CN105567687B

CN105567687B - 一种花生种子特异启动子ahssp1及其应用

Info

Publication number: CN105567687B
Application number: CN201610052765.9A
Authority: CN
Inventors: 孙全喜; 王传堂; 王秀贞; 唐月异; 吴琪; 苑翠玲; 王志伟
Original assignee: Shandong Peanut Research Institute
Current assignee: Shandong Peanut Research Institute
Priority date: 2016-01-26
Filing date: 2016-01-26
Publication date: 2018-06-29
Anticipated expiration: 2036-01-26
Also published as: CN105567687A

Abstract

本发明提供了一种花生种子特异启动子AHSSP1及其应用，该启动子含有重要的RNA聚合酶结合位点TATA box、CAAT box，以及种子启动子所特有的RY元件。经RT‑PCR对其驱动的下游基因AHSSP1进行检测，发现该基因在成熟种子表达，而在成熟植株的根、茎和叶片中不表达，表明AHSSP1是种子特异启动子。本发明进一步通过实验证明AHSSP1能驱动GUS报告基因在植物种子中特异表达。本发明获得的新的花生种子特异启动子AHSSP1，其克隆鉴定将对花生籽仁品质改良或以花生籽仁作为“生物反应器”异源合成药物蛋白等具有重要的应用价值。

Description

一种花生种子特异启动子AHSSP1及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种花生种子特异启动子AHSSP1及其应用。

背景技术

花生是世界重要的油料作物，其籽仁中蛋白质含量为24％～36％；含油量高达38％～60％，是重要的食用蛋白源和食用植物油源。此外，花生中还富含植物固醇、白藜芦醇、维生素E、维生素C和叶酸等植物活性物质，对促进健康、预防疾病十分有益。随着生物技术的发展，利用基因工程技术对花生籽仁中蛋白质、油脂及其它营养成分进行遗传改良或以花生籽仁作为“生物反应器”异源合成蛋白疫苗等已成为一种非常有效的手段。

花生种子特异启动子作为一类专一性启动子，能指导外源基因在花生种子中特异表达，它不仅能使目的基因的表达产物在种子中积累，增加在种子中的表达量，而且也避免了植物营养的浪费。所以，利用花生种子特异性启动子控制目的基因在种子中特异表达具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明提供了一种花生种子特异启动子AHSSP1及其应用，本发明在花生中克隆到一个951bp的启动子片段AHSSP1，经生物信息学分析、RT-PCR以及转基因验证，确定AHSSP1是一个能驱动外源基因在种子中特异表达的启动子。

本发明具体采用的技术方案如下：

一种花生种子特异启动子AHSSP1，其具有如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。

进一步的：所述花生种子特异启动子AHSSP1含有RNA聚合酶结合位点TATA box、CAAT box和RY元件。

进一步的：扩增所述花生种子特异启动子AHSSP1的引物AHSSP1-F2和AHSSP1-R2序列为：

AHSSP1-F2：5’-AAGCTTGCAGAAATAGAAAGTGGGAACAAA-3’；

AHSSP1-R2：5’-GGATCCGTGGTGGTTATGGAATGTGTATTGAAGA-3’。

进一步的：扩增所述花生种子特异启动子AHSSP1的PCR扩增体系为：ddH₂O 31μL，含Mg²⁺的5×HF buffer 10μL；浓度为2.5mM的dNTP 2μL；浓度均为5μM的AHSSP1-F2和AHSSP1-R2各2μL；DMSO 0.6μL；Phusion酶0.5μL；基因组模板2μL。

进一步的：扩增所述花生种子特异启动子AHSSP1的PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃50s，30个循环；72℃后延伸10min。

