CN111154798A - 马铃薯x病毒在诱导番茄种子胎萌中的应用及应用方法 - Google Patents

马铃薯x病毒在诱导番茄种子胎萌中的应用及应用方法 Download PDF

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Abstract

马铃薯X病毒在诱导番茄种子胎萌中的应用及应用方法，属于生物技术领域。本发明一方面公开了马铃薯X病毒在诱导番茄种子胎萌中的应用，另一方面公开了马铃薯X病毒在诱导番茄种子胎萌中的应用方法。本发明方法不需要繁琐的转化及转基因筛选流程，研究番茄种子胎萌的流程只需要大约2个月，能高效、快速研究番茄种子胎萌；并通过利用马铃薯病毒X载体研究番茄种子胎萌，确证表观遗传机制参与调控植物种子胎萌的发生。

Description

马铃薯X病毒在诱导番茄种子胎萌中的应用及应用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及马铃薯X病毒在诱导番茄种子胎萌中的应用及应用方法。
背景技术
胎萌（vivipary），又称为种子成熟前发芽（post-harvest sprouting），是一些植物为了抵抗极端环境而进化出的一种生存适应机制；但对于农业和水果作物，胎萌会降低产量，影响谷物和水果的品质，对全球的食品生产及安全产生巨大的危害。
在粮食和水果作物，如玉米，小麦，水稻和番茄中，对于胎萌进行了一定的研究，发现了相关遗传机制和揭示了某些基因参与调控胎萌的发生。同时，虽有零星证据表明表观遗传可能参与调控种子休眠和/或发芽，然而表观遗传是否参与或如何控制植物胎萌证据欠缺，有待进一步深入研究。
番茄Colourless non-ripening (Cnr)是一个自然发生的表观遗传突变体，在这个突变体中，LeSPL-CNR基因的启动子含有高度甲基化的286bp区域，高度甲基化抑制了LeSPL-CNR基因表达，导致番茄果实不能成熟。我们的前期实验还表明miRNA通过细微调节，也影响LeSPL-CNR基因的表达；而且一些参与RNA介导的DNA甲基化以及维持DNA甲基化的基因，如SlDRM7 (DOMAINS REARRANGED METHYLTRANSFERASE 7)、SlMET1 (METHYLTRANSFERASE 1)、SlCMT2和SlCMT3 (CHROMOMETHYLASE)等，也影响Cnr突变体的表型。特别是SlCMT3，通过马铃薯病毒X诱导SlCMT3基因沉默（VIGS）、降低SlCMT3基因表达，能导致突变体Cnr表型回复，即Cnr果实成熟。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种马铃薯X病毒在诱导番茄种子胎萌中的应用及应用方法的技术方案。
本发明采用的技术方案是：
所述的一种马铃薯X病毒在诱导番茄种子胎萌中的应用。
所述的应用，其特征在于所述马铃薯X病毒为PVX-SlMET1、PVX-SlCMT4或PVX-SINCED。
所述的一种马铃薯X病毒在诱导番茄种子胎萌中的应用方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将目标基因克隆至马铃薯X病毒，经过线性化及体外转录获得含目标基因的马铃薯X病毒RNA并制成病毒溶液；
2）将步骤1）得到的病毒溶液接种至本氏烟，得到病汁叶；
3）将步骤2）得到的病汁叶接种至番茄果实，实现诱导番茄种子胎萌。
所述的应用方法，其特征在于所述的目标基因为SlMET1、SlCMT4或SINCED。
本发明中目标基因SlMET1、SlCMT4和SINCED均为现有基因。
本发明的应用方法具体为：
（1）构建马铃薯病毒X（PVX）载体
设计目标基因的引物，通过载体构建，得到PVX-目标基因的载体
（2）制备线性化 DNA
1）取一个1.5ml 的离心管，逐一加入下列试剂：10×缓冲液10μl，1mg/ml 的10×BSA10 μl，10unit/μl SpeI 3μl，目的DNA 10.5μg, 然后加双蒸水至最终体积100 μl；
2）放置37℃培养箱孵育3h；
3）加入同等体积的苯酚/氯仿（phenol/chloroform），涡旋30s，最大转速（14000rpm）离心3min；
4）转移上清液至新的0.5ml离心管，加入同等体积的苯酚/氯仿，涡旋30s，最大转速（14000rpm）离心3min；
5）转移上清液至新的0.5ml离心管，加入同等体积的氯仿，涡旋30s，最大转速（14000rpm）离心3min；
6）转移上清液至新的1.5ml离心管，加入3M NaAc (pH5.2) 10μl，100%EtOH 250μl，混合均匀，放置-70℃冰箱至少1h；
