CN110041416A

CN110041416A - GmABCA9基因在提高大豆蛋白含量和粒重中的应用

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Publication number: CN110041416A
Application number: CN201910355250.XA
Authority: CN
Inventors: 郭葳; 单志慧; 张婵娟; 陈李淼; 张晓娟; 袁松丽; 郝青南; 邱徳珍; 黄毅; 曹东; 陈水莲; 油清波; 代文君; 包爱丽; 杨中路; 陈海峰; 周新安
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2019-04-29
Filing date: 2019-04-29
Publication date: 2019-07-23
Anticipated expiration: 2039-04-29
Also published as: CN110041416B

Abstract

本发明公开了GmABCA9基因在提高大豆蛋白含量和粒重中的应用。本发明提供了GmABCA9蛋白或其相关生物材料在调控植物种子蛋白含量和/或产量中的应用；所述相关生物材料为能够表达所述GmABCA9蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。实验证明，将GmABCA9基因转入大豆后得到该基因过表达的转基因植株其种子蛋白含量和百粒重均显著高于未转基因的对照植株，说明GmABCA9及其编码基因可以调控植物种子的蛋白含量和粒重。GmABCA9及其相关生物材料可用于改善大豆品质，提高大豆产量。GmABCA9具有应用于大豆新品种选育及创制的潜力。

Description

GmABCA9基因在提高大豆蛋白含量和粒重中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及GmABCA9基因在提高大豆蛋白含量和粒重中的应用。

背景技术

大豆是重要的粮食作物和油料作物之一，是人类饮食和禽畜饲养主要的植物蛋白来源之一。大豆蛋白是一种植物性的完全蛋白质，它除了具有与动物蛋白等同的营养价值外，还有着动物蛋白不可比拟的优点，即不含胆固醇，并含有具降胆固醇作用的异黄酮。大豆蛋白含量是大豆育种的重要目标性状之一。目前我国大豆产量的增加不能满足人们对大豆蛋白的需要，因此在提高蛋白含的同时增加大豆产量是大豆育种的重要方向。而百粒重是影响大豆产量的重要因子，也是大豆育种的重要目标性状，发掘可以同时提高蛋白含量与产量的基因对大豆品种培育具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供GmABCA9基因在提高大豆蛋白含量和粒重中的应用。

第一方面，本发明要求保护GmABCA9蛋白或其相关生物材料在调控植物种子蛋白含量中的应用。

其中，所述相关生物材料为能够表达所述GmABCA9蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达GmABCA9的DNA，该DNA不但可包括启动GmABCA9基因转录的启动子，还可包括终止GmABCA9转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 10099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

构建含有GmABCA9基因表达盒的重组表达载体。所利用的植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用GmULT1构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

第二方面，本发明要求保护GmABCA9蛋白或其相关生物材料在如下任一中的应用：

(A)调控植物产量；

(B)调控植物种子重量。

在第一方面和第二方面中，所述GmABCA9蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量越高，植物种子蛋白含量和/或植物产量和/或植物种子重量越高；所述GmABCA9蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量越低，植物种子蛋白含量和/或植物产量和/或植物种子重量越低。

第三方面，本发明要求保护GmABCA9蛋白或其相关生物材料在植物育种中的应用。

第四方面，本发明要求保护一种培育植物品种的方法。

本发明所要求保护的培育植物品种的方法可为方法A或方法B或方法C：

方法A：一种培育种子蛋白含量提高的植物品种的方法，可包括使受体植物中GmABCA9蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。

方法B：一种培育产量提高的植物品种的方法，可包括使受体植物中GmABCA9蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。

方法C：一种培育种子重量提高的植物品种的方法，可包括使受体植物中GmABCA9蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。

第五方面，本发明要求保护一种培育转基因植物的方法。

本发明所要求保护的培育转基因植物的方法可为方法D或方法E或方法F：

方法D：一种培育种子蛋白含量提高的转基因植物的方法，可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GmABCA9蛋白的核酸分子，得到所述GmABCA9蛋白表达量提高的转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比种子蛋白含量提高。

方法E：一种培育产量提高的转基因植物的方法，可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GmABCA9蛋白的核酸分子，得到所述GmABCA9蛋白表达量提高的转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比产量提高。

方法F：一种培育种子重量提高的转基因植物的方法，可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GmABCA9蛋白的核酸分子，得到所述GmABCA9蛋白表达量提高的转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比种子重量提高。