本发明还提供了所述的花生种子特异启动子AHSSP1在驱动外源基因在植物的种子中特异表达中的作用。

进一步的：所述外源基因为GUS基因。

进一步的：所述植物为拟南芥。

本发明的优点和技术效果是：本发明首先提取花生叶片总DNA，用启动子特异引物AHSSP1-F2和AHSSP1-R2进行PCR扩增，将扩增的片段胶回收后，连接到克隆载体pEASY-Blunt simple中。生物信息学分析，该启动子含有重要的RNA聚合酶结合位点TATA box、CAAT box，以及种子启动子所特有的RY元件，初步证明AHSSP1是种子特异启动子。

经RT-PCR对其驱动的下游基因AHSSP1进行检测，发现该基因在成熟种子表达，而在成熟植株的根、茎和叶片中不表达。这进一步表明AHSSP1是种子特异启动子。用HindI和BamHI从pEASY-Blunt simple载体切下该片段，替换掉植物表达载体pBI121中的35S。将构建好的植物表达载体转入农杆菌GV3101。利用“蘸花法”对拟南芥(Col 0生态型)进行遗传转化，对转基因T2代拟南芥萌发1-8天的幼苗进行GUS组织化学染色分析发现：刚萌发的幼胚染色最深，未长出真叶、保持胚性的幼苗也有较深的染色，而在长出真叶的幼苗中没有检测到蓝色。这说明，AHSSP1能驱动GUS报告基因在植物种子中特异表达，足以证明它是一个种子特异启动子。

所以本发明获得了一个新的花生种子特异启动子AHSSP1，其克隆鉴定将对花生籽仁品质改良或以花生籽仁作为“生物反应器”异源合成药物蛋白等具有重要的应用价值。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是RT-PCR检测AHSSP1基因在花生根、茎、叶和成熟种子中的表达情况，Actin是内标基因。

图2是AHSSP1启动子的PCR扩增及植物表达载体构建示意图。A：启动子AHSSP1片段示意图；B：植物表达载体pBI121结构示意图；C：启动子AHSSP1片段与植物表达载体pBI121连接得到质粒pBI121-AHSSP1；D：PCR获得启动子AHSSP1片段。M：分子量标记Marker(Trans2K PlusII)；GUS：β-葡聚糖苷酶基因；NPTII：新霉素磷酸转移酶基因；NOS-P：胭脂碱合酶基因启动子；NOS-T：胭脂碱合酶基因终止子；35S-P：烟草花叶病毒35S启动子；LB：左边界；RB：右边界。

图3是AHSSP1启动子序列及顺式作用元件分析。

图4是转AHSSP1::GUS拟南芥PCR检测，其中1-10：随机选取的10株卡那抗性的转基因拟南芥；P质粒对照；WT：野生型拟南芥Col 0；M：分子量标记Marker(Trans2K PlusII)。

图5是GUS组织化学染色，其中A：萌发第1天的种子，能染较深的蓝色；B：种子萌发第5天，保持胚性的根、茎和子叶均能染色；C：幼苗长至第8天，此时种子胚性完全丧失，不能再被染成蓝色。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例具体包括以下试验过程：

1.1 试验材料

植物材料为市售的花生品种“花育33”和拟南芥(生态型Col0)。大肠杆菌DH5α感受态、DNA分子量标记、PCR mix等购自北京全式金生物有限公司；高保真酶Phusion购自NewEngland Biolabs公司；X-Gluc购自北京索莱宝科技有限公司；限制性内切酶BamHI和HindIII购自Fermentas公司；T4 DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；农杆菌菌株GV3101以及超表达载体pBI121为本申请人提供。

1.2 AHSSP1所驱动基因内源表达分析

设计基因特异引物AHSSP1-F1和AHSSP1-R1(如表1所示)，提取花生栽培种“花育33”根、茎、叶片和成熟种子的RNA，反转录成cDNA。利用RT-PCR方法检测其在根、茎、叶片和种子中的表达情况，以花生基因Actin作为内参基因(表1)。

图1实验结果显示：该基因只在种子中有很强的表达信号，在根、茎和叶片中均不表达。这表明该基因在种子中特异表达。

该启动子DNA序列(SEQ IN NO：1)如下：

1.3 花生幼嫩叶片DNA提取及AHSSP1启动子片段的克隆

本发明用植物DNA提取试剂盒提取“花育33”幼嫩叶片基因组，以此为模板，使用高保真酶Phusion，利用AHSSP1特异引物AHSSP1-F2和AHSSP1-R2(表1，横线分别是内切酶HindIII和BamHI识别序列)进行PCR扩增。

PCR反应体系：ddH₂O 31μL，5x HF buffer(含Mg²⁺)10μL；dNTP(2.5mM)2μL；AHSSP1-F2和AHSSP1-R2(5μM)各2μL；DMSO 0.6μL；Phusion酶0.5μL；基因组模板2μL。

PCR反应条件：98℃预变性30sec；98℃变性10sec，58℃退火10sec，72℃50sec，30个循环；72℃后延伸10min。用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后，切取含目的条带的凝胶(图2A、2D)，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)回收PCR产物。将其回收产物与pEASY-Blunt simple载体(北京全式金公司)连接、热激法转化大肠杆菌DH5α(北京全式金公司)，将阳性克隆送上海桑尼生物科技有限公司测序，经测序正确后，命名为pEASY-B-AHSSP1。

表1 本发明所用PCR引物

1.4 AHSSP1启动子序列及顺式作用元件分析

将扩增到的启动子序列经PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)和PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线分析，AHSSP1启动子含有重要的RNA聚合酶结合位点TATA box、CAATbox(图3)，以及种子启动子所特有的RY元件(图3)。这表明：AHSSP1启动子能调控下游基因在种子中特异表达。此外，还包含激素响应元件(如赤霉素、脱落酸和水杨酸等)，以及响应光信号、低温以及高温胁迫的元件序列(表2)。

表2 AHSSP1顺式作用元件情况

1.5 AHSSP1启动子的克隆及其驱动GUS报告基因表达载体的构建

用限制性内切酶HindIII和BamHI对pEASY-B-AHSSP1和植物表达载体pBI121分别进行双酶切反应，得到的片段经纯化后，在T4连接酶的作用下连接在一起，得到质粒pBI121-AHSSP1(图2)。此时，该载体中原来的烟草花叶病毒CaMV 35S启动子被AHSSP1启动子替代(AHSSP1::GUS)(图2)。

1.6 农杆菌介导的拟南芥遗传转化、筛选及分子鉴定

利用热激法将构建好的质粒pBI121-AHSSP1转化到农杆菌GV3101，然后利用花絮侵染法转化拟南芥。收集农杆菌侵染后的拟南芥T₀代种子，在无菌超净工作台上操作，用70％酒精处理1min，2.6％次氯酸钠处理10min，再用无菌水冲洗4-5次，分散于含卡那霉素50μg mL^-1的MS培养基上。待T₁代卡那霉素抗性的拟南芥幼苗长出2片子叶后，选取绿色健康的幼苗移栽到蛭石中。待生长大约三周后，随机选取了10株正常生长的拟南芥，提取叶片DNA，以GUS-F和GUS-R为引物(表1)，对GUS基因进行PCR检测，筛选阳性转基因植株(图4)。

1.7 GUS组织化学染色

配制GUS染色液(0.1M磷酸钠缓冲液；10mM EDTA；0.5mM铁氰化钾；0.5mM亚铁氰化钾；1mM X-Gluc；0.1％Triton X-100)；将试验材料在90％丙酮中(冰浴)固定15-20min；然后在染色液(不含X-Gluc)中漂洗3次；将材料置于GUS染色液中，37℃放置12-16h；先用70％酒精脱色半小时，再用100％酒精脱色；镜检照相。

将T₂代转基因纯合体拟南芥种植于MS培养基，分别取萌发1-10天的幼苗进行GUS组织化学染色。萌发第1天的种子，能染较深的蓝色(图5A)；随着幼苗的长大，GUS染色颜色逐渐变浅，其中第5天的时候，保持胚性的根、茎和子叶均能染色(图5B)。幼苗长出真叶后(第8天，此时种子胚性完全丧失)，不能再被GUS染色(此时已分化出明显的根、茎和真叶)(图5C)。这证明：AHSSP1能驱动外源基因在植物的种子中特异表达，它是一个种子特异表达启动子。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省花生研究所

<120> 一种花生种子特异启动子AHSSP1及其应用

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 951

<212> DNA

<213> 花生

<400> 1

gcagaaatag aaagtgggaa caaaactaaa agcagaataa tttttttaca aaacctgcaa 60

atattcacat gactaaagca aataataatt tacaagatga attaattaaa ataaatattc 120

taaaaacaag aagaataaca cacacaatat tttctatgaa gggtaaacaa taaaacttag 180

agcgaaaata aaataaatgc agagaaggca gaataagagg acaaatatgg agtgaaaaag 240

agaagagaat aagtaaaagt aaaatctcaa cacgagagga gaagggatga tttggtttct 300

ctccggtatg tccagcttta ttattagggt aattcaaatt aaattaagaa ttagtgttaa 360

ttatgatgat ataattcatt ttatctaaat tattagatac taggaataat ttacttttta 420

tttaagagaa gatgggagtg gaaatcacct taaatttata catattttcg gagaacagat 480

tttcaaacat ttaaattttt tttttttttg tattgatgat atttaatatt ttttcttatt 540

ctgaaatgga aaatgctagg tgtaaaaaga aaagaattga ttagtcttga ttcaaaacta 600

aggaaaaaaa catttatggt ttaatttttt tttttcttgt aaagtagtag agttaaacat 660

caaacagaag gtgcattaaa cattgaacat ctcattgatt ataccacata acaacatggc 720

atgcttaggt accaaacaaa aaggcatctt ggacagtatt tgcatgaaaa tgtaacgtgg 780

aagcacaaaa tcaattaatg aagcaaacac agccacccca ccctccttcc ccctttccct 840

tttccacgta cctcacatgc aaaatccctc ctttcaccta taaataccat caccaccatc 900

cacactcaaa aaacaccaca cactcttcaa tacacattcc ataaccacca c 951

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agcagtggga actacaagg 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctatcgctct ggttctccat ta 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttggaatggg tcagaaggat gc 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agtggtgcct cagtaagaag c 21

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aagcttgcag aaatagaaag tgggaacaaa 30

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggatccgtgg tggttatgga atgtgtattg aaga 34

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agcgtatcgt gctgcgtttc g 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcgtaagggt aatgcgaggt 20

Claims

1.花生种子特异启动子AHSSP1在驱动外源基因在植物的种子中特异表达中的作用，其特征在于：所述花生种子特异启动子AHSSP1为如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列；

扩增所述花生种子特异启动子AHSSP1的引物AHSSP1-F2和AHSSP1-R2序列为：

AHSSP1-F2：5’- AAGCTTGCAGAAATAGAAAGTGGGAACAAA -3’；

AHSSP1-R2：5’- GGATCCGTGGTGGTTATGGAATGTGTATTGAAGA -3’；

扩增所述花生种子特异启动子AHSSP1的PCR扩增体系为：ddH₂O 31 μL，含Mg²⁺的5×HFbuffer 10 μL；浓度为2.5 mM 的dNTP 2 μL；浓度均为5 μM 的AHSSP1-F2和AHSSP1-R2各2μL；DMSO 0.6 μL；Phusion酶0.5 μL；基因组模板2 μL；

扩增所述花生种子特异启动子AHSSP1的PCR反应条件为：98 ℃预变性 30 s；98 ℃变性10 s，58 ℃退火 10 s，72 ℃ 50 s，30个循环；72 ℃后延伸10 min。

2.根据权利要求1所述的花生种子特异启动子AHSSP1在驱动外源基因在植物的种子中特异表达中的作用，其特征在于所述外源基因为GUS基因。

3.根据权利要求1所述的花生种子特异启动子AHSSP1在驱动外源基因在植物的种子中特异表达中的作用，其特征在于所述植物为拟南芥。