CN107022016B - 一种调控植物贮藏蛋白分选的蛋白质GmGPA3及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控植物贮藏蛋白分选的蛋白质GmGPA3及其编码基因与应用。本发明所提供的GmGPA3为如下a)或b)或c)：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。实验证明，本发明的植物贮藏蛋白分选相关蛋白影响植物中贮藏蛋白的分选，可以用于培育贮藏蛋白分选正常的转基因植物。

Description

一种调控植物贮藏蛋白分选的蛋白质GmGPA3及其编码基因与 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种调控植物贮藏蛋白分选的蛋白质GmGPA3及其编码基因与应用。

背景技术

大豆是我国重要的油料和蛋白作物。大豆贮藏蛋白占大豆籽粒蛋白含量的70％-80％，是食用蛋白的重要来源，同时也是幼苗萌发所需的氨基酸和氮的来源。与其他植物比较，大豆贮藏蛋白中氨基酸组成比较齐全，尤其富含赖氨酸。美国食品和药品管理局(FDA)的健康通告显示，每天食用含有25g大豆蛋白的食品，有助减少心血管发病率。

大豆籽粒贮藏蛋白主要在发育的大豆子叶中合成，并以蛋白体形式沉积。以11S蛋白为例，首先11S贮藏蛋白在粗面内质网上以前体的形式合成，之后经由高尔基体，分选进入蛋白贮藏液泡，并在液泡加工酶的作用下切割成成熟的酸碱亚基。此途径的正常转运是贮藏蛋白能否正常沉积的关键，对大豆的蛋白品质形成至关重要。但有关该途径的分子转运机理在大豆中尚无报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质的名称为GmGPA3，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

其中，序列2由498个氨基酸残基组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

本发明的另一个目的是提供与GmGPA3蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码GmGPA3蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GmGPA3蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码GmGPA3蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列1由1497个核苷酸组成，编码序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GmGPA3的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码GmGPA3的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GmGPA3且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码GmGPA3的核酸分子的表达盒(GmGPA3基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GmGPA3的DNA，该DNA不但可包括启动GmGPA3转录的启动子，还可包括终止GmGPA3转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述GmGPA3基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明还有一个目的是提供GmGPA3蛋白质或上述生物材料的新用途。

本发明提供了GmGPA3蛋白质或上述生物材料在调控植物贮藏蛋白分选中的应用。

上述应用中，所述调控植物贮藏蛋白分选体现在降低植物谷蛋白前体强度和/或降低植物谷蛋白前体含量和/或提高植物谷蛋白酸性亚基含量和/或提高植物谷蛋白碱性亚基含量。所述谷蛋白前体强度是指谷蛋白前体含量与谷蛋白酸性亚基含量的比值。

本发明还提供了上述蛋白质或上述生物材料在培育贮藏蛋白分选正常的转基因植物中的应用。

本发明最后一个目的是提供一种培育贮藏蛋白分选正常的转基因植物的方法。

本发明提供的培育贮藏蛋白分选正常的转基因植物的方法包括提高受体植物中GmGPA3蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的贮藏蛋白分选正常。

上述方法中，所述转基因植物的贮藏蛋白分选正常体现在如下(1)-(4)中任一种：

(1)转基因植物的谷蛋白前体强度低于受体植物；

(2)转基因植物的谷蛋白前体含量低于受体植物；

(3)转基因植物的谷蛋白酸性亚基含量高于受体植物；

(4)转基因植物的谷蛋白碱性亚基含量高于受体植物。

上述方法中，所述提高受体植物中GmGPA3蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达GmGPA3蛋白质。

上述方法中，所述过表达的方法为将所述GmGPA3蛋白质的编码基因导入受体植物。所述GmGPA3蛋白质的编码基因是通过pCAMBIA1300-221-GmGPA3重组载体导入受体植物，pCAMBIA1300-221-GmGPA3重组载体为在载体pCAMBIA1300-221的XbaI识别序列间插入序列表中序列1的第1-1497位核苷酸所示的DNA分子，且保持载体pCAMBIA1300-221的其他序列不变得到的载体。pCAMBIA1300-221-GmGPA3重组载体表达序列2所示的GmGPA3蛋白，GmGPA3蛋白的表达由35S启动子启动。

上述方法中，所述GmGPA3蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻，所述水稻具体为水稻突变体gpa3。

实验证明，本发明的贮藏蛋白分选相关蛋白GmGPA3及其编码基因可以使成熟谷蛋白含量降低突变体gpa3中成熟谷蛋白含量上升至正常水平：水稻突变体gpa3与T0代转空载体植株种子中谷蛋白前体含量基本无差异，成熟的酸性和碱性亚基含量基本无差异，水稻突变体gpa3中谷蛋白前体强度分别为T0代转GmGPA3植株不同株系L1、L2和L3的2.93倍、1.79倍和3.09倍，T0代转GmGPA3植株不同株系L1、L2和L3的成熟酸性亚基和碱性亚基强度均有提升。T0代转空载体植株与水稻突变体gpa3的种子外观基本相同，T0代转GmGPA3植株不同株系的种子出现了透明现象。实验证明，本发明的贮藏蛋白分选相关蛋白GmGPA3及其编码基因可以用来培育一种贮藏蛋白分选正常的转基因植物。

附图说明

图1为T0代转GmGPA3植株的鉴定结果。其中，泳道1为阴性对照，泳道2为阳性对照，泳道3-7均为T0代转GmGPA3植株。

图2为T0代转GmGPA3植株的种子外观及横切面。其中，Baifeng B表示白丰B，gpa3表示水稻突变体gpa3，L1-L3分别为T0代转GmGPA3植株的不同株系。

图3为T0代转GmGPA3植株的种子蛋白质的电泳结果。其中，Baifeng B表示白丰B，gpa3表示水稻突变体gpa3，L1-L3分别为T0代转GmGPA3植株的不同株系。

图4为T0代转GmGPA3植株的种子中的谷蛋白前体强度结果。其中，Baifeng B表示白丰B，gpa3表示水稻突变体gpa3，L1-L3分别为T0代转GmGPA3植株的不同株系。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的载体pCAMBIA1300-221记载于如下文献：Xiao-Bao Ying et al.,RNA-Dependent RNA Polymerase 1from Nicotiana tabacum Suppresses RNA Silencingand Enhances Viral Infection in Nicotiana benthamiana.Plant Cell.2010，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的水稻突变体gpa3记载于如下文献：Ren et al.,GLUTELINPRECURSOR ACCUMULATION3encodes a regulator of post-Golgi vesicular trafficessential for vacuolar protein sorting in rice endosperm.[J].Plant Cell,2014,26:410-25.，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。水稻突变体gpa3是从白丰B的⁶⁰Co辐射诱变突变体库中筛选获得，测序分析发现gpa3的GPA3基因(Os03g0835800)的第11个外显子中有一个由C到T的单碱基替换，导致氨基酸翻译提前终止，形成286个氨基酸的残基。gpa3突变体的贮藏蛋白分选异常，57kDa谷蛋白前体异常积累，伴随着酸碱亚基含量降低，gpa3突变体成熟籽粒表现为皱缩和粉质，且千粒重降低了30％左右。

下述实施例中的大豆Williams 82记载于如下文献：Haun,W.J.,Hyten,D.L.,Xu,W.W.,Gerhardt,D.J.,Albert,T.J.,Richmond,T.,Jeddeloh,J.A.,Jia,G.F.,Springer,N.M.,Vance,C.P.&Stupar,R.M.(2011).The Composition and Origins of GenomicVariation among Individuals of the Soybean Reference Cultivar Williams82.Plant Physiology 155,645-655.，国家种质库编号为I2A12645，统一编号为WDD00587。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、大豆蛋白GmGPA3基因的克隆

1、cDNA的获得

提取大豆Williams 82的总RNA，反转录合成cDNA。

2、PCR扩增

以步骤1获得的cDNA为模板，采用引物GmGPA3-cDNA-F/R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下：

