CN114805517A - 大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用 - Google Patents

大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114805517A
CN114805517A CN202210524072.0A CN202210524072A CN114805517A CN 114805517 A CN114805517 A CN 114805517A CN 202210524072 A CN202210524072 A CN 202210524072A CN 114805517 A CN114805517 A CN 114805517A
Authority
CN
China
Prior art keywords
soybean
gmcol2b
target
protein
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210524072.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114805517B (zh
Inventor
侯兴亮
胡一龙
余斌
孔凡江
汤杨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Botanical Garden of CAS
Original Assignee
South China Botanical Garden of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Botanical Garden of CAS filed Critical South China Botanical Garden of CAS
Priority to CN202210524072.0A priority Critical patent/CN114805517B/zh
Publication of CN114805517A publication Critical patent/CN114805517A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114805517B publication Critical patent/CN114805517B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10Type of nucleic acid
    • C12N2310/20Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用,属于植物分子生物学领域。本发明提供了提供GmCOL2b蛋白或其编码基因等的相关生物材料在调控大豆种子大小中的应用,所述GmCOL2b蛋白为氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质,具体地,是通过降低所述GmCOL2b蛋白在所述大豆中的表达量和/或活性,使大豆的种子变小。本发明还提供了一种培育种子更小的大豆的方法,是通过对受体大豆中GmCOL2b蛋白的编码基因进行敲除而得到,所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明为作物育种提供了宝贵的基因资源,可将大豆GmCOL2b基因广泛应用于大豆育种中。

Description

大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域,具体涉及大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用。
背景技术
大豆(Glycine max)是我国重要的经济和粮食作物,近年来,国内不断增长的大豆需求量导致国内大豆产量远远不能满足我国自身的大豆需求,对外依存度极高。大豆精准遗传改良可以大幅度加快大豆品种选育进程,对满足大豆生产需求意义重大。大豆种子大小是一个重要而复杂的农艺性状,与大豆产量和品质之间同时存在复杂且密切的联系,小粒品种往往具有更高的单株产量和品质,而大豆种子大小受多基因控制,可以通过遗传改良来控制。
近年来,大豆种子大小的研究一直都在进行。目前已有许多与大豆种子大小调控相关基因被克隆并通过转基因实验验证。例如,GmMYB73和GmGA20OX通过转化拟南芥得以验证;还有很多基因已在大豆本身得到验证,包括GmSWEET10a、GmSWEET10b和GmSWEET39等糖转运相关基因,GmCYP78A72和GmCYP78A5等细胞色素相关基因,以及GmFAD3、BIG SEEDS1、GmWRKY15a、PP2C-1、GmLEC2等。但目前为止,调控大豆种子大小的分子机理仍未被完全阐明,各基因之间的调控网络尚不明晰。因此,进一步挖掘与大豆种子大小相关基因对人们深入了解种子发育过程以及提高产量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用,以解决上述现有技术存在的问题,该基因是大豆种子大小的关键调控基因,可以用于大豆不同种子大小品种的培育。
本发明的第一个目的是提供GmCOL2b蛋白或其相关生物材料在大豆育种中的应用,特别是调控大豆种子大小中的应用;所述GmCOL2b蛋白为氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质。所述的调控大豆种子大小可以应用于培育新品种大豆或者鉴定与筛选大豆品种。
