CN103352038B - 一种玉米抗病相关基因mr4及其在玉米抗病改良中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种玉米抗病基因MR4、由其编码的蛋白质、表达载体及其应用；所述玉米抗病基因MR4的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；由其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；表达载体构建方法如下：将通用双元载体pTF102的多克隆位点切除，将其GUS基因上游的2×35S启动子换成玉米泛素基因启动子获得遗传转化载体；将玉米抗病基因MR4用限制性内切酶BamHI和KpnI消化后回收DNA片段；将DNA片段插入到遗传转化载体的限制性内切酶酶切位点。通过转化病害敏感玉米，可以获得超量表达玉米抗病基因MR4的转基因玉米，该转基因玉米具有较强抗真菌性病害的能力。

Description

一种玉米抗病相关基因MR4及其在玉米抗病改良中的应用

技术领域：

本发明属于植物分子生物学与植物基因工程技术领域，具体涉及一种玉米抗病相关基因MR4的克隆、植物表达载体的构建及其在玉米抗病改良中的应用。 

背景技术：

病害是制约粮食增产稳产的重要原因，据估计每年有30％的粮食减产是由病害造成的，因此控制病害是保证粮食增产和稳产的重要途径。传统的病害防治策略主要是通过杂交育种培育抗病品种，或者辅助施用化学农药及化学诱导剂的方法加以防治。植物的基因工程在近30多年的发展时间里显示出巨大的潜力，而利用基因工程开展抗病分子育种正呈现出广阔的前景。 

植物在长期遗传和变异过程中，形成了一套具有控制或抵御病原菌侵染的复杂的防卫系统，防卫系统的启动和功能性运转依赖抗病或抗病相关基因，以及防卫基因的高效表达。抗病及抗病相关基因的克隆对于培育抗病作物品种和研究病原物与寄主作用机制具有十分重要的意义。 

Npr1是拟南芥等多种植物参与防卫反应的转录因子，超量表达Npr1可以提高拟南芥等多种植物的抗病性(Cao et al.1998)；Pto(Tang et al.1999)、Cf-9(Hammond et al.1998)、Xa21（Wang et al.,1996）、N(Witham et al.1996)等抗病基因也相继被克隆和用于作物抗病基因工程中，但源于玉米的抗病基因研究进展缓慢，抗病基因工程相对薄弱。 

玉米是我国最主要粮食作物之一，在国民经济生产中占有举足轻重的地位。随着玉米产业的发展，玉米种植面积在不断扩大，而一些新老病害也交替或连年发生，从而影响了玉米的产量和品质，其中以玉米大/小斑病、圆斑病和弯孢 霉病等长孺孢菌引起的叶部病害尤为突出。分离玉米抗病或抗性相关基因，用于玉米基因工程进行辅助育种和抗性改良对有效控制玉米病害、提高玉米产量和改善玉米品质具有极其重要的意义。 

发明内容:

本发明要解决的一个技术问题是提供一种玉米抗病基因MR4，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。 

可以采用PCR技术，从已接种玉米大斑病菌的玉米的基因组、总mRNA或其反转录产物cDNA中扩增获得玉米抗病基因MR4或其部分核苷酸序列，也可以采用已经克隆的MR4基因或其部分有效片段作探针，从cDNA或基因组文库中筛选到玉米抗病基因MR4。该基因的开放阅读框（ORF）核苷酸长度为2727bp，编码一种由908个氨基酸组成的抗病类似蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。该基因编码的蛋白质包含LRR，NB-ARC和AAA-ATPase等抗病基因所特有的功能域。 

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种玉米抗病基因MR4表达载体。 

所述玉米抗病基因MR4表达载体通过下述方法构建：将通用双元载体pTF102的多克隆位点切除，再将其GUS基因上游的2×35S启动子换成玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子，获得遗传转化载体pTE102-M；将玉米抗病基因MR4用限制性内切酶BamHI和KpnI消化后回收包含MR4完整阅读框的DNA片段；将回收的DNA片段插入到遗传转化载体pTE102-M的限制性内切酶酶切位点。 

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种上述玉米抗病基因MR4在玉米抗病改良中的应用。 

利用分离得到的MR4基因或其有效部分连接到超量表达载体中，通过转化病害敏感玉米，可以获得超量表达MR4基因的抗病转基因玉米，该转基因玉米具有较强抗真菌性病害的能力。 

本发明要解决的第四个技术问题是提供一种通过超量表达MR4基因培育 抗病玉米的方法。 

附图说明:

序列表SEQ IDNO：1.本发明的玉米抗病基因MR4的核苷酸序列。 

序列表SEQ IDNO：2.本发明的玉米抗病基因MR4编码的蛋白质的氨基酸序列。 

图1.本发明的玉米抗病基因MR4编码的蛋白质及其功能域分布。 

图2.遗传转化载体pTF102-M的结构示意图。 

图3.转基因玉米植株与非转基因玉米植株玉米抗病基因MR4表达量检测结果示意图。 

具体实施方式:

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。 

实施例1：玉米抗病基因MR4的克隆 

本实验室前期研究发现：玉米接种大斑病菌前后其表达谱差异明显，因此，利用芯片技术我们实验室筛选到玉米抗感表达差异显著的一系列抗病相关EST序列，其中一个EST序列（SEQ ID NO：1），经在NBCI基因数据库BLAST比对分析，是一个抗病类似基因，命名为eMR4。对照现有玉米全基因序列和表达标签(EST)公共数据库（http://www.maizegdb.org/；http://www.maizesequence.org/index.html），最终我们从中查找到包含EST序列的MR4基因全长cDNA序列。MR4基因开放阅读框（ORF）核苷酸长度为2727bp，编码一种由908个氨基酸组成的抗病类似蛋白，编码的蛋白质包含LRR，NB-ARC和AAA-ATPase等抗病基因所特有的功能域（如图1所示）。 

根据MR4基因在数据库中的cDNA序列设计可以扩增全长ORF的一对引物fulMR4-F（5′-ATGGAATTCGTGGCGTCCAT-3′）；fulMR4-R：（5′-TCAGTGCAATGGGCGGAAC-3′）。为了方便于下一步载体构建，在引物5′-端添加限制性内切酶酶切位点（序列为gcggatcc），得到下一步PCR方法扩 增获得玉米抗病基因MR4所用一对引物fulMR4-F（5′-gcggatccATGGAATTCGTGGCGTCCAT-3′）fulMR4-R：（5′-gcggtaccTCAGTGCAATGGGCGGAAC-3′）。 

剪取在温室生长至5-6叶期、且已接种玉米大斑病菌（该玉米大斑病菌分离于吉林省的高致病力菌株，该菌株命名为JL-S24）3天的B73（其全基因组序列已公布）玉米叶片，用UNIQ-10Trizol mRNA抽提试剂盒（上海生工生产）提取总RNA，使用oligo(dT)15寡聚引物和M-MLV反转录酶(美国Promega公司生产)进行反转录，以反转录产物为模板，利用引物fulMR4-F（5′-gcggatccATGGAATTCGTGGCGTCCAT-3′）fulMR4-R：（5′-gcggtaccTCAGTGCAATGGGCGGAAC-3′），通过PCR方法扩增获得玉米抗病基因MR4。 

实施例2：玉米抗病基因MR4超量表达载体的构建与玉米转化 

本发明所用载体是在通用双元载体pTF102基础上改造得到的遗传转化载体。首先将原通用双元载体pTF102的多克隆位点切除，再将GUS上游的2×35S启动子换成玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子，得到遗传转化载体，命名为pTE102-M(如图2所示)。玉米转化后玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子所驱动基因能够稳定且高效表达。将实施例1所克隆的玉米抗病基因MR4用限制性内切酶BamHI和KpnI消化后回收包含玉米抗病基因MR4完整阅读框的DNA片段，将该DNA片段连接到用相同酶酶切的pTF102-M载体（该载体回收后切去GUS部分的剩余载体），得到玉米抗病基因MR4表达载体pTF102-MR。 

通过PCR和酶切鉴定进行确认，包含玉米抗病基因MR4完整阅读框的DNA片段插入在pTE102-M的限制性内切酶酶切位点，测序显示其核苷酸序列正确。 

实施例3：农杆菌介导的玉米遗传转化与鉴定 

通过表达MR4基因培育抗病玉米的方法，具体如下： 

常规种植玉米自交系(命名为H99），当开花期处于雌穗抽丝前进行套袋隔离，并人工协助自交授粉。授粉后继续套袋隔离，从第一次授粉开始，分别在24小时和48小时再次授粉，取下整穗玉米放入75%酒精中消毒5min，无菌蒸馏水冲洗3遍后，无菌环境吹干，用无菌刀片剥离下完整幼胚，进一步用75%酒精和0.1%升汞消毒，无菌水洗净后吹干。用农杆菌介导的方法将实施例2得到的玉米抗病基因MR4表达载体pTF102-MR导入吹干的幼胚。转化的未成熟胚在20-25℃黑暗共培养3天(MS培养基+AS（100umol/L))，再在新鲜培养基(MS培养基+AS（100umol/L))中继续暗培养7天后，转到含1.5mg/LBialaphos除草剂的MS固体培养基中28℃筛选培养，15-20天后用3.0mg/L的Bialaphos进行2次筛选，筛选出的幼胚长到三叶期时将苗移至大盆中，在培养室中炼苗3-5天后移入温室内，进行正常的管理，最后得到转基因玉米。转基因玉米的自交后代，可以采用300-500mg/L浓度的除草剂进行喷施筛选。 

利用PCR检测法进行分子鉴定，阳性对照为质粒PTF102-MR，阴性对照为未转基因植株DNA和水： 

以Bar基因序列设计引物，上游引物Bar-F（5′-CAGGAACCGCAGGAGTGGA-3′），下游引物Bar-R（5′-CCAGAAACCCACGTCATGCC-3′）。反应体系为：10mmol/LdNTP Mixture，0.5μL；10×PCR buffer，2.5μL；上下游引物各1μL（10μmol/mL）；模板DNA（阳性对照的模板DNA为转基因玉米DNA，阴性对照的模板DNA为非转基因植株的DNA和水），1μL；Ex-Taq，0.2μL(5U)；ddH2O，18.8μL；扩增程序为：94℃预变性3分钟，然后(1)94℃，变性50秒；(2)59℃，退火50秒；(3)72℃，延伸55秒；(4)循环30次；(6)72℃延伸10分钟。通过上述方法初步证明玉米抗病基因MR4已转入玉米基因组中。 

实施例4：超量表达玉米抗病基因MR4的抗病分析 

采用农杆菌介导方法将pTF102-MR导入玉米自交系H99。本发明共获得经分子鉴定确认的独立转化植株11株。取11株转基因玉米和非转基因玉米H99的同叶位叶片，离体接种大斑病菌JL-S24菌株的叶片。与野生型非转基因H99的叶片相比，根据病原侵染受害面积占整个叶片的百分数，所有的阳性遗传转化植株的抗性显著增强（见表1）。说明玉米抗病基因MR4在抗大斑病等真菌性病害育种中具有应用潜力。 

表1.阳性遗传转化植株与阴性野生型非转基因植株的抗性对照表 

表1中，MR4-3、MR4-5……、MR4-22为阳性遗传转化植株，WT为阴性野生型植株。 

为进一步验证遗传转化植株的抗病能力增强是否与转入玉米抗病基因MR4引起的超量表达量有关，本发明用玉米肌动蛋白(actin)基因为标准，采用real-timePCR技术检测了部分实施例3得到遗传转化植株中玉米抗病基因MR4的表达量。具体方法如下： 

取5μg无DNA污染的转基因玉米总RNA，用oligo(dT)寡聚引物和M-MLV反转录酶(美国Promega公司)进行反转录；然后采用Green PCR Master Mix试剂盒(大连Takara公司)，在ABI7500Real-TimePCRsystem(美国Applied Biosystems公司)仪器上进行实时定量PCR（qRT-PCR）反应；其中qRT-PCR引物是MR4-F(5′-CGATGCTGAGCGGATTTCTTT-3′)和MR4-R(5′-GAAGCAAGAACCGCAGAGTC-3′)。同时，取5μg无DNA污染的 玉米肌动蛋白(actin)基因，采用Green PCR Master Mix试剂盒(大连Takara公司)，在ABI7500Real-Time PCR system(美国Applied Biosystems公司)仪器上进行实时定量PCR（qRT-PCR）反应，其中qRT-PCR分析中的引物是A-F(5′-GCATCACACCTTCTACAACGA-3′)和A-R(5′-CATTAGGTGGTCGGTGAGGT-3′)。结果显示，玉米抗病基因MR4的超量表达与玉米抗病性呈正相关(图3和表2所示)，因此，玉米抗病基因MR4是玉米抗病基因工程的优良基因材料。 

植株	MR4-3	MR4-7	MR4-11	MR4-19	WT
						叶片平均坏死面积（%）	11	14	18	9	43

表2中，MR4-3、MR4-7……、MR4-19为阳性遗传转化植株，WT为阴性野生型植株。 

Claims (1)

1.一种通过超量表达玉米抗病基因MR4培育抗大斑病玉米的方法，包括下述步骤：取常规种植玉米自交系，当其开花期处于雌穗抽丝前进行套袋隔离，并人工协助自交授粉；授粉后继续套袋隔离，从第一次授粉开始，分别在24小时和48小时再次授粉，取下整穗玉米放入75％酒精中消毒5min，无菌蒸馏水冲洗3遍后，无菌环境吹干，用无菌刀片剥离下完整幼胚，进一步用75％酒精和0.1％升汞消毒，无菌水洗净后吹干；用农杆菌介导的方法将玉米抗病基因MR4表达载体pTF102-MR导入吹干的幼胚；转化的未成熟胚在20-25℃黑暗共培养3天，所用培养基为MS培养基+100umol/LAS，再在新鲜的上述培养基中继续暗培养7天后，转到含1.5mg/L Bialaphos除草剂的MS固体培养基中28℃筛选培养，15-20天后用3.0mg/L的Bialaphos进行2次筛选，筛选出的幼胚长到三叶期时将苗移至大盆中，在培养室中炼苗3-5天后移入温室内，进行正常的管理，最后得到转基因玉米；所述玉米抗病基因MR4表达载体pTF102-MR的构建方法如下：将通用双元载体pTF102的多克隆位点切除，再将其GUS基因上游的2×35S启动子换成玉米泛素基因启动子，获得遗传转化载体pTE102-M；将玉米抗病基因MR4用限制性内切酶BamHI和KpnI消化后回收包含MR4完整阅读框的DNA片段；将该DNA片段连接到用相同酶酶切的pTF102-M载体，得到玉米抗病基因MR4表达载体pTF102-MR；

所述玉米抗病基因MR4核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。