CN106929516A

CN106929516A - 黄瓜CsDIR16基因及其在降低植物霜霉威农药残留中的应用

Info

Publication number: CN106929516A
Application number: CN201710134469.8A
Authority: CN
Inventors: 辛明; 秦智伟; 刘春红; 周秀艳
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2017-03-08
Filing date: 2017-03-08
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2037-03-08
Also published as: CN106929516B

Abstract

本发明公开了一种黄瓜CsDIR16基因及其在降低植物霜霉威农药残留中的应用，所述黄瓜基因CsDIR16的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，CsDIR16全长588bp，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，共编码195个氨基酸，属于Dirigent‑like protein家族。本发明利用农杆菌介导的遗传转化方法转化黄瓜，获得转基因植株经生物学功能验证，表明本发明所克隆的CsDIR16基因或其编码的蛋白质具有降低植物霜霉威农药残留的功能，进而减少农药的投入，降低农业生产成本，促进农业产业高效发展，为实施绿色农业、有机农业提供新的遗传资源。

Description

黄瓜CsDIR16基因及其在降低植物霜霉威农药残留中的应用

技术领域

本发明属于基因工程应用技术领域，涉及黄瓜CsDIR16基因及其在降低植物霜霉威农药残留中的应用。

背景技术

黄瓜作为世界蔬菜生产的重要栽培作物，因其味道清香、口感爽脆，深受人们喜爱，在市场消费中占有重要地位。然而黄瓜在生产过程中经常受到多种病害和虫害的危害，严重影响产量或者品质，其中黄瓜霜霉病的影响最为严重。霜霉威（propamocarb，PM）是一种可以有效控制黄瓜霜霉病的杀菌剂，主要以喷施方式进行防治，病害得到防治的同时，也会使霜霉威在黄瓜体内产生残留。近年来，随着生活质量的提高，人们越来越重视食品安全问题，尤其是农药残留。因此，黄瓜低农药残留性的研究，不仅可以有效减少农药使用量，降低生产成本，减少对环境的污染，还能更好地防止对人体健康的危害。

Dirigent蛋白最早是由Davin等在金钟连翅(Forsythia intermedia)中发现的，属于引导蛋白，可以捕获木质素单体的自由基，指导其形成多聚的木质素和寡聚的木酚素。木酚素可钝化破坏病原菌的膜系统、某些酶类以及细胞毒素，降低病原菌对植物细胞的毒害作用，还可以限制水分和营养的摄入杀死病原菌；木质素则可以强化植物细胞壁的木质化程度，增加细胞壁的机械强度，进而抑制植物病原菌的侵染。迄今为止，DIR蛋白对木酚素的立体选择性形成的作用仅在DIR-a类成员中得到体外实验的直接验证，主要在植物防御和抵抗昆虫和病原体侵害方面发挥作用，当植物被病原菌感染后，在感染部位的周围发生迅速的木质化反应，加强植物细胞壁的强度，抵御病原菌分泌的酶类物质的降解反应，增加植物细胞壁抗酶溶的能力阻止病原菌的入侵。DIR 基因不仅响应生物胁迫，还能快速响应干旱、高温、冷害以及高盐等非生物胁迫，且受到乙烯、ABA（脱落酸）、H₂O₂、SA（水杨酸）等的调控，说明DIR家族基因在抗逆方面具有普遍功能。响应非生物胁迫的DIR基因多数都属于DIR-b/d亚家族，复苏植物牛耳草中BhDIR1（DIR-b）快速地响应干旱、高温、冷害胁迫所诱导快速上调表达，受到乙烯，ABA，CaCl₂，EGTA，H₂O₂，SA 的调控。甘蔗中ScDir（DIR-d）在甘蔗应答干旱、高盐和氧化等非生物胁迫时起积极的作用，对H₂O₂的响应比较迅速。植物DIR基因应对环境因子的应答涉及到信号通路和应激反应，但其对非生物胁迫的响应机制仍然了解的还不多。

