CN105669847B - 大豆蛋白GmVPS9a1在调控植物贮藏蛋白分选中的应用 - Google Patents
大豆蛋白GmVPS9a1在调控植物贮藏蛋白分选中的应用 Download PDFInfo
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Classifications
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Abstract
本发明公开了大豆蛋白GmVPS9a1在调控植物贮藏蛋白分选中的应用。本发明所提供的GmVPS9a1为：B1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；B2)氨基酸序列为SEQID No.1的第1‑467位的蛋白质；B3)在SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的第1‑467位氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由B1)或B2)衍生的蛋白质；B4)在B1)或B2)或B3)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明的植物贮藏蛋白分选相关蛋白影响植物中贮藏蛋白的分选，可以用于培育贮藏蛋白分选正常的转基因植物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中大豆蛋白GmVPS9a1在调控植物贮藏蛋白分选中的应用。
背景技术
大豆是重要的经济作物和粮食作物，含有大量的不饱和脂肪酸和多种必需氨基酸，产量稳定，在我国各地都有种植。为人类提供了占世界植物蛋白供应市场70％左右的蛋白质资源，由大豆加工的豆制品更是人类日常膳食的重要组成部分。在营养价值上，其氨基酸组成与牛奶蛋白质相近，非常接近于理想蛋白的要求，可与动物蛋白等同，在基因结构上最接近人体氨基酸，所以是最具营养的植物蛋白质，由其制作的饮品，被营养学家誉为“绿色牛奶”。美国食品和药品管理局(FDA)的健康通告显示，每天食用含有25g大豆蛋白的食品，有助减少心血管发病率。贮藏蛋白作为大豆籽粒中的第一大类营养物质，在很大程度上决定了大豆的营养价值和各项蛋白质指标。
大豆贮藏蛋白占籽粒总蛋白含量的70％-80％，其中以11S和7S贮藏蛋白含量最高，分别占种子蛋白的40％和30％，它们营养价值丰富，而且食品加工特性优良。细胞学的研究也初步证实了7S和11S贮藏蛋白的分选途径是一条以内质网为起点、中间经由高尔基体，最终以蛋白贮藏液泡为沉积位点的转运线路。以11S球蛋白为例，首先在内质网中合成一个前体分子，进入贮藏液泡后，会被液泡加工酶切割成酸性亚基和碱性亚基。
发明内容
本发明提供的是一个大豆蛋白GmVPS9a1在调控植物贮藏蛋白分选中的应用。
本发明所提供的贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a1在调控植物贮藏蛋白分选中的应用；所述贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a1为如下B1)或B2)或B3)或B4)的蛋白质：
B1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
B2)氨基酸序列为SEQ ID No.1的第1-467位氨基酸的蛋白质；
B3)在SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的第1-467位氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由B1)或B2)衍生的蛋白质；
B4)在B1)或B2)或B3)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
其中，序列1由468个氨基酸组成。
为了使B1)或B2)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的第1-467位氨基酸所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述B3)中的GmVPS9a1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述B3)中的GmVPS9a1的编码基因可通过将序列表中SEQ ID No.2或SEQ ID No.2的第1-1401位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与GmVPS9a1相关的生物材料在调控植物贮藏蛋白分选中的应用。
本发明所提供的与GmVPS9a1相关的生物材料在调控植物贮藏蛋白分选中的应用中，所述生物材料为下述A1)至A14)中的任一种：
A1)编码GmVPS9a1的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
A12)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官。
上述与GmVPS9a1相关的生物材料在调控植物贮藏蛋白分选中的应用中，A1)所述核酸分子可为如下a1)或a2)或a3)或a4)的基因：
a1)核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
a2)核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第1-1401位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