其中，所述GmABCA9蛋白表达量提高可体现为所述GmABCA9蛋白的编码基因在转录水平的表达量提高。

在上述方法中，所述“向受体植物中导入能够表达GmABCA9蛋白的核酸分子”可通过向所述受体植物中导入含有所述GmABCA9蛋白的编码基因的重组表达载体实现。

在本发明中，所述重组载体为将所述GmABCA9蛋白的编码基因利用Gateway系统重组到pB2GW7.0载体上后得到的重组质粒。

在上述方法中，将所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在上述各方面中，所述种子重量为种子粒重，如百粒重。

在上述各方面中，所述GmABCA9蛋白可为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

在上述各方面中，所述“能够表达GmABCA9蛋白的核酸分子”为所述GmABCA9蛋白的编码基因。

进一步地，所述GmABCA9蛋白的编码基因可是如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述GmABCA9蛋白的DNA分子；

(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述GmABCA9蛋白的DNA分子。

上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNa₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

在上述各方面中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。

进一步地，所述双子叶植物可为豆科植物；

更进一步地，所述豆科植物可为大豆。

本发明的实验证明，将GmABCA9基因转入大豆后得到该基因过表达的转基因植株其种子蛋白含量和百粒重均显著高于未转基因的对照植株，说明GmABCA9及其编码基因可以调控植物种子的蛋白含量和粒重。GmABCA9及其相关生物材料可用于改善大豆品质，提高大豆产量。GmABCA9具有应用于大豆新品种选育及创制的潜力。

附图说明

图1为GmABCA9转基因T2代株系Line1中GmABCA9基因在转录水平的表达量、种子蛋白含量和百粒重结果。A为GmABCA9基因在转录水平的表达量；B为种子蛋白含量；C为百粒重结果。

图2为GmABCA9转基因T2代株系Line2中GmABCA9基因在转录水平的表达量、种子蛋白含量和百粒重结果。A为GmABCA9基因在转录水平的表达量；B为种子蛋白含量；C为百粒重结果。

图3为GmABCA9转基因T2代株系Line3中GmABCA9基因在转录水平的表达量、种子蛋白含量和百粒重结果。A为GmABCA9基因在转录水平的表达量；B为种子蛋白含量；C为百粒重结果。

图4为GmABCA9转基因T2代株系Line4中GmABCA9基因在转录水平的表达量、种子蛋白含量和百粒重结果。A为GmABCA9基因在转录水平的表达量；B为种子蛋白含量；C为百粒重结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

大豆栽培品种天隆一号(国审豆2008023)：为本实验室，即中国农业科学院油料作物研究所选育。

pGWC载体，为Gateway克隆载体。提及pGWC载体的文献：Chen,Q.J.,Zhou,H.M.,Chen,J.,&Wang,X.C.(2006).Using a modified TA cloning method to create entryclones.Analytical biochemistry,358(1),120-125.。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

pB2GW7载体，为Gateway表达载体。提及pB2GW7载体的文献：Dubin,M.J.,Bowler,C.,&Benvenuto,G.(2008).A modified Gateway cloning strategy for overexpressingtagged proteins in plants.Plant Methods,4(1),3.。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、GmABCA9基因提高大豆蛋白含量和粒重

本实施例中所涉及的GmABCA9基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

一、过表达载体构建

1、中间载体构建

以大豆天隆一号叶片cDNA为模板，以基因克隆引物(CDS-fw与CDS-rw)用PrimerStar Max(Takara,Japan)，试剂盒扩增，如表1体系配制反应液(50μl)。

表1反应体系

试剂	使用量	终浓度
			PrimerSTAR Max Premix(2×)	25μl	1×
CDS-fw	10pmol	0.2μM
			CDS-rw	10pmol	0.2μM
Template	200ng
			灭菌蒸馏水	Up to 50μl

98℃10sec变性，58℃退火15sec，72℃延伸3min，共计30个循环，用Bio-Rad PTC-100PCR仪扩增。

基因扩增引物：

CDS-fw：5’-aggctttgactttaggtc ATGGCGACCACTATCAGCG-3’；

CDS-rw：5’-gtctagagactttaggtc TCATTGAAAATCCACTGAACTAACTTGACT-3’。

PCR产物(约3k)琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收3k左右目标片段，回收步骤依据FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit(Vazyme,China)。

