CN110684749A

CN110684749A - 玉米3-磷酸甘油脱氢酶ZmGPDH4及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用

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Publication number: CN110684749A
Application number: CN201911097763.1A
Authority: CN
Inventors: 徐晶宇; 刘梦; 李佐同; 赵莹; 贺琳; 魏金鹏; 赵长江
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2020-01-14

Abstract

本发明公开了玉米3‑磷酸甘油脱氢酶ZmGPDH4及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用。本发明以玉米GPDH基因家族成员ZmGPDH4为研究对象，将其转入拟南芥突变体获得T3代纯合转化子。选取其中COM‑1和COM‑2两个转化子进行抗病功能鉴定。以拟南芥突变体为对照，研究ZmGPDH4转基因拟南芥在病菌胁迫下的3‑磷酸甘油、甘油含量及生理表型的变化。结果表明：在病菌Pst DC3000胁迫处理条件下，ZmGPDH4转基因拟南芥中3‑磷酸甘油、甘油含量显著高于拟南芥突变体，且ZmGPDH4转基因拟南芥的感病情况显著优于对照。表明ZmGPDH4能显著提高转基因植物的抗病能力，ZmGPDH4作为耐逆基因可以被应用于培育玉米耐逆品种。

Description

玉米3-磷酸甘油脱氢酶ZmGPDH4及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及玉米3-磷酸甘油脱氢酶ZmGPDH4及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用。

背景技术

提高作物耐逆能力已成为当前农业及畜牧业领域技术研究的热点和难点，也是目前亟需解决的重大问题。近几年来，随着功能基因组学及分子生物学的发展，挖掘耐逆关键基因，利用基因工程技术培育具有良好耐逆性状的作物新品种已经成为有效提高作物耐逆能力的手段之一。

3-磷酸甘油(Glycerol-3-phosphate/G-3-P)是油脂代谢过程中的一个重要中间产物，参与植物体内多种生理生化过程。3-磷酸甘油可以通过3-磷酸甘油磷酸化酶(GPP)去磷酸化为甘油，还可作为甘油脂类(包括三酰甘油、甘油磷脂和甘油糖脂)的合成前体。3-磷酸甘油脱氢酶(Glycerol-3-phosphate Dehydrogenase，GPDH)催化3-磷酸甘油和磷酸二羟丙酮之间的可逆氧化还原反应，这类酶广泛存在于各种生物体中，且具有组织特异性和细胞定位特异性。目前除了模式植物拟南芥和一些藻类，GPDH家族在其他高等植物中研究报道的很少，尤其在玉米中尚未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何调控植物耐逆性。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了ZmGPDH4蛋白质的新用途。

本发明提供了ZmGPDH4蛋白质在调控植物耐逆性中的应用。

本发明还提供了ZmGPDH4蛋白质在调控植物甘油及3-磷酸甘油含量中的应用。

上述应用中，所述ZmGPDH4蛋白质是如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

为了解决上述技术问题，本发明又提供了与ZmGPDH4蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与ZmGPDH4蛋白质相关的生物材料在调控植物耐逆性中的应用。

本发明还提供了与ZmGPDH4蛋白质相关的生物材料在调控植物甘油及3-磷酸甘油含量中的应用。

本发明还提供了与ZmGPDH4蛋白质相关的生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物中的应用。

所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码ZmGPDH4蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码ZmGPDH4蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码ZmGPDH4蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码ZmGPDH4蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码ZmGPDH4蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码ZmGPDH4蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述应用中，A2)所述的含有编码ZmGPDH4蛋白质的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达ZmGPDH4蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动ZmGPDH4转录的启动子，还可包括终止ZmGPDH4转录的终止子。进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。

可用现有的表达载体构建含有所述ZmGPDH4基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

上述应用中，所述耐逆性为抗病性。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育耐逆性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中ZmGPDH4蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。

进一步的，所述耐逆性为抗病性。

所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在如下(1)-(3)中任一种：

(1)转基因植物中3-磷酸甘油含量高于受体植物；

(2)转基因植物中甘油含量高于受体植物；

(3)转基因植物的感病面积小于受体植物。

更进一步的，所述提高受体植物中ZmGPDH4蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中表达ZmGPDH4蛋白质；所述在受体植物中表达的方法为将ZmGPDH4蛋白质的编码基因导入受体植物；所述ZmGPDH4蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。在本发明的具体实施例中，ZmGPDH4蛋白质的编码基因通过重组载体35S:ZmGPDH4-GFP导入受体植物中，所述重组载体35S:ZmGPDH4-GFP为将pBI121-GFP载体的XbaI和SalI酶切位点之间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的ZmGPDH4基因，且保持pBI121-GFP载体的其他序列不变后得到的载体。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述ZmGPDH4基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法或应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥；所述拟南芥具体可为拟南芥AtGPDHp1(AT5G40610)的T-DNA插入突变体chl-KO(SALK_062006)。