GmGPA3-cDNA-F:5'-TTGAAACGAAACAAGAAGAATGC-3'；

GmGPA3-cDNA-R:5'-CGTAGGTTCAAACATGGCATAAA-3'。

3、测序

对PCR扩增产物进行测序。测序结果：PCR扩增得到大小为1497bp的条带，其具有序列表中序列1所示的核苷酸，将序列1所示的基因命名为GmGPA3基因，GmGPA3基因编码的蛋白命名为GmGPA3，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

实施例2、大豆蛋白GmGPA3在调控植物贮藏蛋白分选中的应用

一、转GmGPA3植株的制备

1、重组载体的制备

在载体pCAMBIA1300-221的XbaI识别序列间插入序列表中序列1的第1-1497位核苷酸所示的DNA分子，且保持载体pCAMBIA1300-221的其他序列不变，得到重组载体，并将该重组载体命名为pCAMBIA1300-221-GmGPA3。pCAMBIA1300-221-GmGPA3与pCAMBIA1300-221的区别仅在于：pCAMBIA1300-221-GmGPA3为在pCAMBIA1300-221的XbaI识别序列间插入序列表中序列1的第1-1497位核苷酸所示的DNA分子得到的重组载体。pCAMBIA1300-221-GmGPA3重组载体表达序列2所示的GmGPA3蛋白，GmGPA3蛋白的表达由35S启动子启动。

2、重组菌的制备

分别将载体pCAMBIA1300-221和pCAMBIA1300-221-GmGPA3导入农杆菌EHA105菌株(英潍捷基(上海)贸易有限公司)中，分别得到的含有pCAMBIA1300-221和pCAMBIA1300-221-GmGPA3的重组农杆菌，将其分别命名为EH-pCAMBIA1300-221和EH-pCAMBIA1300-221-GmGPA3。

3、转基因植物的制备

利用步骤2获得的重组菌EH-pCAMBIA1300-221-GmGPA3进行转基因实验，获得T0代转GmGPA3植株。具体步骤如下：

(1)28℃培养EH-pCAMBIA1300-221-GmGPA3 16小时，收集菌体，并稀释到N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至OD₆₀₀≈0.5，获得菌液；

(2)将培养至一个月的水稻突变体gpa3成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天；

(3)将步骤(2)共培养后的愈伤组织接种在N6固体筛选培养基1(N6固体筛选培养基1为向N6固体培养基中加入潮霉素得到的潮霉素浓度为100mg/L的培养基)上24℃培养16天进行第一次筛选；

(4)挑取步骤(3)第一次筛选后的健康的愈伤组织转入上述N6固体筛选培养基1上24℃下培养进行第二次筛选，每15天继代一次；

(5)挑取步骤(4)第二次筛选后的健康的愈伤组织转入N6固体筛选培养基2(N6固体筛选培养基2为向N6固体培养基中加入潮霉素得到的潮霉素浓度为50mg/L的培养基)上24℃下培养进行第三次筛选，每15天继代一次；

(6)挑取步骤(5)得到的抗性愈伤组织转入水稻分化培养基(北京西美杰科技有限公司产品，货号为C167)上24℃下进行分化，得到分化成苗的T0代转GmGPA3植株。

利用步骤2获得的重组农杆菌EH-pCAMBIA1300-221，按照上述步骤(1)-(6)中的方法，得到T0代转空载体植株。

4、转基因植物的鉴定

对T0代转GmGPA3植株进行PCR鉴定，引物序列如下：5′-GAACATTGCCGCACCCTAGATG-3′；5′-ATCCCGAAGCAACGGTCCAA-3′。并以pCAMBIA1300-221-GmGPA3作为阳性对照(图1中泳道1)，水稻粳稻品种Kitaake基因组DNA作为阴性对照(图1中泳道2)。结果如图1所示。结果显示，T0代转GmGPA3植株均含有目的基因GmGPA3基因(图1中泳道3-7)。选取T0代阳性转GmGPA3植株纯合株系L1、L2和L3用于下述表型检测实验。

二、转GmGPA3植株的表型检测

1、种子表型的观察

分别将步骤一获得的T0代转空载体植株、T0代阳性转GmGPA3植株纯合株系L1、L2和L3以及白丰B(Baifeng B)、水稻突变体gpa3(gpa3)种植在试验田中，至种子成熟。种子成熟后，收取各植株种子并去壳，观察种子外观及横切面。实验重复三次。