使用ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme,China)将扩增片段克隆入用AhdI酶切回收的pGWC载体。

如表2体系配制反应液(20μl)。

表2反应体系

37℃30min于冰上冷却，获得中间载体GmABCA9-pGWC。GmABCA9-pGWC中含有SEQ IDNo.2所示DNA分子。

2、中间载体转化大肠杆菌

取10μl连接产物加入100μl大肠杆菌DH5α感受态后，用化学法转化：即将混合感受态与连接产物的混合样冰上放置30min，置于42℃水中温浴90sec，再立即放入冰上3min，加1ml LB培养基后于37℃230rpm摇菌1hr，3000rpm离心4min去上清后，用剩余培养基重悬菌液，涂含氯霉素(30μg/ml)抗性的LB培养基圆皿，37℃培养24hr，长出菌斑经过扩大培养并测序，测序正确的为阳性克隆。

3、最终载体构建

阳性克隆在5ml含氯霉素(30μg/ml)抗性的LB培养基中于37℃培养过夜，用快速质粒小提试剂盒(Tiangen,China)提取质粒。使用Gateway^TM LR Clonase^TM Enzyme mix(Thermo Fisher Scientific,USA)试剂盒将中间载体上插入片段重组入最终载体pB2GW7载体中。

如表3体系配制反应液(20μl)。

表3反应体系

试剂	使用量
		中间载体GmABCA9-pGWC	1μl(200ng)
pB2GW7	2μl(300ng)
		5X LR Clonase<sup>TM</sup> Reaction Buffer	4μl
TE buffer(ph 8.0)	9μl
		LR Clonase<sup>TM</sup> Enzyme mix	4μl

25℃1hr，加入2μl Proteinase K solution并于37℃温浴10min终止反应。获得最终载体GmABCA9-pB2GW7。载体GmABCA9-pB2GW7的结构描述为：以pB2GW7为骨架，具有SEQ IDNo.2所示DNA分子。该载体具有Basta抗性。

二、最终载体转化大肠杆菌和农杆菌

取10μl连接产物加入100μl大肠杆菌DH5α感受态后，用化学法转化：即将混合感受态与连接产物的混合样冰上放置30min，置于42℃水中温浴90sec，再立即放入冰上3min，加1ml LB培养基后于37℃230rpm摇菌1hr，3000rpm离心4min去上清后，用剩余培养基重悬菌液，涂含卡那霉素(30μg/ml)抗性的LB培养基圆皿，37℃培养24hr，长出菌斑经过扩大培养并测序，测序正确的为阳性克隆。

阳性克隆在5ml卡那霉素(30μg/ml)抗性的LB培养基中于37℃培养过夜，用快速质粒小提试剂盒(Tiangen,China)提取质粒。用化学法转化EHA105农杆菌。将感受态EHA105(100μl)置于冰上，加入1μg质粒DNA GmABCA9-pB2GW7，混匀后于冰上放置30min，再置于液氮中速冻5min后迅速转移到37℃水浴5min，再置于冰上5min。随后加入1ml LB培养基，于28℃230rpm培养4hr。随后用3000rpm离心2min收集菌体，去上清后用剩余培养基重悬菌体，涂布含卡那霉素(30μg/ml)的LB培养基平板，于28℃培养48hr。将长出克隆用克隆PCR鉴定，阳性克隆用于大豆稳定转化。

三、大豆稳定转化

以大豆栽培品种天隆一号为受体材料，用子叶节法进行GmABCA9-pB2GW7稳定转化(Paz,M.M.,Martinez,J.C.,Kalvig,A.B.,Fonger,T.M.,&Wang,K.(2006).Improvedcotyledonary node method using an alternative explant derived from matureseed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation.Plant cellreports,25(3),206-213.)。获得植株用1:1000稀释的Basta(Bayer CropScience,Germany)喷施筛选。阳性苗于温室加代，温室为25℃，16hr光照/8hr黑暗条件。T2代稳定转化植物所收种子用于种子蛋白含量和百粒重测定。