优选地,所述的相关生物材料为大豆GmCOL2b蛋白的编码基因,或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组细胞。
更优选地,所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
进一步地,所述的调控大豆种子大小,是通过降低所述GmCOL2b蛋白在所述大豆中的表达量和/或活性,使大豆的种子变小;或通过提高所述GmCOL2b蛋白在所述大豆中的表达量和/或活性,使大豆的种子变大。
本发明第二个目的是一种培育种子更小的大豆的方法,包括以下步骤:对受体大豆中GmCOL2b蛋白的编码基因进行敲除,得到种子更小的转基因大豆;所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
优选地,所述的敲除是用CRISPR/Cas 9系统对受体大豆中GmCOL2b蛋白的编码基因进行敲除。
更优选地,所述的CRISPR/Cas 9系统中,gRNA序列为:AAATGCTGCGGCACCTGAAC。
更优选地,包括以下步骤:
a.将靶点连接到U3gRNA表达盒,构建CRISPR/gRNA载体;然后将CRISPR/gRNA载体连接到pYLCRISPR/Cas9P35S-B双元载体,获得GmCOL2b敲除载体;所述的靶点序列为:GTTCAGGTGCCGCAGCATTTTCAACCCGG;
b.利用农杆菌介导的遗传转化将所述GmCOL2b敲除载体导入大豆愈伤组织中,获得从愈伤组织转化而来的植株col2b;
c.通过PCR对基因敲除靶点位置进行扩增并测序;
d.从T1代开始筛选除草剂阴性且靶点纯合植株,从而得到种子更小的转基因大豆。
进一步地,使用的引物序列如下:
步骤a中,所述GmCOL2b敲除载体的构建引物:
COL2b-AtU6-29T4F:attgAAATGCTGCGGCACCTGAAC,
COL2b-AtU6-29T4R:aaacGTTCAGGTGCCGCAGCATTT;
步骤c中,所述通过PCR对基因敲除靶点位置进行扩增并测序的检测引物:
COL2b-target-F:ATTCACTTCCCTTCCTCCAAAT,
COL2b-target-R:TGACTAAGAGAACCATCGTAACTG;
步骤d中,所述筛选除草剂阴性且靶点纯合植株的检测引物:
COL2b-target-F:ATTCACTTCCCTTCCTCCAAAT,
COL2b-target-R:TGACTAAGAGAACCATCGTAACTG。
与现有技术相比,本发明有益效果如下:
本发明首次揭示了大豆GmCOL2b基因控制大豆种子大小的生物学功能,该基因功能缺使大豆种子显著变小,百粒重显著降低。本发明为作物育种提供了宝贵的基因资源,可将大豆GmCOL2b基因广泛应用于大豆育种中。
附图说明
图1为pYLsgRNA-AtU3b载体结构图。
图2为pYLCRISPR/Cas9P35S-B双元载体结构图。
图3为对照植株和GmCOL2b敲除植株的基因编辑靶点序列的PCR扩增测序分析。
图4为W82植株和GmCOL2b敲除植株的种子籽粒大小的表型图,比例尺为5毫米。
图5为W82植株和GmCOL2b敲除植株的种子籽粒大小和百粒重。误差性代表标准误差(籽粒大小,n=50;百粒重,n=5)。**代表与W82植株相比存在显著性差异。双尾T检验用于显著性差异分析:**P<0.01。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。
下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,所用引物合成及测序可自主完成或委托第三方基因公司完成。
实施例1 GmCOL2b敲除载体的构建及遗传转化
植物材料
供试是大豆品种为威廉82(williams 82)。
实施例1GmCOL2b敲除载体的构建及遗传转化
1、通过NCBI获得GmCOL2b的全基因组序列(SEQ ID No.1,其编码区的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,其表达的蛋白的序列如SEQ ID No.3所示),该基因位于19号染色体,其在大豆中的基因位点编号为Glyma19g05170。通过网站(http://www.rgenome.net/cas-designer/)中的target design设计并选取脱靶率较低的靶点,靶点序列为:GTTCAGGTGCCGCAGCATTTTCAACCCGG(SEQ ID No.4),gRNA序列为:AAATGCTGCGGCACCTGAAC(SEQ ID No.5);并设计相应靶点引物为:
F:attgAAATGCTGCGGCACCTGAAC;
R:aaacGTTCAGGTGCCGCAGCATTT。
2、利用载体pYLsgRNA-AtU3b(图1)载体,将靶点连接到U3gRNA表达盒,特异引物扩增出表达盒产物,详细地:先进行第一轮PCR,PCR扩增引物:U-F:5-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3;gRNA-R:5-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3。随后进行第二轮,用位置特异引物扩增出表达盒产物。PCR扩增引物:F:attgAAATGCTGCGGCACCTGAAC;R:aaacGTTCAGGTGCCGCAGCATTT。
