CN106995839A - 马铃薯x病毒在筛选植物开花基因及促开花ft蛋白突变体中的应用 - Google Patents

马铃薯x病毒在筛选植物开花基因及促开花ft蛋白突变体中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种马铃薯X病毒在筛选植物开花基因及促开花FT蛋白突变体中的应用，本发明方法与采用传统的转基因方法相比，不需要繁琐的转基因及筛选流程，将原本需要7‑9个月的研究植物开花基因的功能的流程缩短为大约2个月。因此，研究植物开花基因功能更为高效、快速，适合对各种单子叶和双子叶植物开花基因，以及FT基因各个氨基酸突变体的功能进行研究。

Description

马铃薯X病毒在筛选植物开花基因及促开花FT蛋白突变体中 的应用
(一)技术领域
本发明涉及利用一种病毒载体高效、快速地在大型烟草MM中促进植物开花来研究单子叶和双子叶植物开花基因功能的方法，特别涉及利用一种马铃薯X病毒在大型烟草MM中表达单子叶和双子叶植物FT蛋白促进植物开花、研究开花基因的功能，以及应用此方法高效、快速筛选FT蛋白功能突变体。
(二)背景技术
通过遗传工程和DNA重组技术改良植物病毒，构建的基于病毒的表达载体，是研究植物基因功能的有力工具。这种以植物病毒为基础的基因技术可以应用于促进或抑制基因的表达，导致相关基因功能获得或缺失(gain of function或loss of function)的表型。虽然这种以病毒为基础的技术最初主要用在植物中表达重组亚单位疫苗和药用蛋白等外源蛋白，但是近年来，以植物RNA和DNA病毒为基础的病毒技术，如病毒诱导的基因沉默(VIGS)、microRNA-介导的VIGS及病毒诱导的基因编辑，已广泛应用于双子叶和单子叶植物包括一些重要农作物的功能基因组研究。除此以外，病毒表达载体已成为研究植物细胞RNA的移动性、以及研究移动RNA信号在开花、马铃薯块茎形成和RNA沉默中的作用一个有价值的工具。基于病毒的基因技术也是研究内源或外源基因对植物生长发育、植物对生物胁迫和病毒DNA复制的有效手段。例如，通过马铃薯X病毒(PVX)表达番茄LeHB1，可以把花器官转换成果实样结构，揭示了LeHB1除了控制果实成熟外，在花器官发育中也起重要的作用。
利用病毒技术也可以研究开花过程中有关蛋白质和RNA的功能。开花素在植物开花诱导过程中起重要作用，开花素受环境因素，如日长等的调控。在拟南芥中，开花素是由FLOWERING LOCUS T编码的蛋白(FT)。许多FT的同源基因已在其他物种中鉴定，如水稻Hd3a、番茄SFT、烟草NtFT4和甜菜BvFT2。不同于转基因技术，以病毒为基础的技术也被用来证明FT蛋白具有开花素活性，并且更加快速。例如用小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)表达FT蛋白能诱导葫芦开花，PVX表达FT蛋白能促进短光照烟草植物Nicotinana tabacum MarylandMammoth(MM)在非诱导(即不开花)的长光照条件下开花。这些发现为我们进一步发展和应用病毒诱导开花提供了可能性。此后，一些RNA和DNA病毒，包括苹果球形潜病毒(Applelatent spherical virus，ALSV)，棉花皱叶病毒(Cotton leaf crumple virus，CLCrV)，柑橘叶斑病病毒(Citrusleaf blotch virus，CLBV)都已用于表达FT蛋白，并诱导大豆、苹果、梨、龙胆、桔梗植物、棉花提前开花。这些最新的研究进展显示了病毒诱导开花技术在农作物育种中的应用前景。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种马铃薯X病毒在筛选植物开花基因以及促开花FT蛋白突变体中的应用，能够高效、快速研究单子叶和双子叶植物开花基因功能以及筛选促开花FT蛋白突变体。本发明方法与采用传统的转基因方法相比，不需要繁琐的转基因及筛选流程，将原本需要7-9个月的研究植物开花基因的功能的流程缩短为2个月左右。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种马铃薯X病毒在筛选植物开花基因中的应用，利用马铃薯X病毒在大型烟草MM中表达FT蛋白促进植物开花来研究单子叶和双子叶植物开花基因功能；以及应用此方法高效、快速筛选FT蛋白功能突变体。
进一步，所述植物为双子叶或单子叶植物，优选为拟南芥、烟草、水稻或番茄，更优选短光照下不开花的大型烟草MM植物。
进一步，所述应用方法为：将待测基因克隆到马铃薯X病毒载体，经过线性化及体外转录获得含待测基因的马铃薯X病毒RNA并制成病毒溶液；选取2片植物叶片，撒上一层石英砂，滴加病毒溶液，磨擦叶片表面使病毒溶液渗透到叶片表皮中，喷水雾，在23℃、光照16h/d的温室环境下生长，筛选获得促使植物开花的基因。
进一步，所述待测基因为FT蛋白编码基因或其它控制开花的相关基因，优选FT蛋白来自拟南芥(AtFT)、番茄(SFT)、水稻(Hd3a)或烟草(NtFT4)。
进一步，所述FT蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQID NO.11所示。
本发明还提供一种马铃薯X病毒在筛选促开花FT蛋白突变体中的应用，所述的应用是将FT蛋白突变体克隆到马铃薯X病毒载体，然后感染植物叶片，筛选获得促开花FT蛋白突变体；所述FT蛋白突变体是将FT蛋白进行定点或随机突变获得的。优选所述FT蛋白突变体是将FT蛋白第27位苏氨酸(T，SEQ ID NO.2)、第85位酪氨酸(Y，SEQ ID NO.3)、第119位(SEQ ID NO.4)或第173位精氨酸(R，SEQ ID NO.5)分别突变为丙氨酸(A)。
更进一步，所述的应用为：将FT蛋白突变体克隆到马铃薯X病毒，经过线性化及体外转录获得含FT突变体蛋白编码基因的马铃薯X病毒RNA并制成病毒溶液；选取2片植物叶片，撒上一层石英砂，滴加病毒溶液，磨擦叶片表面使病毒溶液渗透到叶片表皮中，喷水雾，在23℃、光照16h/d的温室环境下生长，分析植物开花表型，筛选获得促开花FT蛋白突变体。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明方法与采用传统的转基因方法相比，不需要繁琐的转基因及筛选流程，将原本需要7-9个月的研究植物开花基因的功能的流程缩短为大约2个月。因此，研究植物开花基因功能更为高效、快速，适合对各种单子叶和双子叶植物开花基因，以及FT基因各个氨基酸突变体的功能进行研究。
(四)附图说明
图1，为本发明载体构建模式图。
图2，PVX-AtFT接种大型烟草MM在长光照条件下的开花表型。
图3，PVX-FTR173A，PVX-FTT27A，PVX-FTY85A和PVX-FTR119A接种大型烟草MM后5周在长光照条件下的开花表型(A)及野生型和突变体基因DNA序列的确证(B)。
图4，PVX-Hd3a接种大型烟草MM 5周在长光照条件下的开花表型(A)及野生型和突变体基因RT-PCR检测和DNA序列确证(B)。
图5，PVX-SFT接种大型烟草MM后5周在长光照条件下的开花表型(A)及野生型和突变体基因RT-PCR检测和DNA序列确证(B)。
图6，PVX-NtFT4接种大型烟草MM后5周在长光照条件下的开花表型(A)及野生型和突变体基因RT-PCR检测和DNA序列确证(B)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：利用PVX病毒载体高效、快速研究双子叶植物开花基因的功能
1、利用Trizol(购自Invitrogen公司)，根据制造商提供的方法，从拟南芥(Arabidopsis thaliana)的叶片中提取总RNA，此为模板，利用反转录酶合成第一链cDNA。
2、根据NCBI数据库上登录的拟南芥FT基因(NM_001334207.1，编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示)1-528位区域的序列设计引物，并委托上海英俊公司合成，引物序列信息见表1：
表1 引物序列
3、在PCR反应中，以第一链cDNA为模板，RC0061和RC0062为引物。取一个0.5ml的PCR薄壁管，逐一加入下列试剂：模板DNA 2μL，10mmol/L dNTP混合物0.5μL，20μmol/L上下游引物各0.5μL，5×反应缓冲液4μL，2.5U/μL PrimerSTAR HS DNA聚合酶0.1μL，加双蒸水至最终体积20μL；PCR扩增反应参数设置：94℃预变性5min后开始以下循环反应：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延40s，进行25次循环；循环结束后72℃继续延伸10min，再16℃将反应液温度下降；反应完毕后，将PCR产物进行电泳检查，并对正确的片段切胶保留。
4、利用PCR产物纯化回收试剂盒(购自QIAGEN)，根据制造商提供的方法，回收得到拟南芥AtFT的PCR产物。并使用BspE I与Sal I进行双酶切，然后连接到同样使用BspE I与Sal I双酶切的马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)载体中，随后通过转化，阳性克隆鉴定以及测序，得到PVX-AtFT载体，如图1所示。
5、制备线性化DNA
1)取一个1.5ml的离心管，逐一加入下列试剂：10×缓冲液10μL，1mg/ml的10×BSA10μL，10unit/μL Spe I 3μL，PVX-AtFT载体10.5μg，然后加双蒸水至最终体积100μL；
2)放置37℃培养箱孵育3h；
3)加入同等体积的苯酚/氯仿(phenol/chloroform，v/v25:24)，涡旋30s，最大转速(14000rpm)离心3min；
4)转移上清液至新的0.5ml离心管，加入同等体积的苯酚/氯仿(v/v 25:24)，涡旋30s，最大转速(14000rpm)离心3min；
5)转移上清液至新的0.5ml离心管，加入同等体积的氯仿，涡旋30s，最大转速(14000rpm)离心3min；
6)转移上清液至新的1.5ml离心管，加入3M NaAc(pH5.2)10μL，100％EtOH 250μL，混合均匀，放置-70℃冰箱至少1h；
7)最大转速(14000rpm)离心18min，小心去除上清；
8)加70％EtOH水溶液100μL清洗小块，最大转速(14000rpm)离心5min，小心去除上清，晾干；
9)用40μL的无菌双蒸水溶解小块，获得线性化PVX-FT片段。
6、体外转录
1)取一个1.5ml的离心管，逐一加入下列试剂：10×缓冲液5μL，40units/μLPNasin 1μL，10×NTP4(20mM each of ATP、CTP、UTP、2mM GTP)5μL，5Mm Cap(m7GpppG)5μL，线性化PVX-FT片段2.5μg，然后加RNase-free water至最终体积46μL；
2)放置37℃孵育5min；
3)加50units/μL T7 RNA pol，放置37℃孵育25min；
4)加20mM GTP 5μL，放置37℃孵育35min；
5)加EB(10Mm Tris，pH8.5)45μL，酚氯仿提纯(同DNA线性化时酚氯仿提纯的操作步骤)；
6)用30μL的无菌双蒸水溶解小块，获得PVX-AtFT病毒RNA。
7、本氏烟的病毒接种
1)本氏烟(Nicotiana benthamiana)在23℃、长日照(光照16h/d)的温室环境下生长，选取4-6叶期的健康本氏烟，对其2片舒展的嫩叶进行病毒接种：
2)在幼嫩叶片上均匀撒上薄薄的一层灭菌处理过的石英砂；
3)将步骤6获取的体外转录的PVX-AtFT病毒RNA，用枪头点到叶片上；
4)用戴橡胶手套的双手食指，一个食指托着接种叶，另一个食指在叶面上轻轻磨擦约5下，使病汁液渗透到烟草表皮中；
5)完成接种后，向整个植株喷水雾让其自我修复。
8、大型烟草(Nicotinana tabacum Maryland Mammoth)的病毒接种
1)大型烟草在23℃、长日照(光照16h/d)的温室环境下生长，同样选取4-6叶期的健康大型烟草，一般选择2片正在扩大生长的新生叶进行接种；
2)在选好的叶片上均匀撒上薄薄的一层石英砂；
3)取一片步骤7成功接种PVX-AtFT病毒RNA的本氏烟叶片，加入适量EB研磨，研磨均匀汁液。
4)用戴橡胶手套的双手食指接种步骤3)的汁液，一个托着接种叶，一个在叶面上轻轻磨擦约5下，使病汁液渗透到烟草表皮中；
5)最后向整个植株上喷水雾让其自我修复。
9、接种后的大型烟草在长光照条件下的开花表型观察
在接种7-14天，大型烟草接种叶及部分新生叶出现褪绿病斑。在接种20天时，所有接种PVX/FT病毒RNA的植株开始抽薹，28天时开始出现花苞，35天时有些开始开花。基本接种后每7天详细观测记录1次植株病毒侵染症状，观察植株生长状况等。同样条件下，以PVX/mAtFT(无义FT突变体，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；图1)接种为对照，开花表型参见图2。只有表达野生型AtFT，才可促进大型烟草(MM)在长日照下开花。
实施例2：利用PVX病毒载体高效、快速研究FT基因各个氨基酸突变体的功能
1、按照实施例1方法合成拟南芥第一链cDNA。
2、根据NCBI数据库上登录的拟南芥FT基因1-528位区域的序列设计引物，并委托上海英俊公司合成，引物序列信息见表2：
表2 引物序列
、按照实施例1步骤3方法构建PVX-FTR173A载体(FTR173A突变体氨基酸序列为SEQ IDNO.6所示)，所用引物为RC0061和RC0701；利用重叠PCR方法构建PVX-FTT27A(FTT27A氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示)，PVX-FTY85A(FTY85A氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示)和PVX-FTR119A(FTR119A氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示)载体，具体方法如下：
(1)第一轮PCR扩增反应时，取两个0.5ml的PCR薄壁管，逐一分别加入下列试剂：5×反应缓冲液4μL，10mmol/l dNTP混合物0.5μL，模板DNA 2μL，2.5U/μL PrimerSTAR HSDNA聚合酶0.1μL，然后在其中一个PCR薄壁管中加入20μmol/L的一对上下游引物RC0061/RC0694或RC0696或RC0700各0.5μL，在另一个PCR薄壁管中加入20μmol/L的其他一对上下游引物RC0693或RC0695或RC0699/RC0062各0.5μL，分别再相应加双蒸水至最终体积20μL；
(2)第一轮PCR扩增反应参数设置：94℃预变性5min后开始以下循环反应：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延40s，循环25次；循环结束后72℃继续延伸10min，再16℃将反应液温度下降；
(3)反应完毕后，将PCR产物进行电泳检查，并对正确的片段进行切胶回收以便进行下一轮PCR；
(4)第二轮PCR扩增反应时，取一个0.5ml的PCR薄壁管，逐一再分别加入下列试剂：5×反应缓冲液4μL，10mmol/l dNTP混合物0.5μL，2.5U/μL PrimerSTAR HS DNA聚合酶0.1μL，上一轮PCR的2段产物作为模板DNA分别加2μL，20μmol/L上下游引物RC0061和RC0062各0.5μL，再加双蒸水至最终体积20μL；
