CN110819638B

CN110819638B - 水稻fl1基因及其分子标记和应用

Info

Publication number: CN110819638B
Application number: CN201911311474.7A
Authority: CN
Inventors: 余四斌; 袁志阳; 凡凯; 郑晓海; 王鹏
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2039-12-18
Also published as: CN110819638A

Abstract

本发明涉及水稻FL1基因及其分子标记和应用，所述水稻FL1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述分子标记为所述水稻FL1基因的启动子‑200位碱基处的SNP位点，多态性为C或T。本发明提供的水稻FL1基因与植株的株型和产量相关，在超量表达该基因后，植株株型和产量显著下降。本发明提供的分子标记为一种SNP位点，和水稻FL1基因紧密连锁，可以通过对该SNP位点的多态性进行检测判断水稻FL1基因的基因型，以及判断水稻材料剑叶长宽等株型指标。

Description

水稻FL1基因及其分子标记和应用

技术领域

本发明涉及作物分子生物学领域，尤其涉及水稻FL1基因及其分子标记和应用。

背景技术

水稻是一种主要粮食作物，为不断提高水稻产量，株型改良已成为突破产量瓶颈的重要策略。株型改良是提高水稻产量的重要途径，适当的叶形和株高对于提升冠层的光合利用率，协调“源”与“库”关系，增加作物产量具有重要的作用。理想株型的核心思想是要尽可能的提高叶面积指数，从而提高群体的光合效率和物质生产能力。叶片的大小、空间形态、厚度、叶绿素含量和卷曲性等性状被认为是影响光合作用能力的重要指标。一般认为，直立叶片两面受光，对阳光的反射率较小，光合效率高于平展或弯垂叶。叶片向内卷曲有利于叶片直立，可以减少叶片之间的相互遮阴，改善透风透光，增加光合面积。水稻籽粒灌浆的70％-80％物质来自抽穗后的光合作用，而光合作用主要依靠顶三叶，因此对于剑叶的研究是理想株型研究的重点。另外，单穗颖花数是产量的主要构成因子，直接决定单株产量。由于穗形直接关系到产量的高低，穗形性状也受到研究者更多地关注。Gn1a/OsCKX2编码细胞分裂素氧化酶，在叶片、茎、花序分生组织和花中强烈表达。细胞分裂素在花序分生组织中积累可以增加颖花数目，因此，在Gn1a/OsCKX2表达量较低的水稻品种中每穗颖花数较高。IPA1是一个水稻株型和产量基因，超量表达IPA1减少分蘖数，提高产量相关性状。植株株型与产量是受多基因控制的复杂数量性状。

目前，研究者已经利用遗传群体克隆了多个水稻株型与产量相关基因。然而，水稻育种过程仍需要挖掘更多株型与产量相关基因，特别是解析这些基因的等位基因功能变异，应用于水稻株型改良与高产育种。

发明内容

本发明的目的是提供水稻FL1基因及其分子标记和应用，该基因和植物株型和产量相关。

本发明利用ZS97与9311构建的重组自交系群体剑叶长宽在第一染色体检测到1个控制水稻株型的基因FL1，通过遗传转化证实了该基因负调控水稻剑叶大小与每穗颖花数。本发明通过等位基因功能与单倍型功能分析，证实了该基因启动子-200位点SNP变异导致基因功能变异，进而本发明也开发了一个分子标记用于检测该位点基因型。

第一方面，本发明提供水稻FL1基因，所述水稻FL1基因的核苷酸序列为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸编码相同功能蛋白的核苷酸序列。

本发明进一步提供编码上述水稻FL1基因的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为：

1)如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或

2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的氨基酸序列；

本发明进一步提供包含上述水稻FL1基因的生物材料，所述生物材料为载体、转基因细胞系、工程菌、宿主细胞或表达盒中的一种或多种。

本发明进一步提供上述水稻FL1基因或其编码蛋白或上述生物材料在改良植物株型中的应用。

本发明进一步提供上述水稻FL1基因或其编码蛋白或上述生物材料在提高植物产量中的应用。

本发明进一步提供上述水稻FL1基因或其编码蛋白或上述生物材料在加快植物育种进度中的应用。

本发明进一步提供上述水稻FL1基因或其编码蛋白或上述生物材料在培育高产转基因植物中的应用。

进一步地，通过抑制植物DNA中水稻FL1基因的表达培育高产转基因植物，提高植物产量。

本发明证实了基因FL1是水稻株型与产量的负调控基因以及促进开花基因，基于本发明的发现，本领域技术人员能够理解筛选FL1弱等位基因(低表达量等位基因)能够实现改良植株株型，提高植物产量的目的。因此，本领域技术人员能够理解上述的应用均为FL1基因的负向调控应用。

