CN108070578A

CN108070578A - 一种与植物耐逆性相关蛋白GmHAD1及其编码基因与应用

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Publication number: CN108070578A
Application number: CN201810111898.8A
Authority: CN
Inventors: 蔡占东; 年海; 程艳波; 马启彬; 牟英辉; 连腾祥
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-02-05
Filing date: 2018-02-05
Publication date: 2018-05-25
Anticipated expiration: 2038-02-05
Also published as: CN108070578B

Abstract

本发明公开了一种与植物耐逆性相关蛋白GmHAD1及其编码基因与应用。本发明提供的与植物耐逆性相关蛋白GmHAD1的氨基酸序列如序列表中序列2所示，其编码基因序列如序列表中序列1所示。通过实验证明：将本发明GmHAD1基因过量表达于大豆毛状根和拟南芥中，均可以提高转基因植物的耐低磷能力。本发明公开的基因可作目的基因导入植物，提高植物耐低磷能力，对培育耐低磷大豆品种有重要的意义，也为培育具有较强低磷耐受能力的转基因植物的研究奠定基础。

Description

一种与植物耐逆性相关蛋白GmHAD1及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种与植物耐逆性相关蛋白GmHAD1及其编码基因与应用。

背景技术

大豆是重要的经济作物，在世界范围内普遍种植，是人类食用油和植物蛋白的主要来源。然而低磷土壤严重限制了大豆的生长和发育，还会造成花荚脱落等，并最终影响大豆的产量和品质。植物在长期的进化过程中，已经形成了一系列的低磷耐受机制。其中之一就是植物通过分泌酸性磷酸酶来水解土壤中的有机磷为无机磷，以供植物吸收利用。因而对于大豆调控酸性磷酸酶相关基因的研究对促进大豆抵抗低磷胁迫能力以及产量的提高有重要的意义。

2001年国际上报道了第一个植物HAD家族蛋白，即从番茄中克隆得到的LePS2和LePS2对番茄适应低磷胁迫能力有显著的提高。此后，研究人员对植物HAD家族蛋白进行了多方面研究，在不同植物中相继发现HAD家族蛋白对植物提高低磷耐受能力方面具有重要的意义。Zhang等(2014,2016)在大豆中克隆到GmACP1和GmACP2，这两个基因属于HAD家族，在根部过表达这两个基因都能够显著提高大豆磷效率。因此大豆HAD家族蛋白在大豆适应低磷胁迫能力上具有重要的作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物耐逆性，尤其是调控植物低磷耐性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与植物耐逆性相关蛋白。

本发明所提供的与植物耐逆性相关蛋白的名称为GmHAD1，为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

其中，序列2由255个氨基酸残基组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质GmHAD1，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质GmHAD1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质GmHAD1的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明又提供了与GmHAD1蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的与GmHAD1蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码GmHAD1蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GmHAD1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码GmHAD1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列1由768个核苷酸组成，编码序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GmHAD1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的GmHAD1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GmHAD1且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码GmHAD1的核酸分子的表达盒(GmHAD1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GmHAD1的DNA，该DNA不但可包括启动GmHAD1转录的启动子，还可包括终止GmHAD1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。

可用现有的表达载体构建含有所述GmHAD1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供了GmHAD1蛋白质或上述生物材料的新用途。

本发明提供了GmHAD1蛋白质或上述生物材料在调控植物耐逆性中的应用。

上述应用中，所述调控为提高。

本发明还提供了GmHAD1蛋白质或上述生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了GmHAD1蛋白质或上述生物材料在植物育种中的应用。

上述应用中，所述耐逆性为耐低磷，具体体现在如下m1)-m6)中任一种：m1)提高大豆毛状根在低磷胁迫下的酸性磷酸酶活性；m2)提高大豆毛状根在低磷胁迫下的磷含量和/或磷吸收量；m3)提高大豆毛状根在低磷胁迫下的磷利用效率；m4)提高大豆毛状根在低磷胁迫下的干重；m5)提高拟南芥在低磷胁迫下的根长；m6)提高拟南芥在低磷胁迫下的酸性磷酸酶活性。所述低磷具体可为无磷或0.25mM肌醇六磷酸或10μM KH₂PO₄。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述大豆可为春华2号；所述拟南芥可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。

为解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育耐逆性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中GmHAD1蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。

上述方法中，所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在如下(1)-(5)中任一种：

(1)转基因植物根部酸性磷酸酶活性高于受体植物；

(2)转基因植物根部磷含量或磷吸收量高于受体植物；

(3)转基因植物根部磷利用效率高于受体植物；

(4)转基因植物根部干重高于受体植物；

(5)转基因植物根长长于受体植物。

所述耐逆性为耐低磷，具体体现为在低磷胁迫下：转GmHAD1大豆毛状根的酸性磷酸酶活性高于受体植物和/或转GmHAD1大豆毛状根的磷含量或磷吸收量高于受体植物和/或转GmHAD1大豆毛状根的磷利用效率高于受体植物和/或转GmHAD1大豆毛状根的干重高于受体植物和/或转GmHAD1拟南芥的根长长于受体植物和/或转GmHAD1拟南芥的酸性磷酸酶活性高于受体植物。所述低磷具体可为无磷或0.25mM肌醇六磷酸或10μM KH₂PO₄。

上述方法中，所述提高受体植物中GmHAD1蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达GmHAD1蛋白质。

上述方法中，所述过表达的方法为将GmHAD1蛋白质的编码基因导入受体植物；所述GmHAD1蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

在本发明的一个实施方式中，GmHAD1蛋白的编码基因(即序列1所示的核苷酸)通过含有GmHAD1蛋白的编码基因的表达盒的重组载体pTF101.1-GmHAD1导入受体植物中。所述重组载体pTF101.1-GmHAD1为将序列1所示的GmHAD1基因全长序列正向插入到pTF101.1载体的Xba I和Sac I酶切位点间，且保持pTF101.1载体的其他序列不变后得到的载体。携带本发明基因GmHAD1的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述GmHAD1基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述大豆可为春华2号；所述拟南芥可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。

本发明的有益效果：

(1)本发明所供的大豆耐低磷相关基因GmHAD1在低磷胁迫条件下华春2号大豆材料中表达显著上调。利用发根农杆菌介导转化系统将携带有本发明GmHAD1的植物表达载体转化大豆毛状根和拟南芥。与对照相比，过表达GmHAD1的大豆毛状根酸性磷酸酶活性和磷吸收量显著增加；与野生型拟南芥相比，过表达GmHAD1的转基因拟南芥在1/2MS培养基和土壤培育条件下均生长较好，磷含量较高。说明GmHAD1可能参与调控大豆低磷胁迫的适应性。

(2)本发明所供的大豆耐低磷相关基因GmHAD1，位于大豆第10号染色体，读码框长度为768bp，编码255个蛋白；利用任何一种引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明GmHAD1基因导入植物细胞，可获得低磷胁迫能力显著提高的转基因植株。

(3)使用大豆耐低磷相关基因GmHAD1重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或者组成型启动子，如花椰菜花叶病毒病35S启动子、玉米的泛素启动子，它们可单独使用或者与其它植物启动子结合使用；另外为了便于对转基因植物或者细胞的筛选，可对所有植物表达载体进行加工，可以加入在植物中表达可以产生颜色变化的酶基因或者发光化合物基因(荧光素酶基因、GUS基因等)、具有抗性的抗生素标记物(壮观霉素、卡那霉素等)或者是抗化学试剂标记基因(抗草甘膦基因、抗除草剂基因等)。从转基因植物安全性考虑，可以不加任何选择性标记基因，直接在低磷胁迫中筛选转化植株。

本发明提供了一种与植物耐低磷相关的基因GmHAD1，本发明的基因GmHAD1对大豆和拟南芥体内磷代谢有积极的调控作用。经过实验证明，将基因GmHAD1超表于大豆毛状根和拟南芥中，可增强毛状根和拟南芥对磷元素的吸收，低磷耐受能力显著提高，说明GmHAD1蛋白可以为培育具有较强低磷耐受能力的转基因植物的研究奠定基础。

附图说明

图1为GmHAD1基因在华春2号大豆品种低磷(Low P；5μM)和正常磷(Normal P；1000μM)处理七天后的根部表达情况。

图2为含有GmHAD1基因的植物超表达载体pTF101.1-GmHAD1的结构图。

图3为GmHAD1基因转化大豆毛状根验证其参与大豆适应低磷胁迫图。其中，(A)为转化大豆毛状根PCR鉴定图；M：Marker；VC：以转入空载体pTF101.1的大豆毛状根DNA为模版；1-7：以转基因植株DNA为模版。(B)为转基因根系酸性磷酸酶鉴定图。(C)为毛状根APA活性。(D)为根部磷含量。(E)根干重。(F)磷的利用效率。

图4为GmHAD1基因转化拟南芥验证其增强拟南芥低磷耐受能力图。其中，(A)为野生型和转基因拟南芥在无磷和低磷培养基条件生长图；WT：野生型；Line 1和Line 2：两个转基因株系；N Pi：无磷；L Pi：低磷(10μM)。(B)为GmHAD1在转基因拟南芥中表达情况。(C)为拟南芥根APA活性。(D)为根长。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细的描述本发明。应理解这些实施例只是举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明范围。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施方法中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规实验方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均与首次标明的内容相同。

下述实施方法和实施例中所使用的术语，除非特殊说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。

下述实施例中的pTF101.1载体记载于文献“Wang M,Sun S,Wu C,etal.Isolation and characterization of the brassinosteroid receptor gene(GmBRI1)from Glycine max[J].International journal of molecular sciences,2014,15(3):3871-3888.王妙.GmBRI1和GmCPD基因的克隆及在大豆开花过程中的功能研究[D].吉林大学,2015.”中，公众可从华南农业大学获得。

实施例1、大豆耐低磷相关蛋白GmHAD1及其编码基因的获得

一、大豆耐低磷相关蛋白GmHAD1及其编码基因的获得

1、cDNA的获得

采用植物总RNA提取试剂盒(TR02，GeneMark)提取大豆材料华春2号(耐低磷品种)根部总RNA，经1％琼脂糖电泳检测其完整性；使用PrimeScript^TMRT reagent Kit withgDNA Eraser试剂盒反转录合成cDNA。

2、PCR扩增

以步骤1获得的cDNA为模板，采用GmHAD1-F和GmHAD1-R引物进行PCR扩增，得到PCR产物。引物序列如下：

GmHAD1-F：5’-GGGGAAAACACTTTGGTC-3’；

GmHAD1-R：5’-AGTTACTGGTTGGCTTTG-3’。

PCR反应体系(50μl体系)如下：2×Phanta Max Buffer(25μl)、ddH₂O(19μl)、dNTPMix(1μl)、GmHAD1-F(2μl)、GmHAD1-R(2μl)、cDNA(1μl)、Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase(1μl)。

PCR反应程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，51℃退火15秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；然后72℃彻底延伸5分钟；4℃保存。

3、PCR产物检测

采用DNA产物纯化试剂盒(DP204，天根)纯化回收PCR产物，纯化回收后连接pLB载体(pLB零背景快速连接试剂盒，天根)，并将其转化大肠杆菌TOP10，挑取单菌落摇菌测序。

测序结果表明：PCR扩增得到大小为768bp的扩增产物，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，并将序列1所示的基因命名为GmHAD1基因，GmHAD1基因编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示，将序列2所示的氨基酸序列命名为GmHAD1蛋白。

二、大豆耐低磷相关基因GmHAD1的荧光定量PCR分析

1、低磷处理

将大豆耐低磷品种华春2号的幼苗在水培生长条件下，进行正常磷(Normal P；1000μM)和低磷处理(Low P；5μM)，正常磷处理是将大豆耐低磷品种华春2号的幼苗置于1/2Hogland营养液(购买于青岛海博生物科技有限公司，货号HB8870-1)中进行处理，低磷处理是将大豆耐低磷品种华春2号的幼苗置于低磷营养液中进行处理，低磷营养液是将KCl代替1/2Hogland营养液中KH₂PO₄后得到的营养液。处理7天后采集整根样品迅速放入液氮中，然后-80℃保存。

2、荧光定量PCR

1)分别提取正常磷和低磷处理后的整根样品的总RNA，反转录获得cDNA，RNA提取方法和cDNA合成同步骤一。

2)以步骤1)获得的cDNA为模板，采用qGmHAD1-F和qGmHAD1-R进行荧光定量PCR，以Tubulin为内参基因。基因GmHAD1的引物序列如下：

qGmHAD1-F：5’-GATTGCTGGGTGGGTTAGTG-3’；

qGmHAD1-R：5’-GTGCGTCTCATCATCCTCAT-3’。

内参基因Tubulin的引物序列如下：

qGmHAD1-F：5’-GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3’；

qGmHAD1-R：5’-CACTTACGCATCACATAGCA-3’。

荧光定量PCR反应体系(25μl)如下：SYBR Premix Ex Taq II(12.5μl)、正向引物(1μl)、反向引物(1μl)、cDNA(2μl)和ddH₂O(8.5μl)。

荧光定量PCR反应程序如下：94℃(3分钟)，94℃(10秒)，55℃(10秒)，72℃(30秒)共40个循环，后接溶解曲线分析程序。

3)结果分析

在EXCEL中采用2^^-△△Ct方法进行基因表达量的计算分析。

结果如图1所示。从图中可以看出：大豆品种华春2号中的GmHAD1在低磷条件下表达量显著上调。

实施例2、转GmHAD1基因大豆毛状根的获得及GmHAD1基因功能分析

一、转GmHAD1基因大豆毛状根的获得

1、将序列1所示的GmHAD1基因全长序列正向插入到pTF101.1载体的Xba I和Sac I酶切位点间，构建重组植物表达载体pTF101.1-GmHAD1。重组植物表达载体pTF101.1-GmHAD1的结构图如图2所示，从图中可以看出，GmHAD1基因位于CaMV35S启动子后，CaMV35S启动子用于启动GmHAD1基因的表达。

2、用Bio-rad电击转化仪分别将pTF101.1和pTF101.1-GmHAD1转入发根农杆菌K599(购自BioVector NTCC Inc.)中，然后通过K599发根农杆菌介导转化法转化大豆，获得转空载体株系和阳性转GmHAD1基因大豆毛状根。具体方法如下：

1)育苗：选择均匀一致的大豆华春2号种子，用氯气灭菌12小时，置于26℃光照培养箱12h/d光照条件下蛭石育苗。

2)毛状根诱导：将含有重组质粒(pTF101.1-GmHAD1)的K599菌种在YEP固体培养基+壮观霉素(50mg/L)上划线，28℃培养36小时后挑取单菌落于YEP液体培养+壮观霉素(50mg/L)，220r/min、28℃过夜振荡培养。将3天龄大豆幼苗50株留取子叶节下1到2厘米，其余部分减掉去除。用注射器在下胚轴部位注射菌液三次，26℃恒温、12h/d光照条件下进行毛状根诱导；七天后长出毛状根，转移到1/2Hogland营养液中生长5天，得到转基因株系。

按照上述方法，将含有重组质粒(pTF101.1-GmHAD1)的K599菌种替换为含有pTF101.1的K599菌种，且保持其他步骤不变，得到转空载体株系。

3)阳性转基因株系的鉴定：以35S启动子引物+基因内部引物进行PCR，鉴定阳性转基因株系，PCR扩增得到大小为512bp的转基因株系为阳性转GmHAD1基因株系。引物序列如下：35SJC-F：5’-CCTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’；MIDGmHAD1R：5’-GTGCGTCTCATCATCCTCAT-3’。

鉴定结果如图3A所示。从图中可以看出：阳性转GmHAD1基因株系中均获得大小为512bp的目的条带，而转空载体株系中未扩增得到目的条带。选取阳性转GmHAD1基因株系Line 1、Line 2和Line 3用于下述研究实验。

二、GmHAD1基因功能分析

1、低磷胁迫处理

分别将阳性转GmHAD1基因株系(实验组)和转空载体株系(对照组)在1/2Hogland营养液中生长5天后，得到阳性转GmHAD1基因幼苗和转空载体幼苗。然后将阳性转GmHAD1基因幼苗和转空载体幼苗均移入低磷营养液(低磷营养液是将1/2Hogland营养液中的K₂HPO₄替换为肌醇六磷酸后得到的营养液，肌醇六磷酸在低磷营养液中的浓度为0.25mM)中进行低磷胁迫处理，在26℃，12h/d光照条件下进行培养，培养七天后测定根系的酸性磷酸酶活性、磷含量、干重及磷利用效率。

2、酸性磷酸酶活性检测

在低磷胁迫处理5天时，将阳性转GmHAD1基因株系和转空载体株系(各5株)移入到含有对硝基苯酚磷酸二钠(ρ-NPP，终浓度为0.3mM)的低磷营养液(低磷营养液是将1/2Hogland营养液中的K₂HPO₄替换为肌醇六磷酸后得到的营养液，肌醇六磷酸在低磷营养液中的浓度为0.25mM)中，根部避光处理72小时后加入0.5mL 1M的NaOH终止反应，比较对照组和处理组的营养液颜色的深浅，并测定根的酸性磷酸酶活性。酸性磷酸酶活性的测定方法如下：取根部组织样品0.2g在液氮中研磨至粉末，加入1.5mL的0.1mM缓冲液(1mM醋酸溶液28.82mL+0.3mM的醋酸钠溶液273.3，PH4.0)，继续研磨混匀导入2mL离心管中，12000rpm(4℃)离心20分钟，取20μl上清液，加入480μl酶反应液(0.1mM缓冲液和0.3mMρ-NPP)，30℃条件下暗反应30分钟，加入300μl的1M NaOH终止反应。吸取100μl加入到酶标板反应孔内，ρ-NP标准浓度如下：0.005μM、0.01μM、0.015μM、0.02μM、0.25μM，在450nm波长下由酶标仪测定吸光度，从而检测酸性磷酸酶活性。

结果如图3B和3C所示。从图中可以看出：与对照组相比，阳性转GmHAD1基因株系营养液显现较深黄色，且阳性转GmHAD1基因株系酸性磷酸酶活性均高于对照组，过量表达GmHAD1的大豆毛状根酸性磷酸酶活性显著增加，说明过量表达GmHAD1的大豆毛状根能够分泌更多的酸性磷酸酶。

3、根部磷含量检测

在低磷胁迫处理7天后，取阳性转GmHAD1基因株系和转空载体株系的根部组织样品，委托苏州科铭生物技术有限公司采用硫酸双氧水消解钼锑抗比色法测定磷含量。具体步骤如下：

1)配制如下试剂指示剂：0.25g 2,6-二硝基酚溶于100mL水中(饱和液)。无磷活性炭：采购含磷量少的活性炭直接用0.5mol碳酸氢钠(NaHCO₃)浸24h。在布氏漏斗上抽气过滤，每次用少量蒸馏水淋洗多次，直至检查滤液无磷为止，然后烘干装瓶待用。钼锑抗贮存液：浓硫酸153mL溶解到400mL蒸馏水中，搅拌、冷却。10.0g钼酸鞍溶于60℃的300mL蒸馏水中，冷却。然后将硫酸溶液缓缓滴人钼酸鞍溶液中，再加入100mL 0.5％酒石酸锑钾溶液，最后用水稀释至1L，盛于棕色避光瓶中。钼锑抗显色剂：称1.5g抗坏血酸溶于100ml钼锑抗贮存液中。此液随配随用，有效期1d。磷标准液：用磷酸二氢钾配置5mg/L的磷标准液。硫酸和氢氧化钠：配制10％硫酸(H₂SO₄)，10％氢氧化钠(NaOH)。

2)磷含量测定：将消煮液加入适量活性炭脱色，离心，吸取上清液2-10mL(含5-25μg磷)于50mL工容量瓶中，用水稀释至20mL，加2,6-二硝基酚指示剂2滴，用10％的氢氧化钠或稀硫酸溶液调节pH至溶液刚呈微黄色(小心缓加，边加边摇，防止产生的二氧化碳把溶液喷出瓶口)，然后加人钼锑抗显色剂5mL，摇匀，定容至刻度。在室温20℃-25℃下放置30min后在分光光度计上用波长680-700nm(红色滤光片)比色，以空白试验溶液为参比液调零点。读取数值，在工作曲线上查出显色液磷的读数，颜色在8h内可保持稳定。工作曲线的绘制：分别吸取5mg/L磷标准溶液0、2、3、4、5、6mL于50mL容量瓶中，加水稀释20mL，加人钼锑抗显色剂5mmL，摇匀定容，即得0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/L磷标准系列溶液，与待测溶液同时比色，读出数值。在方格坐标纸上以测得数值为纵坐标，磷含量(mg/L)为横坐标，绘制成工作曲线，相关系数r＝0.99。根据上述步骤进行磷含量测定，最终计算磷含量。

结果如图3D所示。从图中可以看出：与对照组相比，阳性转GmHAD1基因株系中的磷含量显著增加，说明过量表达GmHAD1可提高大豆毛状根的磷含量。

4、根部干重检测

在低磷胁迫处理7天后，取阳性转GmHAD1基因株系和转空载体株系的根部组织样品，测定根部干重。具体步骤如下：将根部样品放入到烘箱内105℃下杀青2小时，然后60℃烘干至恒重，再用电子天平称量重量。

结果如图3E所示。从图中可以看出：与对照组相比，过量表达GmHAD1基因的毛状根干重显著增加，说明过量表达GmHAD1可提高大豆毛状根干重。

5、磷利用效率检测

根据步骤3获得的根部磷含量检测结果和步骤4获得的根部干重检测结果按照如下公式计算磷利用效率：磷利用效率＝根部干重/根部磷含量，磷利用效率表示每毫克磷产生的干物质的量。

结果如图3F所示。从图中可以看出：与对照组相比，过量表达GmHAD1基因的毛状根的磷利用效率显著增加，说明过量表达GmHAD1可提高大豆毛状根的磷利用效率。

实施例3、转GmHAD1基因拟南芥的获得及GmHAD1基因功能分析

一、转GmHAD1基因拟南芥的获得

1、采用冻融法将实施例2中的重组表达载体pTF101.1-GmHAD1转化GV3101(购买于广州市春泥生物科技有限公司，货号AC1001S)中，得到含有pTF101.1-GmHAD1的农杆菌，用于侵染拟南芥植株。

2、采用蘸花法将含有pTF101.1-GmHAD1的农杆菌侵染野生型拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。收获T₁代种子种于营养土上喷施10mg/L的草铵膦(购买于翌圣生物科技有限公司，货号60221ES03)进行筛选。对筛选得到的幼苗产生的下一代再进行筛选，如此重复，最终获得T₃代转GmHAD1拟南芥纯合株系。选取T₃代转GmHAD1拟南芥纯合株系Line1和Line2用于下述实验研究。

3、提取T₃代转GmHAD1拟南芥纯合株系Line1和Line2和野生型拟南芥植株的总RNA，反转录获得cDNA，通过荧光定量PCR检测GmHAD1基因的相对表达量，以Tubulin作为内参基因。基因引物序列同实施例1的步骤二。

结果如图4B所示。从图中可以看出：T₃代转GmHAD1拟南芥纯合株系Line1和Line2中均表达GmHAD1基因，表明外源基因GmHAD1不但已顺利整合到拟南芥的基因组上，而且能够在转基因拟南芥中正常转录表达。

二、GmHAD1基因功能分析

1、低磷胁迫处理

将野生型拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)和T₃代转GmHAD1拟南芥纯合株系的种子消毒后，均匀种植1/2MS固体培养基上，放置4℃冰箱春化3天。然后放置到26℃，16h/d的光照培养箱中垂直培养3天。待拟南芥长至1厘米长，将长度为1厘米野生型拟南芥和T₃代转GmHAD1拟南芥分别放置于无磷培养基(N Pi，0μM KH₂PO₄)、低磷培养基(L Pi，10μM KH₂PO₄)和正常磷培养基(H Pi，1000μM KH₂PO₄)中进行培养。其中，无磷培养基为霍格兰营养液(缺磷)(购买于青岛海博生物科技有限公司，货号HB8870-2)；低磷培养基(L Pi，10μM KH₂PO₄)是将KH₂PO₄和霍格兰营养液(缺磷)混匀得到的培养基，KH₂PO₄在低磷培养基中的浓度为10μM；正常磷培养基(L Pi，10μM KH₂PO₄)是将KH₂PO₄和霍格兰营养液(缺磷)混匀得到的培养基，KH₂PO₄在正常磷培养基中的浓度为1000μM。

2、根长检测

在低磷胁迫处理7天时，观察野生型拟南芥和T₃代转GmHAD1拟南芥纯合株系的长势并测定根长。

结果如图4A和4D所示。从图中可以看出：和野生型拟南芥相比，T₃代转GmHAD1拟南芥纯合株系在无磷和低磷培养基上长势均好于野生型；且T₃代转GmHAD1拟南芥纯合株系在无磷和低磷培养基上根长显著增长。说明过量表达GmHAD1可提高拟南芥的根长。

3、酸性磷酸酶活性检测

在低磷胁迫处理5天时，将野生型拟南芥和T₃代转GmHAD1拟南芥纯合株系的幼苗移入到含有对硝基苯酚磷酸二钠)(ρ-NPP，终浓度为0.3mM)的低磷营养液(低磷营养液是将1/2Hogland营养液中的K₂HPO₄替换为肌醇六磷酸后得到的营养液，肌醇六磷酸在低磷营养液中的浓度为0.25mM)中，根部避光处理7天后加入0.5mL 1M的NaOH终止反应，比较对照组和处理组的营养液颜色的深浅。

结果如4C所示。从图中可以看出：和野生型拟南芥相比，T₃代转GmHAD1拟南芥纯合株系的营养液颜色较黄，表明过量表达GmHAD1的拟南芥可分泌更多的酸性磷酸酶。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一种与植物耐逆性相关蛋白GmHAD1及其编码基因与应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>768

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atggggaaaa cactttggtc ctttgtggtt ttcacatgcc ttttgattcc tctagcagtt 60

gcagattgga acatactgaa gctgcagaca caagatggat tgaagatcag cctgaagaac 120

tattgtgaaa gctggaggat gaatgcggag ctgcacaaca ttagggactt ccaagttgtg 180

cctgaagagt gcactgaata cataggaaaa tatgttaagt ccacacagta caaagtagac 240

tcacagaggg catctgaaga gtgcttggtt taccttagca ccagctgtaa tttgaagaaa 300

gatggattcg atgcttggat ttttgacatt gatgataccc tgctttcaac tgttccttac 360

tacaagaata atctatatgg gggaaagaaa ctgaatgtga catctctaga ggaatggatg 420

cgcaaaggca atgcacctgc tcttgatcac tcattgaagc tatacaatga acttaaatcc 480

aggggtgtgc aaatcatttt ggttacttca aggaaggagc atctcagatc agccacaatt 540

gacaaccttg tcaaagttgg ttattatggg tggactaaaa ttgtctttag agatcctgct 600

aatgaattgg tgtcagtgca aaagtacaag tctgatgtgc gaaggcaaat aataaatgag 660

ggttatcgca tttggggcat tgttggggac caatacagta gcattgaggg gattccaaac 720

cccagaaggg catttaaact cccaaatccg atgtactatg ttgcctaa 768

<210>2

<211>255

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Gly Lys Thr Leu Trp Ser Phe Val Val Phe Thr Cys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Pro Leu Ala Val Ala Asp Trp Asn Ile Leu Lys Leu Gln Thr Gln Asp

20 25 30

Gly Leu Lys Ile Ser Leu Lys Asn Tyr Cys Glu Ser Trp Arg Met Asn

35 40 45

Ala Glu Leu His Asn Ile Arg Asp Phe Gln Val Val Pro Glu Glu Cys

50 55 60

Thr Glu Tyr Ile Gly Lys Tyr Val Lys Ser Thr Gln Tyr Lys Val Asp

65 70 75 80

Ser Gln Arg Ala Ser Glu Glu Cys Leu Val Tyr Leu Ser Thr Ser Cys

85 90 95

Asn Leu Lys Lys Asp Gly Phe Asp Ala Trp Ile Phe Asp Ile Asp Asp

100 105 110

Thr Leu Leu Ser Thr Val Pro Tyr Tyr Lys Asn Asn Leu Tyr Gly Gly

115 120 125

Lys Lys Leu Asn Val Thr Ser Leu Glu Glu Trp Met Arg Lys Gly Asn

130 135 140

Ala Pro Ala Leu Asp His Ser Leu Lys Leu Tyr Asn Glu Leu Lys Ser

145 150 155 160

Arg Gly Val Gln Ile Ile Leu Val Thr Ser Arg Lys Glu His Leu Arg

165 170 175

Ser Ala Thr Ile Asp Asn Leu Val Lys Val Gly Tyr Tyr Gly Trp Thr

180 185 190

Lys Ile Val Phe Arg Asp Pro Ala Asn Glu Leu Val Ser Val Gln Lys

195 200 205

Tyr Lys Ser Asp Val Arg Arg Gln Ile Ile Asn Glu Gly Tyr Arg Ile

210 215 220

Trp Gly Ile Val Gly Asp Gln Tyr Ser Ser Ile Glu Gly Ile Pro Asn

225 230 235 240

Pro Arg Arg Ala Phe Lys Leu Pro Asn Pro Met Tyr Tyr Val Ala

245 250 255

Claims

1.蛋白质，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在调控植物耐逆性中的应用；

或，权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物中的应用；

或，权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在植物育种中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐低磷。

6.一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1所述的蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐低磷。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在如下(1)-(5)中任一种：

(1)转基因植物根部酸性磷酸酶活性高于受体植物；

(2)转基因植物根部磷含量或磷吸收量高于受体植物；

(3)转基因植物根部磷利用效率高于受体植物；

(4)转基因植物根部干重高于受体植物；

(5)转基因植物根长长于受体植物。

9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：

所述提高受体植物中权利要求1所述的蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达权利要求1所述的蛋白质；

或，所述过表达的方法为将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体植物；

或，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

10.根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。