CN110747203B - 基因OsBBX14在提高水稻白叶枯病抗性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基因OsBBX14在提高水稻白叶枯病抗性中的应用。本发明通过PCR方法，扩增出水稻品种日本晴的OsBBX14基因的全长编码区，正向连接在植物表达载体pCAMBIA1390‑ubi上；再进行遗传转化至水稻中，提高OsBBX14基因的表达，得到OsBBX14基因表达增强的转基因水稻植株。在转基因的T3代植株中发现，阳性转基因水稻植株的白叶枯病抗性显著高于野生型。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及通过提高OsBBX14基因的表达水平来提高水稻白叶枯病抗性。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)作为最重要的粮食作物之一，为全球半数以上的人口提供食物来源，对于粮食安全至关重要(Tabien et al.,1996)。而由黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)引起的水稻白叶枯病(Bacterial blight)已经成为水稻生产中重要的病害之一，常常引起水稻减产。因此，采用合适的方法对水稻白叶枯病进行有效防治有着重要的意义。
水稻白叶枯病是由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae，Xoo)所引起的系统性病害，属维管束病害，为水稻生产上的三大病害之一。病原菌Xoo主要通过气孔，水孔或伤口侵染水稻叶片，继而在维管束中大量繁殖，分泌产生大量的胞外多糖使维管束堵塞，导致叶片组织失水产生灰褐色或白色病斑。随着病原菌在维管束中分布，整个植株被病原菌侵染变成灰白色，进而萎蔫干枯甚至死亡，严重影响了水稻植株的光合作用，造成水稻减产(王春连，2006)。如果水稻在分蘖期遭受病害则会造成严重减产甚至绝收(Reddy et al.,1989)。对于该病害的防治主要包括化学防治和种植抗病品种。由于是维管束病害，所以化学防治很难取得良好的防治效果而且对环境会产生危害；而种植抗病品种不但能够有效地防止病害的发生，而且节约防治成本不危害环境，被认为是最经济有效的方法(Suh et al.,2013)。因此培育抗白叶枯病品种已经成为现代水稻育种的主要目标之一，相应的培育和推广抗白叶枯病品种成为各国育种家的首要任务。然而传统的育种方法存在着育种周期长，工作量大和选择效率低等问题。但病原菌的致病性变异，新致病小种的出现和扩散的速度却快得多。因此在进行抗病基因鉴定，定位和克隆的基础上，采用分子标记选择辅助育种和基因工程育种能够大大的提高工作效率缩短育种年限。
对水稻抗白叶枯病基因的鉴定研究始于上世纪五十年代(章琦，2005)。截至2014年3月，国内外已报道的水稻抗白叶枯病基因有38个，编号已排至Xa38，其中Xa3和Xa26为同一个基因(Xiang et al.,2006)，同时还有4对基因Xa25/xa25，Xa26/xa26，Xa32/xa32和Xa33/xa33为不同的水稻材料中鉴定的不同的抗白叶枯病基因，而非等位基因。在已经鉴定的38个抗白叶枯病基因中隐性基因12个：xa5，xa8，xa13，xa15，xa19，xa20，xa24，xa26(t)，xa28(t)，xa32(t)，xa33(t)和xa34(t)(Chen et al.,2011)，其余为显性基因。在38个抗白叶枯病基因中被定位的有30个，有9个基因已经被成功克隆，分别为：显性基因Xa1(Yoshimura et al.,1998)，Xa3/Xa26(Sun et al.,2004；Xiang et al.,2006)，Xa10(Tianet al.,2014)，Xa21(Song et al.,1995)，Xa23(王春连，2006)，Xa27(Gu et al.,2005)和隐性基因xa5(Jiang et al.,2006)，xa13(Chu et al.,2006a)，xa25(Liu et al.,2011)。
抗白叶枯病基因的克隆为转基因育种提供了材料基础，而转基因技术的成熟为转基因育种提供了技术支持。通过转基因的方法能够快速的获得纯合的含有抗病基因的中间材料，大大缩短了育种年限，提高育种效率。目前主要应用于转基因育种的抗白叶枯病基因为Xa21基因，已经通过基因枪、农杆菌介导等的方法将该基因转化到多个水稻品种中。黄大年等(1997)以基因枪法将Xa21基因转入“中百4号”和“京引119”，获得6个转基因株。经白叶枯病抗性鉴定，其中一个转基因植株“京引119-B”抗病性有明显改善，其病斑长度与对照差异达显著水平(黄大年等，1997)。Gao等(2011)用农杆菌介导的方法将Xa21转化到水稻D62B中，收获的T2代和D62A进行回交，获得的后代对白叶枯病抗性明显提高，但是对育性和其他农艺性状没有显著影响(Gao et al.,2011)。Zhai等(2000)通过农杆菌介导的方法将Xa21基因转入5个水稻品种，获得超过110株独立的转基因植株，通过对转基因后代的PCR检测，Xa21基因整合到基因组中并能够稳定遗传(Zhai et al.,2000)。张小红等(2008)通过农杆菌介导的方法将Xa23基因的转入感病品种牡丹江8号，通过对转基因后代的接种鉴定，结果表明Xa23基因的抗性可以准确、稳定地遗传到T1代和T2代(张小红等，2008)。
由于人们对植物抗白叶枯病的分子机制缺乏了解，抗白叶枯病分子育种还有很大的盲目性。而且水稻抗白叶枯病是众多抗病基因共同表达的结果，采用单基因策略提高植物的抗病性在实际生产应用中效果不明显，如果改变一个基因的表达能够整体调控植物抗白叶枯能力，那将是一个理想的选择。
在分析光敏色素调节水稻农艺性状形成机制过程中，本课题组筛选到受phyB下调的一个double B-box锌指蛋白基因。进化树分析表明，该基因编码蛋白与拟南芥的BBX22属于同一个分支，Huang等人(2012)将其命名为OsBBX14。在我们前期研究过程中发现，亚细胞定位和转录激活活性分析结果表明OsBBX14定位于细胞核，并具有转录激活活性，据此推测OsBBX14可能是转录因子。
发明内容
本发明从水稻品种日本晴中分离克隆到B-box锌指蛋白的OsBBX14基因，转入水稻中提高OsBBX14基因的表达水平，显著提高了水稻的白叶枯病抗性。因此，在水稻中过量表达OsBBX14基因的表达对于提高水稻白叶枯病抗性具有重要意义，这为水稻的高抗白叶枯病育种提供新的思路。
本发明首先通过PCR方法，扩增出水稻品种日本晴的OsBBX14基因的全长编码区，包含1134个碱基，正向连接在植物表达载体pCAMBIA1390-ubi上；再进行遗传转化至水稻中，提高OsBBX14基因的表达，得到OsBBX14基因表达增强的转基因水稻植株。在转基因的T3代植株中发现，阳性转基因水稻植株的白叶枯病抗性显著高于野生型水稻。利用1个国际鉴定菌株(PXO99)，6个国内鉴定菌株(YN11、SCYC-6、YN17、FuJ、YN24、YN-1)，进行接种鉴定，结果显示pCAMBIA1390-ubi-BBX14过表达转基因株系对上述菌株均表现为抗病，而非转基因株系表现为感病。
本发明用于构建过量表达OsBBX14基因的植物表达载体、增强OsBBX14基因表达的基因OsBBX14的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明利用水稻品种日本晴的OsBBX14基因的cDNA片段作为应用基因，将该基因正向转入水稻中，提高OsBBX14基因的表达水平，转基因水稻植株表现出白叶枯病抗性。
本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种提高水稻白叶枯病抗性的基因OsBBX14。申请人在水稻中过量表达OsBBX14基因后，发现转基因阳性植株白叶枯抗病性显著提高，为培育抗白叶枯病水稻品种提供了新的思路，也为其它作物利用异源基因技术提高水稻白叶枯抗病性提供了理论支持。
(2)本发明首次初步揭示了水稻OsBBX14基因提高水稻白叶枯病抗性的机制，为提高水稻等禾谷类作物的白叶枯抗病性研究提供支持。
附图说明
图1为本发明的OsBBX14基因表达载体的构建示意图。将克隆在pMD18-T载体上的OsBBX14基因利用BamHI和SpeI酶切，替换pCAMBIA1390-ubi植物表达载体上BamHI和SpeI之间的DNA片段，这样OsBBX14基因正向插入玉米泛素基因启动子(Pubi)后，即pCAMBIA1390-ubi-BBX14植物表达载体；
图2为检测T3代转基因水稻阳性植株中OsBBX14基因转录本相对表达水平结果图。其中OsBBX14-OX表示过表达OsBBX14基因的植株，#3、#5和#16代表独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。EF-1a作为荧光定量PCR分析的内参基因；
图3为过表达OsBBX14基因水稻植株和野生型植株，在大田条件利用1个国际鉴定菌株(PXO99)，6个国内鉴定菌株(YN11、SCYC-6、YN17、FuJ、YN24、YN-1)，进行白叶枯病抗性接种鉴定。其中OsBBX14-OX表示过表达OsBBX14基因的植株，#3、#5和#16代表三个独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株；
图4为过表达OsBBX14基因水稻植株和野生型植株接种不同白叶枯病菌株菌斑长度统计结果。其中OsBBX14-OX表示转OsBBX14基因的植株，#3、#5和#16代表三个独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。
具体实施方式
以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆用于构建OsBBX14基因植物表达载体的DNA片段，以及验证功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其使用不同的用途和条件。
实施例1：分离克隆用于构建OsBBX14基因植物表达载体的DNA片段
采用TRIZOL试剂(Invitrogen)从水稻品种日本晴(公开报道的一个品种)的叶片中提取总RNA。具体步骤如下：将20毫克叶片放至液氮预冷的研钵中，加入液氮快速磨成粉末，将粉末装入1.5ml离心管中，迅速加入1ml Trizol(Invitrogen)颠倒混匀，室温静置5分钟。在4℃，12000rpm离心10分钟，取上清液移至新的1.5ml离心管中。加入200μl氯仿，用手剧烈摇动15秒钟，室温静置2-3分钟。4℃，12000rpm离心15分钟。取无色水相至一新的1.5ml离心管中，加入250μl异丙醇，250μl高盐溶液，颠倒混匀，室温静置10分钟。4℃，12000rpm离心10分钟，吸除上清液。加入1ml冰冷的75％乙醇，上下倒置几次，然后4℃，7500rpm离心5分钟，弃上清，在室温下干燥至沉淀变透明。加入适量的DEPC水(一般为60μl)溶解沉淀，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度。
利用反转录酶SuperScript II(Invitrogen)将其反转录成cDNA，具体步骤如下：依次加入1μl 500μg/ml oligo(dT)12-18、2μg总RNA、1μl 10mM dNTP混合物和DEPC水至12μl，在65℃水浴中5分钟，迅速冰浴5分钟，稍微离心收集样品于管底。然后依次加入4μl 5×第一链缓冲液、2μl 0.1M DTT和1μl RNaseOUT(40U/μl)，42℃，2分钟。然后加入1μlSuperScript II，轻微混合均匀，42℃反应50分钟，然后70℃水浴15分钟使酶失活，这样就合成了第一链cDNA，以第一链cDNA为模板扩增目的基因。用带有酶切位点的上游引物OsBBX14F(5’-ATGGATCCATGTCGCCTCCTCCTCCACCATATTA-3’，SEQ ID NO：3，序列特异引物外加BamHI位点和两个保护碱基)和下游引物OsBBX14R(5’-AACTAGTTTATTGCCTCCGGCGTTTGGAGGTG-3’，SEQ ID NO：4，序列特异引物外加SpeI位点和两个保护碱基)。利用PrimerSTAR HSDNA polymerase with GC buffer(TaKaRa)扩增目的片段，PCR反应条件是94℃预变性1分钟；98℃ 10秒，68℃ 4分钟，30个循环。利用TArget Clone TM-Plus试剂盒(TOYOBO)在PCR产物末端加A。然后连接到pMD18-T载体(TaKaRa)。筛选阳性克隆并测序，获得所需DNA片段(序列如SEQ ID NO：1所示)，将该克隆命名为pMD18-OsBBX14 cDNA。
实施例2：OsBBX14基因植物表达载体的构建和遗传转化
为了能更好地分析OsBBX14的功能，申请人通过过量表达技术使OsBBX14基因在水稻中表达水平提高。根据转基因植株的农艺性状特征研究该基因的功能。
OsBBX14基因植物表达载体的构建方法如下：首先将实施例1中得到的阳性克隆pMD18-OsBBX14用BamHI和SpeI双酶切，回收插入片段；并用同样的方法酶切pCAMBIA1390-ubi的植物表达载体，回收载体片段。用回收的插入片段和载体片段做连接反应，转化大肠杆菌XL1-Blue。通过酶切筛选阳性克隆，获得植物表达载体，命名为pCAMBIA1390-ubi-BBX14(见图1)。pCAMBIA1390-ubi是在国际常用的植物遗传转化载体(见图1)。将pCAMBIA1390-ubi-BBX14转化至农杆菌菌株EHA105。
通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系(参见本发明后面的实施例)将其导入到水稻品种日本晴中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、移苗得到转基因植株。农杆菌介导的水稻遗传转化体系在Hiei等人报道的方法基础上进行改良(Hiei等，1994，Plant J.，6:271-282)。转化共获得20株独立的转基因水稻植株。
具体步骤如下：
(1)愈伤诱导：去壳的野生型日本晴水稻种子，用70％乙醇表面消毒1分钟；5％(活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次；播种于愈伤诱导培养基上诱导愈伤组织(成分见后)，于25-26℃暗培养4-7天后，将从成熟胚盾片处诱导出初生愈伤组织，同时用镊子去掉胚上长出的胚芽，继代于愈伤诱导培养基继续培养2周，直至长出色泽淡黄，质地坚硬呈颗粒状的胚性愈伤组织。
(2)愈伤组织的预培养：将愈伤组织转至新鲜的愈伤诱导培养基培养，于25-26℃暗培养4天。
(3)农杆菌培养：挑取农杆菌单克隆接种到5mL YEP液体培养基中(含有50mg/L的卡那霉素)，28℃，220rpm，培养至对数生长晚期(大约培养18-24小时)。将获得的菌液按1％接种量转接到50mL新鲜的、含有50mg/L卡那霉素的AB液体培养基中(成分见后)；28℃，220rpm，培养至OD600值为0.5左右(培养5-6小时)。
(4)农杆菌侵染：把50mL菌液转入离心管，4℃，4000g离心10分钟，弃上清，加入等体积的AAM培养基重悬菌体。把(2)的日本晴胚性愈伤组织浸入上述AAM菌液，侵染2分钟，缓慢摇动。用无菌吸水纸将愈伤组织吸干，置于共培养培养基上(培养基上铺一层无菌滤纸)，26℃，黑暗共培养2-3天。
(5)愈伤洗涤和选择培养：共培养后的愈伤组织用无菌水洗4次，然后再用含500mg/L羧苄青霉素Cb的无菌水洗2次，再用无菌吸水纸吸干后置于工作台吹30分钟。将愈伤组织置于固体筛选培养基(含有25mg/L潮霉素，400mg/L羧苄青霉素)上，26℃暗培养2周。然后转移到固体筛选培养基(含有30mg/L潮霉素，300mg/L羧苄青霉素)上，26℃暗培养，每2周继代一次，筛选4周。
(6)分化培养：把抗性愈伤组织转移至分化培养基上，28℃光照培养7天，转接一次后，培养至产生再生苗。
(7)壮苗、移栽：将再生的小植株转至新鲜的1/2MS培养基上，于培养瓶中生根壮苗。待小苗长至10cm左右，打开封口膜，炼苗2-3天，将再生苗移至土中培养。
试剂配方：
(1)试剂和溶液缩写：本发明中作用到的植物激素的缩写表示如下：Cb(Cabenicillin,羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)；DMSO(Dimethyl sulfoxide,二甲基亚砜)。
(2)用于水稻遗传转化的培养基配方：
1)YEP液体培养基：2g Bacto-蛋白胨，2g酵母粉，1g NaCl，加水定容至200mL，用5NNaOH调pH至7.0。
2)愈伤诱导培养基：N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2,4-D，Gelrite(Sigma)4g/L，pH 5.8。
3)AB液体培养基：3g/L K2HPO4，1g/L NaH2PO4，1g/L NH4Cl，300mg/L MgSO4·7H2O，150mg/L KCl，10mg/L CaCl2·2H2O，2.5mg/L FeSO4·7H2O，5g/L葡萄糖，pH 7.0。
4)AAM培养基：AA大量，AA微量,0.9g/L L-谷氨酰胺，0.3g天冬氨酸，MS维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，36g/L葡萄糖，68.5g/L蔗糖，20mg/L AS，pH 5.2。
5)共培养培养基：N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，0.5g/L酸水解酪蛋白，2mg/L 2,4-D，20mg/L AS，Gelrite(Sigma)4g/L，pH 5.8。
6)固体筛选培养基：N6大量、N6微量和N6维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2,4-D，Gelrite(Sigma)4g/L，pH 5.8，合适浓度的潮霉素和羧苄青霉素。
7)分化培养基：MS大量，MS微量，铁盐和MS维生素，2g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，30g/L山梨醇，2mg/L KT，0.2mg/L NAA，pH 5.8，30mg/L潮霉素B，200mg/L羧苄青霉素。
8)1/2MS培养基：1/2MS大量，1/2MS微量，MS维生素，30g/L蔗糖，4g/L Gelrite，30mg/L潮霉素B，200mg/L羧苄青霉素，pH 5.8.
(3)主要溶液配方：
1)N6大量元素(10×)
2)N6微量(1000×)：
3)N6维生素(1000×)
4)MS大量元素(10×)
5)MS微量(1000×)：
6)MS维生素(1000×)
7)铁盐(200×)
9)AA微量(1000×)
10)2,4-D储存液(2mg/ml)
称取2，4-D 100mg,溶于1ml DMSO，加入蒸馏水定溶至49ml，然后加入0.5N NaOH，至完全溶解，于-20℃保存。
11)Kinetin储存液(0.2mg/ml)
称取Kinetin 10mg，溶于1ml 1N KOH，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。
12)NAA储存液(0.2mg/ml)
称取NAA 10mg，溶于0.5ml 1N KOH，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。
13)乙酰丁香酮(100mg/ml)
称取乙酰丁香酮100mg，溶于1ml DMSO，于-20℃保存。
14)卡那霉素(50mg/ml)
称取卡那霉素500mg，溶于8ml蒸馏水中，加蒸馏水定溶至10ml，然后用0.22μm滤器过滤除菌，于-20℃保存。
实施例3：检测转基因水稻植株和野生型水稻的OsBBX14基因的转录本水平
以水稻野生型日本晴和8个独立的T3代转基因水稻植株为材料，提取四叶期水稻叶片的RNA，利用RT-PCR检测水稻叶片中OsBBX14基因的转录本水平。具体方法如下：采用TRIZOL试剂(Invitrogen)从上述材料收集0.03g水稻叶片提取总RNA，具体步骤如实施例1的描述。
利用RNase-free DNase(TaKaRa)除去RNA中的DNA，具体步骤如下：依次加入TotalRNA 50μg，10×DNase I Buffer 5μl，DNase I(RNase-free，5U/μl)2μl，RNase Inhibitor(50U/μl)0.4μl，加DEPC水补足总体积至50μl。反应体系混匀后在37℃反应30min。然后在反应体系中加入50μl DEPC水补足至100μl。随后加入苯酚:氯仿:异戊醇(体积比25:24:1)混合物100μl，充分混匀，4℃，12000rpm离心15min。将上层移至新的1.5ml离心管中。加入100μl氯仿:异戊醇(体积比24:1)混合物，充分混匀，4℃，12000rpm离心15分钟。取最上层移至另一新的1.5ml离心管中，加入1/10体积的3M NaAc(pH＝5.2)和2.5倍体积的冷无水乙醇，-80℃放置1小时，4℃，12000rpm离心10分钟，吸除上清液。加入1ml冰冷的75％乙醇，上下倒置几次，然后4℃，7500rpm离心5分钟，弃上清，在室温干燥至沉淀变透明。加入25μl DEPC水溶解沉淀，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度。
根据PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I(TaKaRa)说明书合成cDNA第一链。具体步骤如下：依次加入上述总RNA 1μg、5×PrimeScript buffer 2μl、PrimeScript RT EnzymeMix 0.5μl、Random 6mers(100μM)和Oligo dT Prime(50μM)各0.5μl，最后用RNase FreedH2O补充至总体积为10μl。然后将反应体系在37℃下保温15分钟，使反转录反应进行，然后用85℃高温处理5秒使酶失活，即完成了cDNA第一链的合成。
以上述cDNA为模板，用OsBBX14基因的特异性上游引物OsBBX14qF1(5’-TCCTCCACCATATTACCACCA-3’，SEQ ID NO：5)，和下游引物OsBBX14qR1(5’-GCGCTGCACAGTAGCTTCAT-3’，SEQ ID NO：6)进行荧光定量PCR分析。同时用水稻内源翻译延伸因子基因作为荧光定量PCR分析的内参基因，其特异上游引物为OsEF-1aF(5’-TTTCACTCTTGGTGTGAAGCAGAT-3’，SEQ ID NO：7)，特异下游引物为OsEF-1aR(5’-GACTTCCTTCACGATTTCATCGTAA-3’，SEQ ID NO：8)。利用SYBR Premix Ex TaqTM PCR试剂盒(TaKaRa)进行荧光定量PCR反应。具体步骤如下：依次加入10μl 2×SYBR Premix Ex TaqTM、2.0μl cDNA模板、0.2μM基因特异性引物对，用RNase-free H2O补足反应体系为20μl。PCR反应条件是95℃预变性30秒；95℃变性30秒，60℃退火延伸30秒，40个循环。PCR反应结束后，分析各个样品的扩增曲线和溶解曲线以确定实验结果的可信度。然后用Excel通过2-△△Ct法处理荧光定量PCR获得的Ct值并计算标准误差，对最终处理结果作图。结果表明过表达株系中OsBBX14基因的转录本水平是非转基因水稻植株的50-150倍，从而证明OsBBX14基因已整合到水稻基因组中并且在水稻中大量表达(图2)。
实施例4：转OsBBX14基因水稻在大田处理条件下白叶枯病抗性增强
于5月中旬，将转基因植株和野生型植株用70％乙醇表面消毒1分钟；5％(活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次；16℃浸种36小时，37℃催芽24小时，播种于大田秧床上，保持水层生长30天后，水稻秧苗移栽到大田(株距15厘米，行距25厘米)，生长至抽穗期后，利用1个国际鉴定菌株(PXO99)，6个国内鉴定菌株(YN11、SCYC-6、YN17、FuJ、YN24、YN-1)对水稻进行接种鉴定，结果显示pCAMBIA1390-ubi-BBX14过表达转基因株系对上述菌株均表现为抗病，而非转基因株系表现为感病(如图3)。转基因株系病斑长度显著短于野生型水稻(如图4)。相同实验重复3次，结果表明，发现转基因阳性植株白叶枯病菌抗性较强(菌斑长度为野生型的一半左右)，而对应的野生型植株无白叶枯病抗性。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省水稻研究所
<120> 基因OsBBX14在提高水稻白叶枯抗性中的应用
<130> 0
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1134
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza sativa）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1134)
<223> 编码B-box型锌指蛋白的OsBBX14基因
<400> 1
atg tcg cct cct cct cca cca tat tac cac cac ctc ctc ctc ctc cgc 48
Met Ser Pro Pro Pro Pro Pro Tyr Tyr His His Leu Leu Leu Leu Arg
1 5 10 15
tcc tcg ccc acc acc act gga gga gga gct cgg gtt ctt gcc gcg gcg 96
Ser Ser Pro Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala Arg Val Leu Ala Ala Ala
20 25 30
gag ctc gca cgc atg aag cta ctg tgc agc gcg tgc gag gcg gcg gag 144
Glu Leu Ala Arg Met Lys Leu Leu Cys Ser Ala Cys Glu Ala Ala Glu
35 40 45
gcc agc gtc ctc tgc tgc gcc gac gag gcc gcc ctg tgc gcg cgc tgc 192
Ala Ser Val Leu Cys Cys Ala Asp Glu Ala Ala Leu Cys Ala Arg Cys
50 55 60
gac cgc gac atc cac gcc gcc aac cgc ctc gcc ggg aag cac ctc cgc 240
Asp Arg Asp Ile His Ala Ala Asn Arg Leu Ala Gly Lys His Leu Arg
65 70 75 80
ctc cct ctc ctc tcc ccc gcc tcc tcc tcc tcc tcc tcc gcc gcc gcc 288
Leu Pro Leu Leu Ser Pro Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ala
85 90 95
ctc gcg ccg ccg ccg ccg tcg ccg ccc aag tgc gac ata tgc cag gag 336
Leu Ala Pro Pro Pro Pro Ser Pro Pro Lys Cys Asp Ile Cys Gln Glu
100 105 110
agc cac gcg tac ttc ttc tgc ctc gag gac cgc gcg ctg ctg tgc cgg 384
Ser His Ala Tyr Phe Phe Cys Leu Glu Asp Arg Ala Leu Leu Cys Arg
115 120 125
agc tgc gac gtg gcg gtg cac acg gcc aac gcc ttc gtc tcc gcg cac 432
Ser Cys Asp Val Ala Val His Thr Ala Asn Ala Phe Val Ser Ala His
130 135 140
cgc cgt ttc ctc ctc acc ggc gtg cag gtc ggg cag gag cag gac gag 480
Arg Arg Phe Leu Leu Thr Gly Val Gln Val Gly Gln Glu Gln Asp Glu
145 150 155 160
cac tcc cct gac ccg cct gag ccg tct cct cct cct ccg ccg ccg ccg 528
His Ser Pro Asp Pro Pro Glu Pro Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
165 170 175
cct gca tcc aag agc gac cac ccg gcg ccg ctc tac ggc gag ggc gga 576
Pro Ala Ser Lys Ser Asp His Pro Ala Pro Leu Tyr Gly Glu Gly Gly
180 185 190
gga ggg ttc agc tgg gac gcc gcc gac tcg ccg gcc gcg ggc ggc ctc 624
Gly Gly Phe Ser Trp Asp Ala Ala Asp Ser Pro Ala Ala Gly Gly Leu
195 200 205
ccc gac tgg tcg gcc gtc gtc gac cag ttc ggc tcc ccg ccg ccg cgc 672
Pro Asp Trp Ser Ala Val Val Asp Gln Phe Gly Ser Pro Pro Pro Arg
210 215 220
cac acg gac acc gcg acc gtg acg acc ccg ccg ccg acc aag agg agc 720
His Thr Asp Thr Ala Thr Val Thr Thr Pro Pro Pro Thr Lys Arg Ser
225 230 235 240
cca cgc gcg ccg gcg ttc ggc ggc cag ggc ggc atg atg gat tgg ccc 768
Pro Arg Ala Pro Ala Phe Gly Gly Gln Gly Gly Met Met Asp Trp Pro
245 250 255
ctc ggc gag ttc ttc ggc ggc ttc acc gac ttc acc ggc ggc ttt ggc 816
Leu Gly Glu Phe Phe Gly Gly Phe Thr Asp Phe Thr Gly Gly Phe Gly
260 265 270
ttc ggc ttc ggc gac agt ggc acc tcc aag gct gac agc ggg aag ctg 864
Phe Gly Phe Gly Asp Ser Gly Thr Ser Lys Ala Asp Ser Gly Lys Leu
275 280 285
gga ggg agc acg gac ggc tcg ccg tac tac cgg tcg tca tcg gaa gat 912
Gly Gly Ser Thr Asp Gly Ser Pro Tyr Tyr Arg Ser Ser Ser Glu Asp
290 295 300
gac cgg aac gcc gac gag ctc ttc ggg cag gta cca gag atc cag tgg 960
Asp Arg Asn Ala Asp Glu Leu Phe Gly Gln Val Pro Glu Ile Gln Trp
305 310 315 320
tcg gtg ccg gag ctc ccc tcg ccg ccg acg gcc tcc ggc ctc cac tgg 1008
Ser Val Pro Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Ala Ser Gly Leu His Trp
325 330 335
caa cgc cat cca gcc gcc act cac ggc ggc ggc ggc ggc gga ccc gac 1056
Gln Arg His Pro Ala Ala Thr His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Asp
340 345 350
acc acc gcc ttc gtc ccc gac atc tgc tcc ccc gac agc tgc ttc ccg 1104
Thr Thr Ala Phe Val Pro Asp Ile Cys Ser Pro Asp Ser Cys Phe Pro
355 360 365
gcc acc acc tcc aaa cgc cgg agg caa taa 1134
Ala Thr Thr Ser Lys Arg Arg Arg Gln
370 375
<210> 2
<211> 377
<212> PRT
<213> 水稻（Oryza sativa）
<400> 2
Met Ser Pro Pro Pro Pro Pro Tyr Tyr His His Leu Leu Leu Leu Arg
1 5 10 15
Ser Ser Pro Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala Arg Val Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Glu Leu Ala Arg Met Lys Leu Leu Cys Ser Ala Cys Glu Ala Ala Glu
35 40 45
Ala Ser Val Leu Cys Cys Ala Asp Glu Ala Ala Leu Cys Ala Arg Cys
50 55 60
Asp Arg Asp Ile His Ala Ala Asn Arg Leu Ala Gly Lys His Leu Arg
65 70 75 80
Leu Pro Leu Leu Ser Pro Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ala
85 90 95
Leu Ala Pro Pro Pro Pro Ser Pro Pro Lys Cys Asp Ile Cys Gln Glu
100 105 110
Ser His Ala Tyr Phe Phe Cys Leu Glu Asp Arg Ala Leu Leu Cys Arg
115 120 125
Ser Cys Asp Val Ala Val His Thr Ala Asn Ala Phe Val Ser Ala His
130 135 140
Arg Arg Phe Leu Leu Thr Gly Val Gln Val Gly Gln Glu Gln Asp Glu
145 150 155 160
His Ser Pro Asp Pro Pro Glu Pro Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
165 170 175
Pro Ala Ser Lys Ser Asp His Pro Ala Pro Leu Tyr Gly Glu Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Phe Ser Trp Asp Ala Ala Asp Ser Pro Ala Ala Gly Gly Leu
195 200 205
Pro Asp Trp Ser Ala Val Val Asp Gln Phe Gly Ser Pro Pro Pro Arg
210 215 220
His Thr Asp Thr Ala Thr Val Thr Thr Pro Pro Pro Thr Lys Arg Ser
225 230 235 240
Pro Arg Ala Pro Ala Phe Gly Gly Gln Gly Gly Met Met Asp Trp Pro
245 250 255
Leu Gly Glu Phe Phe Gly Gly Phe Thr Asp Phe Thr Gly Gly Phe Gly
260 265 270
Phe Gly Phe Gly Asp Ser Gly Thr Ser Lys Ala Asp Ser Gly Lys Leu
275 280 285
Gly Gly Ser Thr Asp Gly Ser Pro Tyr Tyr Arg Ser Ser Ser Glu Asp
290 295 300
Asp Arg Asn Ala Asp Glu Leu Phe Gly Gln Val Pro Glu Ile Gln Trp
305 310 315 320
Ser Val Pro Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Ala Ser Gly Leu His Trp
325 330 335
Gln Arg His Pro Ala Ala Thr His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Asp
340 345 350
Thr Thr Ala Phe Val Pro Asp Ile Cys Ser Pro Asp Ser Cys Phe Pro
355 360 365
Ala Thr Thr Ser Lys Arg Arg Arg Gln
370 375
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 根据PCR反应要求设计，用于扩增构建OsBBX14基因植物表达载体所用DNA的
上游引物OsBBX14F
<400> 3
atggatccat gtcgcctcct cctccaccat atta 34
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 根据PCR反应要求设计，用于扩增构建OsBBX14基因植物表达载体所用DNA的
下游引物OsBBX14R
<400> 4
aactagttta ttgcctccgg cgtttggagg tg 32
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 根据荧光定量PCR反应要求设计，用于检测OsBBX14基因表达水平的特异性上
游引物OsBBX14qF1
<400> 5
tcctccacca tattaccacc a 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 根据荧光定量PCR反应要求设计，用于检测OsBBX14基因表达水平的特异性下
游引物OsBBX14qR1
<400> 6
gcgctgcaca gtagcttcat 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 根据荧光定量PCR反应要求设计，用于检测水稻内源翻译延伸因子基因（Os
EF-1a)表达水平的特异性上游引物OsEF-1aF
<400> 7
tttcactctt ggtgtgaagc agat 24
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 根据荧光定量PCR反应要求设计，用于检测水稻内源翻译延伸因子基因（Os
EF-1a)表达水平的特异性下游引物OsEF-1aR
<400> 8
gacttccttc acgatttcat cgtaa 25
Claims (2)
1.基因OsBBX14在提高水稻白叶枯病抗性中的应用，所述基因OsBBX14的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.基因OsBBX14在提高水稻白叶枯病抗性中的应用方法，其特征是，首先通过PCR方法，扩增出水稻品种日本晴的OsBBX14基因的全长编码区，然后正向连接在植物表达载体pCAMBIA1390-ubi上；再进行遗传转化至水稻中，提高OsBBX14基因的表达，得到OsBBX14基因表达增强的转基因水稻植株，所述基因OsBBX14的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911233041.4A CN110747203B (zh) | 2019-12-05 | 2019-12-05 | 基因OsBBX14在提高水稻白叶枯病抗性中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110747203A CN110747203A (zh) | 2020-02-04 |
| CN110747203B true CN110747203B (zh) | 2022-05-06 |
Family
ID=69285636
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911233041.4A Active CN110747203B (zh) | 2019-12-05 | 2019-12-05 | 基因OsBBX14在提高水稻白叶枯病抗性中的应用 |
Country Status (1)
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105255941B (zh) * | 2015-11-27 | 2018-09-21 | 山东省水稻研究所 | 基因OsBBX14在提高水稻干旱胁迫耐性中的应用 |
-
2019
- 2019-12-05 CN CN201911233041.4A patent/CN110747203B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105255941B (zh) * | 2015-11-27 | 2018-09-21 | 山东省水稻研究所 | 基因OsBBX14在提高水稻干旱胁迫耐性中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:002-118-C11, full insert sequence;AK106865.1;《GenBank》;20081204;全文 * |
| OsBBX14 delays heading date by repressing florigen gene expression under long and short-day conditions in rice;Bo Bai;《Plant Sci》;20160630;第247卷;第25-34页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110747203A (zh) | 2020-02-04 |
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |