CN117069816A

CN117069816A - 一种玉米ZmBAG1基因及其应用

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Publication number: CN117069816A
Application number: CN202311273439.7A
Authority: CN
Inventors: 张楠; 李小凤; 李高科; 李余良; 卢文佳
Original assignee: CROP Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2023-09-28
Filing date: 2023-09-28
Publication date: 2023-11-17

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种玉米ZmBAG1基因及其应用。本发明公开了一个玉米抗丝黑穗病相关基因ZmBAG1及其应用。本发明将玉米ZmBAG1基因在抗丝黑穗自交系‘黄早四R’中将ZmBAG1过表达，抗性减弱。利用CRISPR‑Cas9将感病自交系‘黄早四’中的ZmBAG1进行基因编辑后，抗性明显增强。本发明为玉米丝黑穗病抗性机制研究提供了重要的理论支持，同时为玉米抗丝黑穗病育种提供了新基因，具有广阔的应用前景。

Description

一种玉米ZmBAG1基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种玉米ZmBAG1基因及其应用。

背景技术

玉米生长过程中面临多种生物与非生物胁迫，是玉米生产的主要限制因素，其中丝黑穗病是严重影响玉米生产的病害之一。丝黑穗病是一种由丝轴黑粉菌(Sporisoriumreilianum)引起的一种绝产性的土传病害，发病植株的果穗被大量的黑粉孢子占据，导致绝收。据估计，感病率每增加1％，每公顷玉米减产约100公斤。玉米一般多年连作，使得土壤中菌量持续增加，病害日益严重，减轻玉米丝黑穗病的危害已刻不容缓。

丝轴黑粉菌由玉米地中茎组织侵入，入侵后释放大量的效应因子攻击植物的免疫系统，使其以活体营养型的形式在玉米植株内扩展，直到玉米进入开花期，丝轴黑粉菌杀死细胞，进入坏死营养型阶段，产生黑粉孢子进入下一年的侵染循环。丝黑穗病的抗性由为多基因控制的数量性状，玉米的10条染色体上均定位到丝黑穗病抗性的QTL，其中Zuo等在2号染色体克隆到了一个抗玉米丝黑穗病的主效QTL基因ZmWAK，可提高20～40％的抗病性(Zuo,W.,Chao,Q.,Zhang,N.et al.A maize wall-associated kinase confersquantitative resistance to head smut.Nat.Genet.2015.47：151-157.)。该基因编码了一个跨膜的激酶，在玉米地中茎处高表达。病原菌侵染后，ZmWAK诱导细胞发生类凋亡，限制了菌丝进一步在植株内扩展，使其不能通过地中茎进入茎尖分生组织，从而提高了玉米的抗病性。

植物中存在着广泛的BAG(Bcl-2associated athanogene)蛋白，是一类可被泛素化的分子伴侣，该蛋白通过调控类凋亡过程来影响植物对生物以及非生物胁迫的抗性。香蕉中的BAG1基因过表达后可提高对香蕉枯萎病(Fusarium wilt)的抗性。水稻中OsBAG4蛋白积累增加，出现PCD的现象，对于水稻白叶枯病病原菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)以及水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的抗性同时得到了提高。番茄SlBAG2和SlBAG5b参与了叶片衰老的调控，过表达SlBAG9植株对盐胁迫和干旱胁迫更敏感。烟草NtBAG5可与Hsp70和Hsp20互作，影响叶片的衰老。丝轴黑粉侵染抗病材料‘黄早四R’后出现了类凋亡现象，BAG家族中ZmBAG1的表达量显著下降了20倍。说明ZmBAG1参与了丝黑穗病的抗性。BAG蛋白在玉米抗病过程中的作用未见报道，本发明为玉米利用ZmBAG1进行抗病育种提供理论支持，具有重要的理论意义和潜在的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一个与玉米丝黑穗病抗性相关的基因ZmBAG1及其应用。该基因编码一个分子伴侣，亚细胞定位于线粒体。本发明发现，在抗病自交系‘黄早四R’中过表达ZmBAG1基因可显著降低丝黑穗病的抗性。对感病自交系‘黄早四’中的ZmBAG1进行基因编辑，对丝黑穗病的抗性显著增加。因此，ZmBAG1可作为应用于玉米抗丝黑穗病育种和品种改良，为玉米抗丝黑穗病育种提供更多选择。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种玉米ZmBAG1基因，所述玉米ZmBAG1基因的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。