DIR转运蛋白基因在植物解毒代谢中起着重要的作用，参与多种抗逆反应，但是对于Cs DIR16降低植物体内霜霉威残留量的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是从黄瓜（Cucumis sativus L.）中分离、克隆得到一个霜霉威诱导上调表达的CsDIR16基因，然后将该基因导入到黄瓜中，通过对CsDIR16基因在霜霉威胁迫下的研究，发现过量表达CsDIR16基因，增强了转基因黄瓜对霜霉威胁迫的抗性，并有效的降低了转基因黄瓜中霜霉威的残留量。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明以低霜霉威残留黄瓜品系D9320果实的cDNA为模板，以下述引物进行扩增：

正向引物：5′-ATGGCTGGAATCTCTCCAAT-3′；

反向引物：5′- TCAATAATGAAGCACGTAAATGTTA-3′；

得到黄瓜基因CsDIR16，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，CsDIR16全长588bp，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，共编码195个氨基酸，属于Dirigent-like protein家族。预测该蛋白的分子式为C₉₇₇H₁₅₁₅N₂₅₉O₂₇₇S₇，分子量为21545.7，理论等电点为9.36，负电荷残基 (Asp+Glu)总数为16个，正电荷残基 (Arg+Lys)总数为20个。预测该蛋白不稳定系数（Instability index）为32.41，是一个稳定蛋白（稳定系数﹤40 时稳定）。脂肪系数（Aliphatic index，计算球状蛋白脂肪族氨基酸侧链所占相对体积，反应了蛋白的热稳定性）为86.56。总平均亲水性（Grand average of hydropathicity，GRAVY）为0.038，为弱疏水性蛋白(负值为亲水性蛋白，正值为疏水性蛋白)。含N-豆蔻酰化位点（N-myristoylation site）5个，蛋白激酶C磷酸化位点（Protein kinase C phosphorylationsite）4个，ATP/GTP结合区A序列[ATP/GTP-binding site motif A (P-loop)]1个，N-糖基化位点（ N-glycosylation site ）2个，酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（ Casein kinase IIphosphorylation site）4个。

本发明利用农杆菌介导的遗传转化方法转化黄瓜，获得转基因植株经生物学功能验证，表明本发明所克隆的CsDIR16基因或其编码的蛋白质具有降低植物霜霉威农药残留的功能。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、依托本发明能有效降低植物霜霉威农药残留，保证食品安全。一旦获得有效转基因材料，生产上可有效降低农药使用量，降低生产成本，提高食品安全。另一方面，本发明可根据实际生产需求用于叶菜类或是其它农作物，应用广泛，易于被接受认可。

2、通过农杆菌介导的遗传转化将该基因导到植株中，鉴定其在霜霉威胁迫下的功能，为植物低农药残留分子设计育种提供新的基因资源，其在黄瓜低霜霉威残留方面具有较为重要的应用，通过对该基因的进一步研究和转化，可以培育出优良的低霜霉威残留黄瓜新品种用于霜霉威胁迫环境，进而减少农药的投入，降低农业生产成本，促进农业产业高效发展，为实施绿色农业、有机农业提供新的遗传资源，该资源的开发和利用有利于降低农业生产成本和提高食品安全。

附图说明

图1为CsDIR16基因功能鉴定技术路线图。

图2为不同基因型黄瓜CsDIR16表达模式。

图3为霜霉威胁迫下黄瓜D9320（A）和 D0351（B）果实中CsDIR16基因在不同时间点下的表达模式分析。

图4为CsDIR16编码蛋白质三维立体结构图。

图5为CsDIR16基因所属家族CsDIR基因系统进化树分析。

图6为CsDIR16基因亚细胞定位荧光示意图，图中：A-B为GFP基因（对照）在明场、暗场下的成像；C-E为CsDIR16基因在明场（C）、暗场DAPI染色（D）及暗场GFP（E）下的成像；Bright为明场，GFP为绿色荧光，Chlorophy为叶绿素自发荧光，Merged为叠加结果，图中标尺为10 μm。

图7为CsDIR16转基因材料PCR鉴定示意图，图中：M：DNA marker DL2000；1：阳性对照（CsDIR16-pCXSN质粒）；2-7：转CsDIR16-pCXSN基因植株。