a3)与a1)或a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GmVPS9a1的cDNA分子或基因组DNA分子；
a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码GmVPS9a1的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID No.2由1407个核苷酸组成，编码SEQ ID No.1所示的蛋白质。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GmVPS9a1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的GmVPS9a1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GmVPS9a1且具有GmVPS9a1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码GmVPS9a1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述与GmVPS9a1相关的生物材料在调控植物贮藏蛋白分选中的应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述与GmVPS9a1相关的生物材料在调控植物贮藏蛋白分选中的应用中，A2)所述的含有编码GmVPS9a1的核酸分子的表达盒(GmVPS9a1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GmVPS9a1的DNA，该DNA不但可包括启动GmVPS9a1基因转录的启动子，还可包括终止GmVPS9a1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述GmVPS9a1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述与GmVPS9a1相关的生物材料在调控植物贮藏蛋白分选中的应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述与GmVPS9a1相关的生物材料在调控植物贮藏蛋白分选中的应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。所述农杆菌可为农杆菌EHA105。
上述与GmVPS9a1相关的生物材料在调控植物贮藏蛋白分选中的应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
在本发明的一个实施方式中，GmVPS9a1的编码基因通过含有GmVPS9a1的编码基因的表达盒的重组载体导入根癌农杆菌EHA105中。所述重组载体为在载体pCAMBIA1300-221的XbaI识别序列间插入序列表中SEQ ID No.2的第1-1407核苷酸所示的DNA分子，其他序列不变，得到的重组载体pCAMBIA1300-221-GmVPS9a1。pCAMBIA1300-221-GmVPS9a1与pCAMBIA1300-221的区别仅在于：pCAMBIA1300-221-GmVPS9a1为在pCAMBIA1300-221的XbaI识别序列间插入序列表中SEQ ID No.2的第1-1407位核苷酸所示的DNA分子得到的重组载体。pCAMBIA1300-221-GmVPS9a1表达SEQ ID No.1所示的蛋白质(即贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a1，简称GmVPS9a1蛋白)，GmVPS9a1蛋白的表达由35S启动子启动。
其中，SEQ ID No.1由SEQ ID No.2所示的DNA分子(即贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a1基因,简称GmVPS9a1基因)编码。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育贮藏蛋白分选正常的转基因植物的方法。
本发明所提供的一种培育贮藏蛋白分选正常的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入GmVPS9a1的编码基因得到转基因植物的步骤；所述受体植物贮藏蛋白分选异常，所述转基因植物贮藏蛋白分选正常。
上述方法中，所述GmVPS9a1的编码基因是A1)所述核酸分子。
在本发明的实施例中，所述GmVPS9a1的编码基因通过含有GmVPS9a1基因表达盒的GmVPS9a1基因重组表达载体导入目的植物中。
上述方法中，其中所述GmVPS9a1基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述GmVPS9a1基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
所述GmVPS9a1基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method forPlant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson andCorey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition).)。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述GmVPS9a1基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