PCR反应体系:
PCR Mix(GenStar cat#A012-101) 5μL
模板pYLsgRNA-AtU3b 1μL
引物F 0.5μL
引物-R 0.5μL
3μL。
3、并将扩增后的片段连接到pPTG-gRNA-Cas9-AtU6-1双元载体,获得GmCOL2b敲除载体pYLCRISPR/Cas9P35S-B(图2)。连接反应步骤如下:配制10μl 1x BsaI酶切连接反应液:在1x Bsa I-内切酶Buffer(NEB公司)中加入0.5μl 10 x NEB T4 DNA ligase buffer至终浓度0.5~1.0mM,随后加入约20ng pPTG-gRNA-Cas9-AtU6-1质粒(预先配好20ng/μl保存),0.5μl接头(最终浓度0.05~0.1μM),~5UBsaI(NEB公司),~35U T4 DNA ligase(Takara公司)。用变温循环仪(或PCR仪)循环反应5循环:37℃5min,20℃5min。
4、利用农杆菌EH105菌株介导的遗传转化将上述GmCOL2b敲除载体pYLCRISPR/Cas9P35S-B导入大豆愈伤组织中,获得从愈伤组织转化而来的植株col2b。
5、通过PCR对基因敲除靶点位置进行扩增并测序。
PCR引物:
COL2b-target-F:ATTCACTTCCCTTCCTCCAAAT,
COL2b-target-R:TGACTAAGAGAACCATCGTAACTG。
PCR体系:
PCR Mix(GenStar cat#A012-101) 5μL
模板转基因大豆株系的DNA 1μL
引物-F 0.5μL
引物-R 0.5μL
3μL。
PCR程序:在95℃预变性10min,进入循环扩增阶段:95℃30s→59℃30s→72℃60s,循环30-35次,最后在72℃保温10min。
6、从T1代开始筛选除草剂阴性且靶点纯合突变体植株。详细地,利用步骤5的检测方法。对靶点位置进行PCR检测,进行PCR测序,挑选靶点位置DNA序列编辑且纯合的株系,并进行利用除草剂特异引物进行筛选,获得阴性植株筛选。引物:
COL2b-target-F:ATTCACTTCCCTTCCTCCAAAT,
COL2b-target-R:TGACTAAGAGAACCATCGTAACTG;
PCR体系:
PCR Mix(GenStar cat#A012-101) 5μL
模板转基因大豆株系的DNA 1μL
引物-F 0.5μL
引物-R 0.5μL
3μL。
对获得的纯合植株的种子进行观察,对种子籽粒大小表型拍照,用image J测量种子面积,并用分析天平称量百粒重。
通过PCR扩增突变位点,并通过序列测定,检测突变位点确定序列突变情况(突变类型),如图3所示。对种子进行观察发现,col2b种子籽粒明显比W82减小(图4)。通过数据统计种子籽粒大小和百粒重,GmCOL2b敲除株系的种子籽粒大小和百粒重均显著低于野生型的W82(图5)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明群里要求书确定的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院华南植物园
<120> 大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3710
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 1
taaaaaaaaa gtatcatatt tagagagact aaaagattat ttaagtcaaa aaataatttt 60
tgtttagcat ttgttctcac cgagttctag gcaagtgatc cgtcttcgtc ttccctttag 120
tagttgaaca ggtcaattgg ttaaaccaca gattgatgga agtgatataa tgattaaata 180
tgcgatatat attacttgtg tcacatatta atgaaattgt gcggatggtc tagtggtaaa 240
tatactagaa agattttcct agacaaagat cgactctatg gttggtaatt tacttttaca 300
atttccttaa aatagtcaag taactagctg taaacctcag caaatttagt acttggagca 360
actatgaaca attaatgata tttattttaa acattccacc ttaattaaca tcttagttct 420
ccaaactcca ccaaccaaaa atttctattt attttcataa tcacaagcac tccacattct 480
atctgcaaaa tcagtaatta accaaacact tgctttaatc cttttagagc caataagatt 540
actgagagga aaggatatat taaggggtaa caagagattc taactggtgc aagtatagaa 600
tctacatgga cccaaatgac acgtgtctcc aagttgtgtc accatagcaa tacgaacaaa 660
gcctcagcat ctctttaatg attccaaaag gcaaagaagc aacatgcatg gacaggtcca 720
acaccaaaac aaaaaaccct ctctcctaat caaccctgaa acacaaccaa ccacaagata 780
