CN113861279B

CN113861279B - 大豆转录因子GmbHLH664及其编码基因在提高种子蛋白质含量中的应用

Info

Publication number: CN113861279B
Application number: CN202010617352.7A
Authority: CN
Inventors: 张劲松; 陈受宜; 王宙雅; 张万科; 韦伟; 阴翠翠; 陶建军; 林晴
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2040-06-30
Also published as: CN113861279A

Abstract

本发明公开了大豆转录因子GmbHLH664及其编码基因在提高种子蛋白质含量中的应用。本发明提供了GmbHLH664蛋白或其相关生物材料在调控植物种子蛋白含量中的应用；GmbHLH664蛋白为SEQ ID No.1所示蛋白或其经一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白，或其N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。实验证明GmbHLH664及其编码基因可以调控植物种子蛋白含量，过表达后提高了植物种子蛋白含量。GmbHLH664基因对改善作物品质，培育高品质品种具有重要的理论和现实意义。

Description

大豆转录因子GmbHLH664及其编码基因在提高种子蛋白质含量中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及大豆转录因子GmbHLH664及其编码基因在提高种子蛋白质含量中的应用。

背景技术

大豆是重要传统作物，蕴含丰富营养价值，是提供食油、植物蛋白的重要经济作物，在工业生产中大豆油也有很多用途，例如生物燃料，表面活性剂，软化剂等。中国曾是世界最大的大豆生产国，然而，近年来，我国大豆生产只占需求的三分之一，致使中国成为全球最大的大豆进口国，进口总额为全球大豆总出口量的一半。大豆生产远远落后于国内其他粮食作物发展的步伐，不能满足国民需要。

大豆蛋白质是植物性蛋白质。大豆蛋白质的氨基酸组成与牛奶蛋白质相近，除蛋氨酸略低外，其余必需氨基酸含量均较丰富，不含胆固醇，且所含生理活性物质异黄酮还有降胆固醇等作用。大豆蛋白质在基因结构上接近人体氨基酸，所以是最具营养的植物蛋白质，广泛应用于各种食品体系，除用于制作豆奶及各类豆制品外，还因其具有乳化性，用于如肉类食品、焙烤食品、乳制品、饮料等的添加剂。因此提高大豆种子中的蛋白含量是大豆育种的主要方向之一。

发明内容

本发明的目的是提供大豆转录因子GmbHLH664及其编码基因在提高种子蛋白质含量中的应用。

第一方面，本发明要求保护GmbHLH664蛋白或其相关生物材料在调控植物种子蛋白含量中的应用。

所述相关生物材料可为能够表达所述GmbHLH664蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达GmbHLH664的DNA，该DNA不但可包括启动GmbHLH664基因转录的启动子，还可包括终止GmbHLH664转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

构建含有所述GmbHLH664基因表达盒的重组表达载体。所利用的植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用GmbHLH664构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

所述GmbHLH664蛋白可为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

在所述应用中，所述GmbHLH664蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物种子蛋白含量提高。

第二方面，本发明要求保护GmbHLH664蛋白或其相关生物材料在植物育种中的应用。

所述相关生物材料可为能够表达所述GmbHLH664蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。所述GmbHLH664蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

进一步地，在所述应用中，可将含有所述GmbHLH664的植物与其它植物进行杂交以进行植物育种。

第三方面，本发明要求保护一种培育种子蛋白含量提高的植物品种的方法。

本发明所要求保护的培育种子蛋白含量提高的植物品种的方法，可包括使受体植物中GmbHLH664蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。所述GmbHLH664蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

所述培育种子蛋白含量提高的植物品种的方法可以通过杂交手段实现，也可以通过转基因手段实现。

进一步地，本发明要求保护一种培育种子蛋白含量提高的转基因植物的方法。

本发明所要求保护的培育种子蛋白含量提高的转基因植物的方法，可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GmbHLH664蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比种子蛋白含量提高。所述GmbHLH664蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

在所述方法中，所述能够表达GmbHLH664蛋白的核酸分子可通过重组表达载体的形式导入所述受体植物。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子为35S启动子。

更加具体的，所述重组载体为将所述GmbHLH664蛋白的编码基因利用Gateway系统重组到pGWB411载体上后得到的重组质粒。

在上述方法中，将所述干扰载体或所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在上述各方面中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA等。

所述能够表达GmbHLH664蛋白的核酸分子具体可为如下任一所示DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述GmbHLH664蛋白的DNA分子；

(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述GmbHLH664蛋白的DNA分子。

上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNa₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

在上述各方面中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。

进一步地，所述双子叶植物可为十字花科植物或豆科植物；

更进一步地，所述十字花科植物可为拟南芥；所述豆科植物可为大豆。

本发明分析了高蛋白质和低蛋白质大豆品种种子发育前期和中期的转录组，通过比较种子蛋白质快速积累时期，高蛋白与低蛋白品种的差异基因，构建共表达网络，从共表达网络节点中筛选出参与籽粒蛋白质调控的候选基因。所有候选基因均在模式植物拟南芥中验证功能，表明Glyma.10G026000正调控种子的蛋白质含量。经查，Glyma.10G026000在数据库中登记为GenBank：KRH32008.1(本发明将其命名为GmbHLH664)，没有阐明其功能，记为未知蛋白hypothetical protein。实验证明，将GmbHLH664基因转入野生型拟南芥中得到的转基因拟南芥种子中蛋白含量显著高于野生型拟南芥(野生型拟南芥对照、GmbHLH664过表达株系OE6、OE4、OE15和OE24的种子中蛋白含量分别约为种子总干重的22.0、26.5、23.5、24.0和28.0％)，说明GmbHLH664及其编码基因可以调控植物种子蛋白含量，过表达后提高了植物种子蛋白含量。GmbHLH664基因对改善作物品质，培育高品质品种具有重要的理论和现实意义。

附图说明

图1为克隆载体和植物表达载体pGWB411-GmbHLH664示意图。A为克隆载体的物理图谱；B为植物表达载体pGWB411-GmbHLH664的结构示意图。

图2为GmbHLH664过表达拟南芥株系的分子鉴定。

图3为GmbHLH664转基因株系和对照种子蛋白质含量比较。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

大豆材料：大豆品种黑农44(HN44)记载在如下文献中：满为群等，大豆新品种黑农44的选育及不同种植方式对其产量和品种的影响，黑龙江农业科学2004年5期，1-5。2006年获自黑龙江农业科学院大豆研究所；由黑龙江农业科学院大豆研究所2002年经黑龙江省农作物品种审定委员会审定的大豆品种，第一育成人为杜维广研究员，品种权号：CNA20020216.2，审定号为：黑审豆2002003。

表达载体pGWB411记载在如下文献中：Department of Molecular andFunctional Genomics,Shimane University,Aatsue,Shimane 690-8504,Japan,E.mail:tnakagaw@life.shimane-u.ac.jp Isuyoshi Nakagawa,et al.,Gatway Vectors forPlant Transformation,Plant Biotechnology,2009,26,275-284。由Tsuyoshi Nakagawa博士提供，公众得到Tsuyoshi Nakagawa博士同意后可从中科院遗传与发育生物学研究所获得。

农杆菌GV3101公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载在如下文献中：Lee CW等，Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction bymodulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana,Plant Cell,2009,21(9),2948-62。

实施例1、大豆与种子中蛋白质含量相关转录因子GmbHLH664编码基因GmbHLH664的cDNA克隆和植物表达载体的构建

1、转录因子GmbHLH664的获得和植物表达载体的构建

分析了大豆高蛋白质和低蛋白质含量品种种子发育中蛋白质快速积累的前期和中期的转录组，通过比较差异表达基因，构建共表达网络，从共表达网络节点中筛选出参与调控籽粒蛋白质含量的候选基因。根据我们测出的HN44基因组序列，设计引物从HN44中克隆了目的基因。将所有候选基因在模式植物拟南芥中过表达以进行功能验证。结果表明候选基因中Glyma.10G026000正调控大豆种子的蛋白质含量，其过表达拟南芥植株的种子蛋白质含量明显大于对照。。经查，Glyma.10G026000在数据库中登记为GenBank：KRH32008.1，记为未知蛋白hypothetical protein，未见有关该蛋白的功能记录。

提取HN44幼苗的总RNA，将RNA用逆转录酶反转录合成cDNA。根据在PlantGDB的大豆基因组序列及我们测定的HN44基因组序列中Glyma.10G026000全长cDNA序列的信息，设计引物，引物序列如下：

Glyma.10G026000-up：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCTGCGCCACTAGGCAC-3’；

Glyma.10G026000-dp：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTAGTCAACAGCATGGGGTATAATTTG-3’。

以HN44 cDNA为模板，用Glyma.10G026000-up和Glyma.10G026000-dp为引物，进行PCR扩增，得到约2.0Kb的PCR产物。经过测序，该PCR产物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸，经比对，其为转录因子bHLH家族成员，命名为GmbHLH664，该基因编码的蛋白为GmbHLH664，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

基因克隆使用invitrogen公司提供的Gateway系统，载体3′-T突出端，用于直接连接Taq酶扩增的PCR产物。运用TA克隆的原理将基因连接在克隆载体上(图1中A)。TOPO载体和过表达载体pGWB411上均带有重组位点attL1和attL2，连接目的基因的TOPO载体与过表达载体pGWB411在重组酶的作用下进行LR重组反应，最终目的基因成功构建到过表达载体pGWB411上，经测序验证正确后命名为pGWB411-GmbHLH664(图1中B)。pGWB411-GmbHLH664是将SEQ ID No.2所示的DNA分子重组到表达载体pGWB411中得到的GmbHLH664基因表达载体。

实施例2、GmbHLH664过表达拟南芥的获得

一、重组农杆菌的获得

将实施例1得到含有GmbHLH664的重组载体pGWB411-GmbHLH664用电击法导入农杆菌GV3101，挑取重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为GV3101/GmbHLH664。

实验同时设置向农杆菌GV3101中导入pGWB411空载体的对照，所得重组农杆菌命名为GV3101/pGWB411。

二、转GmbHLH664拟南芥的获得及鉴定

将重组农杆菌GV3101/GmbHLH664培养至对数期，然后用抽真空法将其转化哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)中，种子购自Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)。经培育后收获种子，将种子播于含卡那霉素(50mg/L)的MS筛选培养基上，待筛选得到的T₁代植株长至4-6叶时移到蛭石上生长，收获T₁代单株，各单株种子分别播种，用相同的MS筛选培养基继续筛选以观察T₂代的分离情况，如此重复数代直至获得遗传稳定的转基因纯合株系，获得12个转GmbHLH664拟南芥纯系。提取上述12个株系苗RNA，反转录得到cDNA作为模板，引物为：5’-ATGGCTGCGCCACTAGGCAC-3’和5’-ACAGCATGGGGTATAATTTG-3’，进行RealTime-PCR鉴定。以野生型拟南芥(Col-0)为对照。拟南芥AtActin2基因为内标，所用引物为Primer-TF：5’-ATGCCCAGAAGTCTTGTTCC-3’和Primer-TR：5’-TGCTCATACGGTCAGCGATA-3’。随机选取4个株系OE-6、OE-4、OE-15和OE-24做进一步研究。

OE-6、OE-4、OE-15和OE-24中GmbHLH664的相对表达量约为0.26、0.23、0.18和0.14(AtActin2基因表达量记为1)，在对照拟南芥(Col-0)中未能检测出GmbHLH664的表达量(图2)。

实验同时设置了以重组农杆菌GV3101/pGWB411替代GV3101/GmbHLH664的空载对照。结果显示，空载对照拟南芥株系中也未能检测出GmbHLH664的表达量。

上述结果进一步证明，GmbHLH664转入拟南芥中，且得到表达。

三、转GmbHLH664基因拟南芥的表型分析

首先检测了对照和4个GmbHLH664过表达株系(OE-6、OE-4、OE-15和OE-24)在正常条件下的表型。在正常条件下，对照和GmbHLH664过表达株系的表型如莲座、株高等均与对照无明显差异。

