CN109232724B

CN109232724B - 降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG及其应用

Info

Publication number: CN109232724B
Application number: CN201811135918.1A
Authority: CN
Inventors: 秦智伟; 张帆; 辛明; 周秀艳
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2038-09-28
Also published as: CN109232724A

Abstract

降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG及其应用，涉及一种降低农药残留的基因及其应用。降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明可用于降低农药霜霉威残留的转基因植物品系的构建。

Description

降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG及其应用

技术领域

本发明涉及一种降低农药残留的基因及其应用。

背景技术

黄瓜是中国的大宗蔬菜之一，在全国各地均有栽培，且以设施栽培为主。由于设施环境的特殊小气候及周年生产、连作等原因导致黄瓜生产中极易发生霜霉病。黄瓜霜霉病从幼苗到成株过程中均可发生，严重时可造成20％～40％产量损失。农药霜霉威是一种可有效防治黄瓜霜霉病的低毒杀菌剂，因此，目前大量使用霜霉威进行防治。但由于霜霉威存在一定的挥发性和内吸性，使用过程中会污染环境且极易在黄瓜果实内积蓄形成农药残留。农药残存在黄瓜中可视为一种神经性毒物，严重危害人体健康。已有动物实验证实了该农药确实具有致癌作用。

发明内容

本发明为了进一步降低残留农药霜霉威对人体的伤害，而提供了一种降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG及其应用。

本发明降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG在构建低农药残留品系转基因植物中的应用；所述的降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明基因CsMAPEG组成性表达，且具有品种差异性和组织差异性，能积极响应霜霉威胁迫，可能对霜霉威胁迫具有一定的耐受性，并参与降低植株体内的霜霉威残留量。本发明可用于降低农药霜霉威残留的转基因植物品系的构建。

附图说明

图1是基因CsMAPEG编码的蛋白质亲疏水性预测图；

图2是基因CsMAPEG编码的蛋白质信号肽预测图；

图3是基因CsMAPEG编码的蛋白质跨膜区域预测图；

图4是基因CsMAPEG编码的蛋白质二级结构预测图；

图5是基因CsMAPEG编码的蛋白质三级结构预测图；

图6是基因CsMAPEG编码的蛋白质构建的系统进化树；

图7是基因CsMAPEG亚细胞定位图；

图8是具体实施方式二中转基因T₀代黄瓜与野生型黄瓜果实中霜霉威残留量检测图；

图9是具体实施方式二中转基因T₁代黄瓜与野生型黄瓜果实中霜霉威残留量检测图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

黄瓜低农药残留品种D0351果实的cDNA为模板进行PCR扩增，上游引物CsMAPEG-F:ATGGCCGCAATCCAGCTTCTC，下游引物CsMAPEG-R:TTAATGACGAAGAAGCTTAACACCGAAC。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min。将扩增出的条带测序，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，被命名为CsMAPEG，全长为438bp，起始密码子为ATG、终止密码子为TGA的完整开放阅读框，共编码145个氨基酸。CsMAPEG编码的蛋白预测理论分子量为16.486KDa，理论等电点为9.66，原子组成为C₇₇₅H₁₁₉₃N₁₈₉O₁₈₆S₁₁，原子总数2354，脂肪系数为104.83。基因CsMAPEG编码的氨基酸序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的比对结果显示该蛋白带有MAPEG结构域，属于MAPEG superfamily家族蛋白，被命名为CsMAPEG蛋白。

对基因CsMAPEG编码的蛋白进行亲疏水性预测结果如图1所示，第16个氨基酸位置有最高疏水值2.944，第67个氨基酸位置有最大亲水值-2.122，平均亲水系数为-0.538，为亲水蛋白。

利用SignalP程序分析基因CsMAPEG编码的蛋白质(如图2所示)，结果发现检测不到明显的信号肽切割位点，说明该蛋白质可能是细胞质基质或细胞器基质中的蛋白质，不属于膜蛋白或分泌蛋白。使用在线生物软件TMHMM对基因CsMAPEG编码的蛋白质进行跨膜区域预测，结果显示有3个明显的跨膜区域(如图3所示)。采用SOPMA软件分析了基因CsMAPEG编码的蛋白质的二级结构(如图4所示)，结构表明有83个α螺旋，占整个多肽链的57.24％；20个延伸主链，占整个多肽链的13.79％；36个无规卷曲，占整个多肽链的24.83。将基因CsMAPEG编码的蛋白全序列提交到蛋白同源建模Phyre，预测蛋白质三级结构(如图5所示)。

