CN114990139B

CN114990139B - CsHLS1基因或其编码的蛋白在调控黄瓜植株器官大小中的应用

Info

Publication number: CN114990139B
Application number: CN202210454251.1A
Authority: CN
Inventors: 武涛; 李洁; 曹嘉健; 王春华; 杜亚琳; 刘明月; 姚宏鑫
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2022-04-24
Filing date: 2022-04-24
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-04-24
Also published as: CN114990139A

Abstract

本发明公开了CsHLS1基因或其编码的蛋白在调控黄瓜植株器官大小中的应用，涉及农业生物技术领域。本发明通过筛选发现了黄瓜CsHLS1基因与黄瓜叶片大小相关，黄瓜小叶突变体‘ll‑1’的株高、叶片面积、果实长度、以及开花当天雄花和子房较野生型‘649’显著减小，该基因能够应用于筛选叶片大小合适的黄瓜品种，用于对黄瓜株型进行改良。

Description

CsHLS1基因或其编码的蛋白在调控黄瓜植株器官大小中的应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，特别是涉及CsHLS1基因或其编码的蛋白在调控黄瓜植株器官大小中的应用。

背景技术

植物叶片不仅是植物进行光合作用为植物生长发育提供能量的器官，还是植物将土壤水分和大气水分进行交换的场所，在植物萌发到衰老死亡的过程中有着无法替代的作用。叶片面积大小决定干物质积累效率，影响作物最终产量。叶面积大小还决定作物定植密度，通过调控叶面积大小可实现作物高密度定植，增加单位面积光能捕获效率，最终实现作物生产的高产高效。植物在群体生长中，理想株型有利于植株均匀接受光照，很好地提高植株光合作用，增加作物产量，株型育种是作物育种的重要方向，而叶型是植物株型构成的重要因素，对其调控基因进行研究，对于植物理想株型的构建和株型改良具有重要意义。

以模式植物拟南芥为例研究叶片发育的调控机理，通过突变体库筛选到的叶形突变体无疑是理想的材料。在其它物种上，定位到了与叶片相关的一些基因。例如白菜中的叶缘裂刻控制基因BrcCUC3，调控棉花秋葵叶形状的主要基因L，调控绿豆中叶片边缘浅裂叶形的基因lma，西瓜中叶缘裂刻调控基因ClLL1，甘蓝型油菜花叶基因BnLL1，大豆窄小叶形控制的基因Ln等。黄瓜中定位到的与叶片发育相关的基因较少，仅有黄叶基因CsChlI、圆叶基因CsPID、心形和小叶基因scl1、卷叶基因CsPHB和小叶基因LL。

调控叶片大小最主要的调节因子包括植物激素、TCP基因、GRF基因、miR396等。生长素、赤霉素、脱落酸和细胞分裂素均可以影响叶片大小的发育。HLS1基因，全称HOOKLESS1基因，参与了乙烯、赤霉素、茉莉酸、水杨酸等多种植物激素对拟南芥顶端弯钩的调控。通过与拟南芥、酵母(Saccharomyces cerevisiae)、绵羊(Ovis aries)、人(Homo sapiens)等物种进行序列比对，发现黄瓜CsHLS1蛋白的N端具有类似N-乙酰基转移酶的序列。N-乙酰转移酶是一类能催化乙酰基团在乙酰辅酶A和胺之间转移的酶，为氨基乙酰化蛋白质，该家族成员的作用是乙酰化相对较小的分子，如氨基糖苷类和多胺类。一些与IAA(吲哚乙酸)具有相似结构的分子，如血清素和色胺，也被该家族成员乙酰化。

拟南芥中HLS1基因的功能仅仅在顶端弯钩发育和抗病原菌方面有所报道。黄瓜中HLS1基因与拟南芥同源性达56.79％，对其功能的研究尚未报道。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了CsHLS1基因或其编码的蛋白在调控黄瓜植株器官大小中的应用，CsHLS1基因在调控叶片大小，改善黄瓜株型中的应用。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了CsHLS1基因或其编码的蛋白在调控黄瓜植株器官大小中的应用。

所述CsHLS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CsHLS1基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述黄瓜植株器官为茎、叶、花和果实中的至少一种。

CsHLS1基因沉默或敲除的突变体黄瓜的株高、叶片面积、果实长度、开花当天的雄花和子房长度均显著小于野生型黄瓜。

本发明提供了一种调控黄瓜植株器官大小的方法，当需要获得器官变小的黄瓜植株时，将黄瓜中的CsHLS1基因沉默或敲除；当需要获得器官变大的黄瓜植株时，将黄瓜中的CsHLS1基因过表达。