(5)第二轮PCR扩增反应参数设置：94℃预变性5min后开始以下循环反应：94℃变性30s，50℃退火4min，72℃延伸10min，循环3次；然后进入另一组循环反应如下：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，循环25次；循环结束后72℃继续延伸5min，再16℃将反应液温度下降；
(6)反应完毕后，将PCR产物进行电泳检查，并对正确的片段进行切胶回收。
4、按照实施例1步骤4方法构建PVX-FTR173A，PVX-FTT27A，PVX-FTY85A和PVX-FTR119A载体，如图1所示。
5、按照实施例1步骤5方法制备线性化DNA。
6、按照实施例1步骤6方法进行体外转录。
7、按照实施例1步骤7方法进行本氏烟的病毒接种。
8、按照实施例1步骤8方法大型烟草(MM)的病毒接种。
9、按照实施例1步骤9方法观察接种后的大型烟草(MM)在长光照条件下的开花表型。以PVX/mAtFT(无义FT突变体，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；图1)和EB(mock)接种为对照，开花表型参见图3。FTT27A具有正常开花功能，但FTR173A、FTY85A和FTR119A都丧失了FT诱导开花功能。
实施例3：利用PVX病毒载体高效、快速研究单子叶植物开花基因的功能
1、按照实施例1所述方法分别合成水稻和番茄第一链cDNA。
2、根据NCBI数据库上登录的水稻(Hd3a)、番茄(SFT)和烟草MM(NtFT4)FT基因的序列设计引物，并委托上海英俊公司合成，引物序列信息见表3：
表3 引物序列
3、按照实施例1步骤3方法获得Hd3a的PCR产物，所用引物为RC0536和RC0537，模板为水稻第一链cDNA；按照实施例1方法步骤3获得SFT的PCR产物，所用引物为RC0541和RC0542，模板为番茄第一链cDNA；按照实施例1方法步骤3获得NtFT4的PCR产物，所用引物为RC0779和RC0780，模板为烟草MM第一链cDNA。
4、按照实施例1步骤4方法构建PVX-Hd3a(水稻野生型Hd3a(FT)蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示)，PVX-SFT(番茄野生型SFT(FT)蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.9)和PVX/NtFT4(烟草野生型NtFT4蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.11)载体，如图1所示。
5、按照实施例1步骤5方法制备线性化DNA。
6、按照实施例1步骤6方法进行体外转录。
7、按照实施例1步骤7方法进行本氏烟的病毒接种。
8、按照实施例1步骤8方法大型烟草MM的病毒接种。
9、按照实施例1步骤9方法观察接种后的MM在长光照条件下的开花表型。分别以PVX/mHd3a(水稻无意突变体mHd3a(mFT)蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.8)、PVX/mSFT(番茄无意突变体mSFT(mFT)蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.10)、PVX/mNtFT4(烟草无意突变体mNtFT4(mFT)蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.12)和EB(mock)接种为对照，开花表型参见图4-6。只有表达野生型Hd3a、SFT或NtFT4，才可促进大型烟草(MM)在长日照下开花。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州师范大学
<120> 马铃薯X病毒在筛选植物开花基因及促开花FT蛋白突变体中的应用
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列
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<211> 174
<212> PRT
<213> unknown
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<223> 人工序列
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20 25 30
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130 135 140
Glu Phe Ala Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Leu Pro Val Ala Ala Val Phe