为解决上述技术问题，本发明还提供了GmVPS9a1或所述生物材料在培育一种贮藏蛋白分选正常的转基因植物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明还提供了GmVPS9a1或所述生物材料。
本发明中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为水稻。所述水稻具体可为水稻成熟谷蛋白含量降低突变体glup6。
本发明中，所述贮藏蛋白可为所述植物的谷蛋白，如所述植物种子中的谷蛋白。所述贮藏蛋白分选异常具体可为谷蛋白前体异常积累，所述贮藏蛋白分选正常具体可为谷蛋白前体正常积累。
实验证明，本发明的贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a1及其编码基因可以使成熟谷蛋白含量降低突变体glup6中成熟谷蛋白含量上升至正常水平：水稻突变体glup6与T0代转空载体植株种子中谷蛋白前体含量基本无差异，成熟的酸性和碱性亚基含量基本无差异，水稻突变体glup6中谷蛋白前体强度分别为T0代转GmVPS9a1植株不同株系L1、L2和L3的2.28倍、1.87倍和2.47倍，T0代转GmVPS9a1植株不同株系L1、L2和L3的成熟酸性亚基和碱性亚基强度均有提升。T0代转空载体植株与水稻突变体glup6的种子外观基本相同，T0代转GmVPS9a1植株不同株系的种子出现了透明现象。实验证明，本发明的贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a1及其编码基因可以用来培育一种贮藏蛋白分选正常的转基因植物。
附图说明
图1为T0代转GmVPS9a1植株的鉴定结果。其中，泳道1为阳性对照，泳道2为阴性对照，泳道3-7均为T0代转GmVPS9a1植株。
图2为T0代转GmVPS9a2植株的鉴定结果。其中，泳道1为阳性对照，泳道2为阴性对照，泳道3-7均为T0代转GmVPS9a2植株，泳道8为T0代转空载体植株。
图3为T0代转GmVPS9a1植株的种子外观及横切面。其中，TC65表示台中65，glup6表示水稻突变体glup6，L1-L3分别为T0代转GmVPS9a1植株的不同株系。
图4为T0代转GmVPS9a2植株的种子外观及横切面。其中，TC65表示台中65，glup6表示水稻突变体glup6，L1-L3分别为T0代转GmVPS9a2植株的不同株系。
图5为T0代转GmVPS9a1植株的种子蛋白质的电泳结果。其中，TC65表示台中65，glup6表示水稻突变体glup6，L1-L3分别为T0代转GmVPS9a1植株的不同株系。
图6为T0代转GmVPS9a2植株的种子蛋白质的电泳结果。其中，TC65表示台中65，glup6表示水稻突变体glup6，L1-L3分别为T0代转GmVPS9a2植株的不同株系。
图7为T0代转GmVPS9a1植株的种子中的谷蛋白前体强度结果。其中，TC65表示台中65，glup6表示水稻突变体glup6，L1-L3分别为T0代转GmVPS9a1植株的不同株系。
图8为T0代转GmVPS9a2植株的种子中的谷蛋白前体强度结果。其中，TC65表示台中65，glup6表示水稻突变体glup6，L1-L3分别为T0代转GmVPS9a2植株的不同株系。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的载体pCAMBIA1300-221(Xiao-Bao Ying et al.,RNA-DependentRNA Polymerase 1 from Nicotiana tabacum Suppresses RNA Silencing and EnhancesViral Infection in Nicotiana benthamiana.Plant Cell.2010)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的水稻突变体glup6(Tian et al.,Gene analysis of new 57Hmutant gene,glup6,in rice.R.G.Newslett.,2001,18:48-50.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、贮藏蛋白分选相关蛋白可以调控贮藏蛋白的分选
本实施例提供了两个来源于大豆Williams 82(Haun,W.J.,Hyten,D.L.,Xu,W.W.,Gerhardt,D.J.,Albert,T.J.,Richmond,T.,Jeddeloh,J.A.,Jia,G.F.,Springer,N.M.,Vance,C.P.&Stupar,R.M.(2011).The Composition and Origins of Genomic Variationamong Individuals of the Soybean Reference Cultivar Williams 82.PlantPhysiology 155,645-655.国家种质库编号：I2A12645，统一编号：WDD00587)的贮藏蛋白分选相关蛋白基因，分别是贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a1基因和贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a2基因。
1、重组载体及重组菌的制备
在载体pCAMBIA1300-221的XbaI识别序列间插入序列表中SEQ ID No.2的第1-1407位核苷酸所示的DNA分子，其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为pCAMBIA1300-221-GmVPS9a1。pCAMBIA1300-221-GmVPS9a1与pCAMBIA1300-221的区别仅在于：pCAMBIA1300-221-GmVPS9a1为在pCAMBIA1300-221的XbaI识别序列间插入序列表中SEQID No.2的第1-1407位核苷酸所示的DNA分子得到的重组载体。pCAMBIA1300-221-GmVPS9a1中表达SEQ ID No.1所示的蛋白质(即贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a1，简称GmVPS9a1蛋白)，GmVPS9a1蛋白的表达由35S启动子启动。
其中，SEQ ID No.1由468个氨基酸组成，由SEQ ID No.2所示的DNA分子(即贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a1基因,简称GmVPS9a1基因)编码。
在载体pCAMBIA1300-221的XbaI识别序列间插入序列表中SEQ ID No.4的第1-1401位核苷酸所示的DNA分子，其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为pCAMBIA1300-221-GmVPS9a2。pCAMBIA1300-221-GmVPS9a2与pCAMBIA1300-221的区别仅在于：pCAMBIA1300-221-GmVPS9a2为在pCAMBIA1300-221的XbaI识别序列间插入序列表中SEQID No.4的第1-1401位核苷酸所示的DNA分子得到的重组载体。pCAMBIA1300-221-GmVPS9a2中表达SEQ ID No.3所示的蛋白质(即贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a2，简称GmVPS9a2蛋白)，GmVPS9a2蛋白的表达由35S启动子启动。
其中，SEQ ID No.3由466个氨基酸组成，由SEQ ID No.4所示的DNA分子(即贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a2基因,简称GmVPS9a2基因)编码。
分别将载体pCAMBIA1300-221、pCAMBIA1300-221-GmVPS9a1和pCAMBIA1300-221-GmVPS9a2导入农杆菌EHA105菌株(英潍捷基(上海)贸易有限公司)中，分别得到的含有pCAMBIA1300-221、pCAMBIA1300-221-GmVPS9a1和pCAMBIA1300-221-GmVPS9a2的重组农杆菌，将其分别命名为EH-pCAMBIA1300-221、EH-pCAMBIA1300-221-GmVPS9a1和EH-pCAMBIA1300-221-GmVPS9a2。
2、转基因植物的制备
分别利用步骤1的重组农杆菌EH-pCAMBIA1300-221、EH-pCAMBIA1300-221-GmVPS9a1和EH-pCAMBIA1300-221-GmVPS9a2进行转基因实验，具体步骤如下：
(1)28℃培养EH-pCAMBIA1300-221-GmVPS9a1 16小时，收集菌体，并稀释到N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至OD600≈0.5，获得菌液；
(2)将培养至一个月的水稻突变体glup6成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天；
(3)将步骤(2)共培养后的愈伤组织接种在N6固体筛选培养基1(N6固体筛选培养基1为向N6固体培养基中加入潮霉素得到的潮霉素浓度为100mg/L的培养基)上24℃培养16天进行第一次筛选；
(4)挑取步骤(3)第一次筛选后的健康的愈伤组织转入上述N6固体筛选培养基1上24℃下培养进行第二次筛选，每15天继代一次；
(5)挑取步骤(4)第二次筛选后的健康的愈伤组织转入N6固体筛选培养基2(N6固体筛选培养基2为向N6固体培养基中加入潮霉素得到的潮霉素浓度为50mg/L的培养基)上24℃下培养进行第三次筛选，每15天继代一次；
(6)挑取步骤(5)得到的抗性愈伤组织转入水稻分化培养基(北京西美杰科技有限公司产品，货号为C167)上24℃下进行分化，得到分化成苗的T0代转GmVPS9a1植株。
按照上述步骤的方法，将EH-pCAMBIA1300-221-GmVPS9a1分别替换为EH-pCAMBIA1300-221和EH-pCAMBIA1300-221-GmVPS9a2，其他步骤均不变，分别得到T0代转空载体植株和T0代转GmVPS9a2植株。
利用引物5′-GAAGTTTTCGGGGAGTTTCC-3′和5′-AGCAACAAGGTCATCCTTCG-3′对T0代转GmVPS9a1植株进行鉴定，用pCAMBIA1300-221-GmVPS9a1作为阳性对照，用水稻粳稻品种Kitaake基因组DNA作为阴性对照，结果如图1所示。结果显示，T0代转GmVPS9a1植株均含有目的基因GmVPS9a1基因(图1中泳道3-7)。
利用引物5′-AGTTTTCGGGGAGTTTCCAT-3′和5′-CATCACCCTCAGGAGCAACT-3′对T0代转GmVPS9a2植株和T0代转空载体植株进行鉴定，用pCAMBIA1300-221-GmVPS9a2作为阳性对照，用水稻粳稻品种Kitaake基因组DNA作为阴性对照，结果如图2所示。结果显示，T0代转GmVPS9a2阳性植株均含有目的基因GmVPS9a2基因(图2中泳道3-7)，T0代转空载体植株不含有GmVPS9a2基因(图2中泳道8)。
3、转基因植株的表型检测
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
分别将步骤2的T0代转空载体植株、T0代转GmVPS9a1植株与T0代转GmVPS9a2植株以及台中65、水稻突变体glup6种植在试验田中，至种子成熟。种子成熟后，收取各植株种子并去壳，观察种子。