所述CsHLS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种调控黄瓜植株器官大小的方法，将黄瓜中的CsHLS1基因沉默或敲除时，包括以下步骤：

(1)构建基因沉默或敲除载体，所述基因沉默或敲除载体为带有用于对碱基序列如SEQ ID NO.1所示的CsHLS1基因进行沉默或敲除的序列的植物表达载体；

(2)将步骤(1)基因沉默或敲除载体导入黄瓜的细胞中将碱基序列如SEQ ID NO.1所示的CsHLS1基因沉默或敲除，培养后得到转基因黄瓜植株。

优选的，所述植物表达载体为pCBSG015(Basta)。

基因敲除针对的靶点为双靶点，序列为：

(1)TGCCGAAGTGGATAACCAGTTGG；

(2)CCGTCGTTTCGCCGTCGAGGGAT。

本发明通过筛选发现了黄瓜CsHLS1基因与黄瓜叶片大小相关，黄瓜小叶突变体‘ll-1’的株高、叶片面积、果实长度、以及开花当天雄花和子房较野生型‘649’显著减小，该基因能够应用于筛选叶片大小合适的黄瓜品种，用于对黄瓜株型进行改良。

附图说明

图1为黄瓜野生型植株‘649’以及小叶突变体‘ll-1’黄瓜器官状况图；其中，a为植株高度对比图，b为叶片对比图，c为雄花对比图，d为子房对比图，e为黄瓜果实对比图，f为平均叶片面积对比图，g为平均黄瓜果实长度对比图；“**”表示P＜0.01。

图2为CsHLS1基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。

图3为基因敲除CsHLS1基因靶点的示意图。

图4为CsHLS1基因中的Target 1和Target 2测序检测示意图。

图5为黄瓜‘凯特’以及敲除基因CsHLS1不同靶点的黄瓜Cshls1#1和Cshls1#2的植株高度、叶片、子房长度对比图。

图6为黄瓜‘凯特’以及敲除基因CsHLS1不同靶点的黄瓜Cshls1#1和Cshls1#2的叶面积大小测量结果图；其中，“**”表示P＜0.01。

图7为载体pCBSG015(Basta)的图谱。

具体实施方式

实施例1：与黄瓜叶片大小性状相关的SNP位点的发现

利用2％的EMS诱变剂(v/v，甲基磺酸乙酯)对黄瓜高代自交系植株‘649’进行诱变，并从诱变体库中筛选获得一株稳定遗传的黄瓜叶面积减小突变体‘ll-1’，突变体‘ll-1’与野生型‘649’植株及器官大小如图1所示，突变体‘ll-1’黄瓜的株高、叶片面积、果实长度、开花当天的雄花和子房长度均显著小于野生型。

将稳定遗传的黄瓜小叶突变体‘ll-1’与高代自交系野生型‘649’杂交，获得F₁，F₁代黄瓜单株自交留种，获得F₂。正反交F₁代10株，F₂代分离群体166株。F₁单株表型均为野生型表型，F₂分离群体中叶片正常表型120株，叶片变小植株46株。经卡方检验，黄瓜正常叶与小叶植株的分离比例符合3：1(χ²＝0.651，P＞0.05)，表明黄瓜小叶性状是单基因隐性遗传。

根据小叶突变体的遗传特性采用MutMap的方法进行全基因组重测序筛选候选基因，选取1株野生型亲本‘649’单株和F₂分离群体中24株极端小叶表型单株的幼嫩叶片，按单株提取DNA，等量混合，构建野生型和突变体混池，进行全基因组重测序和分析。

野生型和黄瓜小叶突变体‘ll-1’全基因组测序结果数据统计如表1所示。

表1比对数据统计

植株类型	野生型‘649’	小叶突变体‘ll-1’
			参考基因组大小(bp)	197,271,687	193,680,466
比对到参考基因组上的Reads数	61,864,739	77,794,494
			比对到参考基因组上的Reads百分比(％)	90.41	81.08
覆盖度(％)	97.11	97.19

通过筛选，得到1号染色体上2个SNP变异位点，均发生碱基C到T的突变。2个SNP突变位点均发生在外显子区，且氨基酸发生变化。

取F₂代分离群体中小叶突变体表型单株DNA和野生型表型的单株DNA利用竞争性等位基因特异性PCR(CompetitiveAllele Specific PCR，KASP)方法对筛选得到的2个SNP突变位点进行基因分型检测。

检测结果显示，SNP1和SNP2在F₂代小叶突变体表型植株中的基因型均显示T：T型，在野生型表型植株中的基因型均显示为C：C或C：T型，说明SNP1和SNP2基因型与F₂分离群体中单株表型均共分离。在爱若莎拟南芥种质分享中心(https：//www.arashare.cn/index/)购得SNP1(SALK_139444C)和SNP2(SALK_136528C)拟南芥同源基因T-DNA插入突变体，分别测定叶面积，结果显示SNP2的叶面积相比野生型更小。推测SNP2基因(CsaV3_1G036420)可能是调控黄瓜叶片大小的候选基因。

实施例2：CsHLS1基因的克隆

基于实施例1中基因分型结果和拟南芥同源基因T-DNA插入突变体，推测CsaV3_1G036420(基因CsHLS1)是影响黄瓜叶面积大小的调控基因。为明确该基因生物学功能，利用基因序列信息设计特异性引物，进行扩增，克隆基因CsHLS1全长序列。引物序列如下：

CsHLS1-F：5’-ATGGGTGACCCCATTTG-3’；

CsHLS1-R：5’-TCATACCTCTCTTGGGTC-3’。

用TRIZOL法提取黄瓜叶片的总RNA，将RNA反转录为cDNA(诺维赞(南京)HiSeriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit)，实验步骤参考说明书。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃复性30s，72℃延伸2min，34个循环；72℃10min。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图2)后，进行回收、纯化，具体方法参考天根DNA凝胶回收试剂盒，送至擎科生物工程(长沙)股份有限公司测序，经序列比对分析发现，其氨基酸序列与黄瓜数据库中无差别，基因CsHLS1的CDS全长1062bp，基因序列如SEQ ID No.1所示；推测其编码353个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

实施例3：CsHLS1基因CRISPR载体转化黄瓜

委托未米生物科技(江苏)有限公司设计CsHLS1基因敲除双靶点，

其一：TGCCGAAGTGGATAACCAGTTGG；

其二：CCGTCGTTTCGCCGTCGAGGGAT；

并转入载体pCBSG015(Basta)中(图谱见图7)，以构建CsHLS1-CRISPR载体。选择构建成功的载体，并对黄瓜‘凯特’品种(寿光市凯特种业有限公司)进行遗传转化，转化成功的植株在CsHLS1基因靶点发生突变(图3和图4)。待上述基因编辑黄瓜植株及野生型对照植株长至21叶时，观察编辑植株与对照植株表型，并以基因编辑植株与野生型植株为材料，利用叶面积扫描仪分别对9-15节位叶片进行叶面积测量。结果CsHLS1基因敲除后的黄瓜(hls1-crispr)叶片面积(1eaf area)显著小于野生型(WT)(图5、图6)。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> CsHLS1基因或其编码的蛋白在调控黄瓜植株器官大小中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1062

<212> DNA

<213> 黄瓜(Cucumis sativus L.)

<400> 1

atgggtgacc ccatttgtag gatcagaaac agtcccttgt acaagatgct ggttgccgaa 60

gtggataacc agttggttgg tgtgattcaa ggctctataa aggtggtaac tgttcatcag 120

gcgccgaaag accgtgctaa ggttgggtat gttttaggcc ttcgtgttgc gccgtcgttt 180

cgccgtcgag ggattggttg tagccttgtg cgacgccttg aggagtggtt tatgattaat 240

gatgtagatt atgcttatat ggcgacggag aaagacaatg aagcctctgt gaagttgttc 300

attaacaagc ttggatacac taactttaga gttccagcaa ttttggtgaa cccggtgaaa 360

cattaccgat catatcaact cccttctaac atccagattg ctcgcctaaa agtagacgtt 420

gcggagtttc tctaccgaaa attcatggcc tctactgagt ttttccccca tgacattgat 480

catgtgctca aacacaagct aagccttggc acatgggttg cttactacaa agatgacgat 540

gtctcctcca ccaaatttga aacgaacggt agcaagtcgg agataacaat accgaagagc 600

tgggcaatgc tgagtgtatg gaacagtgga gaggtgttca agctacgatt ggggaaggca 660

ccattgtcat gtttgatata tacagagagc tccaaggtga tagacaagat cttcccatgt 720

ctaaagttgc catcaatacc cgatttctat gagccatttg gattctattt catgtatggg 780

gttcatcggg aggggacggg gacagggaag ctggtgagag cgttgtgcca atacgtacac 840

aacatggcgg ctgcagcaag ggactgtaaa gtaatagtaa cagagattgg aggagaagac 900

tctctaagag aagagattcc acattggaaa ttgctgtcat gccctgaaga cttgtggtgc 960

ataaaggcat tgaagaaaga agcaagaaat agcctacatg agttgacaaa aaccccacca 1020

actacaagac cagccctttt tgtagaccca agagaggtat ga 1062

<210> 2

<211> 353

<212> PRT

<213> 黄瓜(Cucumis sativus L.)