145 150 155 160
Tyr Asn Cys Gln Arg Glu Ser Gly Cys Gly Gly Arg Arg Leu
165 170
<210> 3
<211> 175
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
Met Ser Ile Asn Ile Arg Asp Pro Leu Ile Val Ser Arg Val Val Gly
1 5 10 15
Asp Val Leu Asp Pro Phe Asn Arg Ser Ile Ala Leu Lys Val Thr Tyr
20 25 30
Gly Gln Arg Glu Val Thr Asn Gly Leu Asp Leu Arg Pro Ser Gln Val
35 40 45
Gln Asn Lys Pro Arg Val Glu Ile Gly Gly Glu Asp Leu Arg Asn Phe
50 55 60
Tyr Thr Leu Val Met Val Asp Pro Asp Val Pro Ser Pro Ser Asn Pro
65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
Arg Glu Phe Ala Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Leu Pro Val Ala Ala Val
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165 170 175
<210> 4
<211> 175
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
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1 5 10 15
Asp Val Leu Asp Pro Phe Asn Arg Ser Ile Thr Leu Lys Val Thr Tyr
20 25 30
Gly Gln Arg Glu Val Thr Asn Gly Leu Asp Leu Arg Pro Ser Gln Val
35 40 45
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65 70 75 80
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130 135 140
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<213> unknown
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<223> 人工序列
<400> 5
Met Ser Ile Asn Ile Arg Asp Pro Leu Ile Val Ser Arg Val Val Gly
1 5 10 15
Asp Val Leu Asp Pro Phe Asn Arg Ser Ile Thr Leu Lys Val Thr Tyr
20 25 30
Gly Gln Arg Glu Val Thr Asn Gly Leu Asp Leu Arg Pro Ser Gln Val
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<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 6
Met Ser Ile Asn Ile Arg Asp Pro Leu Ile Val Ser Arg Val Val Gly
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Asp Val Leu Asp Pro Phe Asn Arg Ser Ile Thr Leu Lys Val Thr Tyr
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<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 7
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20 25 30
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Val Tyr Pro
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<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 8
Ala Gly Ser Gly Arg Asp Arg Asp Pro Leu Val Val Gly Arg Val Val
1 5 10 15
Gly Asp Val Leu Asp Ala Phe Val Arg Ser Thr Asn Leu Lys Val Thr