优选的，所述玉米ZmBAG1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的，所述玉米ZmBAG1基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了所述的玉米ZmBAG1基因在培育抗丝黑穗病品种中的应用。

本发明还提供了一种表达载体，包括初始载体和权利要求1～3任一项所述的玉米ZmBAG1基因。

本发明还提供了一种宿主，转化或转染有如权利要求5所述的表达载体；所述宿主为微生物。

本发明还提供了所述的表达载体、所述的宿主在培育抗丝黑穗病品种中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明公开了一个玉米抗丝黑穗病相关基因ZmBAG1及其应用。ZmBAG1在线粒体中表达，为一种可被泛素化的分子伴侣，通过调控类凋亡过程来影响玉米对丝黑穗病的抗性。其具有SEQ ID NO：1所示的DNA序列，SEQ ID NO：2所示的cDNA序列。其编码蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。在抗丝黑穗自交系‘黄早四R’中将ZmBAG1过表达，抗性减弱。利用CRISPR-Cas9将感病自交系‘黄早四’中的ZmBAG1进行基因编辑后，抗性明显增强。本发明为玉米丝黑穗病抗性机制研究提供了重要的理论支持，同时为玉米抗丝黑穗病育种提供了新基因，具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为ZmBAG1全长cDNA的扩增图(注：图左Marker为DL2000)。

图2为ZmBAG1的表达水平变化(绿色为未接种丝轴黑粉菌；黄色为接种了丝轴黑粉菌)。

图3为ZmBAG1的亚细胞定位(注：绿色为ZmBAG1的亚细胞定位，红色为线粒体标记，紫色为叶绿体；bar＝10μm)。

图4为过表达阳性和阴性植株的表型差异(过表达阳性(左)和阴性植株(右)的表型差异)。

图5为基因编辑植株的阳性和感病自交系的表型差异(基因编辑植株的阳性(左)和感病自交系(右)的表型差异)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

ZmBAG1序列和表达模式研究

1.本实验前期对抗感材料‘黄早四’和‘黄早四R’(Cytological and MolecularCharacterization ofZmWAK-Mediated Head-Smut Resistance in Maize)接种丝轴黑粉菌后的表达组学进行检测，发现‘黄早四R’中ZmBAG1的表达量显著下降了20倍(图2)。该基因具有抗凋亡的功能，而‘黄早四R’的抗性反应来自于细胞发生了类凋亡。由此可以推测，ZmBAG1表达量的降低可解除对细胞凋亡的抑制，使细胞发生类凋亡，从而限制了菌丝的进一步侵染。鉴此，本发明以ZmBAG1为对象，对ZmBAG1的表达的变化是否引起了丝黑穗病的抗性进行研究。ZmBAG1的核苷酸序SEQ ID NO：1如下：

CCAGTCCCGGCACACCGGCAGCGACCAGCCAGTGATCGACCGAGGCAGATACTGACTAGGAGCAGAGAGCAGCGGAGATGGTGAAGATTCCGAGCCCCAGGAGGCTGTTCAGGAGCCGGTCCAGGAGCACCACCATCATCGGCGGCGGCGGCGCGGACATCTGCGCCATGGTCGCCGAGCACGAGAGGATCGAGTGGGAGGTGCGGCCCGGCGGGATGCTGGTGCAGAAGCGGCGCTCGACGGAGGACGACGCGGCGGCGGCCGTGGAGTACATCCTGGTGAGAGTCTCCACCACCGGGTGGCAGTGGCACGACGTCTCCATCGACGCCACCGCAACCTTCGGTACGTCCGCCGTCGTCCTTCTGTACTGTACTGCATTGCGTTGCGTTGCGTGCTGCCTGCAATCTGCATGCTCTCCATTGTCCCTGCTGCTGCTCCCTCTGCGACCATATCCCTCTGTTCGCTAAGCTGCGTCTGATGATGATGATCCAACAACCCAATGCAGGCGACCTGAAGGTGATGCTGTCGCTGGCGACCGGGCTGTGGCCCAGGGAGCAGAGGCTGCTGTACAGGGGCAAGGAGAGGGACGACTGCGAGCACCTGCACATGGTGGGGGTCCAGGACAAGGACAAGGTGCTGCTCCTGGAGGACCCGGCCGTCAAGGAGAGGAAGCTCAGGTCAACCACCTTGGCGCAGCTCATGGGCGTGCCCTGTCACTCCTTCATCCAAGTGTAGAGAGAAACCCCCGGGGAATATTTCTTGCCATTTTTCTCCCGTCTCGTCGTCGTCGTTCTCCAATTTGCCTGCGTGAGCGAAGGGTTTCAGTCCAGTCTAACCGCGTTTGTTCAGAGCCTGCTGAGTTCCATCTCAGGGCTTGAATTCGGCCAATCGAATCAAGACAGTCGCAAACGATAGGATATAAAGATGATGGATACATGGCGTAAATTACTGTGAACGGGTACGTAATGTCATCCCAGTGCCAGTGTGCGTGAGCCAGTAGTTCTTTGGTTCCTTGCTCTGTATATATTCTCTCTTTTTTTTTCTTCCTGAGATCAGCAAAACAGTTCGGAATTCAATAGATGCTGCTGTAAATCCCTTGTCTTTTTTCCACGGAATGCAGCCCCCTTTTCTAGTA

2.获得ZmBAG1全长cDNA序列SEQ ID NO：2(图1)如下：ATGGTGAAGATTCCGAGCCCCAGGAGGCTGTTCAGGAGCCGGTCCAGGAGCACCACCATCATCGGCGGCGGCGGCGCGGACATCTGCGCCATGGTCGCCGAGCACGAGAGGATCGAGTGGGAGGTGCGGCCCGGCGGGATGCTGGTGCAGAAGCGGCGCTCGACGGAGGACGACGCGGCGGCGGCCGTGGAGTACATCCTGGTGAGAGTCTCCACCACCGGGTGGCAGTGGCACGACGTCTCCATCGACGCCACCGCAACCTTCGGCGACCTGAAGGTGATGCTGTCGCTGGCGACCGGGCTGTGGCCCAGGGAGCAGAGGCTGCTGTACAGGGGCAAGGAGAGGGACGACTGCGAGCACCTGCACATGGTGGGGGTCCAGGACAAGGACAAGGTGCTGCTCCTGGAGGACCCGGCCGTCAAGGAGAGGAAGCTCAGGTCAACCACCTTGGCGCAGCTCATGGGCGTGCCCTGTCACTCCTTCATCCAAGTGTAG

3.该基因编码蛋白质序列为SEQ ID NO：3如下：

MVKIPSPRRLFRSRSRSTTIIGGGGADICAMVAEHERIEWEVRPGGMLVQKRRSTEDDAAAVEYILVRVSTTGWQWHDVSIDATATFGDLKVMLSLATGLWPREQRLLYRGKERDDCEHLHMVGVQDKDKVLLLEDPAVKERKLRSTTLAQLMGVPCHSFIQV

4.检测抗丝黑穗自交系‘黄早四R’和感病自交系‘黄早四’中ZmBAG1的表达变化。采用菌土覆盖的方法来模拟丝黑穗病的真实病害循环，覆盖营养土的处理为未接种的对照。具体接种方法如下：

(1)玉米种子在灭菌的ddH₂O中浸泡过夜。

(2)种子过夜吸涨后用2％NaClO浸泡30min消毒。

(3)去掉NaClO消毒液，用灭菌的ddH₂O清洗5次，洗掉种子表面残留的NaClO。

(4)营养土与蛭石按照1：1的比例混合，混合后121℃，20min高温灭菌。

(5)取黑粉孢子与部分灭菌后的混合培养土按照0.2％(w/w)的比例进行混合。播种前，黑粉孢子按0.1％(w/w)的比例与细土混合配成菌土。

(6)将消毒后的种子播种于灭菌后的培养土中，在种子表面覆盖菌土后覆盖培养土。将种子放入光照培养箱进行培养。培养温度28℃，光照16h，暗培养8h。

5.将‘黄早四’和‘黄早四R’种子播下7天后，取地中茎，使用TianGen公司的植物RNA提取试剂盒提取RNA。

6.使用Transgen的Easy Script First-Strand cDNA试剂盒，将提取的RNA反转录成cDNA。

7.根据6中cDNA序列，设计Realtime PCR引物

SEQ ID NO：4：ACATCCTGGTGAGAGTCTCC；

SEQ ID NO：5：CACCTTGTCCTTGTCCTGGA；

将反转录的cDNA稀释，使用Takara公司SYBGreen mix进行Realtime-PCR扩增反应体系如下表1所示：

表1

结果如图2所示。

8.根据6中cDNA序列，引物两侧加入EcoRI和BamHI酶切位点序列；

SEQ ID NO：6：AAGCTTATGGTGAAGATTCCGAGCCC；

SEQ ID NO：7：GAATTCCCACTTGGATGAAGGAGTGA

扩增ZmBAG1全长(去掉终止密码子)链接NL载体，导入玉米原生质体。在荧光显微镜下对该基因的亚细胞定位结果进行观察，结果如图3所示。ZmBAG1定位在线粒体中。

玉米原生质体制备和转化步骤如下：

(1)培养‘黄早四’黄化苗，直至第二片完全展开且高出第一片叶约8～10cm。

(2)取第二片叶中间6～8cm部位，用刀片切成约0.5～1mm的长条，用镊子将叶片长条两面浸润酶液(1％纤维素酶R-10，0.2％离析酶M-10，0.4M甘露醇，20mM KCl，20mM Mes)后，将其浸泡在酶解液中。

(3)将所有细条收集到酶液后，抽真空0.5h，使酶液能够有效渗透进入叶片细条中。

(4)室温下酶解3h，期间用摇床轻轻摇晃酶液，观察酶切状态，当细条似溶解时停止酶解。

(5)用W5溶液润洗35μm尼龙膜，将原生质体过滤到50ml的圆底离心管中。

(6)100g离心2min，小心吸走酶液。

(7)沿离心管壁小心加入6mlW5溶液重悬细胞，100g离心2min，小心吸去上层溶液。

(8)加入适量的W5溶液重悬，将原生质体细胞放置于冰上30min，吸取一部分原生质体于血球计数板上计数。同时使用5％的BSA润洗细胞培养板，并在每个孔中加入1mlWI溶液。

(9)100g离心2min，小心吸去上层溶液，加入适量MMG溶液重悬原生质体细胞，使其终浓度在1～2×10⁵/ml。

(10)向2ml离心管底部加入10μl质粒DNA(10～20μg)，向管中加入100μl原生质体，轻弹混匀。

(11)向转化体系中加入110μlPEG/Ca²⁺溶液，轻轻混匀，25℃静置15min进行转化。

(12)加入400μlW5溶液，轻柔颠倒混匀，终止转化反应。

(13)100g离心2min，此时原生质体沉淀在离心管底部，尽量弃去上清，小心不要吸到原生质体细胞。

(14)加入100μlWI溶液重悬原生质体，将重悬后的原生质体转移至细胞培养板中，轻摇混匀。

(15)25℃，暗培养过夜后，在荧光显微镜下观察。

实施例2

ZmBAG1过表达植株及其表型鉴定

1.ZmBAG1过表达载体的构建与转化，具体步骤如下：

(1)以‘黄早4R’cDNA为模板

SEQ ID NO：8：ATGGTGAAGATTCCGAGCCC

SEQ ID NO：9：CTACACTTGGATGAAGGAGT；

引物组合扩增cDNA全长。

(2)Xcm I酶切pBCXUN载体，暴露出载体中的T。

(3)将PCR产物及酶切后的pBCXUN载体在1％琼脂糖凝胶中进行检测，切割目的条带，回收产物。

(4)将回收产物16℃过夜连接。连接产物转化大肠杆菌，用载体上特异的引物(5ˋ-TTTTAGCCCTGCCTTCATACGC-3ˋ(SEQ ID NO：22)和5ˋ-AGACCGGCAACAGGATTCAATC-3ˋ(SEQ IDNO：23))进行扩增，阳性克隆测序，注意PCR产物连接方向，保证蛋白正确翻译。

(5)阳性克隆提质粒，转化EHA105农杆菌感受态，侵染玉米‘黄早四R’幼胚。

2.阳性植株的鉴定：利用引物

SEQ ID NO：10：CCCTGTCACTCCTTCATCCA

SEQ ID NO：11：GCTTCTCGTTGGGGTCTTTG

组成的引物对1.中转基因植株进行鉴定。将阳性、阴性植株分成两组，采用实施例1相同的菌土覆盖法接种转基因植株。

3.转基因阳性和阴性植株播种7天后，将植株从土中挖出，观察地中茎表型变化。取茎尖分生组织，使用TianGen公司的植物RNA提取试剂盒提取RNA。

4.使用Transgen的Easy Script First-Strand cDNA试剂盒，将提取的RNA反转录成cDNA。

5.利用病原菌检测引物

SEQ ID NO：12：CACACTGTCCCCATCTACGA

SEQ ID NO：13：TCTCCTTCTGCATACGGTCC；

组成的引物对茎尖分生组织的cDNA进行PCR扩增，所述PCR体系和步骤如下表2和表3所示。确定转基因阳性和阴性植株的茎尖分生组织侵染率。

表2 PCR体系

表3 PCR步骤

扩增完成后用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，经检测转基因阳性植株的茎尖侵染率为47％～65％，阴性植株的茎尖侵染率为24～30％。比阴性植株高23～35％(图4；茎尖侵染率代表着感病程度，阳性植株感病率高)。

实施例3

ZmBAG1基因编辑植株及其表型鉴定

1.基因编辑载体的构建与转化

(1)登录E-CRISP网站(http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)筛选ZmBAG1可用的靶点。候选靶位点在Cas-OFFinder(http：//www.rgenome.net/cas-offinder/)网站评估脱靶情况。最终确定以

SEQ ID NO：14：GCTCCTGAACAGCCTCCTG为靶序列。

(2)合成引物

SEQ ID NO：15：AATAATGGTCTCAGGCGGCTCCTGAACAGCCTCCTG

SEQ ID NO：16：ATTATTGGTCTCTAAACCGCTTCTTGGTGCCG

SEQ ID NO：17：GGCTCCTGAACAGCCTCCTGTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

(3)PCR扩增：以稀释100倍的pCBC-MT1T2为模板进行三引物PCR扩增。

(4)纯化回收PCR产物，建立如下表4所示的酶切-连接体系(restriction-ligation)：

表4酶切-连接体系

(5)取5μl转化大肠杆菌感受态。Kan板筛选。

SEQ ID NO：18：GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC；

SEQ ID NO：19：CTCACAAATTATCAGCACGCTAGTC

菌落PCR鉴定。

(6)阳性克隆提质粒转化EHA105农杆菌感受态细胞，侵染玉米幼胚获得基因编辑植株。

2.基因编辑植株表型鉴定：利用引物

SEQ ID NO：20：TGATCGACCGAGGCAGATAC

SEQ ID NO：21：ACCTCCCACTCGATCCTCTC

组成的引物对转基因植株进行鉴定。获得基因编辑后植株，采用实施例1相同的菌土覆盖法接种转基因植株。

3.转基因阳性和阴性植株播种7天后，将植株从土中挖出。取茎尖分生组织，使用Tian Gen公司的植物RNA提取试剂盒提取RNA，

4.使用Transgen的Easy Script First-Strand cDNA试剂盒，将提取的RNA反转录成cDNA；

5.利用病原菌检测引物

SEQ ID NO：12：CACACTGTCCCCATCTACGA

SEQ ID NO：13：TCTCCTTCTGCATACGGTCC

组成的引物对茎尖分生组织的cDNA进行PCR扩增，所述PCR体系和步骤如表5和表6所示。确定转基因阳性和阴性植株的茎尖分生组织侵染率。

表5 PCR体系

表6 PCR步骤

扩增完成后用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，发现基因编辑植株茎尖侵染率为14～26％，未编辑植株茎尖侵染率为42～67％，基因编辑后丝黑穗病抗性提高了28～41％(图5)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种玉米ZmBAG1基因，其特征在于，所述玉米ZmBAG1基因的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。

2.根据权利要求1所述的一种玉米ZmBAG1基因，其特征在于，所述玉米ZmBAG1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1或2所述的一种玉米ZmBAG1基因，其特征在于，所述玉米ZmBAG1基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.权利要求1～3任一项所述的玉米ZmBAG1基因在培育抗丝黑穗病品种中的应用。

5.一种表达载体，其特征在于，包括初始载体和权利要求1～3任一项所述的玉米ZmBAG1基因。

6.一种宿主，其特征在于，转化或转染有如权利要求5所述的表达载体；所述宿主为微生物。

7.权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的宿主在培育抗丝黑穗病品种中的应用。