上述应用中，所述的植物为水稻、大豆、小麦、大麦、高粱、小米、芝麻、油菜、玉米或花生。优选为水稻。

第二方面，本发明提供一种分子标记，所述分子标记和上述水稻FL1基因连锁，具体为所述水稻FL1基因的启动子-200位碱基处的SNP位点，多态性为C或T。

多态性为C的水稻株型较好，产量也较高；多态性为T的水稻株型较差，产量也较低。

本发明进一步提供用于扩增上述分子标记的引物组合，所述引物组合含有3条引物，其核苷酸序列如下：

上游引物1：5’-CTGCAACGATGTATCATATTTTATCTC-3’；

上游引物2：5’-CTGCAACGATGTATCATATTTTATCTT-3’；

通用引物：5’-CACCGTCTCTACCATAAAAAACAAAC-3’。

本发明进一步提供上述分子标记和引物组合在筛选理想型的水稻材料和/或高产水稻选育中的应用。

如果以上述引物组合对待测水稻基因组扩增得到的PCR产物只检测到上游引物1对应的荧光信号，则待检测SNP位点为碱基C，判定测试样品含有FL1单倍型1，含该等位基因的水稻材料抽穗期较迟，株型较好，产量也较高；若只检测到上游引物2对应的荧光信号，则待检测SNP位点为碱基T，即测试样品不含FL1单倍型1，不含该等位基因的水稻材料抽穗期较早，株型较差，产量也较差；若同时检测到两种荧光信号则检测位点为C:T，则含有杂合的FL1基因。

通过本发明提供的分子标记和引物组合可以简便快速地区分该SNP位点基因型，也能够较好地判断水稻材料剑叶长宽等株型指标。

本发明进一步提供一种检测水稻FL1基因的方法，包括：

检测待测水稻基因组DNA中上述分子标记的类型，若所述分子标记的多态性为C，则所述待测水稻含有FL1单倍型1等位基因，若所述分子标记的多态性为T，则所述待测水稻不含有FL1单倍型1等位基因；

优选使用上述引物组合扩增待测水稻基因组DNA，对所述待测水稻基因组DNA中上述分子标记的类型进行检测。

本发明提供一种水稻FL1基因及其分子标记和应用，具有如下有益效果：

本发明发现了水稻株型与产量基因FL1，并通过遗传转化对该基因功能进行验证，具体利用超量表达技术增强FL1基因功能以及遗传互补FL1弱等位基因，证实了该基因可以显著地促进开花，减小叶片大小，降低水稻产量。本发明还提供了与FL1基因紧密连锁的分子标记，利用该分子标记可以检测FL1等位基因与并进行基因选择，实现其在培育理想株型与高产水稻以及加快水稻育种进程中的应用。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的FL1近等基因系NIL-qFL1⁹³¹¹的基因型与株型、产量表型示意图，其中a为株型，d为基因型，b、e为每穗颖花数和单株产量对比，c、f和g为剑叶长和宽对比；

图2为本发明实施例1提供的FL1近等基因系NIL-qFL1⁹³¹¹的RNA-Seq分析和Realtime-PCR检测结果，其中a为FL1同源基因进化树分析结果及其在ZS97与NIL-qFL1⁹³¹¹表达水平，b为FL1编码区氨基酸序列3种等位变异，c为FL1在NIL-qFL1⁹³¹¹和ZS97中的表达水平对比；

图3为本发明实施例1提供的FL1遗传互补阳性T2代家系剑叶长度和宽度、抽穗期、每穗颖花数、千粒重和单株产量的检测结果示意图；其中，a、b、c、d、e和f依次为三种FL1遗传互补阳性T2代家系(PC1、PC2和PC3)剑叶长度和宽度、抽穗期、每穗颖花数、千粒重和单株产量的检测结果；

图4为本发明实施例1提供的FL1^ZS97，FL1⁹³¹¹与FL1^NIP的超量表达T2阳性家系剑叶长度、剑叶宽度和每穗颖花数的检测结果示意图；其中a、b和c为FL1超量表达的FL1^ZS97的T2阳性家系(FL1^ZS97-OX1-3)剑叶长度和宽度以及每穗颖花数的检测结果，d、e和f为FL1超量表达的FL1⁹³¹¹的T2阳性家系(FL1⁹³¹¹-OX1-3)剑叶长度和宽度以及每穗颖花数的检测结果，a、h和i为FL1超量表达的FL1^NIP的T2阳性家系(FL1^NIP-OX1-3)剑叶长度和宽度以及每穗颖花数的检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1水稻株型与产量基因FL1的获得与表型分析

1、水稻株型与产量位点挖掘

本实施例利用ZS97与9311构建的重组自交系群体在第一染色体检测到1个控制水稻株型位点，命名为qFL1。通过分子标记辅助选择，得到一个qFL1被替换为9311，基因组其他位置均为ZS97基因型的近等基因系NIL-qFL1⁹³¹¹。

本实施例对近等基因系NIL-qFL1³¹¹的株型、基因型进行检测，同时对比近等基因系NIL-qFL1⁹³¹¹和ZS97的每穗颖花数与单株产量以及剑叶长、宽，得到如图1所示结果，其株型如图1的a图，基因型如图1的d图，在武汉正常季节生长。NIL-qFL1⁹³¹¹剑叶长、宽均显著地高于ZS97(图1的c图，f图，g图)，即qFL1的9311等位基因增大水稻植株功能叶面积。另外，NIL-qFL1⁹³¹¹每穗颖花数与单株产量也显著高于ZS97(图1的b图与e图)，即qFL1的9311等位基因可以显著增加水稻产量。

2、qFL1候选基因分析与验证

本实施例利用NIL-qFL1⁹³¹¹与ZS97抽穗期剑叶进行RNA-Seq分析和Realtime-PCR，得到如图2所示结果：两个株系共得到317个差异基因(图2的a图)，其中只有LOC_Os01g11940位于第一染色体导入片段上。LOC_Os01g11940编码FT-like蛋白，命名为FL1。通过序列比对，本实施例发现候选基因区域内NIP与9311在启动子区域存在多个SNP，而在基因编码区仅含有2个非同义突变(图2的b图)。本实施例Realtime-PCR对NIL-qFL1⁹³¹¹与ZS97剑叶FL1表达量进行检测的结果显示，FL1在ZS97中表达量显著地高于NIL-qFL1⁹³¹¹(图2的c图)，该结果与RNA-Seq检测结果一致。

本实施例进一步对FL1进行基因家族分析发现，FL1在水稻基因组存在12个同源基因，并且该基因与Hd3a，RFT1亲缘关系最近。由此，推测FL1会促进水稻开花，减小水稻剑叶，降低水稻产量。

为了验证FL1的基因功能，本实施例从ZS97基因组克隆了FL1启动子(3000bp)与FL1基因编码区，构建到pCambia1301载体，通过农杆菌介导遗传转化NIL-qFL1⁹³¹¹。选取FL1遗传互补阳性T2代家系种子正常季节播种，对水稻植株(剑叶长度和宽度)与产量表型(抽穗期、每穗颖花数、千粒重和单株产量)进行检测，得到如图3所示结果，所有条形图横坐标中WT为野生型对照、PC1、PC2和PC3均为T2阳性家系。结果显示3个独立的T2阳性家系剑叶长和宽显著地减小(图3的a与b)，抽穗期显著缩短(图3的c)，每穗颖花数，千粒重与单株产量也显著地降低(图3的d，e与f)。

近等基因系与遗传互补试验显示：FL1等位基因表达量越高，其剑叶越小，每穗颖花数与产量也越低，因此推测该基因负向调控水稻株型与产量。

3、FL1功能分析

为了验证FL1的基因功能，本发明将FL1基因编码区的3种等位基因FL1^ZS97，FL1⁹³¹¹与FL1^NIP分别构建到pCambia1301载体，由35S启动子驱动超量表达。将上述超量表达载体转化ZS97，分别选取3个表达量显著提高的阳性T2代家系种子在正常季节播种后对株型与产量性状(剑叶长度、剑叶宽度和每穗颖花数)进行检测，得到如图4所示结果，结果显示FL1^ZS97，FL1⁹³¹¹与FL1^NIP的T2阳性家系(FL1^ZS97-OX1-3、FL1⁹³¹¹-OX1-3和FL1^NIP-OX1-3)剑叶长和宽显著地减小(图4的a，b，d，e，g与h)，每穗颖花数与单株产量也显著地降低(图4的c，f与i)。

抽穗期是限制植物育种进程的重要因素，因此缩短水稻抽穗期是加速育种进程的重要方法。本发明中FL1^ZS97与FL1⁹³¹¹超量表达转基因材料不仅改变水稻株型与产量，同时促进水稻开花(表1)。在育种过程中，可以在优良育种基础材料中超量表达FL1，以促进水稻开花，待完成育种选择后，通过回交剔除FL1超量标签，可以加快育种进程。

表1 FL1超量表达转基因材料促进水稻开花

实施例2 FL1分子标记的获得

实施例1通过超量表达FL1编码区3种等位基因，证实了该基因编码区的变异并不影响该基因缩小剑叶，降低产量和促进开花的功能，因此可以得出结论是FL1启动子变异导致等位基因功能变异。本实施例利用FL1启动子区域内SNP对FL1进行单倍型分析，将水稻核心种质分为4种单倍型，单倍型1剑叶长与宽显著地大于其他3种单倍型(表2)。SNP-200可以将FL1等位基因分为两种类型，即单倍型1与其他单倍型，该SNP变异发生在SEQ ID NO.3中第100位。

表2 FL1单倍型分析结果

表格中a，b相同字母表示水稻剑叶长度与宽度经过多重比较(LSD Duncan)不存在显著性差异。

本发明将SNP-200这个单碱基变异开发成KASP(Kompetitive Allele SpecificPCR)标记用于基因选择。所开发的标记K_FL1-200的序列如下：

上游引物1：CTGCAACGATGTATCATATTTTATCTC(SEQ ID NO.4)

上游引物2：CTGCAACGATGTATCATATTTTATCTT(SEQ ID NO.5)

通用引物：CACCGTCTCTACCATAAAAAACAAAC(SEQ ID NO.6)。

两条特异性引物5’分别连接LGC公司的FAM或HEX接头序列。KASP反应体系参照KASP Master Mix试剂说明书，结果检测利用其配套的LGC SNP line基因分型平台。

如果样品PCR产物只检测到上游引物1对应的荧光信号，则检测位点为碱基C，判定测试样品含有FL1单倍型1，即该等位基因株型较好，产量也较高；若只检测到上游引物2对应的荧光信号，则检测位点为碱基T，即测试样品中FL1非单倍型1，即该等位基因株型较差，产量也较低；若同时检测到两种荧光信号则检测位点为C:T，则含有杂合的FL1基因。

利用标记K_FL1-200对20份水稻FL1基因启动子-200位的核苷酸进行检测，标记K_FL1-200的分析结果如表3所示，与该位点的测序结果完全一致，说明该标记能够准确检测水稻材料中FL1单倍型。另外，K_FL1-200分析显示：该位点为C的水稻材料剑叶长宽普遍强于位点为T的水稻材料，由此可以判断该标记不仅可以分析FL1等位基因的基因型，也可以预测植株剑叶大小。

表3标记K_FL1-200测试基因分型数据

由表3结果可知，该标记不仅能够准确区分位点基因型，也能够较好地判断水稻材料剑叶长宽等株型指标。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 水稻FL1基因及其分子标记和应用

<130> KHP191116661.2

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 831

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgacgggca gtagttgtcc ggccgattct tcccagctgc tgtaccctcg ccggggtgcc 60

cccaccacca ccaccacctc ccgtcctcct ctccatccgc tcatcgctca tgcgccctac 120

gacgtcgtcc tccaccgatc cgtcgtcctc tccatcagct cagctcgtga tcaggctgag 180

ctcgcgagct tctggtgcta tataaggctg ggtggtggtg caagtgcgaa gcgagcggcc 240

ggtgaggacg atcgatcgag atcgagcttg acggcggcga gaggaggagg aggggagacg 300

atgagcgggc gggggagggg ggacccgctg gtgctgggga gggtggtggg ggacgtggtg 360

gacccgttcg tgaggagggt ggcgctgcgg gtggcgtacg gcgcgcggga ggtggccaac 420

ggctgcgagc tccgcccctc cgccgtcgcc gaccagcccc gcgtcgccgt cggcggcccc 480

gacatgcgca ccttctacac cctggtgatg gtggatccgg acgcgccgag cccgagcgat 540

ccaaacctca gggagtacct gcactggctg gtcaccgaca tcccggctac cacaggagtc 600

tcttttggga cagaggtggt gtgctacgag agcccgcggc cggtgctggg gatccacagg 660

ctggtgttcc tgctgttcga gcagctgggg cggcacacgg tgtacgcacc ggggtggcgc 720

cagaacttca gcacccgcga cttcgccgag ctctacaacc tcggcctccc tgtcgccgcc 780

gtctacttca actgccagag ggagtctgga accggaggaa gaagaatgtg a 831

<210> 2

<211> 276

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Thr Gly Ser Ser Cys Pro Ala Asp Ser Ser Gln Leu Leu Tyr Pro

1 5 10 15

Arg Arg Gly Ala Pro Thr Thr Thr Thr Thr Ser Arg Pro Pro Leu His

20 25 30

Pro Leu Ile Ala His Ala Pro Tyr Asp Val Val Leu His Arg Ser Val

35 40 45

Val Leu Ser Ile Ser Ser Ala Arg Asp Gln Ala Glu Leu Ala Ser Phe

50 55 60

Trp Cys Tyr Ile Arg Leu Gly Gly Gly Ala Ser Ala Lys Arg Ala Ala

65 70 75 80

Gly Glu Asp Asp Arg Ser Arg Ser Ser Leu Thr Ala Ala Arg Gly Gly

85 90 95

Gly Gly Glu Thr Met Ser Gly Arg Gly Arg Gly Asp Pro Leu Val Leu

100 105 110

Gly Arg Val Val Gly Asp Val Val Asp Pro Phe Val Arg Arg Val Ala

115 120 125

Leu Arg Val Ala Tyr Gly Ala Arg Glu Val Ala Asn Gly Cys Glu Leu

130 135 140

Arg Pro Ser Ala Val Ala Asp Gln Pro Arg Val Ala Val Gly Gly Pro

145 150 155 160

Asp Met Arg Thr Phe Tyr Thr Leu Val Met Val Asp Pro Asp Ala Pro

165 170 175

Ser Pro Ser Asp Pro Asn Leu Arg Glu Tyr Leu His Trp Leu Val Thr

180 185 190

Asp Ile Pro Ala Thr Thr Gly Val Ser Phe Gly Thr Glu Val Val Cys

195 200 205

Tyr Glu Ser Pro Arg Pro Val Leu Gly Ile His Arg Leu Val Phe Leu

210 215 220

Leu Phe Glu Gln Leu Gly Arg His Thr Val Tyr Ala Pro Gly Trp Arg

225 230 235 240

Gln Asn Phe Ser Thr Arg Asp Phe Ala Glu Leu Tyr Asn Leu Gly Leu

245 250 255

Pro Val Ala Ala Val Tyr Phe Asn Cys Gln Arg Glu Ser Gly Thr Gly

260 265 270

Gly Arg Arg Met

275

<210> 3

<211> 299

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctctcttagt actccatcca ttttataaaa aacaaaccta aaatagaatg tgacgtattt 60

taacactata aacctgcaac gatgtatcat attttatctt aggtttgttt tttatggtag 120

agacggtgta tacggtacaa agcgagcagc caagctactg tagctaatgg tagggcgcgt 180

gcgacagggg agtaaagtga agcagcagca gagaagcaga gaccatttcc cctcctccct 240

cctctctcgc caaacacgac gacgtcgcct cggtttagtc gtcgtcggcc ggcagccgg 299

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgcaacgat gtatcatatt ttatctc 27

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgcaacgat gtatcatatt ttatctt 27

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caccgtctct accataaaaa acaaac 26

Claims

1.一种引物组合，其特征在于，所述引物组合用于扩增一种分子标记，

所述分子标记为水稻FL1基因的启动子-200位碱基处的SNP位点，多态性为C或T；

所述水稻FL1基因为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

所述引物组合含有3条引物，核苷酸序列如下：

上游引物1：5’-CTGCAACGATGTATCATATTTTATCTC-3’；

上游引物2：5’-CTGCAACGATGTATCATATTTTATCTT-3’；

通用引物：5’-CACCGTCTCTACCATAAAAAACAAAC-3’。

2.权利要求1所述引物组合在筛选剑叶面积更大的水稻和/或高产水稻选育中的应用。

3.一种检测水稻FL1基因的方法，其特征在于，包括：

检测待测水稻的基因组DNA中分子标记的类型，若所述分子标记的多态性为C，则所述待测水稻含有FL1单倍型1等位基因，若所述分子标记的多态性为T，则所述待测水稻不含有FL1单倍型1等位基因；

所述分子标记为水稻FL1基因的启动子-200位碱基处的SNP位点，多态性为C或T。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，使用权利要求1所述引物组合扩增所述待测水稻的基因组DNA，对所述待测水稻的基因组DNA中，所述分子标记的类型进行检测。