本发明以玉米GPDH基因家族成员ZmGPDH4(GRMZM6G161711_T01)为研究对象，将其转入拟南芥突变体chl-KO获得T3代纯合转化子。选取其中COM-1和COM-2两个转化子进行抗病功能鉴定。以拟南芥突变体chl-KO为对照，研究ZmGPDH4转基因拟南芥在病菌Pst DC3000胁迫下的3-磷酸甘油、甘油含量及生理表型变化。结果发现DC3000处理条件下，ZmGPDH4转基因拟南芥的3-磷酸甘油、甘油含量显著高于拟南芥突变体chl-KO，且转基因株系的感病情况显著小于对照。这些结果表明ZmGPDH4能显著提高转基因植物的抗病能力，ZmGPDH4作为耐逆基因可以被应用于培育玉米耐逆品种。

附图说明

图1为ZmGPDH4基因的表达模式分析。

图2为Pst DC3000处理第三天拟南芥突变体(chl-KO)和转基因拟南芥(COM-1和COM-2)的3-磷酸甘油含量。

图3为Pst DC3000处理第三天拟南芥突变体(chl-KO)和转基因拟南芥(COM-1和COM-2)的甘油含量。

图4为PstDC3000处理下拟南芥突变体(chl-KO)和转基因拟南芥(COM-1和COM-2)细菌生长量的统计。

图5为Pst DC3000处理下拟南芥突变体(chl-KO)和转基因拟南芥(COM-1和COM-2)的染色比较。

图6为Pst DC3000处理下拟南芥突变体(chl-KO)和转基因拟南芥(COM-1和COM-2)的表型差异。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的数据统计分析方法：利用SPSS 16.0(SPSS Inc,Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。单因素方差分析比较不同株系(CK、COM-1和COM-2)在同一处理条件下差异是否具有显著性(P<0.05，one-way ANOVA)。

下述实施例中的pBI121-GFP载体是上海信裕生物科技有限公司的产品，产品目录号或货号为XY2117。

下述实施例中的EHA105农杆菌是上海唯地生物有限公司的产品，产品目录号或货号为AC1010S。

实施例1、病菌胁迫下ZmGPDH4基因在玉米中的表达模式生物胁迫下玉米ZmGPDH4表达数据下载自NCBI中(SRP039594)。

结果如图1所示。结果表明：在病菌胁迫处理后，ZmGPDH4基因在不同品种(R：耐逆型品种S：敏感型品种)玉米中显著上调表达。结果表明，在玉米中ZmGPDH4能够不同程度地被病菌诱导表达，说明ZmGPDH4是玉米适应生物逆境过程中一个重要的调节因子。

实施例2、ZmGPDH4转基因拟南芥的获得及其耐逆性分析一、ZmGPDH4转基因拟南芥的获得及鉴定

1、以玉米根部cDNA为模板，采用ZmGPDH4-GFP-F和ZmGPDH4-GFP-R引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下(下划线所示的序列为酶切识别位点)：

ZmGPDH4-GFP-F：5'-GCTCTAGAATGGAGATGGAGAACGGGCAC-3'；

ZmGPDH4-GFP-R：5'-ACGCGTCGACGTAGAATGGAGTATGACCACCG-3'。

2、用限制性内切酶XbaI和SalI对pBI121-GFP载体和步骤1获得的PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到重组质粒35S:ZmGPDH4-GFP。并对其进行测序验证。

测序结果表明：重组载体35S:ZmGPDH4-GFP为将pBI121-GFP载体的XbaI和SalI酶切位点之间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的ZmGPDH4基因，且保持pBI121-GFP载体的其他序列不变后得到的载体。重组载体35S:ZmGPDH4-GFP表达序列2所示的ZmGPDH4蛋白质。

3、采用冻融法将重组载体35S:ZmGPDH4-GFP转化EHA105受体菌中，经PCR鉴定得到阳性转化子，用于侵染拟南芥植株。

4、采用蘸花法将含有重组质粒35S:ZmGPDH4-GFP的农杆菌侵染拟南芥突变体(chl-KO)。收获T₁代种子并于含50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上筛选。对筛选得到的幼苗产生的下一代再进行PCR筛选，如此重复，最终获得T₃代ZmGPDH4转基因拟南芥纯合株系。

