CN102304544B - 一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法，其步骤：A．大麦茎尖培养及载体构建：1）选取大麦颖果，去除稃片，剥取成熟胚，盾片向下放置在萌发培养基上萌发；2）从中间载体pMBL-3及和绿色荧光蛋白基因GFP用酶切和PCR方法获得玉米泛素启动子及相关序列；B、利用农杆菌介导大麦茎尖遗传转化，步骤：1）大麦茎尖的获取；2）茎尖的浸染；3）茎尖和农杆菌GV3101共培养培养基：取出经农杆菌浸染的茎尖，在无菌滤纸上吸干表层菌液；4）茎尖的恢复培养基；5）茎尖的筛选培养基；6）再生植株的春化和栽培，得到候选的转化植株。方法易行，操作简便，周期短、效率高，程序简单，操作方便，结果可靠。

Description

一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及根癌农杆菌介导的以大麦茎尖为材料的培育转基因植株的方法。本发明涉及大麦茎尖材料制备及处理方法，与根癌农杆菌结合用于大麦栽培品种的遗传转化。

背景技术

大麦是世界上最重要的作物之一，其种植面积和产量均是列于小麦、玉米和水稻之后、位于第四的重要禾谷类作物，主要用作食粮、饲料、啤酒工业原料以及医药工业原料和保健食品。

Tingay等于1997年首次以农杆菌介导法成功转化大麦幼胚，获得转基因大麦植株，随后农杆菌介导的转化方法逐步发展成为大麦遗传转化的重要方法(Tingay S，McElroy D，Kalla R，Fieg S，Wang M，Thornton S &Brettell R.Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation.J Plant，1997，11：1369-1376；McCormac A C，Wu H，Bao M，Wang Y，Xu R，Elliott M C & Chen D F.The use of visual marker genes ascell-specific reporters of Agrobacterium-mediated T-DNA delivery to wheat(Triticum aestivum L.)and Barley(Hordeum vulgare L.).Euphytica，1998，99：17-25；Matthews P R，Wang M B，Waterhouse P M，Thornton S，FiegS J，Gubler F，Jacobsen J V.Marker gene elimination from transgenic barley，using co-transformation withadjacent‘twin T-DNAs’on a standard Agrobacterium transformation vector.Mol Breeding，2001，7：195-202；Murray F，Brettell R，Matthews P，Bishop D，Jacobsen J.Comparison of Agrobacterium-mediated transformationof four barley cultivars using the GFP and GUS reporter genes.Plant Cell Rep，2004，22：397-402；Wu H，McCormac A C，Elliott M C & Chen D F.Agrobacterium-mediated stable transformation of cell suspensioncultures of barley(Hordeum vulgare L.).Plant Cell Tiss.Org.Cult，1998，54：161-171；Trifonova A，Madsen S，Olesen A.Agrobacterium-mediated transgene delivery and integration into barley under a range ofin vitro cultureconditions.Plant Sci，2001，161：871-880；Fang Y D，Akula C，Altpeter F.Agrobacterium-mediated barley(Hordeum vulgare L.)transformation using green fluorescent protein as a visual marker and sequence analysis ofthe T-DNA::barley genomic DNA junctions.J Plant Physiol，2002，159：1131-1138；Travella S，Ross S M，Harden J，Everett C，Snape J W，Harwood W A.A comparison of transgenic barley lines produced by particlebombardment and Agrobacterium-mediated techniques.Plant Cell Rep，2005，23：780-789；Kumlehn J，Serazetdinova L，Hensel G，Becker D，Loerz H.Genetic transformation of barley(Hordeum vulgare L.)viainfection of androgenetic pollen cultures with Agrobacterium tumefaciens.Plant Biotechnol J，2006，4：251-261；Inger

Holme，Henrik Brinch-Pedersen，Mette Lange，Preben Bach Holm.Transformation of differentbarley(Hordeum vulgare L.)cultivars by Agrobacterium tumefaciens infection of in vitro cultured ovules.PlantCell Reports，2008，27，1833-1840等等)。然而，Tingay等采用的方法是先以基因枪轰击大麦愈伤组织，再以农杆菌进行转化。虽然获得了转基因植株，但实验难度大、成本高。同时，在大麦的农杆菌介导转化中，目前存在的突出问题就是以开花后15天左右的幼胚为转化受体，利用模式品种Golden promise用于转化，而以栽培大麦品种开展转化的研究受到限制，转化频率也不高。在实际工作中，由于大麦生长周期长，从播种至幼胚形成需要约150天，田间一年仅能取材一次用于转化，因此，必须改进现有技术体系的缺陷和不足。本发明从最关键的转化受体及其培养转化筛选程序入手，发明了直接以茎尖为受体用于转化，进一步克服了茎尖培养、农杆菌侵染及转基因材料筛选鉴定过程中的关键问题，从而建立一种高效的根癌农杆菌介导的大麦茎尖遗传转化方法。