agcaagaact tgtgcacgcc actaacttgc tgccacgttg gcactcttga ttctcccccc 840
aacactactt ggttcacctc actaaactca atttctcact cacactcact tcagttcaat 900
tcacttccct tcctccaaat tagttccaac acaaaaacca agcaaagaaa aagactctac 960
cgaaacactt cactactcat acaatatttt cagacacaac atgttgaagg aaggcaccaa 1020
caacgttggt ggcagcaaca ctggcaccac ctggtcacgt gtctgtgaca cgtgcctgtc 1080
tgcgccatgc gtgctgtact gccatgcaga ctcagcatat ctttgctctt cctgtgatgc 1140
tcgtgtgcat gcagctaacc gtgtggcctc gagacacaag cgtgtgtggg tgtgcgaagc 1200
gtgtgagcgt gctccggcgg cgtttctatg caaagctgac gcagcttctc tttgttcttc 1260
ctgtgatgct gacattcact cagcaaaccc tctcgctagc cgccacaacc gtgttcccat 1320
tctcccgatc tcaggttccc tcttcaggga accagagcac aatcacaaac gcgtggaaca 1380
cgcgttcgtg aatgaggttg aggaggaaga ggaaggggtt tttgatgagt atgaagacga 1440
ggttgaagct gcttcgtggt tgttgccaca tcctatgaaa aataatgatg aaattgagga 1500
gaatgattgt ggtgacgagg gttttttgtt tgttgatgag tatttggaca atcttgttga 1560
ttgttgtaac tcatgtggtc acaatgacaa ccagtttagc aacgtttatc agcaccagca 1620
gaattacaac actgtccctc agaactatgt agtggttcca gttcaggtgc cgcagcattt 1680
tcaacccggt ttggactttg actcatcaaa agctgggttc agttacgatg gttctcttag 1740
tcaaagtgta agactcttct tttcaattac ttctgtgttt ctttttcggt ttgtttttta 1800
tatgaatagt gttttccctt tttctctttc tttttctttt cccagactct ttggatcatt 1860
catccattgg attatacttt atcagatttt gattttgcct tgacaccttt gctaactctt 1920
ccttccaatt ggcagtttct ttcctttctc cgttcatatg aaactagggt tttaaattat 1980
actcatgatc aataatttgg ttgcaatttt tgatattgta gtacaattgc tattgttgtt 2040
gtgaaaagtt aaaaaaatct taatgttgta accgaaatct caatcacata ctgtttgtaa 2100
aatccttggt tgaaatcaaa gtgggtttcc caagtagctt cttttactag aaacgctagc 2160
aaagtcaact actctagttc aattgccata tatgtgacta atttgattca ttccacaact 2220
cttcatattt ctttgactac ccttttaccg ttcactttgc ggtcttgaga gacttttatt 2280
tattttcttt tttgtcgtat ataagatcag ctttgccttt atggtgtctt ttatttgcta 2340
gttatagttg tgattcctct taaactttgt ttcctcattt catcaactgt atattaattt 2400
cccataattt ttcagcttca attaaaaaaa ttgagcctaa gtgcctgatt tattaaagcc 2460
acaaaatggg tggtttaatt ttttcgacac ctttctttta tatttctttt actcttcttc 2520
tcttttcttt ttctattaca tcatctataa tatatcttca cctttttctt cttactttgg 2580
ggacaaacat ttttgtttca caaagctggt tagctactag tttattgctt agaaaattta 2640
tagccttacc tgtgatctct caaacttcat acacgatttt gtgttaatct tttatatttc 2700
atttttaatt taggtttcgg tttcatcaat ggatgttgga gttgtacccg aatcaacagt 2760
aagtggcatc tcaatgtccc actcaaagtc accaataggg acaaatgacc tatttcctcc 2820