<400> 2

Met Gly Asp Pro Ile Cys Arg Ile Arg Asn Ser Pro Leu Tyr Lys Met

1 5 10 15

Leu Val Ala Glu Val Asp Asn Gln Leu Val Gly Val Ile Gln Gly Ser

20 25 30

Ile Lys Val Val Thr Val His Gln Ala Pro Lys Asp Arg Ala Lys Val

35 40 45

Gly Tyr Val Leu Gly Leu Arg Val Ala Pro Ser Phe Arg Arg Arg Gly

50 55 60

Ile Gly Cys Ser Leu Val Arg Arg Leu Glu Glu Trp Phe Met Ile Asn

65 70 75 80

Asp Val Asp Tyr Ala Tyr Met Ala Thr Glu Lys Asp Asn Glu Ala Ser

85 90 95

Val Lys Leu Phe Ile Asn Lys Leu Gly Tyr Thr Asn Phe Arg Val Pro

100 105 110

Ala Ile Leu Val Asn Pro Val Lys His Tyr Arg Ser Tyr Gln Leu Pro

115 120 125

Ser Asn Ile Gln Ile Ala Arg Leu Lys Val Asp Val Ala Glu Phe Leu

130 135 140

Tyr Arg Lys Phe Met Ala Ser Thr Glu Phe Phe Pro His Asp Ile Asp

145 150 155 160

His Val Leu Lys His Lys Leu Ser Leu Gly Thr Trp Val Ala Tyr Tyr

165 170 175

Lys Asp Asp Asp Val Ser Ser Thr Lys Phe Glu Thr Asn Gly Ser Lys

180 185 190

Ser Glu Ile Thr Ile Pro Lys Ser Trp Ala Met Leu Ser Val Trp Asn

195 200 205

Ser Gly Glu Val Phe Lys Leu Arg Leu Gly Lys Ala Pro Leu Ser Cys

210 215 220

Leu Ile Tyr Thr Glu Ser Ser Lys Val Ile Asp Lys Ile Phe Pro Cys

225 230 235 240

Leu Lys Leu Pro Ser Ile Pro Asp Phe Tyr Glu Pro Phe Gly Phe Tyr

245 250 255

Phe Met Tyr Gly Val His Arg Glu Gly Thr Gly Thr Gly Lys Leu Val

260 265 270

Arg Ala Leu Cys Gln Tyr Val His Asn Met Ala Ala Ala Ala Arg Asp

275 280 285

Cys Lys Val Ile Val Thr Glu Ile Gly Gly Glu Asp Ser Leu Arg Glu

290 295 300

Glu Ile Pro His Trp Lys Leu Leu Ser Cys Pro Glu Asp Leu Trp Cys

305 310 315 320

Ile Lys Ala Leu Lys Lys Glu Ala Arg Asn Ser Leu His Glu Leu Thr

325 330 335

Lys Thr Pro Pro Thr Thr Arg Pro Ala Leu Phe Val Asp Pro Arg Glu

340 345 350

Val

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgccgaagtg gataaccagt tgg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgtcgtttc gccgtcgagg gat 23

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgggtgacc ccatttg 17

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcatacctct cttgggtc 18

Claims

1.沉默或敲除CsHLS1基因在缩小黄瓜植株叶片中的应用，

2.一种缩小黄瓜植株叶片的方法，其特征在于，将黄瓜中的CsHLS1基因沉默或敲除，所述CsHLS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，将黄瓜中的CsHLS1基因沉默或敲除时，包括以下步骤：

(1)构建基因沉默或敲除载体，所述基因沉默或敲除载体为带有用于对碱基序列如SEQID NO.1所示的CsHLS1基因进行沉默或敲除的序列的植物表达载体；

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述植物表达载体为pCBSG015(Basta)。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在进行基因敲除时，同时敲除两个靶点，序列为：

(1)TGCCGAAGTGGATAACCAGTTGG；

(2)CCGTCGTTTCGCCGTCGAGGGAT。