CN101960013A - 在植物组织中异源多肽的高水平表达和积累 - Google Patents

Abstract

在此提供了用于在植物细胞的液泡中增加纤维二糖水解酶的表达和/或积累的组合物和方法。该方法涉及通过使用大麦多胺氧化酶(BPAO)液泡分选信号肽将该酶靶向这些液泡。使用对可操作地连接到该纤维二糖水解酶上的液泡分选信号肽进行编码的表达构建体所转化的植物将该多肽的表达指向这些植物细胞的液泡。在此提供了转基因的植物、种子、和植物组织、和植物的部分。表达本发明的构建体的转基因植物或植物材料的下游用途包括农艺学用途和工业用途，例如人类食品、动物饲料、生物燃料、工业乙醇、发酵原料，和类似物。

Description

在植物组织中异源多肽的高水平表达和积累

参考电子提交的序列表

该序列表的官方副本是通过EFS-Web以ASCII格式的序列表以2009年1月23日生成的名为“71796_Sequence_Listing.txt”的文件进行电子提交的，并且该序列表的大小为64千字节并且与本说明书同时提交。包含在该ASCII格式文件中的序列表是该说明书的一部分，并且通过引用以其全文结合在此。

相关申请

本申请要求了对于2008年1月30日提交的美国临时申请系列号61/024,844的优先权，而且还要求了对于2008年4月24日提交的美国临时申请系列号61/047,692的优先权，这两者通过引用以其全文结合在此。

发明领域

本发明涉及植物分子生物学，特别地涉及用于在植物组织中增加异源多肽的表达和/或积累的方法和组合物。

发明背景

随着转基因技术的出现，已经设计出多种改进植物农艺学性能的新方法用于食物、饲料、和加工应用。此外，使用转基因技术表达外源基因的能力已经开启了用于在植物中生产大量的商业上重要的产品的选择方案。

植物和微生物这两者来源的新型靶基因可以越来越快地获得，用于改进作物物种的农艺学特性连同植物特性的目的。这些进步已经使得对具有令人希望的性状的植物进行开发，这些性状例如：对于疾病、昆虫、和除草剂的抗性，对于热和干旱的耐受，缩短的作物成熟时间，改进的工业加工(例如，用于将淀粉或生物质转化为可发酵的糖类)、和改进的农艺学品质(例如，高油含量和高蛋白含量)。

发明概述

在此提供了用于在植物细胞的液泡中增加感兴趣的多肽的表达和/或积累的组合物和方法。该方法涉及通过使用液泡分选信号肽(vacuole sortingsignal peptide)(例如，大麦多胺氧化酶(BPAO)液泡分选信号肽)将该多肽靶向这些液泡。在此预测使用对可操作地连接到所感兴趣的多肽上的液泡分选信号肽进行编码的表达构建体所转化的植物指导该多肽的表达至这些植物细胞的液泡。

在此提供了转基因植物、种子、和植物组织、和植物的部分。此外提供了用于从植物细胞的液泡中高水平表达和回收感兴趣的多肽的方法。

包括本发明的表达构建体的转基因植物或植物材料的下游用途包括农艺学用途和工业用途，例如人类食品、动物饲料、生物燃料、工业乙醇、发酵原料、和类似物。

发明详细说明

概述

在此提供了用于在植物细胞的液泡中增加感兴趣的多肽的表达和/或积累的方法和组合物。该方法包括将含有液泡分选信号序列(例如，大麦多胺氧化酶(BPAO)液泡分选信号序列)的核酸构建体引入该植物细胞中，该序列可操作地连接到对所感兴趣的多肽进行编码的核苷酸序列上。在不同的实施方案中，该液泡分选信号序列导致在植物细胞的液泡中所感兴趣的多肽的表达和/或积累的增加。

本发明的液泡分选信号序列当被可操作地连接到对感兴趣的多肽进行编码的核苷酸序列上、并且在植物细胞中表达时发挥作用，从而指导或分选所编码的蛋白从内质网(ER)中进入该植物细胞的液泡。在此所使用的，术语“液泡分选信号序列”或“靶向液泡的序列”是指对靶向液泡的肽序列进行编码的核苷酸序列，该液泡靶向肽序列可操作地指导或分选这种序列所连接的选定的蛋白至植物液泡。

植物的液泡是植物细胞分泌系统的成分。液泡贮藏了多肽和次级代谢产物。多肽贮藏于液泡中，例如在自体吞噬泡或裂解型液泡(lytic vacuole)中的降解酶类；或者蛋白贮藏于液泡中，例如在种子贮藏液泡或含有植物贮藏蛋白的液泡中的蛋白。通常，液泡的特征在于它们的功能，并且被称为蛋白贮藏液泡或裂解型液泡。蛋白贮藏液泡与几种组织类型相关联，包括叶子和种子。在种子中，蛋白贮藏液泡可以含有种子贮藏蛋白。裂解型液泡与将由该细胞制备的蛋白进行降解并且再循环的正常代谢过程相关联。裂解型液泡通常地包含分解酶，例如在蛋白的分解中发挥作用的肽酶。

已经鉴定出有效地用于鉴定不同类型的液泡(裂解型或贮藏型)的生物标记物。Jauh et al，Plant Cell 11：1867-1882(1999)使用共聚焦显微镜而表征了液泡和它们所表达的3种液泡膜内在蛋白(TIP)。基于TIP含量鉴定了三种不同类型的液泡，其中通过αTIP和ωTIP、或αTIP、ωTIP和γTIP鉴定了种子贮藏液泡。通过ωTIP、或ωTIP和γTIP鉴定了植物贮藏液泡。通过γTIP显示了裂解型液泡。有趣的是，有证据显示液泡可以进行再次划分并且因此将同一个液泡中的贮藏和裂解水解的功能分开。Paris et al，Cell85(4)：563-572(1996)描述了植物细胞液泡，其中这些液泡膜内在蛋白的特征表明该液泡具有两个不同的区室，一个区室包含针对贮藏蛋白的标志物并且另一个区室包含针对裂解活性的标志物。还参见Martinoia et al，J of ExpBotany 58(1)：83-102(2007)。

因为植物细胞的液泡具有贮藏功能，指导到那里的蛋白就保持在那里，这就导致丰度不断地增加，除非受到液泡蛋白酶类的降解。贮藏在该液泡中的蛋白也从该植物的主要代谢过程中分离出，并且因此将不干扰这种植物的生长和发育。已经发表了几篇有关液泡分选信号的综述，包括Bethkeand Jones，Current Opinion in Plant Biology 3：469-475(2000)；Nakamura andMatsuoka，Plant Physiol 101：1-5(1993)；和Vitale and Hinz，Tmeds in Plant Sci10：316-323(2005)。

在植物中已经鉴别出了三种不同类型的液泡分选信号肽。类型是包含共有序列NPIR或NPILL(使用单字母代码表示氨基酸)的氨基末端前肽。第二种类型的液泡分选信号肽是羧基端前肽，并且第三种类型的信号是在该成熟蛋白中存在的结构域。本申请集中在使用氨基末端或羧基末端的前肽序列，这些前肽序列将多肽靶向植物细胞的液泡。尽管还没有鉴别出针对这些羧基末端液泡分选信号肽的共有序列，但存在着几个例子，包括来自以下蛋白的序列：大麦多胺氧化酶2蛋白(Cervelli et al，The Plant Journal40：410-418(2004))、烟草蛋白酶抑制因子Na-PI(Miller et al，The Plant Cell11：1499-1508(1999))、马铃薯20kDa马铃薯块茎蛋白PT20(Koide et al，PlantCell Physiol 40：1152-1159(1999))、大麦凝集素(Bednarek et al，Plant Cell2：1145-1155(1990)、烟草几丁质酶A(Neuhaus et al，Proc Natl Acad Sci USA88：10362-10366(1991))；来自烟草的葡聚糖酶(Sticher et al，Planta188：559-565(1992))；巴西坚果的2S白蛋白贮藏蛋白(Saalbach et al，PlantCell 3：695-708(1991)；Kirsch et al，Plant Physiol 111：469-474(1996))；和豌豆的2S白蛋白贮藏蛋白(Higgins et al，J Biol Chem 261：11124-11130(1986))。

氨基末端液泡分选信号肽的例子包括甘薯的sporamin和烟草的sporamin(Matsuoka et al，J Biol Chem 265：19750-16757(1990))，和大麦的液泡巯基蛋白酶(aleurain)(Holwerda et al，Plant Cell 4：307-318(1992)。

液泡分选信号肽的类型(氨基末端或羧基末端)并不总是与该信号肽将指导分选的多肽进入的液泡的类型(裂解型或贮藏型)相关(Neuhaus etal Plant Molecular Biology 38：127-144(1998))。在液泡类型中可能存在着组织类型差异，并且其中蛋白在这些组织类型中运输。作为一个例子，根尖细胞包含至少两种类型的液泡，包含液泡巯基蛋白酶(氨基末端分选信号)并且另一种包含大麦凝集素(羧基末端分选信号)(Paris et al，Cell 85：563-572(1996))。相比之下，在成熟的植物组织中在同一液泡中发现了大麦凝集素(羧基末端分选信号)和sporamin(氨基末端分选信号)(Schroeder et al PlantPhysiol 101：451-458(1993))。

此外，这些不同的液泡分选信号(氨基末端/羧基末端)当放置在相对的位置上时可以发挥作用，正如在烟草中所证明。来自sporamin的氨基末端液泡分选信号当放置于异源蛋白的羧基末端、并且在转基因烟草中表达时是功能性的(Koide et al Plant Physiol 114：863-870(1997))。

在本发明的一个实施方案中，该液泡分选信号序列是由大麦多胺氧化酶2(BPAO2)信号序列衍生的。BPAO2具有N端信号肽用于进入分泌途径。该多肽的C-末端延伸的存在导致BPAO定位在植物细胞的液泡中(参见Cervelli et al.The Plant Journal 40：410-418(2004))。我们相信这种BPAO液泡分选信号序列将蛋白靶向蛋白贮藏液泡或靶向液泡的蛋白贮藏隔区，该液泡可能包含单独的用于贮藏或裂解功能的隔区。在一个实施方案中，这种液泡分选信号序列在SEQ ID NO：1中列出。在另一个实施方案中，这种液泡分选信号序列编码了SEQ ID NO：2。在又另一个实施方案中，这种液泡分选信号序列编码了该液泡分选肽的生物学活性片段，该液泡分选肽是SEQ ID NO：2的至少5个、至少6个、或至少7个邻接的氨基酸。该液泡分选肽的“生物学活性”片段是肽，这种肽足以用于将感兴趣的多肽靶向植物细胞的液泡。

在不同的实施方案中，当与对照性核酸构建体相比时，对在此说明的液泡靶向的多肽进行编码的核酸构建体导致了该植物细胞的液泡中该多肽表达和/或积累的增加。“对照性”核酸构建体一词是指核酸构建体，该构建体包括液泡分选信号序列，而不是在此说明的、可操作地连接到对所感兴趣的多肽进行编码的核苷酸序列上的BPAO(或其功能片段)序列。除非另外指明，这种对照性液泡分选信号序列是在SEQ ID NO：5中列出的信号序列。在一个实施方案中，这种增加是至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约10倍、至少约20倍、或更多。

在本发明的另一个实施方案中，这种液泡分选信号肽被可操作地连接到对感兴趣的异源多肽进行编码的多肽上，其中该液泡分选信号肽指导该多肽进入植物液泡。酶类可以是感兴趣的异源多肽，并且进一步定义如下。酶可以衍生自任何来源，例如植物、细菌、真菌或昆虫。该酶可以由天然宿主细胞分泌。该酶可以是纤维素酶。进一步考虑到该纤维素酶可以衍生自微生物并且可以属于任何类别的纤维素酶，例如纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II或葡聚糖内切酶。纤维二糖水解酶I可以由SEQ ID NO：11、15、19、或21中的任何一个的多肽进行编码。纤维二糖水解酶II可以由SEQ ID NO：13或17中之一的多肽进行编码。

因此，本发明的这些方法在当前的做法(这是为了获得商业上所希望的、在植物细胞的液泡中具有增加的某些多肽的积蓄量的植物材料的目的而栽培的作物植物)与将这些作物植物的残余物作为生物质的来源用于生产可发酵的糖类、或用于农业消费和/或人类消费的用途的整合中找到了特定的用途。

提及“作物植物”是指出于生产人类所寻求的、用作口服消费的、或者是在工业、药学、或商业过程中加以利用的植物材料的目的而种植的任何植物。本发明可以施用至植物的任何品种，包括但不仅限于：玉米、小麦、稻、大麦、大豆、棉花、高粱、燕麦、番茄、Miscanthus grass、Switch grass、树、一般的豆类、油菜(rape)/低芥酸菜籽(canola)、苜蓿、亚麻(flax)、向日葵、红花、粟、黑麦、甘蔗、甜菜、可可、茶、芸苔属、棉花、咖啡、甘薯、亚麻、花生、三叶草、蔬菜(例如，莴苣、番茄、葫芦、木薯、马铃薯、胡萝卜、萝卜、豌豆、滨豆、甘蓝、花椰菜、西兰花、孢子甘蓝、胡椒(pepper)、和菠萝；果树(例如，柑橘属的、苹果、梨、桃、杏、胡桃、鳄梨、香蕉、和椰子；和花卉(例如，兰花、康乃馨、和玫瑰)(Brassica，cotton，coffee，sweet potato，flax，peanut，clover；vegetables such as lettuce，tomato，cucurbits，cassava，potato，carrot，radish，pea，lentils，cabbage，cauliflower，broccoli，Brussels sprouts，peppers，and pineapple；tree fruits suchas citrus，apples，pears，peaches，apricots，walnuts，avocado，banana，and coconut；and flowers such as orchids，carnations and roses)。

如在此所使用的，术语“植物部分”或“植物组织”包括植物细胞、植物原生质体、植物细胞组织培养物(植物可以从其中再生)、植物愈伤组织、植物簇、和植物细胞，这些细胞在植物或植物部分(例如，胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、分枝、果实、核、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花药、和类似物)中是完整的。这种植物细胞可以是植物绿色组织的一部分，其中该绿色组织是由含有叶绿素的细胞(例如，在叶、柄、茎、或枝中的那些细胞)组成的。或者，该植物细胞可以被干燥、烘干、脱水或者是衰老的植物组织(例如，在秸秆形成中所发生的情况)。秸秆是指在植物已经进入衰老过程之后仍保留的组织，该过程典型地与收获发生后保留的组织相关联。

在一个实施方案中，该植物是无限(indeterminate)生长型植物。这些品种在温带(temperate)地区在无限制(indefinite)的时期进行营养性生长。这些品种可以被工程化处理以便在这些液泡中积累所感兴趣的多肽并且可以进行生长直到初霜期。在那时，该植物可被允许脱水(dessicate)，然后干燥收获，并用作食品、牲畜饲料、或用于生物质转化过程。

如在此所使用的，“生物质”是指有用的生物材料(包括感兴趣的产品)，该材料会被收集并且旨在进行进一步加工以便将该感兴趣的产品分离或浓缩。“生物质”可以包括果实或它的多个部分，或种子、叶、或茎或根，其中这些是处于工业目的而特定感兴趣的植物部分。“生物质”当它指植物材料时包括植物的任何一种结构或多种结构，该结构包含或代表所感兴趣的产品。

在另一个实施方案中，液泡靶向的多肽在该植物衰老之后仍保留在该植物组织中，并且将该组织干燥以形成秸秆。这是值得注意的观察，因为在植物中衰老过程涉及在自体吞噬过程中在降解性液泡内细胞成分的分解(Nooden in Nooden and Leopold，Chapter 1，The Phenomena of Senescenceand Aging in Senescence and Aging in Plant(1988)，Academic Press，Inc)。所说明的生产液泡靶向的多肽的方法(其中该多肽仍然存在于衰老的植物组织中)与和衰老相关联的正常生理学变化存在着显著的趋异。在另一个实施方案中，这种液泡靶向的多肽在秸秆中积累并且该多肽保留了活性。在另一个实施方案中，在秸秆中这种液泡靶向的多肽保留了在绿色组织中所测量的液泡靶向的多肽活性水平的至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、至少50％、至少45％、至少40％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％、至少15％、至少10％。或者，与在绿色组织中所测量的活性相比，在秸秆中这种液泡靶向的多肽的活性增加了至少2倍(increases in activity by at least 2fold)、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少12倍、至少14倍或至少16倍。可以将活性测量为每单位植物组织中这种多肽的活性的函数(function)、或测量为每单位蛋白中这种多肽的活性的函数。在另一个实施方案中，这种液泡靶向的多肽是蛋白，该蛋白是由该蛋白的天然宿主分泌的。在另一个实施方案中，这种酶包含由内部二硫键(通过天然宿主的糖基化作用和通过异源宿主的糖基化作用)组成的组的一种或多种特征。在另一个实施方案中，所分泌的蛋白是酶。在另一个实施方案中，所分泌的蛋白是由微生物(例如，真菌或细菌)表达的酶。在另一个实施方案中，该酶是纤维素酶。在另一个实施方案中，该纤维素酶选自由CBH1和CBH2组成的组。这种CBH1可以由SEQ ID NO：11、15、19、或21的多肽中的任何进行编码。这种CBH2可以由SEQ ID NO：13或17的多肽中的任何进行编码。

在另一个实施方案中，一旦该秸秆组织已经被收集，这种液泡靶向的多肽在秸秆组织中保持稳定。这种异源多肽可以稳定至少2至3个月、3至6个月、6至9个月、9个月至1年、或超过1年。

冠词“一个/一种”(″a″和″an″)在此用来指一种或超过一种(即，至少1个)该冠词的语法宾语。作为举例，“元件”指一种或多种元件。贯穿本说明书，词语“包括”或变体(例如“包括了”或“包括着”，“包含”)应当被理解为是指包括所提及的元件、整数、或步骤，或多个元件、多个整数或步骤的组，但并不排除任何一个元件、整数或步骤，或多个元件、整数或步骤的组。

用途

将蛋白靶向植物液泡是用于生产商业量的令人希望的蛋白的有用的策略。植物液泡代表在植物细胞中用于溶解物质的最大区室。例如，块茎、球茎、根和茎的最重要的贮藏蛋白位于组成那些器官的细胞的液泡中。此外，大多数种子的贮藏蛋白位于所谓的蛋白体中，这些蛋白体是专门化的液泡，对于这些专门化的液泡同样的分选信号将会像适用到营养性器官的液泡一样适用。所以，有利的是能够指导与在植物养分含量改进相关联的蛋白特异性地进入该液泡中。

类似的考虑还施用到降解性的、或可能对该植物本身有毒的蛋白。

因此，用于靶向到植物细胞液泡的有用的多肽包括在下游农艺学和工业使用中发挥作用的那些多肽，这些使用例如人类食品、动物饲料、生物燃料、工业乙醇、发酵原料、和类似物。

在一个实施方案中，从在此说明的转基因植物中收获的植物材料可以用来配制食品或饮料用于人类消费、或动物饲料，可以用来配制具有易于消化的淀粉、并且因此具有更多可提取能量的食物，或可以用来改进这种食品或饲料的营养品质(例如，增加的维生素含量、增加的油含量、增加的蛋白含量、等等)。这种食品、饲料或饮料可以是面粉、生面团、面包、各种食用干面条或干面片(pasta)、饼干、蛋糕、增稠剂、啤酒、麦芽饮料或食品添加剂。这种食品、饲料、或啤酒产品可以具有降低的变应原性和/或增加的可消化性。此外，生面团产品与从这些相同物种的非转基因种子或谷粒制成的生面团相比可以具有增加的强度和体积。这种食品、饲料、或饮料可以具有超级可消化的蛋白和/或超级可消化的淀粉。这种食品、饲料、或饮料可以是低变应原性的(hypoallergenic)。

从本发明的收获的植物材料中提取的油可以用作用于化学修饰的原料、生物可降解材料的成分、混合的食品产品的成分、食用油或烹调油的成分、润滑剂或它的成分、生物柴油或它的成分、休闲食品的成分、发酵工艺的原料、或化妆品的成分。

所收获的本发明的植物材料还可以与其他成分组合以生产有用的产品。产品中所包括的具体成分将根据该产品的最终用途来确定。示例性的产品包括动物饲料、用于化学修饰的原料、生物可降解材料、混合的食品产品、食用油、烹调油、润滑剂、生物柴油加工原料、休闲食品、化妆品、清洗剂和洗涤剂的组合物(例如，衣物洗涤剂类、盘子清洗洗涤剂类、和硬表面清洗组合物类)、和发酵工艺原料。包含在此说明的所收获的植物物质的产品还包括完整的或部分地完整的猪、家禽、和牛的饲料，宠物食品，和人类食品产品，例如挤出式休闲食品、面包、作为食品粘合剂、水产养殖饲料、可发酵的混合物、食品增补剂、运动饮料、营养食品棒、维生素增补剂、食物饮料、和谷类食品。结合在此说明的所收获的植物材料的产品包括例如纸板、纸产品、和工业材料。这些产品可以结合粗收获的植物材料、或可以结合经加工或提取形式的所收获的植物材料(例如，从所收获的植物材料中提取的油、蛋白、淀粉、等)。

感兴趣的多肽

适合于靶向液泡和积累的感兴趣的多肽包括改进或通过其他方式有助于所收获的植物材料转化成为商业上有用的产品的那些多肽，包括例如增加的或改变的碳水化合物含量和/或分布、改进的发酵特性、增加的油含量、增加的蛋白含量、提高的可消化度、和增加的营养成分含量(例如，增加的植物甾醇含量、增加的生育酚含量、增加的雄诺龙(stanol)含量或增加的维生素含量)。感兴趣的多肽类还包括例如在收获的作物中导致或贡献降低含量的不需要的成分，例如植酸、大豆胰蛋白酶(trypsin)抑制剂、或淀粉降解酶类，这取决于下游的用途。“导致”或“贡献”是指这种感兴趣的多肽可以直接地或间接地贡献感兴趣的性状的存在(例如，通过异源表达淀粉降解酶来增加纤维素的降解)。

在一个实施方案中，所感兴趣的液泡靶向的多肽贡献了改进的食品或饲料的可消化度。木聚糖酶是半纤维素分解酶，这些酶改进了植物细胞壁的分解，这使得动物更好地利用这些植物营养素。这导致了改进的生长率和饲料转化。而且，作为木聚糖酶活性的结果，由含有木聚糖的饲料所衍生的消化物的粘度可以被降低。

来自真菌和细菌微生物的多种木聚糖酶已经得到鉴别和表征(参见例如，美国专利号5,437,992；Coughlin，M.P.；Biely，P.et al.，Espoo 1993；P.Souminen and T.Reinikainen eds.，Foundation for Biotechnical and IndustrialFermentation Research 8：125-135(1993)；美国专利申请公开号2005/0208178；和WO03/16654)。具体而言，在里氏木霉(T.reesei)中已经鉴别出了三种特异性的木聚糖酶(XYL-I，XYL-II、和XYL-III)(Tenkanen，et al.，Enzyme Microb.Technol.14：566(1992)；Torronen，et al.，Bio/Technology10：1461(1992)；和Xu，et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：718(1998))。

在另一个实施方案中，所感兴趣的液泡靶向的多肽是多糖降解酶。此类植物可以用于产生例如用于生物加工的发酵原料。在一些实施方案中，对于发酵工艺有用的酶类包括α淀粉酶类、蛋白酶类、支链淀粉酶类、异淀粉酶类、纤维素酶类、半纤维素酶类、木聚糖酶类、环糊精糖基转移酶类(glycotransferases)、脂肪酶类、植酸酶类、漆酶类、氧化酶类、酯酶类、角质酶类(cutinases)、颗粒淀粉水解酶类或其他葡糖淀粉酶类。