ccttctcatg ccttcacatc tcacaccaat ggacagagag gcaagagtcc taagatatag 2880
ggagaaaaag aagacaagaa agttcgagaa gaaaataaga tatgcctcaa ggaaggccta 2940
tgcagagact agaccccgca taaagggtcg ttttgcaaag agaactgatg tagaagctga 3000
agtggatcag atgttctcca caaaactatt caatgaagtt ggaggtagca tttttcccac 3060
tttctagaat ggaaagaaag taattgccaa gccatagaag agaaggttgg gaaccacaca 3120
tcattggaag aacttcatgt aatttttatg tagtctaatt agtttggtat tatatttact 3180
tctatcttgt gctttataaa tataaagtat catttgagtc gctatatatt ttgtctacat 3240
acaccttcct tctcaaaatt ttgccttata ataatttaat ttctgatcaa tttctacata 3300
tttttcaaca gatttctgtt tggtcatctc acatctaggt acaatgacat ccgtcgaatt 3360
aattactgat gtaacattaa ttcaatggca aaattaaatt aaatcaatga gtacgactag 3420
tttacactta aaattttcac ttgtataggt aaaaaaatat ttcgcttcca cctcaaaatg 3480
aaagctataa cttcatcggt tattgatgct ttaaattgta ttaactaatc gattagacta 3540
tagtcgaggt cttaaagaat ccaaacgaga agtaaaattc aagattacaa ttttgtactg 3600
atagttcaat tttccatgtt aggagatata atgttaattt gatggtaaaa gaagaaggaa 3660
aaaagaaata aattgtgagt ttaaattcat tcgagttaaa aaaattaata 3710
<210> 2
<211> 1101
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 2
atgttgaagg aaggcaccaa caacgttggt ggcagcaaca ctggcaccac ctggtcacgt 60
gtctgtgaca cgtgcctgtc tgcgccatgc gtgctgtact gccatgcaga ctcagcatat 120
ctttgctctt cctgtgatgc tcgtgtgcat gcagctaacc gtgtggcctc gagacacaag 180
cgtgtgtggg tgtgcgaagc gtgtgagcgt gctccggcgg cgtttctatg caaagctgac 240
gcagcttctc tttgttcttc ctgtgatgct gacattcact cagcaaaccc tctcgctagc 300
cgccacaacc gtgttcccat tctcccgatc tcaggttccc tcttcaggga accagagcac 360
aatcacaaac gcgtggaaca cgcgttcgtg aatgaggttg aggaggaaga ggaaggggtt 420
tttgatgagt atgaagacga ggttgaagct gcttcgtggt tgttgccaca tcctatgaaa 480
aataatgatg aaattgagga gaatgattgt ggtgacgagg gttttttgtt tgttgatgag 540
tatttggaca atcttgttga ttgttgtaac tcatgtggtc acaatgacaa ccagtttagc 600
aacgtttatc agcaccagca gaattacaac actgtccctc agaactatgt agtggttcca 660
gttcaggtgc cgcagcattt tcaacccggt ttggactttg actcatcaaa agctgggttc 720
agttacgatg gttctcttag tcaaagtgtt tcggtttcat caatggatgt tggagttgta 780
cccgaatcaa cagtaagtgg catctcaatg tcccactcaa agtcaccaat agggacaaat 840
gacctatttc ctccccttct catgccttca catctcacac caatggacag agaggcaaga 900
gtcctaagat atagggagaa aaagaagaca agaaagttcg agaagaaaat aagatatgcc 960
tcaaggaagg cctatgcaga gactagaccc cgcataaagg gtcgttttgc aaagagaact 1020
gatgtagaag ctgaagtgga tcagatgttc tccacaaaac tattcaatga agttggaggt 1080