5、提取T₃代ZmGPDH4转基因拟南芥纯合株系的总RNA，通过RT-PCR方法定性检测ZmGPDH4基因的相对表达量，同时以拟南芥基因Actin2

(AT5G18780)和UBQ1(AT4G05320)作为内参基因，引物序列如下：

Actin2-F：5′-TTACCCGATGGGCAAGTC-3′；

Actin2-R：5′-GCTCATACGGTCAGCGATAC-3′；

UBQ1-F：5′-GGCCTTGTATAATCCCTGATGAA-3′；

UBQ1-R：5′-AGAAGTCGACTTGTCATTAGAAAGAA-3′。

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明：拟南芥突变体(chl-KO)的RT-PCR无扩增产物，而ZmGPDH4转基因拟南芥纯合株系COM-1和COM-2均可以扩增出大小为1104bp的目的条带，表明外源基因ZmGPDH4不但已顺利整合到拟南芥的基因组上，而且能够在转基因拟南芥中正常转录表达。选取T₃代ZmGPDH4转基因拟南芥纯合株系COM-1和COM-2用于下一步的耐逆性分析。

二、ZmGPDH4转基因拟南芥的耐逆性分析

1、拟南芥接菌实验

1)种子消毒：将拟南芥突变体(chl-KO)和ZmGPDH4转基因拟南芥株系(COM-1和COM-2)种子置于2mL离心管中，先在离心管中加入75％无水乙醇消毒1min，期间不断摇晃振荡，使消毒均匀。瞬时离心10s，沉淀拟南芥种子，弃上清，用无菌水清洗3-5次。然后用10％的NaClO消毒10min，用枪头吸掉上层杂质，用无菌水清洗8-10次，直至无色无味。

2)植株培养：将拟南芥突变体(chl-KO)和ZmGPDH4转基因拟南芥株系(COM-1和COM-2)种子消毒后播种于1/2MS培养基上,春化2d后,于人工光照培养室中培养7d,

培养条件为16h光照/8h黑暗,昼夜温度为22℃/20℃,光照强度为400μmol·m^-2·s^-1,相对湿度为65-75％。待种子萌发7d后,移栽入营养土(蛭石:珍珠岩:黑土＝1:1:3)中继续生长3周。再用Pst DC3000菌液处理拟南芥突变体chl-KO和转基因株系COM-1、COM-2各植株,继续在人工气候室中培养3d,观察各植株的生理表型情况,拍照。

3)3-磷酸甘油及甘油含量的测定：取约1g(W)叶片用液N₂研磨至粉末状,加入2ml10％高氯酸(HClO₄),4℃下10000r离心10min,吸取上清液并加入1M碳酸钾(K₂CO₃),4℃下10000r离心5min,上清液即为粗样品提液。3-磷酸甘油含量测定:依次向比色杯中加入硫酸肼缓冲液(0.4M hydrazine；1M glycine；5mM EDTA；pH9.5)300μl,60mMβ-NAD⁺35μl,样品溶液300μl,混匀放置至室温,检测A₃₄₀读数直至稳定,记录读数A₁。加入GPDH酶液1μl(0.25U)后迅速混匀,静置20min后,记录读数A₂,也可以再加入GPDH酶液0.5μl(0.25U)确定A₂不再变化。最后根据公式计算出3-磷酸甘油含量＝0.335*(A₂-A₁)/W。甘油含量测定:依次向比色杯中加入反应缓冲液(1M hydrazine；0.2M glycine；1mM MgCl₂；pH9.8)1.4ml,20mMβ-NAD⁺50μl,50mM ATP 50μl,GPDH酶液0.8μl(0.4U),样品溶液300μl,混匀放置至室温,检测A₃₄₀读数直至稳定,记录读数A₁。加入GK酶液1μl(1U)后迅速混匀,静置15-30min后,记录读数A₂,也可以再加入GK酶液0.5μl(0.5U)确定A₂不再变化。最后再计算出各组织中甘油浓度＝0.328*(A₂-A₁)*/1.8W。

结果如图2和图3所示。结果表明：3d后，在没有接菌的拟南芥对照组中3-磷酸甘油含量在不同株系间无显著差异，而接菌组转基因拟南芥株系中3-磷酸甘油含量显著高于对照拟南芥突变体(图2)；在没有接菌的拟南芥对照组中甘油含量在不同株系间无显著差异，而接菌组转基因拟南芥株系中甘油含量显著高于对照拟南芥突变体(图3)；上述结果表明ZmGPDH4基因能够促进甘油的积累从而提高植物的抗逆性，ZmGPDH4提高了转基因拟南芥对生物胁迫的抗性。