结果显示，T0代转空载体植株与水稻突变体glup6的种子外观基本相同，T0代转GmVPS9a1植株与T0代转GmVPS9a2植株种子均出现了透明现象(图3和图4)，并且T0代转GmVPS9a1植株与T0代转GmVPS9a2植株不同株系的种子有不同程度的透明现象。
分别提取T0代转GmVPS9a1植株与T0代转GmVPS9a2植株不同株系以及T0代转空载体植株、水稻突变体glup6、台中65种子蛋白进行蛋白质电泳(图5和图6)，根据蛋白电泳结果对谷蛋白前体进行定量，各株系中谷蛋白前体强度如图7和图8所示。
结果显示，水稻突变体glup6种子中谷蛋白前体强度分别为T0代转GmVPS9a1植株不同株系L1、L2和L3的2.28倍、1.87倍和2.47倍，T0代转GmVPS9a1植株不同株系L1、L2和L3的成熟酸性亚基和碱性亚基强度均有提升；水稻突变体glup6种子中谷蛋白前体强度分别为T0代转GmVPS9a2植株不同株系L1、L2和L3的2.80倍、4.08倍和3.55倍，T0代转GmVPS9a2植株不同株系L1、L2和L3的成熟酸性亚基和碱性亚基强度均有提升。表明，GmVPS9a1及其基因和GmVPS9a2及其基因均可以使水稻突变体glup6的贮藏蛋白分选恢复正常。
Claims (9)
1.贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a1在调控植物贮藏蛋白分选中的应用；所述贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a1为如下B1）或B2）的蛋白质：
B1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
B2）氨基酸序列为SEQ ID No.1的第1-467位氨基酸的蛋白质。
2.与权利要求1所述贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a1相关的生物材料在调控植物贮藏蛋白分选中的应用；所述生物材料为下述A1）至A14）中的任一种：
A1）编码权利要求1所述贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a1的核酸分子；
A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；
A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；
A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；
A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；
A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；
A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；
A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物；
A9）含有A1）所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10）含有A2）所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11）含有A1）所述核酸分子的转基因植物组织；
A12）含有A2）所述表达盒的转基因植物组织；
A13）含有A1）所述核酸分子的转基因植物器官；
A14）含有A2）所述表达盒的转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1）所述核酸分子为如下a1）或a2）的基因：
a1）核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
a2）核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第1-1401位核苷酸的cDNA分子或DNA分子。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
5.一种培育贮藏蛋白分选正常的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1中所述贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a1的编码基因得到转基因植物的步骤；所述受体植物贮藏蛋白分选异常，所述转基因植物贮藏蛋白分选正常。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：权利要求1所述贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a1的编码基因是权利要求3中A1）所述核酸分子。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
8.权利要求1所述贮藏蛋白分选相关蛋白GmVPS9a1在培育贮藏蛋白分选正常的转基因植物中的应用。
9.权利要求2或3所述生物材料在培育贮藏蛋白分选正常的转基因植物中的应用。
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| PREDICTED: vacuolar protein sorting-associated protein 9A-like [Glycine max];ACCESSION：XM_003526606.1;《Genbank》;20140701;蛋白序列 * |
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