agcatttttc ccactttcta g 1101
<210> 3
<211> 366
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400> 3
Met Leu Lys Glu Gly Thr Asn Asn Val Gly Gly Ser Asn Thr Gly Thr
1 5 10 15
Thr Trp Ser Arg Val Cys Asp Thr Cys Leu Ser Ala Pro Cys Val Leu
20 25 30
Tyr Cys His Ala Asp Ser Ala Tyr Leu Cys Ser Ser Cys Asp Ala Arg
35 40 45
Val His Ala Ala Asn Arg Val Ala Ser Arg His Lys Arg Val Trp Val
50 55 60
Cys Glu Ala Cys Glu Arg Ala Pro Ala Ala Phe Leu Cys Lys Ala Asp
65 70 75 80
Ala Ala Ser Leu Cys Ser Ser Cys Asp Ala Asp Ile His Ser Ala Asn
85 90 95
Pro Leu Ala Ser Arg His Asn Arg Val Pro Ile Leu Pro Ile Ser Gly
100 105 110
Ser Leu Phe Arg Glu Pro Glu His Asn His Lys Arg Val Glu His Ala
115 120 125
Phe Val Asn Glu Val Glu Glu Glu Glu Glu Gly Val Phe Asp Glu Tyr
130 135 140
Glu Asp Glu Val Glu Ala Ala Ser Trp Leu Leu Pro His Pro Met Lys
145 150 155 160
Asn Asn Asp Glu Ile Glu Glu Asn Asp Cys Gly Asp Glu Gly Phe Leu
165 170 175
Phe Val Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Leu Val Asp Cys Cys Asn Ser Cys
180 185 190
Gly His Asn Asp Asn Gln Phe Ser Asn Val Tyr Gln His Gln Gln Asn
195 200 205
Tyr Asn Thr Val Pro Gln Asn Tyr Val Val Val Pro Val Gln Val Pro
210 215 220
Gln His Phe Gln Pro Gly Leu Asp Phe Asp Ser Ser Lys Ala Gly Phe
225 230 235 240
Ser Tyr Asp Gly Ser Leu Ser Gln Ser Val Ser Val Ser Ser Met Asp
245 250 255
Val Gly Val Val Pro Glu Ser Thr Val Ser Gly Ile Ser Met Ser His
260 265 270
Ser Lys Ser Pro Ile Gly Thr Asn Asp Leu Phe Pro Pro Leu Leu Met
275 280 285
Pro Ser His Leu Thr Pro Met Asp Arg Glu Ala Arg Val Leu Arg Tyr
290 295 300
Arg Glu Lys Lys Lys Thr Arg Lys Phe Glu Lys Lys Ile Arg Tyr Ala
305 310 315 320
Ser Arg Lys Ala Tyr Ala Glu Thr Arg Pro Arg Ile Lys Gly Arg Phe
325 330 335
Ala Lys Arg Thr Asp Val Glu Ala Glu Val Asp Gln Met Phe Ser Thr
340 345 350
Lys Leu Phe Asn Glu Val Gly Gly Ser Ile Phe Pro Thr Phe
355 360 365
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttcaggtgc cgcagcattt tcaacccgg 29
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaatgctgcg gcacctgaac 20

Claims (10)

1.大豆GmCOL2b蛋白或其相关生物材料在大豆育种中的应用,其特征在于,所述的大豆GmCOL2b蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的在大豆育种中的应用是调控大豆种子大小中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述的相关生物材料为大豆GmCOL2b蛋白的编码基因,或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组细胞。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