利用植物茎尖为转化受体，不仅不需要以幼胚为受体时从播种至开花灌浆期的长时间植物栽培管理周期，也不必经过诱导愈伤及分化成苗阶段，转化后可以直接成苗，转化及成苗周期短。茎尖已用于一些双子叶植物遗传转化，包括大豆、棉花、花生、向日葵、葡萄和豌豆，以及部分单子叶植物的转化。在大麦中，以基因枪介导的大麦茎尖转化已经报道(Christou P，McCabe DE，Martinell BJ，SwainWF.Soybean geneticEngineering-commercial production of transgenic plants[J].Trends in Biotechnology，1990，8：145-151；Wang XF，Chi JN，Ma ZY.Advances on genetic transformation of cotton shoot apical meristem via gene-gunbombardment[J].Cotton Science，2006，18(1)：53-57；Brar GS，Cohen BA，Vick CL，Johnson GW.Recovery oftransgenic peanut(Arachis hypogaea L.)plants from elite cultivars utilizing ACCELLw technology[J].The PlantJournal，1994，5：745-753；Burrus M，Molinier J，Himber C，Hunold R，Bronner R，Rousselin P，Hahne G.Agrobacterium-mediated transformation of sunflower(Helianthus annuus L.)shoot apices：transformationpatterns[J].Molecular Breeding，1996，2：329-338；Dutt M，Li ZT，Dhekney SA，Gray DJ.Transgenic plants fromshoot apical meristems of Vitis vinifera L.“Thompson Seedless”via Agrobacterium-mediated transformation[J].Plant Cell Reports，2007，26(12)：2101-2110；Hussey G，Johnson RD，Warren S.Transformation of meristematiccells in the shoot apex of cultured pea shoots by Agrobacterium tumefaciens and A.rhizogenes[J].Protoplasma，1989，148(2)：101-105；Arockiasamy S，Ignacimuthu S.Regeneration of transgenic plants from two indica rice(Oryza sativa L.)cultivars using shoot apex explants[J].Plant Cell Reports，2007，26(10)：1745-1753；Zhang S，Cho MJ，Koprek T，Yun R，Bregitzer P，Lemaux PG.Genetic transformation of commercial cultivars of oat(Avenasativa L.)and barley(Hordeum vulgare L.)using in vitro shoot meristematic cultures derived from germinatedseedlings[J].Plant Cell Reports，1999，18：959-966.)，但农杆菌介导的大麦茎尖转化仍未见报道。与基因枪法获得的转基因植株相比，根癌农杆菌介导的遗传转化具有转基因遗传稳定性高、转基因拷贝数低、减少基因沉默、转基因整合位点边界序列容易鉴定(转基因品种商品化的必要条件)、转化成本低等多种优势。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法，方法易行，操作简便，高效、快速，利用大麦种子直接萌发后的茎尖为受体，在农杆菌介导下，将外源基因转入大麦栽培品种，从而降低了转基因大麦成本，为商品化应用转基因技术培育新品种提供技术。

本发明通过以下技术方案实现：

一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法，其步骤是：

1、大麦茎尖培养及载体构建：

根据大麦种子及其发育特点，前处理种子后用于培养大麦茎尖。

1)选取健康饱满的大麦颖果，去除稃片，用70％(v/v)乙醇浸泡3min，然后用0.1％(w/v)HgCl₂浸泡13～15min，无菌水冲洗3-5次每次1-3min，消毒的种子浸泡在无菌水中、室温(20-25℃)萌动15-17h，剥取成熟胚，盾片向下放置在萌发培养基上萌发。