2、细菌生长量实验

将拟南芥突变体(chl-KO)和ZmGPDH4转基因拟南芥株系(COM-1和COM-2)培养至3周(方法同上)。病菌Pst DC3000胁迫处理3d后，每组株系取至少6片接菌叶片，用酒精消毒，研磨，涂于固体LB培养基，28℃过夜培养，对菌落数量进行计数。实验进行三次独立的生物学重复。

结果如图4所示。结果表明：拟南芥突变体的细菌生长量明显高于各转基因拟南芥株系。说明ZmGPDH4调控植株对生物胁迫的反应，进一步表明过表达ZmGPDH4提高了转基因拟南芥对生物胁迫的抗性。

3、染色实验

将拟南芥突变体(chl-KO)和ZmGPDH4转基因拟南芥株系(COM-1和COM-2)培养至3周(方法同上)。对各株系植株进行接菌处理，在培养条件为16h光照/8h黑暗,昼夜温度为22℃/20℃,光照强度为400μmol·m-2·s-1,相对湿度为65-75％的光照气候室中培养3d,取不同植株叶片用于各种生化染色。

(1)3,3-二氨基联苯胺(DAB)染色

分别取转基因及突变体植株叶片,置于2ml离心管中,加入1.5ml DAB染色液,室温染色过夜。染色结束后,用75％乙醇+5％甘油沸水浴脱色。

(2)氮蓝四唑(NBT)染色

分别取转基因突变体植株叶片,置于2ml离心管中,加入1.5ml NBT染色液,室温染色过夜。染色结束后,用75％乙醇+5％甘油沸水浴脱色。

(3)伊文思蓝(Evans blue)染色

分别取转基因突变体植株叶片,置于2ml离心管中,加入1.5ml Evans blue染色液,室温染色过夜。染色结束后,用96％乙醇沸水浴脱色。

结果如图5所示。结果表明：在正常条件下，ZmGPDH4转基因拟南芥和对照拟南芥突变体染色未见差异，然而，在Pst DC3000菌液胁迫条件下，ZmGPDH4转基因拟南芥的染色成都显著低于对照拟南芥突变体株系。说明ZmGPDH4基因的过表达能够减少ROS的积累,从而减少ROS对植物的伤害以及减轻植株叶片受损伤情况。

通过对ZmGPDH4转基因拟南芥接菌后的3-磷酸甘油含量、甘油含量及细菌生长量进行统计分析和表型观察，发现ZmGPDH4能显著提高转基因植物的抗病能力，为进一步利用转基因手段培育玉米抗病品种提供了理论基础和基因准备。

序列表

<110> 黑龙江八一农垦大学

<120> 玉米3-磷酸甘油脱氢酶ZmGPDH4及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1104

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

atggagatgg agaacgggca cgccaagtac cgggtggccg tcattggcag cggcaactgg 60

ggcagcgtcg cctcccgcct catcgcctcc aacaccgcca agctgccctc cttctatgat 120

gaagtaagga tgtgggtgtt tgaggaaata ctgcctacag gcaggaagct atctgagtcc 180

attaacgaac agaatgagaa ctgcaaatac ttgccaggta taaagcttgg aacgaatgtt 240

attgccgacc ctgacttgga gagcgcagtc aaagacgcga atatgctggt ttttgtgacg 300

ccccatcaat ttgtggaggg tatatgtaag aagcttgtag ggaagctaac accaggagct 360

gaggctatct ccctcatcaa gggcatggag gtcaagatgg aagggccatg catgatatcc 420

aagttaatcg cggatacact tggaatcaat tgctgtgtgc tcatgggtgc taacattgca 480

aacgagattg ctgtcgaaga gttcagtgaa gcaacaattg ggtataggaa agataaggaa 540

gtggcaaatc gatgggctaa actttttacc acaccctact tcctagtttc tgtcgcagaa 600

gatattgaag gagtagagct gtgtggaact ctgaaaaata tcgtggctat tgcagcaggc 660

cttgtggatg gcttggatat gggaaacaat acaaaggctg caataatgag gattggtttg 720

cgagaaatgc gtgctttctc taagcttctg ttcccttcag tcagagacaa cacgttcttc 780

gagagctgtg gtgtcgccga cctaataacc acgtgccttg gtgggaggaa cagaagagtg 840

gctgaggcct ttgcacgaaa tggtggcaaa aggtcttttg atgaactgga ggcagagatg 900

ttgcgtggcc aaaaactcca gggagtgtcc acagcaaggg aagtctatga agtgttgact 960

tatcgaggat ggcaggagct gtttcctctg ttatcaacag tgcatgagat ctgtattggg 1020

cagttgcctc ctacatcgat agttgaatac agtgagcaca cgccaaatct ctccatcatc 1080

ggtggtcata ctccattcta ctga 1104

<210> 2

<211> 367

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

Met Gly Met Gly Ala Gly His Ala Leu Thr Ala Val Ala Val Ile Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ala Thr Gly Ser Val Ala Ser Ala Leu Ile Ala Ser Ala Thr