5.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的调控大豆种子大小,是通过降低所述GmCOL2b蛋白在所述大豆中的表达量和/或活性,使大豆的种子变小;或通过提高所述GmCOL2b蛋白在所述大豆中的表达量和/或活性,使大豆的种子变大。
6.一种培育种子更小的大豆的方法,其特征在于,包括以下步骤:对受体大豆中GmCOL2b蛋白的编码基因进行敲除,得到种子更小的转基因大豆;所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的敲除是用CRISPR/Cas 9系统对受体大豆中GmCOL2b蛋白的编码基因进行敲除。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的CRISPR/Cas 9系统中,gRNA序列为:AAATGCTGCGGCACCTGAAC。
9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
a.将靶点连接到U3 gRNA表达盒,构建CRISPR/gRNA载体;然后将CRISPR/gRNA载体连接到pPTG-gRNA-Cas9-AtU6-1双元载体,获得GmCOL2b敲除载体;所述的靶点序列为:GTTCAGGTGCCGCAGCATTTTCAACCCGG;
b.利用农杆菌介导的遗传转化将所述GmCOL2b敲除载体导入大豆愈伤组织中,获得从愈伤组织转化而来的植株col2b;
c.通过PCR对基因敲除靶点位置进行扩增并测序;
d.从T1代开始筛选除草剂阴性且靶点纯合植株,从而得到种子更小的转基因大豆。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,使用的引物序列如下:
步骤a中,所述GmCOL2b敲除载体的构建引物:
COL2b-AtU6-29T4F:attgAAATGCTGCGGCACCTGAAC,
COL2b-AtU6-29T4R:aaacGTTCAGGTGCCGCAGCATTT;
步骤c中,所述通过PCR对基因敲除靶点位置进行扩增并测序的检测引物:
COL2b-target-F:ATTCACTTCCCTTCCTCCAAAT,
COL2b-target-R:TGACTAAGAGAACCATCGTAACTG;
步骤d中,所述筛选除草剂阴性且靶点纯合植株的检测引物:
COL2b-target-F:ATTCACTTCCCTTCCTCCAAAT,
COL2b-target-R:TGACTAAGAGAACCATCGTAACTG。
CN202210524072.0A 2022-05-13 2022-05-13 大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用 Active CN114805517B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210524072.0A CN114805517B (zh) 2022-05-13 2022-05-13 大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210524072.0A CN114805517B (zh) 2022-05-13 2022-05-13 大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114805517A true CN114805517A (zh) 2022-07-29
CN114805517B CN114805517B (zh) 2023-07-25

Family

ID=82515989

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210524072.0A Active CN114805517B (zh) 2022-05-13 2022-05-13 大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114805517B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116463356A (zh) * 2023-04-27 2023-07-21 广州大学 大豆GmSPA3a变体及其在育种中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102212529A (zh) * 2010-04-09 2011-10-12 中国科学院遗传与发育生物学研究所 控制种子大小和油脂合成的基因
CN109439670A (zh) * 2018-12-27 2019-03-08 山东农业大学 一种用于改良种子大小和品质的基因的获得方法和应用
CN110041416A (zh) * 2019-04-29 2019-07-23 中国农业科学院油料作物研究所 GmABCA9基因在提高大豆蛋白含量和粒重中的应用
CN113637060A (zh) * 2021-09-15 2021-11-12 中国农业科学院作物科学研究所 大豆GmSPA3a/3b蛋白及其相关生物材料在调控植物开花和株高中的应用
CN113980106A (zh) * 2021-10-27 2022-01-28 中国农业大学 调控植物种子和器官大小的小肽及其编码基因和应用