实验同时设置向大豆栽培品种天隆一号中转入pB2GW7空载体的对照。

四、基因表达水平分析

用实时荧光定量PCR的方法进行转基因株系的表达水平分析。用TRIzol(ThermoFisher Scientific,USA)提取GmABCA9转基因T2代株系Line1，Line2，Line3，Line4以及空载对照株系和天隆一号(TL1)复叶中RNA，使用M-MLV Reverse Transcriptase反转录试剂盒(Promega,USA)反转为cDNA，再使用Takara SYBR Premix Ex Taq(Takara,Japan)构建反应体系，并在ABI Q3或Q5仪器上进行实时荧光定量PCR(Applied Biosystems,USA)。每个样本有3个生物学重复，并用于统计分析。GmACT11作为内参基因，以天隆一号(TL1)的表达水平为1，用-△△C(t)法进行分析。

qACT11-fw：5’-ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC-3’；

qACT11-rw：5’-GCTGGTCCTGGCTGTCTCC-3’。

qABCA9-fw：5’-AAGGACAAGAGTGAAGTGGATG-3’；

qABCA9-rw：5’-GACCGTAGCCTATAACGGTATC-3’。

扩增程序：95℃15 15min；95℃10sec,60℃退火15sec，72℃延伸20sec，共计40个循环。

五、种子蛋白含量测定

使用近红外法进行种子蛋白含量测定：依据国标GB/T 24870-2010粮油检验大豆粗蛋白质、粗脂肪含量的测定近红外法，采用瑞典Foss1241近红外品质分析仪测定，每个样品测定3次，取平均值。蛋白含量表示为每克大豆干重中蛋白重量，单位为mg/g

测量的大豆为T2代，于5月底种植于汉川转基因基地，间距20cm种植，行距50cm，每行12株。用近红外法测定时，每60株植物种子混合为一个样本进行测定。每个株系测量3个样本用于统计。

六、重量测定

每60株植物种子混合为一个样本，从中数100粒种子称重，每个株系测量3个样本用于统计。

七、显著性差异统计

显著性差异统计均用Student’t-test计算(p)，**,p<0.01；*,0.01<p<0.05。

八、结果

1、GmABCA9转基因T2代株系Line1

GmABCA9转基因T2代株系Line1中GmABCA9基因在转录水平的表达量如图1中A所示，种子蛋白含量如图1中B所示，百粒重结果如图1中C所示。

由图可见：

(1)GmABCA9基因在转录水平的表达量

与转基因受体天隆一号(TL1)相比，GmABCA9转基因T2代株系Line1中GmABCA9基因在转录水平的表达量显著降低(转基因沉默现象，参见“吴迪,朱延明.转基因植物中外源基因沉默机制及防止对策[J].生物技术通讯,2002(03):228-231+238；孔莹莹,蒋丽,韩凝,边红武,朱睦元,王君晖.植物转基因中同源共抑制的机制及其解决措施[J].生命科学,2012,24(05):399-403”一文.即大量过表达外源基因所产生的大量RNA触发了受体植物自身的RNA干涉系统,导致植物在不表达外源基因的同时沉默了受体自身的同源基因)。