20 25 30
Tyr Gly Ser Lys Thr Val Ser Asn Gly Cys Glu Leu Lys Pro Ser Met
35 40 45
Val Thr His Gln Pro Arg Val Glu Val Gly Gly Asn Asp Met Arg Thr
50 55 60
Phe Tyr Thr Leu Val Met Val Asp Pro Asp Ala Pro Ser Pro Ser Asp
65 70 75 80
Pro Asn Leu Arg Glu Tyr Leu His Trp Leu Val Thr Asp Ile Pro Gly
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Thr Thr Ala Ala Ser Phe Gly Gln Glu Val Met Cys Tyr Glu Ser Pro
100 105 110
Arg Pro Thr Met Gly Ile His Arg Leu Val Phe Val Leu Phe Gln Gln
115 120 125
Leu Gly Arg Gln Thr Val Tyr Ala Pro Gly Trp Arg Gln Asn Phe Asn
130 135 140
Thr Lys Asp Phe Ala Glu Leu Tyr Asn Leu Gly Ser Pro Val Ala Ala
145 150 155 160
Val Tyr Phe Asn Cys Gln Arg Glu Ala Gly Ser Gly Gly Arg Arg Val
165 170 175
Tyr Pro
<210> 9
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<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 9
Met Pro Arg Glu Arg Asp Pro Leu Val Val Gly Arg Val Val Gly Asp
1 5 10 15
Val Leu Asp Pro Phe Thr Arg Thr Ile Gly Leu Arg Val Ile Tyr Arg
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Asp Arg Glu Val Asn Asn Gly Cys Glu Leu Arg Pro Ser Gln Val Ile
35 40 45
Asn Gln Pro Arg Val Glu Val Gly Gly Asp Asp Leu Arg Thr Phe Phe
50 55 60
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Gly Ser Ser Phe Gly Gln Glu Ile Val Ser Tyr Glu Ser Pro Arg Pro
100 105 110
Ser Met Gly Ile His Arg Phe Val Phe Val Leu Phe Arg Gln Leu Gly
115 120 125
Arg Gln Thr Val Tyr Ala Pro Gly Trp Arg Gln Asn Phe Asn Thr Arg
130 135 140
Asp Phe Ala Glu Leu Tyr Asn Leu Gly Leu Pro Val Ala Ala Val Tyr
145 150 155 160
Phe Asn Cys Gln Arg Glu Ser Gly Ser Gly Gly Arg Arg Arg Ser Ala
165 170 175
Asp
<210> 10
<211> 176
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 10
Pro Arg Glu Arg Asp Pro Leu Val Val Gly Arg Val Val Gly Asp Val
1 5 10 15
Leu Asp Pro Phe Thr Arg Thr Ile Gly Leu Arg Val Ile Tyr Arg Asp
20 25 30
Arg Glu Val Asn Asn Gly Cys Glu Leu Arg Pro Ser Gln Val Ile Asn
35 40 45
Gln Pro Arg Val Glu Val Gly Gly Asp Asp Leu Arg Thr Phe Phe Thr
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165 170 175
<210> 11
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<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 11
Met Pro Arg Ile Asp Pro Leu Ile Val Gly Arg Val Val Gly Asp Val
1 5 10 15
Leu Asp Pro Phe Thr Arg Ser Val Asp Leu Arg Val Val Tyr Asn Asn
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Arg Glu Val Asn Asn Ala Cys Gly Leu Lys Pro Ser Gln Ile Val Thr
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Thr Ser Phe Gly Asn Glu Val Ile Cys Tyr Glu Asn Pro Gln Pro Ser
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Leu Gly Ile His Arg Phe Val Phe Val Leu Phe Arg Gln Leu Gly Arg
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130 135 140
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<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 12
Pro Arg Ile Asp Pro Leu Ile Val Gly Arg Val Val Gly Asp Val Leu
1 5 10 15
Asp Pro Phe Thr Arg Ser Val Asp Leu Arg Val Val Tyr Asn Asn Arg
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Glu Val Asn Asn Ala Cys Gly Leu Lys Pro Ser Gln Ile Val Thr Gln
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Pro Arg Val Gln Ile Gly Gly Asp Asp Leu Arg Asn Phe Tyr Thr Leu
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130 135 140
Ala Glu Val Tyr Asn Leu Gly Leu Pro Val Ser Ala Val Tyr Phe Asn
145 150 155 160
Cys His Arg Glu Ser Gly Thr Gly Gly Arg Arg Ala Tyr
165 170

Claims (10)

1.一种马铃薯X病毒在筛选植物开花基因中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述植物为拟南芥、烟草、水稻或番茄。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用方法为：将待测基因克隆至马铃薯X病毒，经过线性化及体外转录获得含待测基因的马铃薯X病毒RNA并制成病毒溶液；选取2片植物叶片，撒上一层石英砂，滴加病毒溶液，磨擦叶片表面使病毒溶液渗透到叶片表皮中，喷水雾，在23℃、光照16h/d的温室环境下生长，筛选促使植物开花的基因。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述待测基因为FT蛋白编码基因或其它控制开花的相关基因。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述FT蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.11所示。
7.一种马铃薯X病毒在筛选促开花FT蛋白突变体中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用是将FT蛋白突变体克隆至马铃薯X病毒，然后感染植物叶片，筛选获得促开花FT蛋白突变体；所述FT蛋白突变体是将FT蛋白进行定点或随机突变获得的。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述FT蛋白突变体是将FT蛋白第27位苏氨酸、第85位酪氨酸、第119位或第173位精氨酸分别突变为丙氨酸。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用为：将FT蛋白突变体克隆至马铃薯X病毒，经过线性化及体外转录获得含FT突变体蛋白编码基因的马铃薯X病毒RNA；选取2片植物叶片，撒上一层石英砂，滴加含FT突变体蛋白编码基因的马铃薯X病毒RNA，磨擦叶片表面使病毒RNA渗透到叶片表皮中，喷水雾，在23℃、光照16h/d的温室环境下生长，筛选获得促开花FT蛋白突变体。
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