2)从中间载体pMBL-3(张倩，廖玉才，陈方方，董璇，李和平.大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因的克隆与表达.华中农业大学学报，2006，25(5)：461-464.)及和绿色荧光蛋白基因GFP(Ward W W，Cody C W，Hart R C and Cormier M J.Spectrophotometric identity of the energy-transfer chromophores inRenilla and Aequorea green fluorescent proteins.Photochem.Photobiol.1980，31，611-615；Reichel，C.，Mathur，J.，Eckes，P.，Langenkemper，K.，Koncz，C.，Schell，J.，Reiss，B.，and Maas，C.(1996)Enhanced greenfluorescence by the expression of an Aequorea victoria green fluorescent protein mutant in mono-anddicotyledonous plant cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，5888-5893.)用酶切和PCR方法获得玉米泛素启动子及相关序列，克隆连接到以pUC18(购于大连宝生物公司)为基础的载体上，构建形成了pMBL9植物表达载体。其具体的构建路线见图1。将构建好的植物表达载体转化根癌农杆菌。

2、利用农杆菌介导大麦茎尖遗传转化，它包括以下步骤：

1)、大麦茎尖的获取：

取大麦成熟胚在21-24℃萌发生长3-5天的幼苗，除去幼苗的根、盾片及幼叶，留下4-6mm的茎尖，用针刺伤生长点，置于高渗培养基上处理1-3小时。

2)、茎尖的浸染：

从步骤1)得到大麦茎尖，加入用农杆菌浸染培养基悬浮的根癌农杆菌GV3101菌液，浸染茎尖24-26min，超声波处理14-16s。

3)、茎尖和农杆菌GV3101共培养培养基：

取出经农杆菌浸染的茎尖，在无菌滤纸上吸干表层菌液，于21-24℃共培养1-3天。

4)、茎尖的恢复培养基：

将上述3)中的茎尖转至恢复培养基，于23-27℃下培养6-8天。

5)、茎尖的筛选培养基：

将恢复培养后的茎尖转到筛选培养基上筛选2-4轮，每轮9-11天。

6)、再生植株的春化和栽培：

将筛选获得的阳性苗转至生根培养基上9-11天，再春化处理2周后，移栽到土钵中，于生长室中培养，23-27℃，2000Lux，光照培养至移栽，得到候选的转化植株。

在本发明中，下列培养基是至关重要的，各类培养基组分及其配方如下：

1、萌发培养基(编号：MS1)：

1900mg/L KNO₃，1650mg/L NH₄NO₃，170mg/L KH₂PO₄，370mg/L MgSO₄·7H₂O，440mg/L CaCl₂·2H₂O，27.8mg/L FeSO₄·7H₂O，37.3mg/L Na₂·EDTA，0.83mg/L KI，6.2mg/L H₃BO₃，22.3mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6mg/LZnSO₄·7H₂O，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，1.25mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L CoCl₂·6H₂O，2mg/L甘氨酸，1mg/L V_B1，0.5mg/L V_B6，0.5mg/L V_B5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，6g/L琼脂，pH5.8。

2、高渗培养基(编号：MS2)：

1900mg/L KNO₃，1650mg/L NH₄NO₃，170mg/L KH₂PO₄，370mg/L MgSO₄·7H₂O，440mg/L CaCl₂·2H₂O，27.8mg/L FeSO₄·7H₂O，37.3mg/L Na₂·EDTA，0.83mg/L KI，6.2mg/L H₃BO₃，22.3mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6mg/LZnSO₄·7H₂O，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，1.25mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L CoCl₂·6H₂O，2mg/L甘氨酸，1mg/L V_B1，0.5mg/L V_B6，0.5mg/L V_B5，1g/L水解酪蛋白，0.69g/L L-脯氨酸，0.4mol/L甘露醇+6g/L琼脂粉，pH 5.8。

3、农杆菌浸染培养基(编号：MS3)：

190mg/L KNO₃，165mg/L NH₄NO₃，17mg/L KH₂PO₄，37mg/L MgSO₄·7H₂O，44mg/L CaCl₂·2H₂O，2.78mg/L FeSO₄·7H₂O，3.73mg/L Na₂·EDTA，0.083mg/L KI，0.62mg/L H₃BO₃，2.23mg/L MnSO₄·4H₂O，0.86mg/L ZnSO₄·7H₂O，0.025mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.125mg/L CuSO₄·5H₂O，0.0025mg/L CoCl₂·6H₂O，0.2mg/L甘氨酸，0.1mg/L V_B1，0.05mg/L V_B6，0.05mg/L V_B5，200mg/L L-脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，100mg/L Vc，1.95g/L MES，45g/L麦芽糖，10g/L葡萄糖，40μL/L L-77，0.5g/L谷氨酰胺，pH 5.2。使用时加1‰ 1mol/L乙酰丁香酮，抽滤灭菌。

4、共培养培养基(编号：MS4)：

1900mg/L KNO₃，1650mg/L NH₄NO₃，170mg/L KH₂PO₄，370mg/L MgSO₄·7H₂O，440mg/L CaCl₂·2H₂O，27.8mg/L FeSO₄·7H₂O，37.3mg/L Na₂·EDTA，0.83mg/L KI，6.2mg/L H₃BO₃，22.3mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6mg/LZnSO₄·7H₂O，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，1.25mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L CoCl₂·6H₂O，2mg/L甘氨酸，1mg/L V_B1，0.5mg/L V_B6，0.5mg/L V_B5+0.69g/L L-脯氨酸+1g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH 5.2，使用时加1‰ 1mol/L乙酰丁香酮，抽滤灭菌。

5、恢复培养基(编号：MS5)：

1900mg/L KNO₃，1650mg/L NH₄NO₃，170mg/L KH₂PO₄，370mg/L MgSO₄·7H₂O，440mg/L CaCl₂·2H₂O，27.8mg/L FeSO₄·7H₂O，37.3mg/L Na₂·EDTA，0.83mg/L KI，6.2mg/L H₃BO₃，22.3mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6mg/LZnSO₄·7H₂O，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，1.25mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L CoCl₂·6H₂O，2mg/L甘氨酸，1mg/L V_B1，0.5mg/L V_B6，0.5mg/L V_B5+0.69g/L L-脯氨酸+1g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH 5.8，高压蒸汽灭菌后加入500mg/L头孢霉素。

6、筛选培养基(编号：MS6)：

1900mg/L KNO₃，1650mg/L NH₄NO₃，170mg/L KH₂PO₄，370mg/L MgSO₄·7H₂O，440mg/L CaCl₂·2H₂O，27.8mg/L FeSO₄·7H₂O，37.3mg/L Na₂·EDTA，0.83mg/L KI，6.2mg/L H₃BO₃，22.3mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6mg/LZnSO₄·7H₂O，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，1.25mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L CoCl₂·6H₂O，2mg/L甘氨酸，1mg/L V_B1，0.5mg/L V_B6，0.5mg/L V_B5+0.69g/L L-脯氨酸+1g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH 5.8，高压蒸汽灭菌后加2mg/L PPT和500mg/L头孢霉素。

上述培养基除注明的抽滤灭菌外，其余的高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。

本发明的有益效果是：

本发明以我国生产上广泛推广种植的两个大麦主推品种(鄂大麦9号、鄂大麦32122，来自湖北省农业科学院)为实验材料，在参考已发表的大麦农杆菌转化方法，并结合申请人对大麦发育及根癌农杆菌侵染机理研究结果的基础上获得。迄今已报道的大麦农杆菌介导的转化全部以幼胚为受体，诱导愈伤组织后用于转化，所用的基因型大多采用模式品种Golden Promise。Golden Promise是国外的酿酒大麦品种，目前大麦遗传转化的工作集中在对Golden Promise的研究，但其种植成本高昂，在我国并没有广泛种植。同时，Tingay等(Tingay S，McElroy D，Kalla R，Fieg S，Wang M，Thornton S & Brettell R.Agrobacteriumtumefaciens-mediated barley transformation.J Plant，1997，11：1369-1376；Trifonova A，Madsen S，Olesen A.Agrobacterium-mediated transgene delivery and integration into barley under a range of in vitro culture conditions.Plant Sci，2001，161：871-880；)的经典农杆菌转化方法，以大麦开花灌浆期的幼胚为受体，诱导愈伤组织，再用基因枪轰击为辅助手段轰击愈伤后，以农杆菌转化愈伤，这种方法繁琐，实验周期长，因而实验成本高昂，限制了其应用及推广。本发明克服了现有技术的不足，利用种子萌发4天的幼苗茎尖用于转化，完全避免了大麦种植栽培这个耗时的过程，而且转化后也不需要诱导愈伤，而是直接筛选获得转基因植株。同时，茎尖为受体没有愈伤筛选过程，不同大麦基因型转化效率相当，所以茎尖转化打破了大麦遗传转化基因型的限制，我国不同主推大麦品种均具有较高的转化率。以茎尖为受体的遗传转化方法，与常规方法相比，培养转化受体所需的时间缩短了38倍，转化后的筛选培育时间也缩短了近3倍(见表1)；筛选获得的转基因植株经PCR分析鉴定为阳性，进一步经Southern杂交分析证实，外源基因确已整合到大麦基因组中，并且均为单个拷贝。本发明的方法周期短、效率高，程序简单，操作方便，结果可靠，具有十分广泛的应用价值。

表1本发明转化的大麦品种与文献报道方法转化的模式品种主要技术参数比较

说明：a参考文献：Trifonova A，Madsen S，Olesen A.Agrobacterium-mediated transgene delivery and integrationinto barley under a range of in vitro culture conditions.Plant Sci，2001，161：871-880。

b：本发明分多批次转化，品种鄂大麦32122共转化了710个幼胚，品种鄂大麦9号共转化了680个幼胚。

附图说明

图1为一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法流程图。

图2为一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法中植物表达载体pMBL9物理构建图谱。

图3为一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法中利用农杆菌介导筛选转化方法得到的转化植株。

图中右上角是已结实的单穗。

图4为一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法中T₀代转化植株的PCR结果。

图中标注1至8和10，阳性转基因植株；9，阴性转基因植株；11，未转化对照；12，不含DNA的PCR对照；M，分子量标准。

图5为一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法中T₁代转化植株的Southern杂交结果。

图中标注M为未转化对照鄂大麦32122；1和2为鄂大麦32122的转基因株系；3为鄂大麦9号的转基因株系。

具体实施方式

实施例1：

以大麦茎尖为外植体，农杆菌介导的基因转化(图1)：

1、大麦种子灭菌和萌发：

选取健康饱满的大麦颖果(大麦品种鄂大麦9号、鄂大麦32122来自湖北省农业科学院)，去除稃片，用70％乙醇浸泡3min，然后用0.1％HgCl₂浸泡13～15mm，无菌水冲洗4次，每次2min。消毒的种子浸泡在无菌水中、室温萌动16h，剥取成熟胚，盾片向下放置在MS1培养基(参见《发明内容》部分)上，每皿放置30个成熟胚。

2、茎尖的切取和预处理：

取成熟胚在22℃下萌发生长4d的无菌幼苗，除去根、盾片及幼叶，留下5mm左右的茎尖，用针刺伤生长点。将茎尖在高渗培养基MS2(参见《发明内容》部分)上处理2h。

3、茎尖的浸染：

将经过预培养的茎尖转入农杆菌浸染培养基MS3(参见《发明内容》部分)中，超声波处理15s，置于摇床上振荡(100转/分钟)浸染25分钟。

4、茎尖和农杆菌共培养培养基：

将侵染后的茎尖置于无菌滤纸上稍微吹干，接种至共培养培养基MS4(参见《发明内容》部分)上，在22℃黑暗条件下培养2天；

5、茎尖的恢复培养基：

25℃下暗培养7天；

6、茎尖的的筛选培养基、壮苗春化和移栽：

恢复培养后，挑选恢复良好的茎尖转入含2mg/L的筛选生根培养基MS6(参见《发明内容》部分)上筛选3轮，每轮10d。选取正常生长生根的幼苗于冰箱中春化2周后移栽于温室，转基因植株在温室中正常生长开花结实(见图3)。

实施例2：

含bar基因和GFP基因载体PMBL-9的构建。

1)中间载体pMBL-3用BamHI和BglII双酶切，电泳回收大片段。

2)中间载体PUC18-GFP用BamHI和BglII双酶切，电泳回收710bp GFP片段。

3)将1)中获得的线性化的pMB3载体和2)中获得的GFP片段用T4连接酶连接。

4)将连接产物转化大肠杆菌DH5α并提取质粒。

5)采用HindIII酶切鉴定重组子。电泳检测获得3000bp左右条带，载体PMBL-9构建成功。

实施例3：

对T₀代转化植株的PCR检测：

取0.1g左右的T₀代大麦转基因植株的叶片，在液氮中研磨成粉末，用常规的CTAB法(参考本申请人专利申请号为200610019482.0公开的方法)抽提大麦总DNA。设计一对引物Ubi-P5 primer(正向，5′-CATCTCTGTATATGCATCAG-3′)和Ubi-P6 primer(反向，5′-CGGTAGTTCTACTTCTGTTC-3′进行PCR扩增。在25ul PCR反应液中，含有300ng模板DNA，2.5ul PCR缓冲液，1.5ul 25mM MgCl₂，2ul 1.25mMdNTPs，0.5ul Ubi-P5 primer(10pmol/ul)，0.5ul Ubi-P6 primer(10pmol/ul)，1U Taq聚合酶。PCR反应程序为：95℃预变性4min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，36个循环；72℃延伸10min。琼脂糖凝胶检测PCR产物反应完成后，取18ul PCR产物在1.2％(w/v)琼脂糖凝胶上电泳。凝胶成像系统中紫外灯下照相，根据PCR产物片断判断外源基因的整合情况。共剥取大麦品种鄂大麦9号的茎尖670个，经PCR鉴定，获得PCR阳性植株4株，阳性率为0.59％。取鄂大麦32122茎尖510个，转化后经PCR鉴定，筛选获得PCR阳性植株10株，阳性率为1.96％。发明效果如附图4所示。

实施例4：

对T₁代转化植株的Southern杂交检测：

选取3个PCR鉴定为阳性的T₁代株系，取3-5g左右的T0代大麦转基因植株的叶片，在液氮中研磨成粉末，用常规的CTAB法(参考本申请人专利申请号为200610019482.0公开的方法)抽提大麦总DNA。提取叶片基因组DNA，经SacI酶切、电泳、转膜后，以启动子为杂交探针的Southern杂交结果表明(图5)，在这3个株系中均检测到杂交条带，其中以鄂大麦32122茎尖为受体的2个株系(图5，1和2)，以鄂大麦9号茎尖为受体的1个株系(图5，3)，而未转化的野生型对照(图5，W)没有信号。因此，这些小麦株系的基因组中确实整合了外源基因。这3个株系均分别只有一条杂交信号带，说明转基因它们在基因组中均为单个拷贝。来自鄂大麦32122的2个株系，具有不同的Southern杂交带型，表明它们独立地整合在大麦基因组的不同位点。

Claims (1)

1.一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法，其步骤是：

A、大麦茎尖培养及载体构建：

1）选取大麦颖果，去除稃片，用70%v/v乙醇浸泡3min，然后用0.1%w/vHgCl₂浸泡13～15min，无菌水冲洗3-5次每次1-3min，消毒的种子浸泡在无菌水中、室温萌动15-17h，剥取成熟胚，盾片向下放置在萌发培养基上萌发；

2）a、中间载体pMBL-3用BamHI和BglII双酶切，电泳回收大片段；

b、中间载体PUC18-GFP用BamHI和BglII双酶切，电泳回收710bp GFP片段；

c、将a中获得的线性化的pMB3载体和b中获得的GFP片段用T4连接酶连接；

d、将连接产物转化大肠杆菌DH5α并提取质粒；

e、采用HindIII酶切鉴定重组子，电泳检测获得3000bp条带，得到重组载体PMBL-9，将构建好的重组载体PMBL-9转化根癌农杆菌；

B、利用农杆菌介导大麦茎尖遗传转化，它包括以下步骤：

1）、大麦茎尖的获取：

取大麦成熟胚在21-24℃萌发生长3-5天的幼苗，除去幼苗的根、盾片及幼叶，留下4-6mm的茎尖，用针刺伤生长点，置于高渗培养基上处理1-3小时；

2）、茎尖的浸染：

从步骤1）得到大麦茎尖，加入用农杆菌浸染培养基悬浮的根癌农杆菌GV3101菌液，浸染茎尖24-26min，超声波处理14-16s；

3）、茎尖和农杆菌GV3101共培养培养基：

取出经农杆菌浸染的茎尖，在无菌滤纸上吸干表层菌液，于21-24℃共培养1-3天；

4）、茎尖的恢复培养基：

将步骤3）中的茎尖转至恢复培养基，于23-27℃下培养6-8天；

5）、茎尖的筛选培养基：

将恢复培养后的茎尖转到筛选培养基上筛选2-4轮，每轮9-11天；

6）、再生植株的春化和栽培：

将筛选获得的阳性苗转至生根培养基上9-11天，再春化处理2周后，移栽到土钵中，于生长室中培养，23-27℃，2000Lux，光照培养至移栽，得到候选的转化植株；

所述的萌发培养基：

1900mg/L KNO₃，1650mg/L NH₄NO₃，170mg/L KH₂PO₄，370mg/L MgSO₄·7H₂O，440mg/L CaCl₂·2H₂O，27.8mg/L FeSO₄·7H₂O，37.3mg/L Na₂·EDTA，0.83mg/L KI，6.2mg/L H₃BO₃，22.3mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6mg/LZnSO₄·7H₂O，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，1.25mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L CoCl₂·6H₂O，2mg/L甘氨酸，1mg/L V_B1，0.5mg/L V_B6，0.5mg/L V_B5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，6g/L琼脂，pH5.8；