结果如图2所示。结果显示，T0代转空载体植株与水稻突变体gpa3的种子外观基本相同，而T0代阳性转GmGPA3植株纯合株系L1、L2和L3种子均出现了透明现象(图2)，并且T0代阳性转GmGPA3植株纯合株系L1、L2和L3的种子有不同程度的透明现象。与野生型白丰B(Baifeng B)种子的透明表型相比，GmGPA3可以恢复突变体gpa3的表型，说明GmGPA3具有调控贮藏蛋白分选转运的功能。

2、种子贮藏蛋白SDS-PAGE凝胶图谱分析

分别提取T0代转空载体植株、T0代阳性转GmGPA3植株纯合株系L1、L2和L3以及白丰B(Baifeng B)、水稻突变体gpa3(gpa3)的种子蛋白进行SDS-PAGE检测，根据蛋白电泳结果，利用软件Quantity One对谷蛋白前体、酸性亚基和碱性亚基进行定量，并计算转GmGPA3植株纯合株系L1、L2和L3以及白丰B(Baifeng B)和水稻突变体gpa3(gpa3)中谷蛋白前体强度。谷蛋白前体强度是指谷蛋白前体含量与谷蛋白酸性亚基含量的比值。

上述种子蛋白提取及电泳方法如下：随机挑取粒数去壳，研钵中磨成米粉，称取25mg，加入700μL提取液(配方如表1所示)，混匀，50℃烘箱过夜，次日12，000rpm离心5min，吸取上清进行SDS-PAGE检测。电泳时，首先采用80V跑浓缩胶，待蛋白进入分离胶之后，电压升至120V，跑至溴酚蓝指示剂接近凝胶底部时，从玻璃板中剥取凝胶，考马斯亮蓝染色15min后，去除染色液，水漂洗剩余的染色液后，加入适量脱色液，脱色至可清晰分辨蛋白条带后，Bio-rad凝胶成像设备扫描。

表1、SDS-PAGE制胶加样表(一个电泳槽凝胶用量)

	凝胶贮液(mL)	Tris-HCL(mL)	H<sub>2</sub>O(mL)	10％SDS(μL)	TEMED(μL)	10％AP(μL)
							15％分离胶	14.83	11.08	3.66	297	24.75	124
7.5％浓缩胶	3.35	4.99	4.99	133.84	20	84

各株系中种子蛋白的SDS-PAGE检测结果如图3所示。各株系中谷蛋白前体强度大小的检测结果如图4所示。从图中可以看出：和水稻突变体gpa3种子中谷蛋白前体强度相比，T0代阳性转GmGPA3植株纯合株系L1、L2和L3种子中谷蛋白前体强度明显降低，水稻突变体gpa3种子中谷蛋白前体强度(110.03)分别为T0代阳性转GmGPA3植株纯合株系L1(37.65)、L2(61.48)和L3(35.66)的2.93倍、1.79倍和3.09倍。和水稻突变体gpa3种子中成熟酸性亚基和碱性亚基强度相比，T0代阳性转GmGPA3植株纯合株系L1、L2和L3的成熟酸性亚基和碱性亚基强度均有提升。水稻突变体gpa3与T0代转空载体植株种子中的谷蛋白前体含量基本无差异，成熟的酸性和碱性亚基含量基本无差异。上述结果说明：GmGPA3及其基因均可以使水稻突变体gpa3的贮藏蛋白分选恢复正常。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种调控植物贮藏蛋白分选的蛋白质GmGPA3及其编码基因与应用

<160>2

<210>1

<211>1497bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atgcattact gggttcgagc ttcttcttct gatttcgccg gaacccatcc ccaacgtcgc 60

agtggtcatt ccgctgttaa catcgggaaa tccaaggttg tcgtgttcgg aggactcgtg 120

gataagaagt ttctcagcga tatggctgtc tatgatattg aggccaaaca atggtttcag 180

cctgagtgca ctggaagtgg ttcagatggg catgtgggtc ctagctctcg ggctttccat 240

gttgccgttg ccattgattg tcatatgttc atttttggtg gtcgccttgg gagtcaaagg 300

ttgggggact tttgggtttt ggatactgat atatggcaat ggtctgaact aactggcttc 360

ggtgacttgc cttcaccacg agattttgct gcagcttcag cagttggaaa ccgtaaaatt 420

gttatgtatg gtggatggga tggaaaaaag tggttatctg atgtttatgt cttggataca 480

atatccctcg agtggatgga gctctcagtt tctggaacat tgccgcaccc tagatgtggg 540

catactgcca caatggtcga aaaacggtta cttgtttatg gtggaagagg aggaggtgga 600

ccaattatgg gcgatttatg ggcgttgaag ggcctcattg aagaagagaa tgaagcacct 660

gggtggactc aattaaagct tccaggtcaa gcaccttctc cccgatgtgg ccatacagtg 720

acatccggag gacactattt gttgatgttt ggagggcatg ggactggtgg atggttgagt 780

cgttatgata tctattataa tgattgcatt atattagaca gagtttcagc acagtggaag 840

cggctctcca taggcaatga accccctcct gctagagcat accactctat gtcaattatt 900

ggttcacggt atctgctaat tggtggtttt gatgggaaat caacttatgg tgatccctgg 960

tggttagtcc ctcaagagga cccaattgca agtagattaa ctgcatctcc acccagaaat 1020

attcctgaaa gtaaggatgt tacctcactt aatgatgatt ttcaacctca gttcaaggaa 1080

agccaaacag agaaatttcc tttctctgaa ttgcaaagac gattgcaaat atcagtttcg 1140

gaatccaatt ctaggcttca tattgtaaat gagttggaag ataaagagct tcttgagtta 1200

gcatcaagat tagcaggtga aaatgtttct acaaattcac tgaaggcaat tgaagcactt 1260

cgtgaacact ggagaaagtc tgaatcgaat atggttaaac tcaaagagct tggaccgttg 1320

cttcgggatt accaacgtct aatatacagg caatatctag aaaggagtgc atctgctcaa 1380

caacctggat ttggtgaaca agtgatgcat caactttacc atgtaaaaaa tgctactcag 1440

ttgcgcatgg atgatattcc aaaacttttg gcagagtaca aacagctacc tatatga 1497

<210>2

<211>498

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met His Tyr Trp Val Arg Ala Ser Ser Ser Asp Phe Ala Gly Thr His

1 5 10 15

Pro Gln Arg Arg Ser Gly His Ser Ala Val Asn Ile Gly Lys Ser Lys

20 25 30

Val Val Val Phe Gly Gly Leu Val Asp Lys Lys Phe Leu Ser Asp Met

35 40 45

Ala Val Tyr Asp Ile Glu Ala Lys Gln Trp Phe Gln Pro Glu Cys Thr

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Asp Gly His Val Gly Pro Ser Ser Arg Ala Phe His

65 70 75 80

Val Ala Val Ala Ile Asp Cys His Met Phe Ile Phe Gly Gly Arg Leu

85 90 95

Gly Ser Gln Arg Leu Gly Asp Phe Trp Val Leu Asp Thr Asp Ile Trp

100 105 110

Gln Trp Ser Glu Leu Thr Gly Phe Gly Asp Leu Pro Ser Pro Arg Asp

115 120 125

Phe Ala Ala Ala Ser Ala Val Gly Asn Arg Lys Ile Val Met Tyr Gly

130 135 140

Gly Trp Asp Gly Lys Lys Trp Leu Ser Asp Val Tyr Val Leu Asp Thr

145 150 155 160

Ile Ser Leu Glu Trp Met Glu Leu Ser Val Ser Gly Thr Leu Pro His

165 170 175

Pro Arg Cys Gly His Thr Ala Thr Met Val Glu Lys Arg Leu Leu Val

180 185 190

Tyr Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Pro Ile Met Gly Asp Leu Trp Ala

195 200 205

Leu Lys Gly Leu Ile Glu Glu Glu Asn Glu Ala Pro Gly Trp Thr Gln

210 215 220

Leu Lys Leu Pro Gly Gln Ala Pro Ser Pro Arg Cys Gly His Thr Val

225 230 235 240

Thr Ser Gly Gly His Tyr Leu Leu Met Phe Gly Gly His Gly Thr Gly

245 250 255

Gly Trp Leu Ser Arg Tyr Asp Ile Tyr Tyr Asn Asp Cys Ile Ile Leu

260 265 270

Asp Arg Val Ser Ala Gln Trp Lys Arg Leu Ser Ile Gly Asn Glu Pro

275 280 285

Pro Pro Ala Arg Ala Tyr His Ser Met Ser Ile Ile Gly Ser Arg Tyr

290 295 300

Leu Leu Ile Gly Gly Phe Asp Gly Lys Ser Thr Tyr Gly Asp Pro Trp

305 310 315 320

Trp Leu Val Pro Gln Glu Asp Pro Ile Ala Ser Arg Leu Thr Ala Ser

325 330 335

Pro Pro Arg Asn Ile Pro Glu Ser Lys Asp Val Thr Ser Leu Asn Asp

340 345 350

Asp Phe Gln Pro Gln Phe Lys Glu Ser Gln Thr Glu Lys Phe Pro Phe

355 360 365

Ser Glu Leu Gln Arg Arg Leu Gln Ile Ser Val Ser Glu Ser Asn Ser

370 375 380

Arg Leu His Ile Val Asn Glu Leu Glu Asp Lys Glu Leu Leu Glu Leu

385 390 395 400

Ala Ser Arg Leu Ala Gly Glu Asn Val Ser Thr Asn Ser Leu Lys Ala

405 410 415

Ile Glu Ala Leu Arg Glu His Trp Arg Lys Ser Glu Ser Asn Met Val

420 425 430

Lys Leu Lys Glu Leu Gly Pro Leu Leu Arg Asp Tyr Gln Arg Leu Ile

435 440 445

Tyr Arg Gln Tyr Leu Glu Arg Ser Ala Ser Ala Gln Gln Pro Gly Phe

450 455 460

Gly Glu Gln Val Met His Gln Leu Tyr His Val Lys Asn Ala Thr Gln

465 470 475 480

Leu Arg Met Asp Asp Ile Pro Lys Leu Leu Ala Glu Tyr Lys Gln Leu

485 490 495

Pro Ile

Claims (8)

1.如下任一所述的相关生物材料在调控植物贮藏蛋白分选中的应用；

1）蛋白质，氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

2）编码1）所述的蛋白质的核酸分子；

3）含有2）所述核酸分子的表达盒；

4）含有2）所述核酸分子的重组载体；

5）含有3）所述表达盒的重组载体；

6）含有2）所述核酸分子的重组微生物；

7）含有3）所述表达盒的重组微生物；

8）含有4）所述重组载体的重组微生物；

9）含有5）所述重组载体的重组微生物；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：2）所述核酸分子为其编码序列是序列1所示的cDNA分子或DNA分子。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述调控植物贮藏蛋白分选体现在降低植物谷蛋白前体强度和/或降低植物谷蛋白前体含量和/或提高植物谷蛋白酸性亚基含量和/或提高植物谷蛋白碱性亚基含量。

4.权利要求1中1）-9）任一所述的相关生物材料在培育贮藏蛋白分选正常的转基因植物中的应用。

5.一种培育贮藏蛋白分选正常的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的表达量，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的贮藏蛋白分选正常。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述转基因植物的贮藏蛋白分选正常体现在如下（1）-（4）中任一种：

（1）转基因植物的谷蛋白前体强度低于受体植物；

（2）转基因植物的谷蛋白前体含量低于受体植物；

（3）转基因植物的谷蛋白酸性亚基含量高于受体植物；

（4）转基因植物的谷蛋白碱性亚基含量高于受体植物。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的表达量的方法为在受体植物中过表达权利要求1中所述蛋白质；

所述过表达的方法为将权利要求1中所述蛋白质的编码基因导入受体植物；

所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。

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