(2)种子蛋白含量

TL1为受体对照，种子蛋白含量为42.07(mg/g)；转基因Line1为41.61(mg/g)，比TL1对照降低1％(0.01<P<0.05)。

(3)种子百粒重

TL1为受体对照，百粒重为16.9g；转基因Line1为16g，比TL1对照降低5.32％(P<0.01)。

2、GmABCA9转基因T2代株系Line2

GmABCA9转基因T2代株系Line2中GmABCA9基因在转录水平的表达量如图2中A所示，种子蛋白含量如图2中B所示，百粒重结果如图2中C所示。

由图可见：

(1)GmABCA9基因在转录水平的表达量

与转基因受体天隆一号(TL1)相比，GmABCA9转基因T2代株系Line2中GmABCA9基因在转录水平的表达量无显著差异。

(2)种子蛋白含量

TL1为受体对照，种子蛋白含量为42.07(mg/g)；转基因Line2为41.75(mg/g)，与TL1对照相比无显著差异。

(3)种子百粒重

TL1为受体对照，百粒重为16.9g；转基因Line2为16.72g，与TL1对照相比无显著差异。

3、GmABCA9转基因T2代株系Line3

GmABCA9转基因T2代株系Line3中GmABCA9基因在转录水平的表达量如图3中A所示，种子蛋白含量如图3中B所示，百粒重结果如图3中C所示。

由图可见：

(1)GmABCA9基因在转录水平的表达量

与转基因受体天隆一号(TL1)相比，GmABCA9转基因T2代株系Line3中GmABCA9基因在转录水平的表达量显著提高。

(2)种子蛋白含量

TL1为受体对照，种子蛋白含量为42.07(mg/g)；转基因Line3为44.52(mg/g)，比TL1对照提高5.8％(P<0.01)。

(3)种子百粒重

TL1为受体对照，百粒重为16.9g；转基因Line3为20.55g，比TL1对照提高21.59％(P<0.01)。

4、GmABCA9转基因T2代株系Line4

GmABCA9转基因T2代株系Line4中GmABCA9基因在转录水平的表达量如图4中A所示，种子蛋白含量如图4中B所示，百粒重结果如图4中C所示。

由图可见：

(1)GmABCA9基因在转录水平的表达量

与转基因受体天隆一号(TL1)相比，GmABCA9转基因T2代株系Line4中GmABCA9基因在转录水平的表达量显著提高。

(2)种子蛋白含量

TL1为受体对照，种子蛋白含量为42.07(mg/g)；转基因Line4为45.78(mg/g)，比TL1对照提高8.8％(P<0.01)。

(3)种子百粒重

TL1为受体对照，百粒重为16.9g；转基因Line4为19.8g，比TL1对照提高17.16％(P<0.01)。

5、空载对照株系

无论是GmABCA9基因在转录水平的表达量，还是种子蛋白含量和百粒重，转入pB2GW7载体的空载对照株系与转基因受体TL1相比均基本一致，无统计学差异。

以上结果表明，GmABCA9基因在转录水平的表达量越高，种子蛋白含量和百粒重越高(正相关)。

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> GmABCA9基因在提高大豆蛋白含量和粒重中的应用

<130> GNCLN190958

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 962

<212> PRT

<213> Glycine max (L.) Merrill

<400> 1

Met Ala Thr Thr Ile Ser Gly Ile Pro Leu Val Ala Leu Gln Val Lys

1 5 10 15

Ala Leu Leu Lys Lys Asn Leu Leu Leu Ser Trp Arg Asn Lys Arg Ala

20 25 30

Ser Leu Leu Gln Leu Leu Ser Pro Phe Met Phe Ile Phe Leu Ile Phe

35 40 45

Ala Ile Asp Lys Ala Met Lys Ala Lys Thr Ser Thr Ser Ser Ser Tyr

50 55 60

Lys Ser Val Thr Glu Pro Pro Met Glu Pro Ser Leu Pro Ile Thr Pro

65 70 75 80

Cys Glu Asp Lys Leu Phe Ile Asn Leu Pro Cys Tyr Asp Phe Val Trp

85 90 95

Ser Gly His Gln Ser Pro Lys Phe Arg Ile Ile Val Ala Arg Ile Met

100 105 110

Asn Asn Asn Pro Gly Arg Pro Ile Pro Pro Ser Lys Val Lys Ser Phe

115 120 125

Lys Asp Lys Ser Glu Val Asp Ala Trp Leu Phe Ser Asn Pro Met Arg

130 135 140

Cys Pro Ala Ala Leu His Phe Ile Glu Arg Asn Asp Thr Val Ile Gly

145 150 155 160

Tyr Gly Leu Gln Thr Asn Ser Thr Ser Leu Gln Arg Arg Gly Lys Phe

165 170 175

Glu Asn Pro Thr Ala Ser Phe Gln Leu Ala Ala Glu Arg Glu Ile Ala

180 185 190

Arg Tyr Leu Ile Gly Asp Ala Glu Phe Ser Trp Asn Val Phe Leu Arg

195 200 205

Glu Phe Ala His Pro Ser Thr Thr Pro Phe Ser Val Val Ala Ser Ile

210 215 220

Gly Pro Ala Phe Phe Leu Val Ile Ala Ile Phe Asn Phe Val Leu Gln

225 230 235 240

Ile Arg Ser Leu Val Thr Glu Lys Glu Leu Lys Leu Arg Gln Ala Met

245 250 255

Thr Met Met Gly Leu Tyr Asp Phe Ala Tyr Trp Phe Ser Trp Leu Ile

260 265 270

Trp Glu Ala Val Val Ala Ile Leu Ser Ser Leu Leu Ile Val Leu Phe

275 280 285

Gly Met Met Phe Gln Phe Arg Phe Phe Leu Asp Asn Ser Phe Val Val

290 295 300

Leu Phe Phe Phe Phe Phe Leu Phe Glu Leu Ser Met Thr Gly Leu Ala

305 310 315 320

Phe Met Ile Ser Ala Phe Ile Arg Lys Ser Ser Ser Ala Thr Thr Val

325 330 335

Gly Phe Tyr Ile Phe Ile Val Gly Phe Val Thr Gln Leu Val Ala Leu

340 345 350

Val Gly Phe Pro Tyr Lys Asp Ser Phe Ser Lys Thr Thr Arg Asn Leu

355 360 365

Trp Ser Leu Phe Pro Pro Asn Leu Phe Ser Gln Gly Ile Asn Val Leu

370 375 380

Ser Asp Ala Val Ala Thr Ser Glu Asp Lys Gly Val Ser Trp Ser Lys

385 390 395 400

Arg Gly Glu Cys Ala Leu Asn Lys Thr Asp Cys Val Ile Thr Ile Asp

405 410 415

Asp Ile Tyr Lys Trp Leu Ala Ala Thr Phe Phe Leu Trp Phe Val Leu

420 425 430

Ala Ile Tyr Phe Asp Asn Ile Ile Pro Asn Ala Ser Gly Val Arg Lys

435 440 445

Ser Ile Trp Tyr Phe Leu Asn Pro Asn Tyr Trp Met Gly Lys Gly Gly

450 455 460

Gln Lys Val Lys Glu Gly Gly Val Cys Ser Cys Ile Gly Ser Ala Leu

465 470 475 480

Cys Gln Glu Gln Ser Thr Pro Asp Asp Asp Val Leu Glu Glu Glu Asn

485 490 495

Lys Val Lys Gln Gln Leu Thr Glu Gly Leu Val Asp Ala Asn Ile Ala

500 505 510

Val Gln Ile Arg Gly Leu Ala Lys Thr Tyr Pro Gly Thr Arg Ser Ile

515 520 525

Gly Cys Cys Phe Lys Cys Lys Arg Thr Ser Pro Tyr Asn Ala Val Lys

530 535 540

Gly Leu Trp Val Asn Phe Ala Lys Asp Gln Leu Phe Cys Leu Leu Gly

545 550 555 560

Pro Asn Gly Ala Gly Lys Thr Thr Ala Ile Asn Cys Leu Ala Gly Ile

565 570 575

Thr Pro Val Thr Asp Gly Asp Ala Leu Ile Tyr Gly His Ser Ile Arg

580 585 590

Ser Ser Ser Gly Leu Ser Asn Ile Gln Lys Leu Ile Gly Val Cys Pro

595 600 605

Gln Phe Asp Ile Leu Trp Asp Ala Leu Ser Gly Gln Glu His Leu Gln

610 615 620

Leu Phe Ala Thr Ile Lys Gly Leu Ser Pro Ser Ser Ile Lys Ser Ile

625 630 635 640

Thr Gln Thr Ser Leu Ala Glu Val Arg Leu Thr Asp Ala Ser Lys Val

645 650 655

Arg Ala Gly Ser Tyr Ser Gly Gly Met Lys Arg Arg Leu Ser Phe Ala

660 665 670

Ile Ala Leu Ile Gly Asp Pro Lys Leu Val Ile Leu Asp Glu Pro Thr

675 680 685

Thr Gly Met Asp Pro Ile Ile Arg Arg His Val Trp Asp Ile Ile Glu

690 695 700

Asn Ala Lys Arg Gly Arg Ala Ile Val Leu Thr Thr His Ser Met Glu

705 710 715 720

Glu Ala Asp Ile Leu Ser Asp Arg Ile Gly Ile Met Ala Lys Gly Ser

725 730 735

Leu Arg Cys Ile Gly Thr Ser Ile Arg Leu Lys Ser Arg Phe Gly Ala

740 745 750

Gly Phe Ile Ala Asn Ile Ser Phe Asn Gly Asn Asn Ile Glu Cys Ser

755 760 765

Pro Ala Ser Gly Asp Ala Ile Ser Thr Glu His His Glu Ala Val Lys

770 775 780

Lys Leu Phe Lys Asn His Leu Asp Val Val Pro Lys Glu Glu Asn Asn

785 790 795 800

Asn Phe Leu Thr Phe Val Ile Pro His Asp Arg Glu Ala Leu Leu Lys

805 810 815

Asn Phe Phe Ser Glu Leu Gln Asp Arg Glu Lys Glu Phe Gly Ile Ser

820 825 830

Asp Ile Gln Leu Gly Leu Thr Thr Leu Glu Glu Val Phe Leu Asn Ile

835 840 845

Ala Arg Gln Ala Glu Leu Glu Ser Ala Ala Ala Glu Gly Arg Leu Val

850 855 860

Thr Leu Thr Leu Thr Ser Gly Glu Ser Val Gln Ile Pro Ile Gly Ala

865 870 875 880

Arg Phe Val Gly Ile Pro Gly Thr Glu Ser Ala Glu Asn Pro Thr Trp

885 890 895

Phe Met Val Glu Val Tyr Trp Glu Gln Asp Asp Thr Gly Ala Leu Cys

900 905 910

Ile Ala Ser His Ser Gln Lys Val Pro Ile Pro His Gly Val Gln Leu

915 920 925

Ser Ser Ser Pro Ser Arg Arg His Arg Arg Tyr Leu Gly Gln Ser Gly

930 935 940

Thr Val His Gly Val Val Ile Asp Pro Ser Gln Val Ser Ser Val Asp

945 950 955 960

Phe Gln

<210> 2

<211> 2889

<212> DNA

<213> Glycine max (L.) Merrill

<400> 2

atggcgacca ctatcagcgg catcccgctg gtggcgctgc aagtcaaggc gctcttgaag 60

aagaacctct tgctgtcatg gcggaacaag agggcgagtc tgctacagtt actctcccct 120

ttcatgttca ttttcctcat cttcgcaatc gacaaagcca tgaaggcaaa gacctcgacc 180

tcttcctcct acaagagcgt cacagaacct cccatggagc cttctctccc catcaccccc 240

tgcgaggaca agctcttcat caatctcccc tgctacgact tcgtctggag cggccaccag 300

agccccaagt ttcggatcat cgttgcccgc atcatgaaca acaaccctgg ccgacccatc 360

cctccctcca aggtgaaatc gtttaaggac aagagtgaag tggatgcatg gcttttcagt 420

aaccctatgc ggtgtccagc ggcgcttcat tttatagagc gaaacgatac cgttataggc 480

tacggtcttc agacgaattc caccagtctt cagcggcgag ggaagttcga gaaccccacg 540

gcgtcgtttc agcttgccgc agaacgtgaa attgccagat accttattgg agacgcggaa 600

ttcagttgga atgtttttct gagggaattc gcgcaccctt ccacgactcc tttctctgtt 660

gtggcttcaa ttggtccagc gtttttcctc gtgatcgcca tatttaattt tgttcttcag 720

attaggtctt tggtcacgga gaaagagctt aaacttcgcc aggcaatgac tatgatgggg 780

ctttacgact ttgcttactg gttttcctgg ctcatctggg aggcagttgt cgcaatccta 840

tcgtccctcc tcatagttct ctttggaatg atgttccagt ttcgcttttt cttggataac 900

agttttgtgg tcctgttctt ttttttcttc ctatttgaac ttagtatgac tggcttggcc 960

ttcatgatat ctgctttcat tcggaaatca tcttcggcaa caacagtggg gttctatata 1020

tttattgtgg gctttgtgac tcagcttgtg gcactagtag gatttcctta caaagatagc 1080

ttctccaaaa ccacacgaaa tttgtggtca ttattccccc ccaatctttt ttctcaaggt 1140

ataaatgtgc tttcagatgc agttgcaact tctgaagaca aaggtgttag ctggagtaaa 1200

cggggagaat gtgctcttaa caaaacagac tgtgttataa ctattgatga catttataaa 1260

tggcttgcag ctacattctt tctctggttt gttctggcca tttactttga caatataatc 1320

ccaaatgcat cgggtgtgag gaaatcaata tggtattttc taaatcccaa ttattggatg 1380

ggcaaaggag gtcaaaaagt gaaagagggt ggggtttgta gctgtatagg ttcagcccta 1440

tgtcaagaac aaagtacacc agatgatgat gtccttgaag aagaaaacaa agtgaaacag 1500

caactaacag aaggtcttgt tgatgcaaat attgctgttc agatacgtgg ccttgcaaag 1560

acataccctg gcacacgtag cattggttgc tgctttaaat gtaaaagaac ttcaccttac 1620

aatgctgtta agggtttgtg ggtgaacttt gcaaaggatc agttattttg tcttctagga 1680

cccaatggag ctggaaaaac tacagctatt aattgtttgg cagggataac tccagtaact 1740

gatggagatg cattgattta tggacattca atcagaagtt ctagtggctt gtcaaacatt 1800

caaaagctta taggagtatg tccacagttt gatatcctat gggatgcact gtctggtcaa 1860

gaacacctcc aactcttcgc tactattaaa ggcctgtccc catcttccat aaaatcaatt 1920

acccagactt cattagcaga ggtgagactc acggatgcat ccaaagtgag agctggaagt 1980

tacagtggag gaatgaaacg ccgtctcagt tttgctattg cccttattgg tgaccctaag 2040

ttagtcattc tggatgagcc gactactggt atggatccaa taataagaag gcatgtgtgg 2100

gacataattg aaaatgcaaa gagagggcgt gccattgttc ttacaacaca ctctatggaa 2160

gaagctgaca ttctaagtga ccgcataggt atcatggcaa aaggaagtct tcgctgcatt 2220

ggcacctcaa tcagattgaa gtcacgcttt ggtgctggtt ttattgctaa tatcagcttc 2280

aatggaaaca atattgaatg tagtcctgcc agtggagatg caatatctac agaacatcat 2340

gaggcagtga agaaattgtt taagaatcat ttagatgtag tgccaaaaga ggagaacaat 2400

aacttcctaa cttttgtgat tcctcatgac cgagaggcgc tcctgaaaaa tttcttttca 2460

gagctccaag atcgagaaaa agaatttggc atatctgaca tccagcttgg tctaacaact 2520

ctcgaagaag ttttcttgaa tattgcaaga caagcagagc ttgaaagcgc tgcagctgaa 2580

gggagactag tgacactgac cttaacatct ggggaatctg tgcagattcc tataggagct 2640

aggtttgtgg gaattccagg aacagagtct gctgaaaacc ctacttggtt catggtagaa 2700

gtatactggg aacaagatga tactggtgcc ttatgcattg ccagccactc acagaaggtt 2760

cctattcctc atggcgttca actatcatct tctccttcta gaagacaccg tagatattta 2820

ggccagtcag gaacagttca tggggtcgtg attgatccaa gtcaagttag ttcagtggat 2880

tttcaatga 2889

Claims

1.GmABCA9蛋白或其相关生物材料在调控植物种子蛋白含量中的应用；

所述相关生物材料为能够表达所述GmABCA9蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

2.GmABCA9蛋白或其相关生物材料在如下任一中的应用：

(A)调控植物产量；

(B)调控植物种子重量；

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述GmABCA9蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量越高，植物种子蛋白含量和/或植物产量和/或植物种子重量越高；

所述GmABCA9蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量越低，植物种子蛋白含量和/或植物产量和/或植物种子重量越低。

4.GmABCA9蛋白或其相关生物材料在植物育种中的应用；

5.一种培育植物品种的方法，为方法A或方法B或方法C：

方法A：一种培育种子蛋白含量提高的植物品种的方法，包括使受体植物中GmABCA9蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

方法B：一种培育产量提高的植物品种的方法，包括使受体植物中GmABCA9蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

方法C：一种培育种子重量提高的植物品种的方法，包括使受体植物中GmABCA9蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。

6.一种培育转基因植物的方法，为方法D或方法E或方法F：

方法D：一种培育种子蛋白含量提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GmABCA9蛋白的核酸分子，得到所述GmABCA9蛋白表达量提高的转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比种子蛋白含量提高；

方法E：一种培育产量提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GmABCA9蛋白的核酸分子，得到所述GmABCA9蛋白表达量提高的转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比产量提高；

方法F：一种培育种子重量提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GmABCA9蛋白的核酸分子，得到所述GmABCA9蛋白表达量提高的转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比种子重量提高。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述“向受体植物中导入能够表达GmABCA9蛋白的核酸分子”是通过向所述受体植物中导入含有所述GmABCA9蛋白的编码基因的重组表达载体实现的。

8.根据权利要求1-7中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述GmABCA9蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述“能够表达GmABCA9蛋白的核酸分子”为所述GmABCA9蛋白的编码基因；

进一步地，所述GmABCA9蛋白的编码基因是如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

10.根据权利要求1-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物；

进一步地，所述双子叶植物为豆科植物；

更进一步地，所述豆科植物为大豆。