测量了野生型拟南芥对照、GmbHLH664过表达纯系OE-6、OE-4、OE-15和OE-24的籽粒中蛋白质含量，即彻底干燥的籽粒的蛋白质含量。方法如下：

采用Thermo Flash2000有机元素分析仪(中国科学院遗传与发育生物学研究所分子农业中心平台)测定拟南芥种子蛋白质。收获成熟期拟南芥种子，37℃烘干三天，65℃再充分烘干一天，每个样品称取0.004g种子，包裹于锡囊中。基于杜马斯燃烧法原理，样品经自动进样器进入燃烧反应管，燃烧后进一步反应，得出样品中N元素含量。测定数值乘以转换系数6.25，得出所称样品粗蛋白含量。

实验生物学重复三次，结果取平均值±标准差。

结果如图3所示，野生型拟南芥对照、GmbHLH664过表达纯系OE-6、OE-4、OE-15和OE-24的籽粒蛋白质含量分别约为种子总干重的22.0、26.5、23.5、24.0和28.0％，结果表明，4个GmbHLH664过表达转基因株系种子蛋白质含量均显著高于对照。

实验同时设置了空载对照株系，结果表明，空载对照株系在正常条件下的表型如莲座、株高等均与野生型对照没见显著差异。种子蛋白含量与野生型对照也基本一致无统计学差异。

上述实验表明，大豆转录因子GmbHLH664正调控种子中的蛋白质含量。其编码基因GmbHLH664的过量表达提高了转基因植株种子中蛋白质含量，并且其在提高转基因植株种子蛋白质含量的同时，没有明显影响植株的正常生长。因此该基因可作为提高双子叶植物种子中蛋白质含量的目的基因。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 大豆转录因子GmbHLH664及其编码基因在提高种子蛋白质含量中的应用

<130> GNCLN201493

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 664

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Ala Ala Pro Leu Gly Thr Ser Leu Gln Ser Met Leu Gln Ala Ala

1 5 10 15

Val Gln Ser Val Gln Trp Thr Tyr Ser Leu Phe Trp Gln Leu Cys Pro

20 25 30

Gln Gln Gly Ile Leu Val Trp Gly Asp Gly Tyr Tyr Asn Gly Ala Ile

35 40 45

Lys Thr Arg Lys Thr Val Gln Pro Met Glu Val Ser Ala Glu Glu Ala

50 55 60

Ser Leu Gln Arg Ser Gln Gln Leu Arg Glu Leu Tyr Glu Ser Leu Ser

65 70 75 80

Ala Gly Glu Thr Asn Pro Pro Cys Arg Arg Pro Cys Ala Ala Leu Ser

85 90 95

Pro Glu Asp Leu Thr Glu Ser Glu Trp Phe Tyr Leu Met Cys Val Ser

100 105 110

Phe Ser Phe Pro Pro Gly Val Gly Leu Pro Gly Lys Ala Tyr Ala Arg

115 120 125

Arg Gln His Leu Trp Leu Thr Gly Ala Asn Glu Val Asp Ser Lys Thr

130 135 140

Phe Ser Arg Ala Ile Leu Ala Lys Ser Ala Arg Ile Gln Thr Val Val

145 150 155 160

Cys Ile Pro Leu Leu Asp Gly Val Val Glu Phe Gly Thr Met Asp Lys

165 170 175

Val Gln Glu Asp Leu Ser Phe Ile Gln His Val Glu Thr Phe Phe Ile

180 185 190

Asp His Leu Asn Pro Leu Pro Pro Lys Pro Ala Leu Ser Glu His Ser

195 200 205

Thr Ser Asn Pro Ala Ser Ser Ser Glu His Ile Pro Ala Val Met Tyr

210 215 220

Thr Val Val Asp Pro Leu Ala Ala Asn Pro Asn Leu Asn Asp Asp Met

225 230 235 240

Asp Glu Asp Ile Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu

245 250 255

Pro Glu Ser Gly Ser Glu Asp Lys Ala Gly Tyr Gly Ile Ala Arg Gln

260 265 270

Thr Pro Thr Pro Ala Met Ala Ala Glu Pro Ser Glu Leu Ile Gln Leu

275 280 285

Glu Met Pro Glu Asp Ile Arg Leu Gly Ser Pro Asn Asp Gly Ser Asn

290 295 300

Asn Leu Asp Ser Asp Phe His Leu Leu Ala Val Ser Gln Gly Val Asn

305 310 315 320

Thr Ala Gly Gln Ala Glu Ser Thr Arg Arg Trp Gly Leu Ser Gln Asn

325 330 335

Pro Met Gln Val Gln Leu Pro Thr Ser Ala Leu His Pro Leu Glu Asp

340 345 350

Leu Thr Gln Glu Asp Thr His Tyr Ser Gln Thr Val Ser Asn Ile Leu

355 360 365

Gln Asn Gln Phe Thr Arg Trp Pro Ala Ser Pro Ser Ser Val Gly Tyr

370 375 380

Val Ser Tyr Ser Thr Gln Ser Ala Phe Ala Lys Trp Ser Ser Arg Ala

385 390 395 400

Ser His His His Phe His Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Gly Thr

405 410 415

Ser Gln Cys Ile Leu Lys Tyr Ile Leu Phe Thr Val Pro Tyr Leu His

420 425 430

Ala Lys Asn Pro Gly Glu Ser Ser Pro Gln Thr Thr Ala Ala Asp Thr

435 440 445

Lys Leu Arg Gly Lys Gly Ala Pro Gln Glu Glu Leu Ser Ala Asn His

450 455 460

Val Leu Ala Glu Arg Arg Arg Arg Glu Lys Leu Asn Glu Arg Phe Ile

465 470 475 480

Ile Leu Arg Ser Leu Val Pro Phe Val Thr Lys Met Asp Lys Ala Ser

485 490 495

Ile Leu Gly Asp Thr Ile Glu Tyr Val Lys Gln Leu Arg Arg Lys Ile

500 505 510

Gln Glu Leu Glu Ala Arg Asn Arg Gln Met Thr Glu Ala Glu Gln Arg

515 520 525

Ser Lys Leu Pro Glu Ile Ala Val Gln Arg Thr Ser Ser Ser Ser Ser

530 535 540

Lys Glu Gln Gln Arg Ser Gly Val Thr Met Thr Glu Lys Arg Lys Val

545 550 555 560

Arg Ile Val Glu Gly Val Val Ala Lys Ala Lys Ala Val Glu Ala Glu

565 570 575

Ala Thr Thr Ser Val Gln Val Ser Ile Ile Glu Ser Asp Ala Leu Leu

580 585 590

Glu Ile Glu Cys Arg His Lys Glu Gly Leu Leu Leu Asp Val Met Gln

595 600 605

Met Leu Arg Glu Val Arg Ile Glu Val Ile Gly Val Gln Ser Ser Leu

610 615 620

Asn Asn Gly Val Phe Val Ala Glu Leu Arg Ala Lys Val Lys Glu His

625 630 635 640

Ala Asn Gly Lys Lys Val Ser Ile Val Glu Val Lys Arg Ala Leu Asn

645 650 655

Gln Ile Ile Pro His Ala Val Asp

660

<210> 2

<211> 1995

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atggctgcgc cactaggcac tagccttcaa agcatgttgc aggctgcggt gcaatctgtt 60

cagtggactt atagtctctt ctggcaactt tgtccacaac aagggattct ggtttggggt 120

gatggttact acaatggagc aattaaaaca cggaagacgg tgcaaccaat ggaggtgagt 180

gctgaagagg cttctctcca aagaagccag caacttagag aactctatga atcactgtcc 240

gccggagaga caaacccgcc ttgtcgccgg ccttgtgccg ccttgtcgcc tgaggactta 300

acagaatccg aatggttcta tttgatgtgt gtctcattct cctttccacc tggtgttggg 360

ttgcctggaa aggcatatgc gaggaggcag catctatggc tcacgggtgc aaatgaggtg 420

gacagcaaaa cattttcacg agctattcta gccaagagtg ctcgcataca gactgtggtg 480

tgcattcctt tattggacgg tgtggttgag tttggcacaa tggataaggt tcaagaagac 540

ctcagcttca tccaacacgt ggagaccttc ttcatagacc acctcaaccc tttgccaccg 600

aagcctgcct tgtcggagca ctcaacctca aaccccgcct cctcctctga acacatcccc 660

gccgtcatgt ataccgtcgt ggatccactt gccgccaatc ccaacctaaa tgatgacatg 720

gatgaggata ttgaggagga agaggaggag gaagaggaag atgaggagcc ggaatctggt 780

tccgaagaca aagccggata cggcatcgct cgccaaactc cgacaccagc catggcggca 840

gagcccagcg agctgataca actagagatg ccggaggaca tccggcttgg gtctccaaac 900

gatgggtcaa acaacttaga ctcagatttt cacttgctgg cggtgagtca gggtgttaac 960

acagcggggc aggctgagtc aactcggagg tggggcctga gtcaaaaccc catgcaagtt 1020

caactaccga cttcagccct tcatccattg gaagacttga cacaagagga cactcactac 1080

tctcaaacag tgtccaacat cctccaaaac cagttcacac ggtggccagc ctcaccctcc 1140

tccgttggat acgtctcata ctccacgcaa tcagcattcg caaaatggag cagccgcgcc 1200

agccaccacc acttccaccc ggcggcggcg gcggcggcgg acggcaccag ccagtgcatc 1260

ctcaagtaca tcctcttcac ggtcccgtac ctccacgcca agaaccccgg cgagagttct 1320

ccccaaacca ccgccgcgga caccaaactc cgcggcaagg gagcgccgca ggaggagctc 1380

agcgccaacc acgtgctggc cgagcgccgc cgccgcgaga agctgaacga gaggttcata 1440

atcctgcggt cgctggtccc cttcgtgacc aaaatggaca aggcgtcgat attgggagac 1500

accatcgagt acgtgaagca gttgcggcgg aagatccagg agctcgaggc gcgtaaccgc 1560

cagatgacgg aggcggaaca acgttccaag ctcccagaga tagcagttca gagaacaagt 1620

agcagttcga gcaaggagca acagaggagt ggggtgacaa tgacggagaa gaggaaggtg 1680

aggatcgtgg aaggggtggt ggcgaaggcg aaggcggtgg aggctgaggc caccacgtcg 1740

gtgcaagttt cgatcataga aagcgacgca ctgttggaga tcgagtgtcg tcacaaagaa 1800

gggttgcttc tggacgtgat gcagatgctg agggaggtga ggatagaagt tataggggtg 1860

cagtcgtcgc ttaacaatgg ggtgttcgtg gcggagttga gggctaaggt gaaggaacat 1920

gcaaacggca agaaggtcag cattgtggaa gtgaagaggg cacttaacca aattataccc 1980

catgctgttg actaa 1995

Claims

1. GmbHLH664蛋白或其相关生物材料在调控植物种子蛋白含量中的应用；

所述相关生物材料为能够表达所述GmbHLH664蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述GmbHLH664蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白；

所述植物为双子叶植物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述GmbHLH664蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物种子蛋白含量提高。

3. GmbHLH664蛋白或其相关生物材料在提高植物种子蛋白含量育种中的应用；

所述GmbHLH664蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述植物为双子叶植物。

4.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于：能够表达所述GmbHLH664蛋白的核酸分子为如下任一所示DNA分子：

（B1）SEQ ID No.2所示的DNA分子；

（B2）与（B1）限定的DNA序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同一性且编码所述GmbHLH664蛋白的DNA分子。

5.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为十字花科植物或豆科植物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述十字花科植物为拟南芥；所述豆科植物为大豆。

7.一种培育种子蛋白含量提高的植物品种的方法，包括使受体植物中GmbHLH664蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

所述GmbHLH664蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述植物为双子叶植物。

8.一种培育种子蛋白含量提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GmbHLH664蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比种子蛋白含量提高；

所述GmbHLH664蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述植物为双子叶植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：能够表达所述GmbHLH664蛋白的核酸分子是通过重组表达载体的形式导入所述受体植物的。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：能够表达所述GmbHLH664蛋白的核酸分子为如下任一所示DNA分子：

（B1）SEQ ID No.2所示的DNA分子；

11.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为十字花科植物或豆科植物。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述十字花科植物为拟南芥；所述豆科植物为大豆。