多糖降解酶类包括：淀粉降解酶类，例如，α-淀粉酶类(EC 3.2.1.1)、葡萄糖醛酸酶类(glucuronidases)(E.C.3.2.1.131)；外-1，4-α-D葡聚糖酶类，例如淀粉糖化酶类(amyloglucosidase)和葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)、β-淀粉酶类(EC 3.2.1.2)、α-糖苷酶类(EC 3.2.1.20)、和其他外-淀粉酶类；和淀粉脱支酶类，例如a)异淀粉酶(EC 3.2.1.68)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、和类似物；b)纤维素酶类，例如外-1，4-3-纤维素二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、外-1，3-β-D-葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)、β-糖苷酶(EC 3.2.1.21)；c)L-阿拉伯糖酶类(arabinases)，例如内-1，5-α-L-阿拉伯糖酶(EC 3.2.1.99)、α-阿拉伯糖苷酶类(EC 3.2.1.55)和类似物；d)半乳聚糖酶类(galactanases)，例如内-1，4-β-D-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、内-1，3-β-D-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.90)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)和类似物；e)甘露聚糖酶类(mannanases)，例如内-1，4-β-D-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、α-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.24)和类似物；f)木聚糖酶类，例如内-1，4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、β-D-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、1，3-β-D-木聚糖酶、和类似物；g)其他酶类，例如α-L-岩藻糖苷酶(EC3.2.1.51)、α-L-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)、果聚糖酶(EC 3.2.1.65)、菊粉酶(inulanase)(EC 3.2.1.7)、和类似物。

本发明的另一个实施方案涵盖了在所收获的植物材料中异源淀粉降解酶类(例如，葡糖淀粉酶和淀粉酶)的表达和积累用于下游的用途(例如，乙醇生产)。葡糖淀粉酶类(α-1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶类，E.C.3.2.1.3.)是淀粉水解外切活性的糖酶类。葡糖淀粉酶类催化了顺序的葡萄糖单元从淀粉或相关的寡聚糖和多糖分子的非还原端去除，并且可以水解淀粉(直链淀粉和支链淀粉)的直链糖苷连接和分支糖苷连接。术语“α-淀粉酶(即，E.C.分类3.2.1.1)”是指催化这些α-1，4-糖苷连接水解的酶类。这些酶类也被说明为在含有1，4-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖类中影响1，4-α-D-糖苷连接的外水解或内水解的那些酶类。用于说明这些酶的另一种术语是“糖原酶”(glycogenose)。示例性的酶类包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶。商业上，葡糖淀粉酶和淀粉酶是非常重要的酶类，它们已经用于要求淀粉水解的多种多样的应用中。

其他可以使用的额外的酶类包括蛋白酶类，例如真菌的和细菌的蛋白酶类。真菌的蛋白酶类包括例如从曲霉属、木霉属、毛霉属和根霉属(例如黑曲霉、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉、和米黑毛霉(M miehei))获得的那些酶类。在本发明中特别感兴趣的是纤维二糖水解酶(CBH)酶类(EC 3.2.1.91)。纤维素酶是能够水解纤维素的1，4-β-D-糖苷连接的酶类。在一个实施方案中，这种纤维二糖水解酶是CBH1或CBH2，例如在SEQ IDNO：11中列出的CBH1酶和在SEQ ID NO：13中列出的CBH2酶。

其他酶类包括但不限于：半纤维素酶类，例如甘露聚糖酶类和阿拉伯呋喃糖酶类(EC 3.2.1.55)；木素酶类(ligninases)；脂肪酶类(例如，E.C.3.1.1.3)、葡萄糖氧化酶类、果胶酶类、木聚糖酶类、转葡萄糖苷酶类、α1，6糖苷酶类(例如，E.C.3.2.1.20)；酯酶类，例如阿魏酸酯酶(ferulic acid)(EC3.1.1.73)和乙酰基木聚糖酯酶类(EC 3.1.1.72)；和角质酶类(例如，E.C.3.1.1.74)。

酶类的选择可以取决于用于下游用途的底物特异性和/或所希望的最终产物(例如，具有改进特性(例如热稳定性、酸稳定性、和类似性质)的酶类)。应当认识到发挥在此说明的这些令人希望的功能之一的、本领域中已知的任何酶可以用于本发明的构建体中。在一个实施方案中，所感兴趣的多肽是由在SEQ ID NO：10、12、14、16、18、和20中列出的多核苷酸序列进行编码的。

还应当认识到可以将编码了这种液泡分选肽、所感兴趣的多肽，或它们这两者的核苷酸序列进行优化用于在所转化的宿主细胞中增加表达。换言之，可以使用宿主细胞偏好的密码子来合成这些核苷酸序列用于改进的表达，或可以按照宿主偏好的密码子使用频率来使用密码子进行合成。大体上，这种基因的GC含量将会增加。参见例如，Campbell and Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11的对于宿主偏好的密码子使用的讨论。在本领域中可以得到多种方法用于合成植物偏好的基因。参见例如，美国专利号5,380,831、和5,436,391，和Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，通过引用结合于此。

感兴趣的多肽还可以从自然界中出现的原始形式得到进一步修饰或进化，从而改变所感兴趣的多肽的特性。存在着几种可供使用的技术或方法，用于进化蛋白以产生具有改变的特征或特性的变体。例如，基于随机氨基酸变化或随机诱变的技术包括化学诱变(Smith，Ann.Rev.Genet.19：423-462(1985))、直接进化；(美国专利号5,830,696)；基因位点饱和诱变(GSSM)(美国专利号6,171,820和6,579,258)、在定向进化中外切核酸酶介导的基因装配(美国专利号6,361,974和6,352,842)、在定向进化中的末端选择(美国专利号6,358,709和6,238,884)、基于重组的合成改组(美国专利号5,965,408和6,440,668、和澳大利亚专利号AU724521)、和嗜热酶的定向进化(美国专利号5,830,696和6,335,179)。这些技术产生具有随机突变的变体的集合，并接着对这个变体集合进行筛选以鉴别具有所希望的特征组的那些单个的变体。

可以由进化来改变的蛋白特征包括活性模式(例如，最适温度、pH、盐浓度、离子、等等)。所寻找的这些新特征可以是除了这些蛋白目前的特征组之外的特征、或可以涉及改变特征。蛋白特征可以包括但不限于以下特点：活性模式、吸水能力、防止水吸收的能力、凝胶化能力、等等。例如，可以希望对蛋白进行工程化处理，这种蛋白展示出耐热性和耐酸性、连同额外的对蛋白酶酶解敏感性增强的特征。在该实施例中，这种蛋白的初始特征(耐热性和酸稳定性)需要得到保持，同时加上这种新的特征(对蛋白酶的增强的敏感性)。还可以考虑酶的比活性，其中酶的“比活性”被定义为在给定的时间单位内酶能够转化或催化的底物的量。

植物表达盒

本发明的组合物还包括用于在所感兴趣的植物细胞的液泡中将感兴趣的多肽转化并且表达并且积累的核酸序列。这些核酸序列可以存在于DNA构建体或表达盒中。如在此所使用的，“表达盒”是指核酸序列，该序列能够指导特定的核苷酸序列在适当的宿主细胞中的表达，包括可操作地连接至所感兴趣的核苷酸序列(即，对所感兴趣的多肽进行编码的核苷酸序列)上的启动子，该核苷酸序列被可操作地连接至终止信号上。它还典型地包括适当翻译这种核苷酸序列所要求的序列。包括所感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，这意味着其组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少一种而言是异源的。该表达盒也可以是自然发生的、但是已经按照用于异源表达的重组体形式而获得的表达盒。然而，典型地，该表达盒相对于该宿主而言是异源的，即该表达盒的特定的DNA序列不是自然地发生于该宿主细胞中，并且必须已经由转化事件(event)引入到该宿主细胞或该宿主细胞的祖细胞(ancestor)中。该核苷酸序列在该表达盒中的表达可以是在组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，该诱导型启动子仅在该宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激物时才启动转录。额外地，该启动子还可以是对特定的组织、或器官、或发育阶段特异性的。

本发明涵盖了使用表达盒进行转化的植物，这些表达盒能够指导感兴趣的多肽在植物细胞的液泡中的表达和积累。该表达盒将在5′至3′的转录方向上包括转录和翻译的起始区(例如，启动子)、对液泡分选肽进行编码的多核苷酸，和对感兴趣的多肽进行编码的多核苷酸。该表达盒可以可任选地包括在植物中发挥作用的转录和翻译的终止区(即，终止区)。

除了对这种液泡分选肽进行编码的多核苷酸序列之外，该构建体还进一步包括额外的调控元件，从而促进所感兴趣的多肽的转录、翻译、或转运。这种表达构建体的调控序列被可操作地连接到所感兴趣的多核苷酸上。“可操作地连接”一词是指在调控元件与第二种序列之间的功能性连接，其中该调控元件引发并且/或介导了对应于该第二个序列的DNA序列的转录、翻译、或转位。大体上，可操作地连接意味着相连接的核苷酸序列是相邻的。这些调控元件包括启动子、增强子(enhances)、和用于将细胞质合成的蛋白靶向该植物细胞的内膜系统的信号序列。在一个实施方案中，该构建体在5’至3’方向的转录方向上包括转录和翻译的启动区(例如，启动子)、对内质网信号序列进行编码的多核苷酸，对液泡分选肽进行编码的多核苷酸，和对所感兴趣的多肽进行编码的多核苷酸。示例性信号序列包括γ玉米素27kD信号序列(SEQ ID NO：8)和大豆的大豆球蛋白-1(GY1)信号序列(SEQ ID NO：3)。在本发明的方法中有用的其他方法对于本领域中的普通技术人员而言将是清楚的。

在所感兴趣的植物中任何能够驱动表达的启动子可以用于本发明的实践。该启动子对于该植物宿主而言可以是天然的或类似的、或外来的或异源的。术语“异源的”和“外源的”当在此使用时是指核酸序列(例如，DNA或RNA序列)或基因，是指来自序列，该序列起始于对这种特定的宿主细胞而言是外来的来源、或若来自相同的来源则是从其初始形式进行修饰。因此，在宿主细胞中的异源基因包括基因，该基因对于该特定的宿主细胞是内源的、但是通过例如使用DNA改组已经得到修饰。这些术语还包括自然发生的DNA序列的非自然发生的多个拷贝。因此，这些术语是指DNA区段，该区段对于该细胞而言是外来的或异源的，或对于该细胞是同源的(但却在该宿主细胞核酸内的位置中，其中该元件通常不被发现)。对外源DNA区段进行表达以产生外源多肽。

“同源性”核酸(例如，DNA)序列是核酸(例如，DNA或RNA)序列，该序列与引入它的宿主细胞自然地相关联。

所包括的启动子的选择取决于几个因素，包括但不限于：效率、可选择性、可诱导性、所希望的表达水平、和细胞或组织优选的表达。通过相对于该序列对启动子和其他调节区域进行适当地选择并定位来调节序列的表达对于本领域中的普通技术人员是一项例行事务。

在某些细胞类型中，一些适当的启动子唯一地或主导地起始了转录。因此，如在此所使用的，细胞类型优选的或组织优选的启动子是优选地在该目标组织中驱动表达、但是也可在其他细胞类型或组织中导致一些表达的启动子。用于对植物基因组DNA中的启动子区域进行鉴别并表征的方法包括，例如在以下参考文献中所说明的那些方法：Jordano，et al.，Plant Cell，1：855-866(1989)；Bustos，et al.，Plant Cell，1：839-854(1989)；Green，et al.，EMBO J.7，4035-4044(1988)；Meier，et al.，Plant Cell，3，309-316(1991)；和Zhang，et al.，Plant Physiology 110：1069-1079(1996)。

在光合作用组织中具有活性的、以便在绿色组织(例如，叶子和茎)中驱动转录的启动子是本发明特别感兴趣的。最适当的是在此类组织中唯一地或主导地驱动表达的启动子。该启动子可以在整个植物组成性地赋予表达，或考虑到这些绿色组织而差异性地赋予表达，或考虑到在发生表达的绿色组织中的发育时期而差异性地赋予表达，或响应于外部刺激而赋予表达。

此类启动子的实施例包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子(例如，来自东方落叶松(Larix laricina)的RbcS启动子)、松树cab6启动子(Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35：773-778)、来自小麦的Cab-1基因启动子(Fejes et al.(1990)Plant Mol.Biol.15：921-932)、来自菠菜的CAB-1启动子(Lubberstedt et al.(1994)Plant Physiol.104：997-1006)、来自稻的cab1R启动子(Luan et al.(1992)Plant Cell 4：971-981)、来自玉米的丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)启动子(Matsuoka et al.(1993)Proc Natl Acad SciUSA 90：9586-9590)、烟草Lhcb1*2启动子(Cerdan et al.(1997)Plant Mol.Biol.33：245-255)、拟南芥SUC2蔗糖-H+共输送体启动子(Truemit et al.(1995)Planta 196：564-570)，和来自菠菜的类囊体膜蛋白启动子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS)。在茎、叶和绿色组织中驱动转录的其他启动子说明于美国专利公开号2007/0006346中。TrpA启动子是木髓优选的启动子，并且已经在美国专利6,018,104中说明。

Hudspeth和Grula(Plant Molec Biol 12：579-589(1989))已经说明了编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。使用标准的分子生物学技术，该基因的启动子可以用于在转基因植物中以绿色组织特异性的方式驱动任何基因的表达。

在本发明的一些其他实施方案中，诱导型启动子可以是令人希望的。诱导型启动子响应于外界刺激(例如，化学试剂或环境刺激)来驱动转录。例如，诱导型启动子可以响应于激素(例如，赤霉素(giberellic acid)或乙烯)、或响应于光或干旱赋予转录。

多种转录终止子在表达盒中是可供使用的。那些终止子负责该转基因和正确的mRNA聚腺苷酸化之外的转录终止。这种终止区可以是与该转录起始区天然的、可以是与该可操作地连接的感兴趣的DNA序列天然的、可以是与该植物宿主天然的、或可以衍生自其他来源(即，对于该启动子、所感兴趣的DNA序列、该植物宿主、或它们的任何组合是外来的或异源的)。适当的转录终止子是已知在植物中发挥作用的那些终止子，并且包括CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子、和豌豆rbcs E9终止子。这些启动子可以在单子叶植物和双子叶植物中使用。此外，可以使用基因的天然转录终止子。

在一些实施方案中，该表达盒将包括选择性标记基因用于选择经转化的细胞。将选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。

已经从该转录单元内发现许多增强基因表达的序列，并且这些序列可以与本发明的基因结合使用以增加它们在转基因植物中的表达。

不同的内含子序列已经显示出增强表达，特别地在单子叶植物的细胞中。例如，已经发现玉米Adhl基因的内含子在被引入玉米细胞中时在它们的同源启动子之下显著地增强了该野生型基因的表达。发现内含子1在具有氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中是特别有效的并且增强了表达(Callis et al.，Genes Develop.1：1183-1200(1987))。在同一实验系统中，来自玉米bronze 1基因的内含子在增强表达方面具有相似的作用。内含子序列已经被例行地结合到植物转化载体中，典型地在非翻译性前导序列之中。

还已知从病毒中衍生的大量非翻译性前导序列增强了表达，并且这些在双子叶植物的细胞中是特别有效的。特别地，来自烟草花叶病毒(TMV，″W-序列″)、玉米褪绿斑驳病毒(Maize Chlorotic Mottle Virus leader)(MCMV)、和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列已经在增强表达方面显示为有效的(例如，Gallie et al.Nucl.Acids Res.15：8693-8711(1987)；Skuzeski et al.Plant Molec.Biol.15：65-79(1990))。本领域中已知的其他前导序列类包括但不限于：小RNA病毒病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein，O.，Fuerst，T.R.，and Moss，B.PNAS USA86：6126-6130(1989))；马铃薯Y病毒属前导序列类，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Allison et al.，1986)；MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)；Virology 154：9-20)；人类免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列，(Macejak，D.G.，and Samow，P.，Nature 353：90-94(1991))；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译性前导序列(AMV RNA 4)，(Jobling，S.A.，and Gehrke，L.，Nature 325：622-625(1987)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)，(Gallie，D.R.etal.，Molecular Biology of RNA，pages 237-256(1989)；和玉米萎黄病毒前导序列(MCMV)(Lommel，S.A.et al.，Virology 81：382-385(1991))。还参见Della-Cioppa et al.，Plant Physiology 84：965-968(1987)。

植物

在本发明中有用的植物包括以下植物，这些植物对于对感兴趣的液泡靶向的多肽进行编码的至少一种多核苷酸是转基因的。本领域中的普通技术人员应当认识到植物可以表达一种或多种额外的多肽序列，这种或这些多肽序列与一种或多种感兴趣的第二种性状相关联或对这种或这些性状作出贡献。这些多肽可以是细胞质表达的、可以靶向亚细胞器、或可以是由该植物细胞分泌的。感兴趣的第二种性状包括农艺学性状，这些性状主要是对种子公司、种植者、或谷粒处理机有益的，例如除草剂抗性、病毒抗性、细菌性病原体抗性、昆虫抗性、线虫抗性、和真菌抗性。参见例如，美国专利号5,569,823；5,304,730；5,495,071；6,329,504；和6,337,431。感兴趣的第二种性状还可以是已知增加植物活力或产量的性状(包括允许植物在不同的温度下、土壤条件下、和日光和降水的水平下进行生长的性状)，或允许鉴别出展示感兴趣的性状的植物的性状(例如，选择性标记基因，种皮颜色、等等)。用于产生具有令人希望的第二种性状的植物的多种基因在本领域中是可以获得的。

所选择的植物类型取决于不同因素，包括：例如，所收获的植物材料的下游用途，这个植物物种对转化的可处理性(amendability)，和对这些植物进行培养、收获、和/或加工所处的多种条件。普通技术人员应当进一步认识到用于选择适当的植物品种用于本发明的额外因素，包括高产可能性、良好的茎强度、对特定疾病的抗性、干旱耐受性、快速干燥、和足以允许在最小量的损失下贮藏和装船运到市场的谷粒品质。

进一步地考虑到本发明的构建体可以被引入到具有改进特性的植物品种中，这些改进的特性适合于或最适于特别的下游用途。

例如，在具有改变的淀粉代谢的植物中自然发生的遗传变异性在本发明的方法中是有用的。许多此类植物在对淀粉合成酶或淀粉降解酶的同种型进行编码的基因中携带突变。例如，已经鉴别出植物，它们对于糯性基因waxy(wx)、直链淀粉扩增基因(amylose extender)(ae)、暗胚乳基因(dull)(du)，角状基因(homy)(h)，皱缩基因(shrunken)(sh)，易脆基因(brittle)(bt)，粉质基因(floury)(fl)，不透明基因(opaque)(o)，或甜质基因()sugary(su)的突变体等位基因中的一种或多种是杂合的或纯合的。参见例如，美国专利号4,428,972；4,767,849；4,774,328；4789738；4,789,557；4,790,997；4,792,458；4,798,735；和4,801,470，通过引用结合在此。这些植物能够以它们天然形式进行使用，或能够进行修饰以展示一种或多种所感兴趣的额外的主要性状。

对于具有增加的营养品质的植物，可以获得几个玉米品种，例如以下品种，它们具有增加的赖氨酸(Crow′s Hybrid Com Company，Milford，Ill)、增加的蛋白(BASF)和增加的油(Pfister Hybrid Com Company，El Paso，Ill.商标为

)水平。其他适当的高油玉米包括被称为伊利诺高油(Illinois High Oil，IHO)和亚历山大高油(Alexander High Oil，Alexo)的玉米种群，它们的样品可以从University of Illinois Maize GeneticsCooperative--Stock Center(Urbana，Ill.)获得。

还可以获得甜玉米，其中存在着在正常情况下在未成熟玉米粒中发现的淀粉量的降低和葡萄糖、蔗糖和/或水溶性多糖的量的增加(Creech，R.andAlexander，D.E.In Maize Breeding and Genetics；D.B.Walden，Ed.；JohnWiley and Sons：New York，1978；pp.249-264)。在几种植物物种中(例如，玉米(Shannon&Garwood，1984)、豌豆(Bhattacharyya et al.，1990)、马铃薯(Hovenkamp-Hermelink et al.，1987)、拟南芥(Caspar et al.，1985；Lin et al.，1988a；Lin et al.，1988b)和烟草(Hanson et al.，1988))，已经发现了具有改变的碳水化合物组合物的突变体。棕色中脉(Bmr)玉米已经被用作替代物(alternative)用于改进青贮杂交体的可消化性达到几十年。在反刍摄入和可消化性方面的改进是从Bmr突变的杂化体中降低的木素含量获得的。具有令人希望的、用于下游加工的性状(如在此说明)的额外品种(自然发生的和转基因的)对于本领域中的普通技术人员是熟知的。

本发明中有用的植物还包括(但不限于)：产生可食用的花的作物，例如花椰菜(Brassica oleracea)、朝鲜蓟(Cynara scolvmus)、和红花(红花属，例如红花)；水果，例如苹果(苹果属，例如苹果)、香蕉(芭蕉属，例如小果野蕉)、浆果(例如茶藨子属植物，茶藨子属，例如红醋栗)、樱桃类(例如甜樱桃，李属，例如欧洲甜樱桃)、黄瓜(黄瓜属，例如黄瓜)、葡萄(葡萄属，例如葡萄)、柠檬(Citrus limon)、甜瓜(Cucumis melo)、坚果(例如胡桃，胡桃属，例如胡桃；花生，Arachis hypoaeae)、橙(柑桔属，例如柚)、桃(李属(Prunus)，例如桃)、梨(梨属(Pyra)，例如西洋梨)、胡椒(茄属，例如珊瑚樱)、李子(李属，例如欧洲李)、草莓(草莓属，例如麝香草莓)、番茄(番茄属，例如番茄)；叶类，例如苜蓿(苜蓿属，例如紫苜蓿)、甘蔗(Saccharum)、甘蓝(例如Brassica oleracea)、菊苣(菊苣属(Cichoreum)，例如菊苣)、韭(葱属，例如韭葱)、莴苣(莴苣属，例如莴苣)、菠菜(菠菜属，例如菠菜(oleraceae))、烟草(烟草属，例如烟草)；根类，例如竹芋(竹芋属，例如竹芋)、甜菜(甜菜属，例如甜菜)、胡萝卜(胡萝卜属，例如野胡萝卜)、木薯(木薯属，例如木薯)、芜菁(芸苔属，例如芜青)、萝卜(萝卜属，例如萝卜)、山药(薯蓣属，例如山药)、甘薯(Ipomoea batatas)；种子，例如豆(菜豆属，例如菜豆)、豌豆(豌豆属，例如豌豆)、大豆(大豆属，例如大豆)、小麦(小麦属，例如普通小麦)、大麦(大麦属，例如大麦)、玉米(玉蜀黍属，例如玉蜀黍)、稻(稻属，例如亚洲栽培稻)；草类，例如芒草(芒属，例如巨芒)和柳枝稷(黍属，例如柳枝稷)；树，例如白杨(杨属，例如欧洲山杨)、松树(Pinus)；灌木，例如棉花(例如Gossypium hirsutum)；和块茎，例如甘蓝(芸苔属，例如甘蓝(oleraceae))、马铃薯(茄属，例如阳芋)(cauliflower(Brassica oleracea)，artichoke(Cynara scolvmus)，and safflower(Carthamus，e.g.tinctorius)；fruitssuch as apple(Malus，e.g.domesticus)，banana(Musa，e.g.acuminata)，berries(such as the currant，Ribes，e.g.rubrum)，cherries(such as the sweet cherry，Prunus，e.g.avium)，cucumber(Cucumis，e.g.sativus)，grape(Vitis，e.g.vinifera)，lemon(Citrus limon)，melon(Cucumis melo)，nuts(such as the walnut，Juglans，e.g.regia；peanut，Arachis hypoaeae)，orange(Citrus，e.g.maxima)，peach(Prunus，e.g.persica)，pear(Pyra，e.g.communis)，pepper(Solanum，e.g.capsicum)，plum(Prunus，e.g.domestica)，strawberry(Fragaria，e.g.moschata)，tomato(Lycopersicon，e.g.esculentum)；leafs，such as alfalfa(Medicago，e.g.sativa)，sugar cane(Saccharum)，cabbages(such as Brassica oleracea)，endive(Cichoreum，e.g.endivia)，leek(Allium，e.g.porrum)，lettuce(Lactuca，e.g.sativa)，spinach(Spinacia e.g.oleraceae)，tobacco(Nicotiana，e.g.tabacum)；roots，such as arrowroot(Maranta，e.g.arundinacea)，beet(Beta，e.g.vulgaris)，carrot(Daucus，e.g.carota)，cassava(Manihot，e.g.esculenta)，turnip(Brassica，e.g.rapa)，radish(Raphanus，e.g.sativus)yam(Dioscorea，e.g.esculenta)，sweetpotato(Ipomoea batatas)；seeds，such as bean(Phaseolus，e.g.vulgaris)，pea(Pisum，e.g.sativum)，soybean(Glycine，e.g.max)，wheat(Triticum，e.g.aestivum)，barley(Hordeum，e.g.vulgare)，corn(Zea，e.g.mays)，rice(Oryza，e.g.sativa)；grasses，such as Miscanthus grass(Miscanthus，e.g.，giganteus)andswitchgrass(Panicum，e.g.virgatum)；trees such as poplar(Populus，e.g.tremula)，pine(Pinus)；shrubs，such as cotton(e.g.，Gossypium hirsutum)；andtubers，such as kohlrabi(Brassica，e.g.oleraceae)，potato(Solanum，e.g.tuberosum))、和类似物。

植物转化

在此说明的表达构建体能够以多种本领域公认的方法引入该植物细胞中。在多核苷酸(例如，感兴趣的核苷酸构建体)的背景中，术语“引入”旨在是指以这样方式将该多核苷酸呈递给该植物，这些使得该多核苷酸获得进入该植物细胞的内部的途径。其中将引入超过一种多核苷酸，这些多核苷酸可以装配成单个的核苷酸构建体的一部分，或者单独的核苷酸构建体，并且可以位于相同的或不同的转化载体上。相应地，作为培育实验方案的一部分，这些多核苷酸能够在单一的转化事件中、在多个分开的转化事件中、或例如在多个植物中引入到感兴趣的宿主细胞之中。本发明的这些方法不取决于用于将一种或多种多核苷酸引入到植物中的特定方法，仅仅是这种或这些多核苷酸获得了进行该植物的至少一种细胞的内部的途径。用于将多核苷酸引入植物的方法在本领域中是已知的，包括但不限于：瞬时转化法、稳定转化法、和病毒介导法。

在多核苷酸的背景下，“瞬时转化”旨在指将多核苷酸引入该植物中并且不整合到该植物的基因组中。

在将多核苷酸引入到植物中的背景下，提及“稳定引入”或“稳定引入的”是指所引入的多核苷酸被稳定地整合到该植物基因组中，并且因此该植物是用该多核苷酸稳定地转化的。

“稳定转化”或“稳定转化的”旨在是指引入到植物中的多核苷酸(例如，在此说明的核苷酸构建体)整合进入该植物的基因组中，并且能够它的后代遗传，更具体地被多个连续代的后代遗传。

可供用于植物转化的转化载体对于植物转化领域的普通技术人员而言是已知的，并且涉及到本发明的这些基因可以与任何此类载体结合连接。载体的选择将取决于所优选的转化技术和用于转化的目标物种。对于某些目标物种，可以优选不同的抗生素或除草剂选择标志物。在转化中例行使用的选择标志物包括：nptll基因，它赋予了针对卡那霉素和相关的抗生素的抗性(Messing&Vierra.Gene 19：259-268(1982)；Bevan et al.，Nature304：184-187(1983))；bar基因，它赋予了针对除草剂草丁膦(phosphinothricin)的抗性(White et al.，Nucl.Acids Res 18：1062(1990)，Spencer et al.Theor.Appl.Genet 79：625-631(1990))；hph基因，它赋予了针对抗生素潮霉素的抗性(Blochinger&Diggelmann，Mol Cell Biol 4：2929-2931)；和dhfr基因，它赋予了针对氨甲喋呤(methatrexate)的抗性(Bourouis et al.，EMBO J.2(7)：1099-1104(1983))；EPSPS基因，它赋予了针对草甘膦(phosphinothricin)的抗性(美国专利号4,940,935和5,188,642)；和甘露糖-6-磷酸异构酶基因，它该基因提供了代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629)。

用于植物再生的方法在本领域中也是熟知的。例如，Ti质粒载体已用于递送外来DNA、连同直接DNA摄取，脂质体，电穿孔，显微注射、和微粒轰击。此外，也可以将来自土壤杆菌属的细菌用于转化植物细胞。以下说明的是用于转化双子叶植物和单子叶植物的代表性技术、连同代表性的质粒转化技术。

许多载体可以用于使用根瘤土壤杆菌的转化。这些载体典型地携带至少一个T-DNA边缘序列，并且包括载体，例如pBIN19(Bevan，Nucl.AcidsRes.(1984))。对于用于土壤杆菌转化中的载体的构建，参见例如美国专利申请公开号2006/0260011，通过引用结合在此。

不使用根瘤土壤杆菌的转化规避了对于所选定的转化载体中T-DNA序列的要求，并且因此除了诸如以上说明的含有T-DNA序列的载体之外，可以利用缺少这些序列的载体。不依赖于土壤杆菌的转化技术包括通过微粒轰击、原生质体摄入(例如，PEG和电穿孔)和显微注射进行转化。载体的选择主要取决于所优选的用于进行转化的物种。对于此类载体的构建，参见例如美国公开号20060260011，通过引用结合在此。

对于在植物质体中本发明的核苷酸序列的表达，使用了质体转化载体pPH143(WO 97/32011，实施例36)。该核苷酸序列被插入到pPH143中，由此替换了PROTOX编码序列。然后，将该载体用于质体转化和针对大观霉素抗性来选择转化体。或者，该核苷酸序列被插入pPH143中，由此它替换了aadH基因。在这种情况下，选择转化体用于耐受PROTOX抑制剂。

用于双子叶植物的转化技术在本领域中是熟知的，并且包括基于土壤杆菌的技术和不要求土壤杆菌的技术。非土壤杆菌技术涉及由原生质体或细胞来直接摄取外源遗传物质。这项技术可以由PEG或电穿孔介导的摄取、微粒轰击介导的递送、或显微注射来完成。这些技术的例子说明如下Paszkowskiet al.，EMBO J.3：2717-2722(1984)，Potrykus et al.，Mol.Gen.Genet.199：169-177(1985)，Reich et al.，Biotechnology 4：1001-1004(1986)，和Klein et al.，Nature 327：70-73(1987)。在每种情况下，使用本领域已知的标准技术将这些转化的细胞再生为整株植物。

土壤杆菌介导的转化是用于双子叶植物转化的优选技术，这是由于它的高转化效率和它广泛地用于不同物种的缘故。土壤杆菌转化典型地涉及将携带所感兴趣的外来DNA的双载体(例如pCIB200或pCIB2001)转移到适当的土壤杆菌菌株上，该菌株可以取决于由该宿主土壤杆菌菌株或在共驻存的Ti质粒上或染色体上携带的vir基因的补充物(例如，菌株CIB542用于pCIB200和pCIB2001(Uknes et al.Plant Cell 5：159-169(1993))。将重组二元载体转移到土壤杆菌中是通过三亲本交配操作来实现的，这是使用了携带该重组二元载体的大肠杆菌，辅助大肠杆菌菌株(它带有质粒，例如pRK2013，并且能够将该重组二元载体动员到该目标土壤杆菌菌株中)来进行的。或者，该重组二元载体可以通过DNA转化转移到土壤杆菌中(Hofgen&Willmitzer，Nucl.Acids Res.16：9877(1988))。

通过重组土壤杆菌来转化这些目标植物物种通常涉及将土壤杆菌与来自该植物的外植体进行共培养，并且遵循本领域中熟知的科学实验方案进行。经转化的组织在选择性培养基(带有抗生素或存在于这些二元质粒T-DNA边缘之间的除草剂抗性标记物)上再生。

用基因来转化植物细胞的另一种方法涉及在植物组织和细胞中推进惰性的或具有生物活性的颗粒。这项技术公开于美国专利号4,945,050，5,036,006和5,100,792(全部属于Sanford等人)。大体上，该操作涉及在对渗透该细胞的外表面有效的条件下在这些细胞中推进惰性的或具有生物活性的颗粒并且在其内部提供整合。当使用惰性颗粒时，该载体可通过用含有所希望的基因的载体对这些颗粒进行包被而被引入到该细胞中。或者，这种靶细胞可以被该载体包围，这样使得通过唤醒该颗粒将该载体带到该细胞中。生物学活性颗粒(例如，经干燥的酵母细胞，经干燥的细菌或噬菌体，每种均含有被探索引入的DNA)也可以推入植物细胞组织中。

目前，大多数的单子叶植物物种的转化已经变成例行操作。优选的技术包括使用PEG或电穿孔技术直接将基因转移至原生质体中、和微粒子轰击进入愈伤组织。使用单一DNA种类或多个DNA种类(即，共转化)可以进行转化，并且这两类技术均适合用于本发明。共转化可以具有以下优点：避免构建全部载体、并且产生转基因植株(这些转基因植株具有针对所感兴趣的基因和该选择性标记物的未连锁基因座)，使得能够在后代中去除该选择性标记物，如果这被认为是令人希望的话。然而，使用共转化的缺点是单独的DNA种类被整合到该基因组中的频率少于100％(Schocher etal.Biotechnology 4：1093-1096(1986))。

专利申请EP 0292435、EP 0392225、和WO 93/07278说明了用于制备来自玉米原种近交系的愈伤组织和原生质体的技术，使用PEG或电穿孔法的原生质体的转化、和来自经转化的原生质体的玉米植物的再生。Gordon-Kamm等人(Plant Cell 2：603-618(1990))和Fromm等人(Biotechnology 8：833-839(1990))已经发表了使用微粒轰击来转化A188-衍生的玉米系的技术。此外，WO 93/07278和Koziel等人(Biotechnology 11：194-200(1993))说明了通过微粒轰击来转化玉米原种近交系的技术。这项技术利用了从授粉后14-15天的玉米穗上切割的、未成熟的、1.5-2.5mm长的玉米胚和PDS-1000He基因枪(Biolistics)设备用于轰击。

稻的转化也可利用原生质体或微粒子轰击通过直接的基因转移技术来进行。原生质体介导的转化已经被说明用粳型和籼型(Zhang et al.Plant CellRep 7：379-384(1988)；Shimamoto et al.Nature 338：274-277(1989)；Datta etal.Biotechnology 8：736-740(1990))。这两种类型也可使用微粒轰击进行例行转化(Christou et al.Biotechnology 9：957-962(1991))。此外，WO 93/21335说明了经由电穿孔来转化稻的技术。

专利申请EP 0332581说明了用于早熟禾亚科(Pooideae)原生质体的产生、转化和再生的技术。这些技术允许转化鸭茅属(Dactylis.*320-)和小麦。而且，小麦转化已经由Vasil等人(Biotechnology 10：667-674(1992))进行说明，使用了微粒轰击进入C型长期再生的愈伤组织的细胞中，并且还由Vasil等人(Biotechnologyl 11：1553-1558(1993))和Weeks et al.(PlantPhysiol.102：1077-1084(1993))进行说明，使用了对未成熟胚和未成熟胚衍生的愈伤组织的微粒轰击。然而，一项用于小麦转化的优选技术涉及通过微粒轰击未成熟胚来转化小麦，并且在基因递送之前包括高蔗糖或高麦芽糖的步骤。在轰击之前，将任何数量的胚(0.75-1mm长)放置在含有3％的蔗糖(Murashiga&Skoog，Physiologia Plantarum 15：473-497(1962))和3mg/l 2，4-D的MS培养基用于体细胞胚的诱导，该诱导允许在黑暗下进行。在所选定的进行轰击的当天，将这些胚从诱导培养基上去除，并将其放置在渗透剂上(即，含有添加至所希望的浓度(典型地为15％)的蔗糖或麦芽糖的诱导培养基)。这些胚被允许质壁分离2-3小时，并接着被轰击。每个目标培养皿中20个胚是典型的，尽管不是至关重要的。使用标准操作将适当的携带基因的质粒(例如，pCIB3064或pSOG35)沉淀到微米大小的金颗粒上。使用大约1000psi的爆发压力使用80目的筛，用DuPont

氦装置对胚的每个培养皿进行射击。轰击后，将这些胚放置回黑暗中以便恢复大约24小时(仍旧在渗透剂上)。24小时后，将这些胚从该渗透剂上去除，并将其放置回诱导培养基，在再生之前它们在其中放置了大约1个月。大约一个月之后，将这些具有正在发育的胚胎发生的愈伤组织的胚外植体转移到再生培养基(MS+1mg/升NAA，5mg/升GA)中，该培养基进一步包含适当的选择剂(在pCIB3064的情况下是10mg/l basta而在pSOG35的情况下是2mg/l氨甲蝶呤)。大约一个月之后，将已发育的芽转移到更大的被称为“GA7”的无菌容器中，这些容器包含半强度的MS、2％蔗糖、和相同浓度的选择剂。

也已经说明了使用土壤杆菌来转化单子叶植物。参见WO 94/00977和美国专利号5,591,616，这两者均通过引用结合在此。还参见Negrotto et al.，Plant Cell Reports 19：798-803(2000)，通过引用结合在此。

例如，稻(Oryza Sativa)可以用来产生转基因植物。可以使用不同的稻栽培品种(Hiei et al.，1994，Plant Journal 6：271-282；Dong et al.，1996，Molecular Breeding 2：267-276；Hiei et al.，1997，Plant Molecular Biology，35：205-218)。同样，以下说明的不同介质成分可以在数量上变化或被替代。通过培养于MS-CIM培养基上(MS basal salts，4.3g/升；B5维生素(200X)，5ml/升；蔗糖，30g/升；脯氨酸，500mg/升；谷氨酰胺，500mg/升；酪蛋白水解物，300mg/升；2，4-D(1mg/ml)，2ml/升；用1N KOH将pH调节至5.8；植物凝胶(phytagel)，3g/升)而起始了胚发生响应和/或由成熟的胚建立了培养物。将处于培养响应的起始阶段的成熟胚或已确定的培养系进行接种，并且用包含所希望的载体构建体的土壤杆菌菌株LBA4404(土壤杆菌)进行共培养。土壤杆菌在固体YPC培养基(100mg/L大观霉素或任何其他适当的抗生素)上从甘油母液中进行培养，在28℃培养大约2天。将土壤杆菌重新悬浮于液态MS-CIM介质中。将土壤杆菌培养物稀释到0.2至0.3的OD600，并且加入乙酰丁香酮(Acetosyringone)直至终浓度为200μM。在将该溶液与这些稻培养物混合以便诱导土壤杆菌用于DNA转移至这些植物细胞中之前，加入土壤杆菌。为了接种，将这些植物培养物浸入该细菌悬液中。将这种液体细菌悬浮液去除，并且将经接种的培养物放置在共培养的培养基上并且在22℃孵育2天。然后，这些培养物被转移到含有替卡西林(Ticarcillin)(400mg/升)的MS-CIM培养基上以便抑制土壤杆菌的生长。对于利用这种PMI选择性标记基因的构建体(Reed et al.，In VitroCell.Dev.Biol.-Plant 37：127-132)，将培养物转移到含有甘露糖作为碳水化合物来源的选择性培养基(MS，其中2％是甘露糖，300mg/升的替卡西林)7天后，并且在黑暗中培养3-4周。然后，将抗性集落继转移到再生诱导培养基(MS，其中没有2，4-D、0.5mg/升IAA、1mg/升玉米素(zeatin)，200mg/升特美汀(timentin)，2％甘露糖和3％山梨糖醇)，并且在黑暗中生长14天。然后，将增殖的集落转移到另一轮再生的诱导介质中，并且将其转到光照培养室。将再生的芽转移到具有GA7-1培养基(MS，没有激素和2％的山梨糖醇)的GA7容器持续2周，并接着当它们足够大并且含有足够多的根时被转到温室中。将植物移栽到温室的土壤中(以便产生)长至成熟，并且收获T1代种子。

通过用本发明的核酸序列进行转化获得的植株可以是多种多样的植物物种中的任何一种，包括那些单子叶植物和双叶子植物，然而，在本发明的方法中所使用的植物更优选地是选自以上所列的一列农艺学上重要的目标作物。本发明的基因的表达连同对生产和质量重要的其他特征可以通过育种结合到植物系中。育种的方法和技术在本领域中是已知的。参见例如Welsh J.R.，Fundamentals of Plant Genetics and Breeding，John Wiley&Sons，NY(1981)；Crop Breeding，Wood D.R.(Ed.)American Society of AgronomyMadison，Wis.(1983)；Mayo O.，The Theory of Plant Breeding，Second Edition，Clarendon Press，Oxford(1987)；Singh，D.P.，Breeding for Resistance toDiseases and Insect Pests，Springer-Verlag，NY(1986)；和Wricke and Weber，Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding，Walter de Gruyter and Co.，Berlin(1986)。

对于质体的转化，烟草(Nicotiana tabacum c.v.)“Xanthienc”的种子以1″循环阵列在T琼脂培养基上每个培养皿产生7个萌芽，并且在用1μm钨微粒(包被着来自质粒pPH143和pPH145的DNA)(M10，Biorad，HercμLes，Calif.)进行播种后轰击12-14天，基本上如所说明(Svab，Z.and Maliga，P.(1993)PNAS 90，913-917)将轰击的种苗在T培养基上孵育2天，在这之后将它的叶子剪去并且在光亮中(350-500umol质子/m²/s)将轴外面向上放置于含有500μg/ml二盐酸大观霉素(Sigma，St.Louis，Mo.)的RMOP培养基上(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.and Maliga，P.(1990)PNAS 87，8526-8530)。在轰击3-8周之后将在脱色的叶子下面出现的具有抗性的芽在同一选择性培养基上进行亚克隆，允许形成愈伤组织，并且将次生芽分离并进行亚克隆。在独立的亚克隆中经转化的质体基因组拷贝的完整分离(同质体性(homoplasmicity))是由DNA印迹杂交的标准技术进行评估的(Sambrooket al.，(1989)MolecμLar Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor)。BamHI/EcoRI酶切的总细胞DNA(Mettler，I.J.(1987)Plant Mol Biol Reporter 5，346349)在1％的Tris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶上被分开、转移到尼龙膜(Amersham)上、并且用sup.32P标记的随机配对的DNA序列进行探测，这些DNA序列对应于0.7kbBamHI/HindIII DNA片段，该片段来自包含rps 7/12质体靶向的序列的pC8。将同质体的芽无菌地扎根于包含大观霉素的MS/IBA培养基上(McBride，K.E.et al.(1994)PNAS 91，7301-7305)并且转移到温室中。

这些引入到以上说明的转基因种子和植物中的遗传特性仅仅通过有性繁殖或营养生长来传递下去，并且由此在后代植物中保存和繁殖。大体上，维护和繁殖使用了已知的农业方法，这些方法已发展为适应特异性目的，例如，耕种、播种或收获。

根据本发明的这些转基因植物和种子的遗传特性的优势的用途可以在植物育种上进一步进行。取决于所希望的特性，采用不同的育种措施。相关的技术是在本领域内是熟知的，并且包括不仅限于杂交、近亲繁殖、回交育种、多系育种、变种混合、种间杂交、非整倍体技术、等等。因此，根据本发明的转基因种子和植物可以用来改良植物系的育种，这些植物系例如增加常规方法的效力，例如除草剂或杀虫剂处理、或由于它们经修饰的遗传特性而允许免除所述的方法。

通过说明而非限制性的方式提供了以下的实施例。

实施方案

实施例1.单子叶植物和双子叶植物优化的基因

使用Vector NTI 9.0中的回译程序设计了双子叶植物和单子叶植物的合成基因。使用对于单子叶植物或双子叶植物优选的密码子将4种蛋白序列回译成单子叶植物优化的和双子叶植物优化的编码序列。将额外的序列加到每种纤维素酶基因编码序列的5’和3’端用于克隆和差异性地靶向多个亚细胞区室。这些序列包括BamHI克隆位点、Kozak序列、和5’端的N-末端信号序列。将靶向液泡或内质网(ER)的序列、和SacI克隆位点加入到3’端。引入沉默突变以去除干扰克隆策略的任何限制性酶切位点。通过GENEART(德国)合成了合成基因。表1概述了几种基因和表达盒的组分，它们在实施例中进行进一步说明。

表1：在实施例中说明的序列和序列表

实施例2.构建植物表达载体

针对单子叶植物和双子叶植物优化的纤维素酶这两者设计了能够在转基因植物中指导纤维素酶表达的表达载体。烟草表达载体使用了组成型启动子夜香树黄化曲叶病毒(CYLCV)启动子加上前导序列(SEQ ID NO：9)来驱动这些双子叶植物优选的纤维素酶基因的表达。烟草表达的纤维素酶通过融合到大豆的大豆球蛋白GY1信号序列(SEQ ID NO：3)和ER保留序列(SEQ ID NO：4)上而靶向内质网(ER)。烟草表达的纤维素酶通过该纤维素酶基因在C-端与sporamin靶向液泡的序列(SEQ ID NO：5)融合(Plant Phys114：863-870(1997))并且在N-端与GY1信号序列融合而靶向该液泡。该纤维素酶的质体靶向是通过来自融合到N-末端的Cyanophora paradoxa的铁氧化还原蛋白-NADP+还原酶(FNR)的转运肽(SEQ ID NO：6)(FEBS Letters381：153-155(1996))。

使用大豆的大豆球蛋白GY1启动子和信号序列(GenBank AccessionX15121)来驱动大豆种子特异性的纤维素酶表达。将该纤维素酶靶向大豆涉及C-端加入ER保留序列(SEQ ID NO：4)或来自β-伴大豆球蛋白的蛋白贮藏液泡(PSV)序列(SEQ ID NO：7)(Plant Phys 2004：134，625-639)。

玉米PepC启动子(The Plant Journal 1994：6(3)，311-319)用于驱动玉米叶特异性表达每种单子叶植物优化的纤维素酶。将该纤维素酶基因在N-端融合到γ玉米素27kD信号序列(SEQ ID NO：8)上从而靶向穿过ER，并且融合到大麦多胺氧化酶(SEQ ID NO：2)的液泡序列结构域(VSD)上从而指导该纤维素酶进入该液泡(Plant Phys 2004：134，625-639)。或者，使用ER保留序列(SEQ ID NO：4)来代替VSD从而将该纤维素酶保留在ER中。质体靶向的构建体包含以上说明的FNR转运肽。将这些玉米优化的纤维素酶中每酶在该水稻谷蛋白启动子之后进行克隆，用于该玉米种子的胚乳中表达。如以上所说明，将额外的序列加入用于将该蛋白靶向到胚乳的ER。载体组分的信息示于表2。使用本领域中已知的重组DNA技术将所有表达盒亚克隆到二元载体中用于转化进入烟草、大豆和玉米中。

表2.用于转基因烟草、玉米、和大豆事件生产的植物表达载体

实施例3.转基因植物的蛋白分析

从大约100mg的叶组织、或从玉米产生的面粉、和从非转基因和转基因的植物的大豆种子中获得了蛋白提取物。将叶子材料放入含有小钢球的96个深孔块中，并且在干冰上预冷。使用Geno/Grinder(SPEC/CertiPrep，Metuchen，New Jersey)将这些样品研磨成细粉。通过汇集大约10-20个种子来制备面粉样品并且使用KLECO Grinder(Gracia Machine Company，Visalia，CA)研磨成细粉。在室温下将这些样品提取到250-500μl的Western Blot提取缓冲液(Western Extraction Buffer)(WEB＝12.5mM硼酸钠、pH10；2％BME；和1％SDS)或测定缓冲液中持续大约30分钟、之后跟随以13,000rpm离心约5分钟。

通过将100μl的WEB样品转移到eppendorf管并且加入25μl的4XBioRad LDS或改进的BioRad加样缓冲液(4X BioRad LDS：BME，以2：1的比例)进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。在70℃下将样品加热10分钟，然后立即放在冰上5分钟。短暂地旋转样品后，并且转回放到冰上。使用MOPS缓冲液将样品提取物(5-10μl)在BioRad 4-12％Bis/Tris蛋白胶(18孔)上跑胶。

使用凉的Nupage转移缓冲剂(Invitrogen)通过在100volt下将SDS-PAGE胶转移到硝酸纤维素膜上持续30分钟来进行免疫印迹分析。使用丽春红染料(Sigma)看到了转移到该印迹上的总蛋白。丽春红(ponceau)染色之后，将该膜在封闭缓冲液中在含有3％奶粉的TBST洗涤缓冲液(30mM Tris-HCL，pH 7.5，100mM NaCl，和0.05％Tween 20)中孵育30分钟，然后在TBST中洗涤3次每次5分钟。以1ug/ml在含有3％奶的TBST洗涤缓冲液中加入多克隆的羊或兔的一抗，并且将该印迹孵育2小时至过夜。过夜孵育之后，用TBST洗涤缓冲液将该印迹洗涤3次每次5分钟。将二抗(兔-AP或山羊-AP)稀释为1：8000(在TBST中)并且加入，从而形成印迹持续30分钟。用该二抗孵育之后，再次洗涤该印迹3次每次5分钟。通过加入Moss BCIP/NBT-碱性磷酸酶底物可以看到多个免疫反应条带。在BCIP/NBT底物中孵育之后用水彻底冲洗这些印迹并且允许风干。

用于活性分析的样品提取物的蛋白印迹分析表明在免疫反应性蛋白的积累与酶活性之间的相关性(说明于实施例4中)。具有靶向ER的序列(构建体15936)的CBH1检测为条带，该条带迁移接近于该全长酶的预测大小(带有靶向ER的序列和保留序列为56.6kD，并且当靶向ER的序列被处理掉而在该ER中形成CBH1酶时为53.3kD)。在该Westem Blot中还检测到第二条更小的约为51kD的条带。靶向到该叶子液泡的CBH1(构建体15935)主要以51kD蛋白的形式积累。

使用Western Blot法分析来筛选用构建体15942和构建体15944产生的转基因玉米植物。这种玉米叶表达的、具有靶向ER的序列(构建体15944)的CBH1(SEQ ID NO：14)检测为条带，该条带迁移接近于该全长酶的预测大小(57kD)。还发现第二个宽条带，中心为大约51kD。液泡靶向的CBH1(SEQ ID NO：14)(构建体15942)在大约51kD显示宽的条带，而在57kD具有小的条带。

叶子生长(ER靶向)24天后和叶子生长(液泡靶向)41天后还测量了CBH1靶向到玉米叶的ER或靶向到玉米叶的液泡的水平。

在种植表达的CBH1靶向到ER的玉米60天后还收获了叶子并且允许干燥。将50mg的干叶粉末在强变性缓冲液中进行提取，并且如以上所说明通过SDS-PAGE和Western Blot法分析样品。

实施例4.酶的提取和转基因事件的活性分析。

将大约100mg的转基因植物的新鲜叶组织或种子粉末提取到5至10ml的以下缓冲剂之一中：(A)100mM乙酸钠，0.02％Tween，0.02％叠氮钠pH4.75，1％PVP和完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂(Roche)；(B)100mM乙酸钠，1mg/ml BSA，0.02％Tween，和0.02％叠氮钠pH 4.75；或(C)100mM乙酸钠pH 5.3，100mM NaCl，1mg/ml明胶，1mM EDTA，0.02％Tween-20，0.02％NaN₃用于从叶或从种子中提取蛋白的可替代缓冲剂在本领域中是熟知的。将样品置于台式离心机上30-60分钟，然后以3000rpm离心10分钟。对于新鲜的叶样品，通过Pierce BCA实验方案如在产品说明书中所介绍来测量所提取的总蛋白量。使用以下底物之一进行纤维素酶活性测定：pNP-乳糖苷、甲基伞形酮基-乳糖苷(MUL)、羧甲基纤维素、燕麦-μ葡聚糖、磷酸处理的纤维素(PASC)、艾维素(Avicel)、或遵循以前公开的实验方案(Methods in Enzymology，Vol 160)用于测量纤维素酶活性的其他可商购的底物。对于转基因植物表达CBH1所生成的酶活性数据在表3-7中给出。对于玉米叶在ER中和在液泡中表达CBH2所生成的酶活性数据示于表8中。对于玉米叶在24天的ER中和在41天绿叶的液泡中表达CBH1所生成的酶活性数据、连同在100天的干叶子的ER中的数据也得以生成。

总之，这些烟草转基因植物表明使用sporamin靶向液泡的序列将纤维素酶靶向该液泡与将同样的蛋白靶向ER相比促进更多的蛋白积累在烟草叶子中。此外，用这种sporamin靶向液泡的序列将这些纤维素酶靶向该液泡没有导致高水平的酶积累，正如在表达同样的、靶向具有靶向BPAO的序列的液泡的纤维素酶的玉米植物中观察到。

该转基因玉米的数据与该转基因烟草的数据是一致的，因为与当同样的酶靶向到ER时所观察到的相比靶向液泡导致纤维素酶更高的积累。然而，将该纤维素酶靶向ER导致蛋白产物的积累，这些蛋白产物当与同样的纤维素酶靶向该液泡时观测到的相比更接近于预测大小的纤维素酶。通过Western Blot法并且通过比较由表达液泡或ER靶向的纤维素酶的转基因植物所产生的这些产物来完成该分析。

应当注意到较高分子量的酶积累在这些表达构建体的ER靶向的形式中。这些较高分子量的产物更可能是该基因的全长产物。这些较高分子量产物可能是该基因的截短的形式，该基因通过例如糖基化进行加工，糖基化可以改变通过Western Blot法观察到的这些产物的大小。最后，这些更高分子量的产物除了被例如通过糖基化进一步加工之外还可能是该基因的全长产物，其中糖基化可能改变由Western Blot法观察到的这些产物的大小。

表3.在表达双子叶植物优化的、靶向到烟草叶子的液泡(构建体15935)和ER(构建体15936)的CBH1(SEQ ID NO：10)的转基因烟草事件中纤维二糖水解酶I(CBHI)的活性总结样品提取到缓冲剂A中，并且以甲基伞形酮基-乳糖苷作为底物进行CBH1活性测定。

ND＝未检测到

表4.在表达单子叶植物优化的、由靶向玉米叶的液泡的SEQ ID NO：14的多核苷酸所编码的CBH1的转基因玉米事件(构建体15942)中纤维二糖水解酶I(CBHI)的活性总结。样品提取到缓冲剂A中，并且以甲基伞形酮基-乳糖苷作为底物进行CBH1活性测定。

植物身份号	平均nmol/min/mg蛋白	标准差	Western Blot法
				001A	1.51	0.46	+
002A	0.63	0.05	+
				003A	0.53	0.18	+
004A	1.01	0.34	+
				005A	0.04	0.01	-
006A	0.03	0.01	-
				007A	2.34	0.48	+
008A	0.48	0.05	+
				009A	0.65	0.05	+

011A	0.11	0.05	-
				012A	1.47	0.12	+
013A	1.88	0.62	+
				014A	0.68	0.14	+
015A	3.45	0.17	+
				016A	3.17	0.42	+
018A	2.32	0.52	+
				019A	4.33	2.02	+
021A	0.88	0.01	+
				022A	2.69	0.15	+
023A	0.03	0.00	-
				024A	4.84	0.36	+
025A	1.77	0.22	+
				026A	0.57	0.04	+
027A	1.87	0.77	+
				028A	8.43	1.09	+
029A	1.88	0.70	+
				030A	1.08	0.04	+
非转基因的对照	0.07	0.00	-

表5.在表达单子叶植物优化的、由靶向玉米叶的ER的SEQ ID NO：14的多核苷酸所编码的CBH1的转基因玉米事件(构建体15944)中纤维二糖水解酶I(CBHI)的活性总结。样品提取到缓冲剂A中，并且以甲基伞形酮基-乳糖苷作为底物进行CBH1活性测定。

植物身份号	平均nmol/min/mg蛋白	标准差	Western Blot法
				001A	1.71	0.09	+
002A	0.01	0.00	-
				003A	1.10	0.13	+
004A	0.03	0.00	-
				005A	0.63	0.04	+
006A	ND	ND	-
				007A	ND	ND	-
008A	ND	ND	-
				009A	1.20	0.04	+
010A	ND	ND	-
				011A	ND	ND	+
012A	1.34	0.09	+
				013A	5.85	0.43	+
014A	1.20	0.07	+
				015A	1.95	0.19	+
016A	ND	ND	-
				017A	2.50	0.07	+
018A	ND	ND	+
				019A	ND	ND	-
020A	0.91	0.07	+
				021A	2.34	0.05	+

022A	ND	ND	-
				023A	ND	ND	+
024A	ND	ND	-
				025A	ND	ND	+
026A	ND	ND	+
				027A	1.51	0.09	+
028A	ND	ND	+
				029A	ND	ND	+
030A	ND	ND	+
				031A	2.36	0.07	+
032A	ND	ND	-
				033A	1.59	0.11	+
034A	ND	ND	+
				035A	1.14	0.11	+
036A	1.06	0.09	+
				037A	1.27	0.21	+
038A	0.55	0.01	+
				039A	1.51	0.02	+
040A	1.36	0.15	+
				041A	0.53	0.01	+
042A	0.02	0.00	-
				043A	1.15	0.05	+
044A	0.81	0.03	+

045A	ND	ND	-
				046A	0.52	0.03	+

ND＝未检测到

实施例5.微晶纤维素结合和水解测定法

艾维素结合测定法如以上所说明，将大约100mg的叶组织提取到5mL的测定缓冲剂(A)中。提取后，将大约250ul的样品与25mg艾维素(微晶纤维素)孵育0和60分钟。将零时间点的样品加入到Eppendorf管，该管在加入提取物之前置于冰上并立即处理。在室温下将样品在台式漩涡振荡器上孵育60分钟。孵育后，将样品在eppendorf离心机中以13000rpm离心5分钟。小心地去除上清液，并且用冰水将艾维素洗涤3次。最后洗涤之后，将80ul的Western Blot提取缓冲液(WEB)和25ul的BioRad 4X加样缓冲液加入该样品中。将样品漩涡振荡，然后在70℃下放至10分钟。将艾维素以13000rpm沉淀，并且去除上清液并且如以上所说明通过Western Blot法进行分析。

通过以上段落中说明的艾维素结合测定方法对衍生自构建体15935(Nt22-16A，Nt22-19A)和构建体15936(Nt23-11A，Nt23-23B，Nt23-30B)的转基因植物进行分析。通过Western Blot分析，植物Nt22-16A、Nt23-11A和Nt23-23B是阳性的；而在艾维素测定方法中，植物Nt22-19A和Nt23-30B是阴性的。该数据汇总于表3中。

艾维素水解测定法将转基因叶样品冷冻干燥，然后使用Kleco研磨器研磨成细粉。将大约150mg的经研磨的叶材料称重，并且在室温下提取到4ml缓冲剂A中持续30分钟。将样品离心并且弃去上清液。将加入到非表达转基因提取物中的1ml的每种叶提取物、真菌表达的BD22308或里氏木霉CBH1(Megazyme International)酶、或真菌酶类加入到50mg艾维素中，并且在37℃下将样品置于漩涡振荡器上。使用BCA试剂(Pierce)测量蛋白浓度。在0、24、48和72小时取出两份100μl样品。通过HPLC分析进行糖分析。对于用靶向ER的构建体15944(CBH1(SEQ ID NO：14))转化的玉米转基因植物生成的数据示于表6中。

来自这些转基因植物的蛋白提取物对于总蛋白含量是等效的；然而，这些数据不代表在转基因植物中CBH1(SEQ ID NO：14)表达的相对水平。表6中的数据证明在艾维素测定法中植物表达的纤维素酶是具有活性的，该测定法证明了该纤维素酶与底物的结合和随后的纤维素酶活性。

表6：使用由转基因玉米植物表达的纤维素酶从艾维素中释放纤维二糖

Mega Tr.＝可商购的CBH1，Megazyme TrCBH1

实施例6.植物叶组织中的CBH1蛋白

产生了在实施例2中说明的含有CBH1表达构建体的转基因玉米植物。这些转基因玉米植物生长在温室中，并且在植物的发育过程中在不同点上收获叶子组织。通过收集穗并且在种植后大约45至110天除去水分允许这些温室生长的植物衰老。对由衰老得到的秸秆组织分析纤维素酶蛋白。在分析前将收获的秸秆组织贮藏在-20℃，并且刚好在分析前冻干18至24小时。随后使用Kleco Grinder(Gracia Machine Company，Visalia，CA)将冻干的秸秆组织研磨成细粉来生产秸秆粉。基本上如实施例3和4中所说明，使用大约100mg的秸秆粉来检测秸秆粉中的纤维素酶活性。表7描绘了在该植物的生长、发育和衰老期间在代表性的时间点上检测植物组织中的纤维素酶测量为组织克数的函数的纤维素酶活性表明在衍生自转基因玉米植物的秸秆组织中纤维素酶是稳定的并且是具有活性的。