20 25 30

Ala Leu Leu Pro Ser Pro Thr Ala Gly Val Ala Met Thr Val Pro Gly

35 40 45

Gly Ile Leu Pro Thr Gly Ala Leu Leu Ser Gly Ser Ile Ala Gly Gly

50 55 60

Ala Gly Ala Cys Leu Thr Leu Pro Gly Ile Leu Leu Gly Thr Ala Val

65 70 75 80

Ile Ala Ala Pro Ala Leu Gly Ser Ala Val Leu Ala Ala Ala Met Leu

85 90 95

Val Pro Val Thr Pro His Gly Pro Val Gly Gly Ile Cys Leu Leu Leu

100 105 110

Val Gly Leu Leu Thr Pro Gly Ala Gly Ala Ile Ser Leu Ile Leu Gly

115 120 125

Met Gly Val Leu Met Gly Gly Pro Cys Met Ile Ser Leu Leu Ile Ala

130 135 140

Ala Thr Leu Gly Ile Ala Cys Cys Val Leu Met Gly Ala Ala Ile Ala

145 150 155 160

Ala Gly Ile Ala Val Gly Gly Pro Ser Gly Ala Thr Ile Gly Thr Ala

165 170 175

Leu Ala Leu Gly Val Ala Ala Ala Thr Ala Leu Leu Pro Thr Thr Pro

180 185 190

Thr Pro Leu Val Ser Val Ala Gly Ala Ile Gly Gly Val Gly Leu Cys

195 200 205

Gly Thr Leu Leu Ala Ile Val Ala Ile Ala Ala Gly Leu Val Ala Gly

210 215 220

Leu Ala Met Gly Ala Ala Thr Leu Ala Ala Ile Met Ala Ile Gly Leu

225 230 235 240

Ala Gly Met Ala Ala Pro Ser Leu Leu Leu Pro Pro Ser Val Ala Ala

245 250 255

Ala Thr Pro Pro Gly Ser Cys Gly Val Ala Ala Leu Ile Thr Thr Cys

260 265 270

Leu Gly Gly Ala Ala Ala Ala Val Ala Gly Ala Pro Ala Ala Ala Gly

275 280 285

Gly Leu Ala Ser Pro Ala Gly Leu Gly Ala Gly Met Leu Ala Gly Gly

290 295 300

Leu Leu Gly Gly Val Ser Thr Ala Ala Gly Val Thr Gly Val Leu Thr

305 310 315 320

Thr Ala Gly Thr Gly Gly Leu Pro Pro Leu Leu Ser Thr Val His Gly

325 330 335

Ile Cys Ile Gly Gly Leu Pro Pro Thr Ser Ile Val Gly Thr Ser Gly

340 345 350

His Thr Pro Ala Leu Ser Ile Ile Gly Gly His Thr Pro Pro Thr

355 360 365

Claims

1.ZmGPDH4蛋白质在调控植物耐逆性中的应用；

或，ZmGPDH4蛋白质在调控植物3-磷酸甘油/甘油含量中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述ZmGPDH4蛋白质是如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

3.与ZmGPDH4蛋白质相关的生物材料在调控植物耐逆性中的应用；

或，与ZmGPDH4蛋白质相关的生物材料在调控植物3-磷酸甘油/甘油含量中的应用；

或，与ZmGPDH4蛋白质相关的生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码ZmGPDH4蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为抗病性。

7.一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中ZmGPDH4蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为抗病性；

(1)转基因植物中3-磷酸甘油含量高于受体植物；

(2)转基因植物中甘油含量高于受体植物；

(3)转基因植物叶片感病面积小于受体植物。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中ZmGPDH4蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达ZmGPDH4蛋白质；

或，所述过表达的方法为将ZmGPDH4蛋白质的编码基因导入受体植物；

或，所述ZmGPDH4蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

10.根据权利要求1-6任一所述的应用或权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。