CN114423867A (zh) * 2019-09-05 2022-04-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 改善种子大小和质量的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102212529A (zh) * 2010-04-09 2011-10-12 中国科学院遗传与发育生物学研究所 控制种子大小和油脂合成的基因
CN109439670A (zh) * 2018-12-27 2019-03-08 山东农业大学 一种用于改良种子大小和品质的基因的获得方法和应用
CN109913473A (zh) * 2018-12-27 2019-06-21 山东农业大学 一种用于改良种子大小和品质的基因及其应用
CN110041416A (zh) * 2019-04-29 2019-07-23 中国农业科学院油料作物研究所 GmABCA9基因在提高大豆蛋白含量和粒重中的应用
CN114423867A (zh) * 2019-09-05 2022-04-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 改善种子大小和质量的方法
CN113637060A (zh) * 2021-09-15 2021-11-12 中国农业科学院作物科学研究所 大豆GmSPA3a/3b蛋白及其相关生物材料在调控植物开花和株高中的应用
CN113980106A (zh) * 2021-10-27 2022-01-28 中国农业大学 调控植物种子和器官大小的小肽及其编码基因和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SUBMIT DIRECT: "NP_001278944.1", 《NCBI》 *
ZHANG等: "A soybean deletion mutant that moderates the repression of flower by cool temperatures", 《FRONTIERS IN PLANT SCIENCE》, vol. 11, no. 249, pages 1 - 15 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116463356A (zh) * 2023-04-27 2023-07-21 广州大学 大豆GmSPA3a变体及其在育种中的应用
CN116463356B (zh) * 2023-04-27 2024-03-19 广州大学 大豆GmSPA3a变体及其在育种中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114805517B (zh) 2023-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107164347B (zh) 控制水稻茎秆粗度、分蘖数、穗粒数、千粒重和产量的理想株型基因npt1及其应用
CN109575114B (zh) 一种水稻粒形粒重相关基因、蛋白、分子标记及应用
CN112011567B (zh) 水稻pal1基因及其编码蛋白与应用
CN111778265A (zh) 玉米赤霉素氧化酶的突变基因、突变体、表达载体和应用
CN108642065A (zh) 一种水稻胚乳粉质相关基因OsSecY2及其编码蛋白质和应用
CN114805517B (zh) 大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用
CN108047319B (zh) 水稻种子休眠性调控基因OsMPK14及其应用
CN113862265A (zh) 一种改良水稻粒型和外观品质的方法
CN109485710B (zh) 水稻种子休眠性调控基因OsAnn3及其编码的蛋白和应用
CN110777150B (zh) 蛋白GmPLATZ在调控植物种子产量中的应用
CN115125219B (zh) OsJMJ718基因及其编码蛋白在调控水稻粒型中的应用
CN114990139B (zh) CsHLS1基因或其编码的蛋白在调控黄瓜植株器官大小中的应用
CN110407922B (zh) 水稻耐冷基因qSCT11及其应用
CN113817033B (zh) ZmELF3.1蛋白及其功能缺失突变体在调控作物气生根数目或层数的应用
CN111304219B (zh) 一种分离自水稻wz1中的gl1基因及其在增加水稻粒长中的应用
CN110904146B (zh) 拟南芥gif1基因在调控种子大小中的应用
CN111440231B (zh) 蛋白质GmFULa在调控大豆株型和产量中的应用
CN114921583A (zh) 一种控制小麦株高的QTL及其候选基因TaDHL-7B和应用
CN109371041B (zh) 一种增加穗粒数的水稻基因OsHGN及其应用
CN113929756A (zh) Gl11蛋白和编码gl11蛋白的基因在调控水稻粒形和千粒重中的应用
CN106349353B (zh) 一种调控植物淀粉合成相关蛋白OsFSE及其编码基因与应用
CN111575252A (zh) 水稻育性相关基因OsLysRS的鉴定及其应用
CN111499713B (zh) 水稻粒型基因qGL6-2及其应用
CN113999295B (zh) 水稻OsFD2基因在调控种子大小中的应用
CN114164291B (zh) 水稻粒长基因gl10等位基因的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant