述的分离的多肽，其中该质体转运序列编码选自下组的多肽：SEQ ID NOs：2、3、5和7。

27.如权利要求24所述的分离的多肽，其中该单子叶植物是玉米或甘蔗植物。

28.如权利要求25所述的分离的多肽，其中该双子叶植物是大豆或甜菜(sugarbeet)植物。