图8为霜霉威在转正义CsDIR16和转反译CsDIR16黄瓜中残留量分析。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1：

CsDIR16基因分离克隆及表达分析

在之前的研究中，我们通过对黄瓜霜霉威胁迫表达谱测序分析，鉴定出了一个受霜霉威诱导表达明显上调的CsDIR16基因，为了得到其全长序列信息，我们在黄瓜基因组数据库（http://www.icugi.org/）中搜索CsDIR16的全长序列，利用Primer premier 5.0设计特异性引物，进行PCR扩增。引物序列如下：

正向引物：5′-ATGGCTGGAATCTCTCCAAT-3′

反向引物：5′- TCAATAATGAAGCACGTAAATGTTA-3′

首先使用Trizol（Invetrigen^TM）法提取黄瓜果实、茎、叶及总RNA（试剂盒购自Invetrigen公司，操作方法按照说明书）。而后取1ul中RNA样品，根据Toyobo反转录试剂盒ReverTra Ace qPCR RT-Kit说明书反转录成cDNA第1链。所得的第一链cDNA用于荧光定量PCR反应扩增目的基因的模板。反转录体系中各组分如下：

通过在黄瓜基因组数据库（http://www.icugi.org/）中搜索ID号为Csa4M280630.1的CDs全长序列（命名为CsDIR16），利用Primer premier 5.0设计特异性引物，进行PCR扩增。PCR克隆体系中各组分如下：

PCR扩增反应在Bio-Rad DNA Engine® Systems扩增仪上按以下程序完成：94℃预变性5 min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1 min（共30个循环）；循环完成后72℃延伸10 min。PCR扩增结束后产物于-20℃保存。

PCR扩增产物的回收是使用1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下快速切下目的条带，回收CsDIR16基因的目的片段，具体方法参照北京全式金胶回收试剂盒说明书进行。

pEASY-T₃载体连接与阳性克隆筛选是将CsDIR16基因的胶回收产物与北京全式金公司的pEASY-T3载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，具体方法参照北京全式金公司pEASY-T3载体说明书，进行蓝白斑筛选。挑取若干白色单菌落于含有抗性LB液体培养基中，在37℃，200 rpm/min振荡培养箱过夜，以菌液为模板，进行PCR检验，以及EcoR I酶切验证阳性菌落（PCR体系同上），将鉴定获得的CsDIR16基因的阳性菌液，送至苏州金唯智有限公司进行测序。酶切反应体系如下：

为了探究CsDIR16对霜霉威胁迫的响应模式，利用荧光定量PCR 技术分析D0351和D9320果实中的表达模式（图2）。结果表明：在相同浓度的霜霉威处理下，基因型不同的黄瓜品系中CsDIR16呈现出不同的表达模式，CsDIR16基因在霜霉威处理后，其表达量在两个黄瓜品系上存在差异，在黄瓜低霜霉威残留品系‘D0351’中CsDIR16基因上调表达，高于对照6.5倍，而在黄瓜高霜霉威残留品系‘D9320’上调表达高于对照仅有1.5倍，该结果与实验室前期转录组测序结果一致，说明CsDIR16在霜霉威胁迫下显著上调表达，积极响应霜霉威胁迫信号。

CsDIR16对霜霉威胁迫具有独特的响应模式。CsDIR16基因在D9320（图3A）中喷水与喷施霜霉威后在0-3h范围内都呈上调表达趋势，3h后都随时间延长表达量逐渐下降，在各个时间点均不存在明显差异。在D0351（图3B）中喷水与喷施霜霉威在0-6h各个时间点据表现为明显上调表达，其上调表达量分别为喷水的2.13、1.97、2.66、2.43倍，9h相对6h表达量下降，但是喷施霜霉威是喷水表达量的13.77倍。推测该基因为导致霜霉威含量在两个不同品种的黄瓜中残留量不同的关键基因。

实施例2：

CsDIR16蛋白三维立体分子结构图

利用CPHmodels 3.2（http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/）生成原子坐标（PDB格式），然后利用Rasmol windows软件输出CsDIR蛋白的三维立体分子结构图，分析预测蛋白质结构（图4），该蛋白含有7处β-折叠（黄色）和1处α-螺旋（粉红色）。

实施例3：

CsDIR家族蛋白及系统进化分析

以拟南芥的AtDIR蛋白作为query序列，BLAST黄瓜所有的注释蛋白序列，e-value值为1e-20。结果显示黄瓜中一共含23个CsDIR家族基因，按照基因在染色体上分布的前后排序，命名为CsDIR1、CsDIR2……CsDIR23，如表1所示，23个CsDIR基因分布于黄瓜的7条染色体上，其中4号染色体上最多。将23个CsDIR家族基因的蛋白进行比对，构建基因系统进化树，如图5所示，根据系统发育分析将这些CsDIR基因分成a、b、d、e四个亚家族，其中没有属于c亚家族的。DIRa、DIRb、DIRd和DIRe在遗传距离上的分化，提示该亚家族成员基因可能执行的生物学功能并不仅限于抗病性与木质素合成，其中DIR-a类主要负责木酚素的立体选择合成木质素，防御和抵抗昆虫和病原体的侵害。DIR-b/d类主要负责响应干旱、高温、冷害、高盐和氧化等非生物胁迫，受到乙烯、ABA（脱落酸）、H₂O₂、SA（水杨酸）等的调控，提高植物的抗逆能力。

表1 黄瓜中全部的CsDIR基因

表2 响应霜霉威胁迫的CsDIR基因及表达量分析

实施例4：

CsDIR16基因亚细胞定位

在线定位预测指出CsDIR16定位于细胞核，本研究利用拟南芥原生质体细胞来研究CsDIR16基因的亚细胞定位。在这里我们选用了pGII-EGFP载体构建CsDIR16基因的定位载体。利用RT-PCR扩增出CsDIR16基因整个ORF（阅读框），利用PCR扩增无终止密码子序列，纯化PCR产物与pEASY-T₃载体连接，使用BamH1和Sma1双酶切带有开放阅读框的CsDIR16-pEASY-T₃载体和pGII-EGFP载体，回收目的片段，用T₄-DNA连接酶25℃过夜连接，将目的片段融合到绿色荧光蛋白（GFP）上游BamH1和Sma1中间的位置，构建植物绿色荧光表达载体CsDIR16-pGII-EGFP，转入大肠杆菌DH5α（方法和体系同上），筛选并验证阳性菌落，送至苏州金唯智有限公司测序。

取10 μL测序正确且无终止密码的CsDIR16-pGII-EGFP菌液，加入到50 mL（含有50μL Kan）LB液体培养基中，于37℃、200 rpm的恒温摇床中过夜培养。菌液分装后用提取20管质粒，再将提好的质粒混在一起，加入等体积的异丙醇沉淀，再加入1/10的3M NaAC，在低温离心机中4℃，14000 rpm离心10 min，用75%的无水乙醇清洗2遍，室温下晾干，沉淀用试剂盒中的EB进行溶解。用紫外分光光度计检测质粒浓度，浓度在1 μg/μL左右的纯度，可以用于融入拟南芥原生质体细胞，该浓度的质粒可以提高亚细胞定位的成功率。

CsDIR16-pGII-EGFP质粒转化拟南芥原生质体：

1、将上步检验好的拟南芥原生质细胞100 g离心3min，弃上清，尽量去除W5溶液，加入2mL MMG溶液，重悬原生质体，使之最终浓度在2×10⁵个/mL；

2、取干净的2 mL离心管，加入20 μL（约30 μg）CsDIR16-pGII-EGFP质粒DNA和200 μL原生质细胞，轻柔混匀，25℃静止5 min；

3、加入220 μL（等体积）的40% PEG4000溶液，轻柔混匀，25 ℃静止5 min；

4、加入1 mL预冷的W5溶液，轻柔混匀；

5、重复步骤4，加入1 mL预冷的W5溶液和1% BSA，轻柔混匀后，于25 ℃光照培养16 h；

6、利用激光共聚焦显微镜（Leica，Germany）观察融合蛋白表达情况，试验重复3次。

48小时之后，用Germany Leica TCS SP2型激光共聚焦显微镜，观察CsDIR16融合蛋白的亚细胞定位情况。结果显示，GFP 对照质粒在整个细胞中都表达，CsDIR16-pGII-EGFP融合蛋白在细胞核、细胞膜及细胞质中表达，说明CsDIR16基因编码的蛋白属于遍在定位的蛋白（图6）。