所述的高渗培养基：

1900mg/L KNO₃，1650mg/L NH₄NO₃，170mg/L KH₂PO₄，370mg/L MgSO₄·7H₂O，440mg/L CaCl₂·2H₂O，27.8mg/L FeSO₄·7H₂O，37.3mg/L Na₂·EDTA，0.83mg/L KI，6.2mg/L H₃BO₃，22.3mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6mg/LZnSO₄·7H₂O，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，1.25mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L CoCl₂·6H₂O，2mg/L甘氨酸，1mg/L V_B1，0.5mg/L V_B6，0.5mg/L V_B5，1g/L水解酪蛋白，0.69g/L L-脯氨酸，0.4mol/L甘露醇+6g/L琼脂粉，pH 5.8；

所述的农杆菌浸染培养基：

190mg/L KNO₃，165mg/L NH₄NO₃，17mg/L KH₂PO₄，37mg/L MgSO₄·7H₂O，44mg/L CaCl₂·2H₂O，2.78mg/L FeSO₄·7H₂O，3.73mg/L Na₂·EDTA，0.083mg/L KI，0.62mg/L H₃BO₃，2.23mg/L MnSO₄·4H₂O，0.86mg/L ZnSO₄·7H₂O，0.025mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.125mg/L CuSO₄·5H₂O，0.0025mg/L CoCl₂·6H₂O，0.2mg/L甘氨酸，0.1mg/L V_B1，0.05mg/L V_B6，0.05mg/L V_B5，200mg/L L-脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，100mg/L Vc，1.95g/L MES，45g/L麦芽糖，10g/L葡萄糖，40μL/L L-77，0.5g/L谷氨酰胺，pH 5.2。使用时加1‰1mol/L乙酰丁香酮，抽滤灭菌；

所述的共培养培养基：

1900mg/L KNO₃，1650mg/L NH₄NO₃，170mg/L KH₂PO₄，370mg/L MgSO₄·7H₂O，440mg/L CaCl₂·2H₂O，27.8mg/L FeSO₄·7H₂O，37.3mg/L Na₂·EDTA，0.83mg/L KI，6.2mg/L H₃BO₃，22.3mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6mg/LZnSO₄·7H₂O，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，1.25mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L CoCl₂·6H₂O，2mg/L甘氨酸，1mg/L V_B1，0.5mg/L V_B6，0.5mg/L V_B5+0.69g/L L-脯氨酸+1g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH 5.2，使用时加1‰1mol/L乙酰丁香酮，抽滤灭菌；

所述的恢复培养基：

1900mg/L KNO₃，1650mg/L NH₄NO₃，170mg/L KH₂PO₄，370mg/L MgSO₄·7H₂O，440mg/L CaCl₂·2H₂O，27.8mg/L FeSO₄·7H₂O，37.3mg/L Na₂·EDTA，0.83mg/L KI，6.2mg/L H₃BO₃，22.3mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6mg/LZnSO₄·7H₂O，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，1.25mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L CoCl₂·6H₂O，2mg/L甘氨酸，1mg/L V_B1，0.5mg/L V_B6，0.5mg/L V_B5+0.69g/L L-脯氨酸+1g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH 5.8，高压蒸汽灭菌后加入500mg/L头孢霉素；

所述的筛选培养基：

1900mg/L KNO₃，1650mg/L NH₄NO₃，170mg/L KH₂PO₄，370mg/L MgSO₄·7H₂O，440mg/L CaCl₂·2H₂O，27.8mg/L FeSO₄·7H₂O，37.3mg/L Na₂·EDTA，0.83mg/L KI，6.2mg/L H₃BO₃，22.3mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6mg/LZnSO₄·7H₂O，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，1.25mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L CoCl₂·6H₂O，2mg/L甘氨酸，1mg/L V_B1，0.5mg/L V_B6，0.5mg/L V_B5+0.69g/L L-脯氨酸+1g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH 5.8，高压蒸汽灭菌后加2mg/L PPT和500mg/L头孢霉素。

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