用构建体15942(液泡靶向的CBH1)转化的转基因玉米019A与不同的玉米品种杂交从而生成F1杂交种子。F1杂交种子生长于温室中，并且基本上如以上在实施例6中所说明从秸秆粉收集组织样品。基本上如在实施例3和4中所说明对收集的样品分析纤维素酶活性。对于F1杂交植物生成的纤维素酶活性数据在表7中描绘。

用构建体15944(ER靶向的CBH1)转化的转基因玉米017A允许自我授粉并且设定为T1种子。T1种子生长于温室中，并且基本上如以上在实施例6中所说明从秸秆粉中收集组织样品。基本上如在实施例3和4中所说明对收集的样品分析纤维素酶活性。对于T1转基因植物生成的纤维素酶活性数据在表7中描绘。

从转基因玉米植物中收集的秸秆允许在对纤维素酶活性进行测定前在室温下放置一年，基本上如实施例3中所说明。在室温下一年后，该秸秆中纤维素酶的活性与在该秸秆收获时观察到的活性仍然是可比的。这些观察提示这些纤维素酶在秸秆组织中保持稳定。

表7.表达靶向液泡或靶向ER的CBH1的转基因玉米植物使用MUL作为底物测定植物

^*活性测量为组织的平均值nmol/min/g

实施例7.植物组织中的CBH2蛋白

产生了在实施例2中说明的含有CBH2(SEQ ID NO：16)表达构建体的转基因玉米植物。将这些T0转基因玉米植物自我授粉以生成T1种子和植物。通过收集穗并且在种植后约45至110天除去水分允许这些温室生长的植物衰老。对由衰老得到的秸秆组织分析纤维素酶蛋白。在分析之前将收获的秸秆组织贮藏在-20℃，并且刚好在分析前冻干18至24小时。随后，使用KlecoGrinder(Gracia Machine Company，Visalia，CA)将冻干的秸秆组织研磨成细粉以产生秸秆粉。基本上如在实施例3和4中所说明使用大约100mg的秸秆粉来确定秸秆粉中的纤维素酶活性。表8描绘了在该植物的生长、发育和衰老期间在代表性的时间点上检测T1转基因植物组织中的纤维素酶

表8：表达CBH2(SEQ ID NO：12)的T1转基因玉米植物。使用PASC作为底物测量酶活性

^*活性测量为组织的平均值nmol/min/克

实施例8：表达葡聚糖内切酶的转基因玉米植物

对从真菌物种分离的葡聚糖内切酶进行鉴别，并且将其克隆到含有PEPC绿色组织启动子的表达载体中、或克隆到含有稻谷蛋白启动子的表达载体中用于种子表达。将这些表达盒亚克隆到含有选择性标记PMI的转化载体中。通过土壤杆菌转化和随后选择PMI表达而生成转基因玉米植物。通过对在含有该葡聚糖内切酶或PMI选择性标记的表达盒中的任何组分进行Taqman分析将证实转基因玉米植物。

基本上如在实施例3中所说明对转基因玉米植物测定葡聚糖内切酶表达。靶组织将是叶、种子和秸秆。

实施例9.表达纤维素酶的转基因甘蔗

在实施例2和表2中说明的针对玉米的二元载体转化构建体将用于生成转基因甘蔗植物。使用标准的分子生物学技术将分离含有该纤维素酶表达盒和该选择性标记表达盒的二元载体的片段。使用本领域内的普通技术人员已知的基因枪转化技术将该片段用于转化甘蔗愈伤组织。转基因甘蔗植物将从该愈伤组织中产生，并且基于Taqman分析针对该纤维素酶表达盒或该选择性标记表达盒的任何组分进行选择。

基本上如在实施例3中所说明对转基因甘蔗植物评价纤维素酶的表达。有待评估的这些组织包括茎、叶、秸秆和汁液。

实施例10：在种子中转基因纤维素酶的表达

使用在实施例2中说明的转化载体15928和15929来生成转基因大豆植物。在这些实验中所使用的表达构建体使用了种子优选的启动子来驱动靶向液泡(构建体15928)或内质网(15929)的CBH1(SEQ ID NO：10)纤维素酶的表达。收获来自这些转基因植物的种子，并且基本上如在实施例3中所说明测定CBH1活性。除了酶活性，通过Western Blot法对植物进行评估以确定所产生的CBH1蛋白的大小。CBH1活性数据汇总于表9和10中。对于CBH2(来自实施例2的构建体15975和15982)将产生类似生成的数据。

大豆种子表达的具有靶向液泡的序列(构建体15928)的CBH1检测为在约58kD和53kD处跑出的2个条带。该液泡靶向的蛋白的预测大小为53.7。内质网靶向的CBH1(构建体15929)在大约60kD处显示出主导的单一条带。该内质网靶向的CBH1蛋白的预测大小为53.3kD。该观察与在转基因玉米中生成的数据一致。

表9：表达靶向液泡(SEQ ID NO：2)的CBH1(SEQ ID NO：10)的转基因大豆种子

表10：来自大豆的表达靶向并且保留在ER(SEQ ID NO：3和4)中的CBH1(SEQ ID NO：10)的转基因种子

在本说明书中提到的所有公开文件和专利申请对于本发明所涉及的领域的普通技术人员的技术水平而言是指示性的。所有公开文件和专利申请是通过引用结合在此的，其程度就像每个单独公开文件或专利申请被专门地和单独地表明通过引用结合在此一样。

尽管本发明在上文中出于理解清楚的目的、通过展示和实施例已经相当详细地进行了说明，应当显而易见的是进行某些改变和改进是在所附的权利要求书的范围内的。

Claims (45)

1.分离的核酸分子，包括靶向蛋白贮藏液泡的序列，该序列可操作地连接到编码异源多肽的核酸，该异源多肽被可操作地连接于植物绿色组织启动子。

2.分离的核酸分子，包括靶向C-末端液泡的序列，该序列可操作地连接于编码异源多肽的核酸，该异源多肽被可操作地连接于植物绿色组织启动子。

3.如权利要求1至2之一所述的分离的核酸，其中该靶向液泡的序列由SEQ ID NO：2编码。

4.如权利要求1至2之一所述的分离的核酸，其中该异源多肽是由真菌分泌的蛋白。

5.如权利要求1至3中任何一项所述的分离的核酸，其中该异源多肽是酶。

6.如权利要求5所述的分离的核酸，其中该酶是纤维素酶。

7.如权利要求6所述的分离的核酸，其中该纤维素酶选自由CBH1和CBH2组成的组。

8.如权利要求7所述的分离的核酸，其中该CBH1是由多肽编码的，该多肽选自由SEQ ID NO：11、15、19和和21组成的组。

9.如权利要求7所述的分离的核酸，其中该CBH2是由多肽编码的，该多肽选自SEQ ID NO：13和17组成的组。

10.用于在转基因植物中积累异源蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

a)可操作地连接植物绿色组织启动子、靶向蛋白贮藏液泡的序列、和编码该异源多肽的核酸，和

b)生成转基因植物，其中该异源多肽被靶向到该液泡上。

11.用于在转基因植物中积累异源蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

a)可操作地连接植物绿色组织启动子、靶向C-末端液泡的序列、和编码该异源多肽的核酸，和

b)生成转基因植物，其中该异源多肽被靶向到该液泡上。

12.如权利要求10至11之一所述的方法，其中该靶向序列是由SEQ IDNO：2编码的。

13.如权利要求10至11之一所述的方法，其中该异源多肽是由真菌分泌的蛋白。

14.如权利要求10至11之一所述的方法，其中该异源多肽是酶。

15.如权利要求14所述的方法，其中该酶是纤维素酶。

16.如权利要求15所述的方法，其中该纤维素酶选自CBH1和CBH2组成的组。

17.如权利要求16所述的方法，其中该CBH1是由多肽编码的，该多肽选自SEQ ID NO：11、15、19和21组成的组。

18.如权利要求16所述的方法，其中该CBH2是由多肽编码的，该多肽选自SEQ ID NO：13和17组成的组。

19.转基因植物细胞，包括核酸分子，该核酸分子包括靶向蛋白贮藏液泡的序列，该序列可操作地连接于编码异源多肽的核酸，该异源多肽被可操作地连接于植物绿色组织启动子。

20.转基因植物细胞，包括核酸分子，该核酸分子包括靶向C-末端液泡的序列，该序列可操作地连接于编码异源多肽的核酸，该异源多肽被可操作地连接于植物绿色组织启动子。

21.如权利要求19至20之一所述的转基因植物细胞，其中该植物是单子叶植物。

22.如权利要求19至20之一所述的转基因植物细胞，其中该植物是双子叶植物。

23.如权利要求19至20之一所述的转基因植物细胞，其中该靶向液泡的序列是由SEQ ID NO：2编码的。

24.如权利要求19至20之一所述的转基因植物细胞，其中该异源多肽是由真菌分泌的蛋白。

25.如权利要求19至20之一所述的转基因植物细胞，其中该异源多肽是酶。

26.如权利要求21所述的转基因植物细胞，其中该单子叶植物是玉米。

27.如权利要求26所述的转基因植物细胞，其中该酶是纤维素酶。

28.如权利要求27所述的转基因植物细胞，其中该纤维素酶选自CBH1和CBH2组成的组。

29.如权利要求28所述的转基因植物细胞，其中该CBH1是由多肽编码的，该多肽选自SEQ ID NO：11、15、19和21组成的组。

30.如权利要求28所述的转基因植物细胞，其中该CBH2是由多肽编码的，该多肽选自SEQ ID NO：13和17组成的组。

31.用于在植物秸秆中积累异源多肽的方法，该方法包括以下步骤：

a)将核酸构建体引入所述植物细胞，该构建体包括靶向蛋白贮藏液泡的序列，该序列被可操作地连接于编码异源多肽的核酸；和

b)允许该植物细胞衰老以形成秸秆。

32.用于在植物秸秆中积累异源多肽的方法，包括以下步骤：

a)将核酸构建体引入所述植物细胞，该构建体包括靶向C-末端液泡的序列，该序列被可操作地连接于编码异源多肽的核酸；和

b)允许该植物细胞衰老以形成秸秆。

33.如权利要求31至32之一所述的方法，其中该异源多肽在该秸秆中积累的异源多肽是在该绿色组织中的至少3倍，其中将该异源多肽测量为每单位克组织中异源多肽的量。

34.如权利要求31至32之一所述的方法，其中该秸秆是玉米。

35.如权利要求31至32之一所述的方法，其中该靶向液泡的序列是由SEQ ID NO：2编码的。

36.如权利要求31至32之一所述的方法，其中该异源多肽是由真菌分泌的蛋白。

37.如权利要求36所述的方法，其中该异源多肽是酶。

38.如权利要求37所述的方法，其中该酶是纤维素酶。

39.如权利要求38所述的方法，其中该纤维素酶选自CBH1和CBH2组成的组。

40.如权利要求39所述的方法，其中该CBH1是由多肽编码的，该多肽选自SEQ ID NO：11、15、19和21组成的组。

41.如权利要求39所述的方法，其中该CBH2是由多肽编码的，该多肽选自SEQ ID NO：13和17组成的组。

42.表达接近预测大小的纤维二糖水解酶的方法，该方法包括以下步骤：

a)可操作地连接植物启动子、ER保留序列、和纤维二糖水解酶；

b)分离表达所述纤维二糖水解酶的转基因植物，其中所述纤维二糖水解酶通过Western B1otWestern印迹法迁移到接近该预测的大小。

43.如权利要求42所述的方法，其中该植物启动子选自绿色组织启动子和种子优选的启动子组成的组。

44.如权利要求42所述的方法，其中该转基因植物是大豆。

45.如权利要求31至33中任何一项所述的方法，其中该多肽在衰老组织中稳定至少2至3个月、至少3至6个月、至少6至9个月、至少9个月至1年、或超过1年。