实施例5：

植物转化超表达载体构建

1、将提取pCXSN的质粒用Xcm1酶切。

酶切的体系：

酶切条件：37℃酶切1h。

将酶切产物跑电泳，胶回收酶切pCXSN的大片段。

2、目的片段pCXSN载体的连接

按照一定比例（a:b=1:1，3:1，1:3）将胶回收的CsDIR和pCXSN的大片段用T4DNA连接酶16℃连接过夜，反应体系为：

3、转化

转化到大肠杆菌感受态，混合铺LB平板，使用卡纳抗生素Kan筛选。长出肉眼可见的白色菌落后，轻轻挑起单个菌落加入含有Kan的LB液体培养基中37℃，200r/min震荡培养过夜，先使用PCR扩增的方法检测菌液，扩增出目的片段的菌液，送去苏州金唯智生物科技有限公司测序。

实施例6：

黄瓜遗传转化

1、转化根癌农杆菌

1）农杆菌感受态细胞的激活

将-80℃保存的农杆菌LBA4404菌液4℃融化，YEB固体培养基铺平板过夜培养，利福平抗生素筛选，直至长出单菌落。用枪头小心挑取单菌落，打入含有利福平抗生素的5mLYEB液体培养基的三角瓶中，封口膜封口，至于震荡摇床中，28℃，200r/mim摇菌过夜培养，直至菌液浑浊。将浑浊的菌液加入到含有利福平的50mL的YEB液体培养基中，是终浓度为1:10，28℃，200r/mim摇菌，直至菌液的OD值达到0.5将上述菌液转入50mL已灭菌的大离心管中，冰上冷却30min。冷却后的菌液分装到1.5mL的小离心管中，每个离心管1mL，4000r/mim，离心10min，弃上清液。每个离心管内加入20mmol/L的 CaCl₂ 100μL ，轻弹管底，菌液重悬，短期使用于4℃保存，其余-80℃保存备用。

2）CsDIR载体导入农杆菌

取100μL激活的农杆菌感受态细胞加入10μL纯化的CsDIR16-pCXSN重组质粒DNA，用枪头轻轻混匀。将菌液至于冰上冷却5min后迅速冻于液氮中8min，将速冻的菌液至于37℃温浴8mim。将冻融的农杆菌中加入无菌液体YEB培养基 500μL，旋转混合均匀，放入震荡培养箱中培养4h，温度28℃，转速200r/min。室温离心5 mim，转速6000r/min，弃上清约600mL后用枪头吸打混匀菌液。吸取菌液涂布于含有卡纳和利福平抗生素的YEB固体培养基上，28℃，培养过夜，约48h长出菌落，4℃保存备用。

3）转化农杆菌的PCR

挑单菌落加入5mL液体YEB培养基（含50μg/mL Kan、 50μg/mL Rif和50μg/mL Str），28℃，200r/min过夜培养16h直至菌液浑浊。以农杆菌菌液为模板，用CsDIR引物进行PCR验证。

2、子叶节侵染法将CsDIR16-pCXSN转入黄瓜

1）各步骤培养基配方

无菌苗发芽培养基：4.33g/L MS，30g/L Suc ， 2 g/L植物凝胶II，pH=5.80；

菌体重悬培养基：2.17g/L MS，30g/L Suc，pH =5.80；

共培养培养基：4.33g/L MS，30g/L Suc，0.5g/L MES2 g/L植物凝胶II，pH =5.80；灭菌后加入6-BA（终浓度0.5mg/L）和ABA （终浓度1mg/L）；

分化筛选培养基：4.33g/L MS，30g/L Suc，0.5g/L MES，2 g/L植物凝胶II，pH =5.80；灭菌后加入6-BA（终浓度0.5mg/L）、ABA （终浓度1mg/L）、头孢（终浓度400mg/L）；

生根培养基：4.33g/L MS，30g/L Suc，0.5g/L MES，2 g/L植物凝胶II，pH =5.80。

所有培养基灭菌条件为120℃，高压灭菌20min。

2）转化受体材料的获得

挑选饱满大小一致的黄瓜9320种子，室温浸泡1h，用镊子轻轻剥去种皮，用1％的氯化汞溶液浸泡消毒10min；用无菌水冲洗3-4次，摆放到发芽培养基上，温度设置为25℃，避光培养3d。

取黄瓜子叶节：将黑暗培养3d的黄瓜取出，去掉子叶保护膜，将2片子叶从茎顶部轻轻掰下，不要连带顶芽，不要破坏子叶节；将取好的黄瓜子叶节其放入已高压灭菌的三角瓶中，适量加入已活化的CsDIR16-pCXSN农杆菌菌液，28℃，100转/分钟，浸染子叶节15min。将子叶近轴面朝上放入共培养培养基中，25℃黑暗培养2d。共培养后，将外植体子叶近轴面朝上转入分化筛选培养基中。温度设置为25±1℃，光照强度为1500-1800lx、光照周期为16h/8h。一般筛选28天左右就会分化出新芽。将发育出的新芽其从外植体基部切下，接种到生根培养基上进行生根培养。两周后不定芽基部产生大量根须。

将已生根的植株从培养基中取出，洗去根部培养基，栽入灭菌土与蛭石1：1混合的营养钵中，浇灌营养液，并套盖保鲜袋保湿，在培养箱中温度24/18℃，光照16/8h培养一周左右长出新叶揭去保鲜膜，完成驯化。

实施例7：

转CsDIR16基因黄瓜的鉴定

采用 CTAB 法提取黄瓜DNA，用于 PCR 扩增反应，并以转化质粒 DNA 的 PCR 扩增结果作为阳性对照，未转化植株叶片为阴性对照。PCR 扩增片段为载体pCXSN上的一段序列。转基因鉴定引物：

正向引物：5′- CGGCAACAGGATTCAATCTTA-3′

反向引物：5′- CAAGCATTCTACTTCTATTGCAGC-3′

PCR 反应体系为 94 ℃，5 min 预变性；94 ℃，1 min，56 ℃，1 min，72 ℃，1 min，33个循环；72 ℃，10 min 退火。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定转入目的基因的植株。

CsDIR16转基因材料PCR鉴定结果如图7所示。

实施例8：

转CsDIR16基因黄瓜霜霉残留量测定

黄瓜中霜霉威的残留量与转入CsDIR16基因的关系如图8所示。T₁代在喷施霜霉威后，野生型黄瓜叶片中霜霉威的残留量在前9h内随时间延长而逐渐增多，9-48h略有下降，但是变化不大；在导入CsDIR16过表达载体的植株中，前6h霜霉威的残留量与野生型一致，随时间延长而逐渐增多，但是6h以后霜霉威的残留量明显下降；在导入CsDIR16反译表达载体的植株中霜霉威的残留量与野生型基本保持一致。