7）最大转速（14000rpm）离心18min，小心去除上清；
8）加70% EtOH 100μl清洗小块，最大转速（14000rpm）离心5min，小心去除上清，晾干；
9）用40μl的无菌双蒸水，溶解小块。
（3）体外转录
1）取一个1.5ml的离心管，逐一加入下列试剂：10×缓冲液5μl，40units/μl PNasin 1μl，10×NTP4（20mM each of ATP，CTP，UTP，2mM GTP）5μl.5mM Cap(m7GpppG)5μl，线性化DNA 片段2.5μg，然后加RNase-free水至最终体积46μl；
2）放置37℃孵育5min；
3）加50 units/μl T7 RNA pol, 放置37℃孵育25min；
4）加20mM GTP 5μl，放置37℃孵育35min；
5）加EB（10mM Tris，pH8.5）45μl，用酚氯仿提纯（同DNA线性化时酚氯仿提纯的操作步骤）；
6）用30μl的无菌双蒸水， 溶解小块。
（4）本氏烟的病毒接种
1）本氏烟（NB）在23℃、长日照（光照16h/ d）的温室环境下生长，选取4-6叶期的健康本氏烟，对其2片舒展的嫩叶进行病毒接种；
2）在幼嫩叶片上均匀撒上薄薄的一层灭菌处理过的石英砂；
3）将获取的体外转录的病毒 RNA 用枪头点到叶片上；
4）用戴橡胶手套的双手食指，一个食指托着接种叶，另一个食指在叶面上轻轻磨擦约5下，使病汁液渗透到烟草表皮中；
5）完成接种后，向整个植株喷水雾让其自我修复。
（5）病汁叶接种番茄果实
1）番茄种植于人工气候室中，人工气候室条件：温度为25℃、相对湿度60-70%，光照昼夜循环为16h白天/8h夜晚。以开花后5-15天的番茄幼果为研究对象。每个样品至少注射3株番茄，即约60个番茄幼果。
2）取一片接种成功的NB叶片，加入1ml RNase-free EB缓冲液充分研磨；
3）用注射器吸取混合液，注射到番茄果柄处；
4）注射后向整个植株上喷水雾，使其自我修复；
5）番茄正常培养，待番茄果实破色后观察并记录种子胎萌发育情况。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明方法不需要繁琐的转化及转基因筛选流程，研究番茄种子胎萌的流程只需要大约2个月，能高效、快速研究番茄种子胎萌；并通过利用马铃薯病毒X载体研究番茄种子胎萌，确证表观遗传机制参与调控植物种子胎萌的发生。
附图说明
图1为本发明载体构建模式图；
图2为PVX/SlMET1接种番茄果实后的胎萌表型；
图3为PVX/SlCMT4接种番茄果实后的胎萌表型；
图4为PVX/SINCED接种番茄果实后的胎萌表型；
图5为PVX/SIZ-ISO接种番茄果实后的胎萌表型；
图6为PVX/SlABI3接种番茄果实后的胎萌表型。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：利用VIGS研究SlMET1是否参与番茄种子胎萌
1、利用Trizol，根据制造商提供的方法，从番茄的叶片中提取总RNA。以此为模板，利用反转录酶合成第一链cDNA。
2、根据NCBI数据库上登录的番茄SlMET1基因的序列设计引物，并委托上海英俊公司合成，引物序列信息见表1：
表1
Figure 625515DEST_PATH_IMAGE001
。
3、在PCR反应中，以第一链cDNA为模板，引物1和引物2为引物。取一个0.5ml的 PCR薄壁管，逐一加入下列试剂：模板 DNA 2μl，10mmol/l dNTP混合物0.5μl，20μmol/l上下游引物各0.5μl，5×反应缓冲液4μl， 2.5U/μl PrimerSTAR HS DNA 聚合酶0.1μl，加双蒸水至最终体积20μl；PCR 扩增反应参数设置：94℃预变性5min后开始以下循环反应： 94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延40s，进行25次循环；循环结束后72℃继续延伸10 min，再16℃将反应液温度下降；反应完毕后，将PCR 产物进行电泳检查，并对正确的片段切胶保留。
4、利用PCR产物纯化回收试剂盒，根据制造商提供的方法，回收得到SlMET1的PCR产物。并使用 MluI和SalI 进行双酶切，然后连接到同样使用 MluI和SalI 双酶切的马铃薯 X 病毒载体中，随后通过转化，阳性克隆鉴定以及测序，得到PVX/SlMET1载体，如图1所示。
5、制备线性化 DNA
1）取一个1.5ml 的离心管，逐一加入下列试剂：10×缓冲液10μl，1mg/ml 的10×BSA10μl，10unit/μl SpeⅠ 3μl， PVX-SlMET1载体 10.5μg， 然后加双蒸水至最终体积100μl；
2）放置37℃培养箱孵育3h；
3）加入同等体积的苯酚/氯仿（phenol/chloroform），涡旋30s，最大转速（14000rpm）离心3min；
4）转移上清液至新的0.5ml离心管，加入同等体积的苯酚/氯仿，涡旋30s，最大转速（14000rpm）离心3min；
5）转移上清液至新的0.5ml离心管，加入同等体积的氯仿，涡旋30s，最大转速（14000rpm）离心3min；
6）转移上清液至新的1.5ml离心管，加入3M NaAc(pH5.2) 10μl，100%EtOH 250μl，混合均匀，放置-70℃冰箱至少1h；
7）最大转速（14000rpm）离心18min，小心去除上清；
8）加70% EtOH 100μl清洗小块，最大转速（14000rpm）离心5min，小心去除上清，晾干；
9）用40μl的无菌双蒸水溶解小块。
6、 体外转录
1）取一个1.5ml的离心管，逐一加入下列试剂：10×缓冲液5μl，40units/μl PNasin 1μl，10×NTP4（20mM each of ATP，CTP，UTP，2mM GTP）5μl，5mM Cap(m7GpppG)5μl，线性化PVX/SlMET1片段2.5μg，然后加RNase-free water至最终体积46μl；
2）放置37℃孵育5min；
3）加50 units/μl T7 RNA pol, 放置37℃孵育25min；
4）加20mM GTP 5μl，放置37℃孵育35min；
5）加EB（10Mm Tris,pH8.5）45μl，用酚氯仿提纯（同DNA线性化时酚氯仿提纯的操作步骤）；
6）用30μl的无菌双蒸水溶解小块。
7、 本氏烟的病毒接种
1）本氏烟（NB）在23℃、长日照（光照16h/ d）的温室环境下生长，选取4-6叶期的健康本氏烟，对其2片舒展的嫩叶进行病毒接种；
2）在幼嫩叶片上均匀撒上薄薄的一层灭菌处理过的石英砂；
3）将获取的体外转录的PVX/SlMET1病毒 RNA 用枪头点到叶片上；
4）用戴橡胶手套的双手食指，一个食指托着接种叶，另一个食指在叶面上轻轻磨擦约5下，使病汁液渗透到烟草表皮中；
5）完成接种后，向整个植株喷水雾让其自我修复。
8、 病汁叶接种番茄果实
1）番茄种植于温室中：白天25℃，夜晚20℃，光照16h/d，每个样品接种3株番茄，约60个从开花后1天到MG时期的不同生长阶段的番茄果实；
2）取一片接种成功的NB叶片，加入1ml RNase-free EB充分研磨；
3）用注射器吸取混合液，注射到番茄果柄处；
4）注射后向整个植株上喷水雾，使其自我修复；
5）番茄正常培养，待番茄果实破色后观察并记录种子胎萌发育情况，胎萌表型参见图2，表明PVX/SlMET1病毒接种番茄果实后诱导了番茄种子胎萌。
实施例2：利用VIGS研究SlCMT4是否参与番茄种子胎萌
1、按照实施例1方法所述合成拟南芥第一链cDNA；
2、根据NCBI数据库上登录的番茄SlCMT4基因的序列设计引物，并委托上海英俊公司合成，引物序列信息见表2：
表2
Figure 334845DEST_PATH_IMAGE002
；
3、按照实施例1方法步骤3得到SlCMT4的PCR产物片段，所用引物为引物3和引物4；
4、按照实施例1方法步骤4构建PVX/SlCMT4，如图1所示；
5、按照实施例1方法步骤5制备线性化DNA；
6、按照实施例1方法步骤6进行体外转录；
7、按照实施例1方法步骤7进行本氏烟的病毒接种；
8、按照实施例1方法步骤8进行病汁叶接种番茄果实，并观察胎萌表型，具体表型参见图3，表明PVX/SlCMT4病毒接种番茄果实后诱导了番茄种子胎萌。
实施例3：利用VIGS研究SINCED是否参与番茄种子胎萌
1、按照实施例1方法所述合成拟南芥第一链cDNA；
2、根据NCBI数据库上登录的番茄SINCED基因的序列设计引物，并委托上海英俊公司合成，引物序列信息见表3：
表3
Figure 285484DEST_PATH_IMAGE003
；
3、按照实施例1方法步骤3得到SINCED的PCR产物片段，所用引物为引物5和引物6；
4、按照实施例1方法步骤4构建PVX/SINCED，如图1所示；
5、按照实施例1方法步骤5制备线性化 DNA；
6、按照实施例1方法步骤6进行体外转录；
7、按照实施例1方法步骤7进行本氏烟的病毒接种；
8、按照实施例1方法步骤8进行病汁叶接种番茄果实，并观察胎萌表型，具体表型参见图4，表明PVX/SINCED病毒接种番茄果实后诱导了番茄种子胎萌。
实施例4：利用VIGS研究SIZ-ISO是否参与番茄种子胎萌
1、按照实施例1方法所述合成拟南芥第一链cDNA；
2、根据NCBI数据库上登录的番茄SIZ-ISO基因的序列设计引物，并委托上海英俊公司合成，引物序列信息见表4：
表4
Figure 102743DEST_PATH_IMAGE004
；
3、按照实施例1方法步骤3得到SIZ-ISO的PCR产物片段，所用引物为引物7和引物8；
4、按照实施例1方法步骤4构建PVX/SIZ-ISO，如图1所示；
5、按照实施例1方法步骤5制备线性化DNA；
6、按照实施例1方法步骤6进行体外转录；
7、按照实施例1方法步骤7进行本氏烟的病毒接种；
8、按照实施例1方法步骤8进行病汁叶接种番茄果实，并观察胎萌表型，具体表型参见图5，表明PVX/SIZ-ISO接种番茄果实后不诱导胎萌。
实施例5：利用VIGS研究SlABI3是否参与番茄种子胎萌
1、按照实施例1方法所述合成拟南芥第一链cDNA；
2、根据NCBI数据库上登录的番茄SlABI3基因的序列设计引物，并委托上海英俊公司合成，引物序列信息见表5：
表5
Figure 455227DEST_PATH_IMAGE005
；
3、按照实施例1方法步骤3得到SlABI3的PCR产物片段，所用引物为引物9和引物10；
4、按照实施例1方法步骤4构建PVX/SlABI3，如图1所示；
5、按照实施例1方法步骤5制备线性化 DNA；
6、按照实施例1方法步骤6进行体外转录；
7、按照实施例1方法步骤7进行本氏烟的病毒接种；
8、按照实施例1方法步骤8进行病汁叶接种番茄果实，并观察胎萌表型，具体表型参见图6，表明PVX/SlABI3接种番茄果实后不诱导胎萌。
序列表
<110> 杭州师范大学
<120> 马铃薯X病毒在诱导番茄种子胎萌中的应用及应用方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 1
gatacgcgtc cttcgcaaga cccttcc 27
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 2
ttcgtcgact taccaagggc cctgaggag 29
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 3
gatacgcgtc cttcgcaaga cccttcc 27
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 4
ttcgtcgact taccaagggc cctgaggag 29
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 5
aatatcgata tggcaactac tacttcacat g 31
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 6
gcgcggccgg tattattctt tggtgtttga t 31
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 7
gagatcgatg ccatagcata tcactccacc aa 32
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 8
ctacggccgc caaatccagt agaattgtca at 32
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 9
caaatcgatc gcctccttat agtcaaacca tgag 34
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 10
tcgcggccgg atacggatca tattgagcac cga 33

Claims (4)

1.一种马铃薯X病毒在诱导番茄种子胎萌中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述马铃薯X病毒为PVX-SlMET1、PVX-SlCMT4或PVX-SINCED。
3.一种马铃薯X病毒在诱导番茄种子胎萌中的应用方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将目标基因克隆至马铃薯X病毒，经过线性化及体外转录获得含目标基因的马铃薯X病毒RNA并制成病毒溶液；
2）将步骤1）得到的病毒溶液接种至本氏烟，得到病汁叶；
3）将步骤2）得到的病汁叶接种至番茄果实，实现诱导番茄种子胎萌。
4.如权利要求3所述的应用方法，其特征在于所述的目标基因为SlMET1、SlCMT4或SINCED。
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