<110>东北农业大学

<120>黄瓜CsDIR16基因及其在降低植物霜霉威农药残留中的应用

<160>2

<210>1

<211>588

<212>DNA

<400>1

1 ATGGCTGGAATCTCTCCAATCTCCCCCACCCACTTCCTCTTTCTCTCTTTCCTCCTCTTC

61 TCCGCCATAGCTTTGGCTATAGCCGAAGATGAAAACTCCTTTGCAAGAACAGTGAACAGG

121 AAACGTCTGGGTCTTAGAAAAGAAAAGCTCAGCCACTTCCGTCTCTACTGGCACGACGTT

181 CTAAGTGGAAAAGACCCAACCTCCATGCAAATCGTTCCCCCTGTTTCGAACACTTCAATG

241 ACTAGATTCGGTGCGGTCCAAATGATCGACAACCCATTAACGGAAACTGCAGATATCAAG

301 TCCAAACTATGGGGAAGAGCAGAGGGATTGTATGCATCGGCTTCACAAGACGGATCTGGG

361 TTGTTAATGGCGATGAACTTCGCGTTTGTGAGTGGGAAGTACAATGGAAGCTCCATCACA

421 ATATTTGGAAGGAACCCATTTTTGGAGAAAGTGAGAGAGATGCCTGTGATCGGTGGAAGT

481 GGGTTGTTCAGATTTGCGAGAGGGTATGCGAAAGCTTCAACCGTTAATATTGATTTCACA

541 ACAGGGGATGCTGTCGTTGAATATAACATTTACGTGCTTCATTATTGA

<210>2

<211>195

<212>DNA

<400>2

1 M A G I S P I S P T H F L F L S F L L F

1 ATGGCTGGAATCTCTCCAATCTCCCCCACCCACTTCCTCTTTCTCTCTTTCCTCCTCTTC

21 S A I A L A I A E D E N S F A R T V N R

61 TCCGCCATAGCTTTGGCTATAGCCGAAGATGAAAACTCCTTTGCAAGAACAGTGAACAGG

41 K R L G L R K E K L S H F R L Y W H D V

121 AAACGTCTGGGTCTTAGAAAAGAAAAGCTCAGCCACTTCCGTCTCTACTGGCACGACGTT

61 L S G K D P T S M Q I V P P V S N T S M

181 CTAAGTGGAAAAGACCCAACCTCCATGCAAATCGTTCCCCCTGTTTCGAACACTTCAATG

81 T R F G A V Q M I D N P L T E T A D I K

241 ACTAGATTCGGTGCGGTCCAAATGATCGACAACCCATTAACGGAAACTGCAGATATCAAG

101 S K L W G R A E G L Y A S A S Q D G S G

301 TCCAAACTATGGGGAAGAGCAGAGGGATTGTATGCATCGGCTTCACAAGACGGATCTGGG

121 L L M A M N F A F V S G K Y N G S S I T

361 TTGTTAATGGCGATGAACTTCGCGTTTGTGAGTGGGAAGTACAATGGAAGCTCCATCACA

141 I F G R N P F L E K V R E M P V I G G S

421 ATATTTGGAAGGAACCCATTTTTGGAGAAAGTGAGAGAGATGCCTGTGATCGGTGGAAGT

161 G L F R F A R G Y A K A S T V N I D F T

481 GGGTTGTTCAGATTTGCGAGAGGGTATGCGAAAGCTTCAACCGTTAATATTGATTTCACA

181 T G D A V V E Y N I Y V L H Y *

541 ACAGGGGATGCTGTCGTTGAATATAACATTTACGTGCTTCATTATTGA

Claims

1.一种黄瓜基因CsDIR16，其特征在于所述黄瓜基因CsDIR16的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.权利要求1所述黄瓜基因CsDIR16编码的蛋白质，其特征在于所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.扩增权利要求1所述黄瓜基因CsDIR16的引物，其特征在于正向引物：5′-ATGGCTGGAATCTCTCCAAT-3′；反向引物：5′- TCAATAATGAAGCACGTAAATGTTA-3′。

4.权利要求1所述黄瓜基因CsDIR16或权利要求2所述黄瓜基因CsDIR16编码的蛋白质在降低植物霜霉威农药残留中的应用。

5.根据权利要求4所述的黄瓜基因CsDIR16或黄瓜基因CsDIR16编码的蛋白质在降低植物霜霉威农药残留中的应用，其特征在于所述黄瓜基因CsDIR16用于霜霉威胁迫生长环境。

6.根据权利要求4所述的黄瓜基因CsDIR16或黄瓜基因CsDIR16编码的蛋白质在降低植物霜霉威农药残留中的应用，其特征在于所述黄瓜CsDIR16基因在培育低霜霉威农药残留黄瓜新品种中的应用。

7.根据权利要求6所述的黄瓜基因CsDIR16或黄瓜基因CsDIR16编码的蛋白质在降低植物霜霉威农药残留中的应用，其特征在于所述低霜霉威农药残留黄瓜新品种用于霜霉威胁迫环境。