CsMAPEG蛋白输入MEGA软件Neighbor-joining法构建系统进化树(如图6所示)，表明CsMAPEG蛋白与甜瓜Cucumis melo L.(XM 008462283.2)同源性最高。

构建CsMAPEG与GFP融合表达载体：设计带有XmaⅠ和BamHⅠ酶切位点的引物扩增基因CsMAPEG，获得去掉终止密码子的CsMAPEG开放读码框，其中引物序列为CsMAPEG-LF:CGGGATCCATGGCCGCAATCCAGCTTCTC和CsMAPEG-LR:CCCCCCGGGTAATGACGAAGAAGCTTAACACCGAAC。用去掉终止密码子的CsMAPEG开放读码框构建pEASY-T3-CsMAPEG载体，转化至Trans1-T1大肠杆菌中并鉴定测序，将pEASY-T3-CsMAPEG瞬时表达载体质粒和pGII-eGFP载体质粒用快速内切酶XmaⅠ和BamHⅠ双酶切，胶回收得纯化产物，将目的基因片段与载体片段用T4连接酶连接，获得融合表达载体CsMAPEG-pGII-EGFP，转化至Trans1-T1大肠杆菌中并鉴定。在转入空载体的整个细胞中可见明亮的绿色荧光，而在转入CsMAPEG-pGII-EGFP融合表达载体绿色荧光只富集在细胞质中，由此可见CsMAPEG蛋白主要存在于细胞质上(如图7所示)。

具体实施方式二：本实施方式降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG在构建低农药残留品系转基因植物中的应用；所述的降低农药霜霉威残留基因CsMAPEG的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

用基因CsMAPEG和PCXSN-1250载体(XcmⅠ单酶切)构建载体PCXSN-CsMAPEG再转化大肠杆菌，通过菌液PCR及测序鉴定构建PCXSN-CsMAPEG正义表达载体，之后采用冻融法将构建的表达载体转入根癌农杆菌LBA4404中，侵染黄瓜子叶节。然后采用“Farkas M H,Berry J O.Chlortetracycline detoxification in maize via induction ofGlutathione S-transferases after antibiotic exposure[J].Environ SciTechnol.2007,1450-1456.”中遗传转化技术，用含1.0mg/L草甘膦的MS培养基筛选，获得T₀代转基因黄瓜；T₀代植株自交授粉获得转基因T₁代转基因黄瓜种子，并以非转基因黄瓜高农药残留品种D9320植株作为对照，分别在幼苗长到“三叶一心”时使用喷雾法接种多主棒孢霉菌于黄瓜叶片，接种浓度为1×10⁵个分生孢子/mL。于第10节位商品瓜成熟时对植株喷施400倍稀释的霜霉威盐酸盐溶液，对照组喷施相同的霜霉威盐酸盐溶液，均以喷施到叶片叶缘滴液为度。喷施处理后1h、6h、12h、24h、48h、72h取样，进行霜霉威残留量检测分析。

称取待检测样品12.5g(用剪刀剪碎，然后准确称取样品，可以置于-20℃保存)，然后向待检测样品中加入25ml的乙腈，匀质2min，静置0.5h；之后将其中的乙腈提取到含有3gNaCl的离心管涡旋1min，直接离心；再取上清5ml，于60℃水浴，将乙腈蒸干，蒸干后用2.5ml丙酮溶解，过有机相滤膜(0.22，2个套用)后装小瓶(500～1000ul)备用。将上述小瓶盛装的溶液均稀释50倍后再装一批小瓶，用气质联用仪进行检测。其中，过完滤膜的溶液要澄清，无颗粒，可将过完滤膜的溶液静止数分钟后观察是否浑浊，若有颗粒需要再次过膜，直到澄清。

测定果实中霜霉威残留量：

结果表明在转基因(T₀和T₁代转基因黄瓜)和野生型(对照组黄瓜)果实中霜霉威残留量变化模式相同，残留量随时间变化先增加再减少。霜霉威胁迫最初12小时中转基因T₀代植株中霜霉威残留量逐渐增加，12小时处达到最大值，之后降低，且各时间点残留量明显低于野生型。霜霉威残留量在T₁代植株中的变化趋势与T₀代一致，其中，转基因后12小时残留量与野生型基本一致，12小时处达到最大值，之后呈明显降低趋势，且残留量显著低于野生型，72小时处残留量仅为最大值的0.43倍。

喷施霜霉威后针对不同黄瓜不同组织部位样品中CsMAPEG蛋白的表达量为果实>叶片>茎>根，CsMAPEG蛋白在果实中表达量最高。

植株三叶一心幼苗期激素JA、SA和ABA诱导，转基因组CsMAPEG蛋白表达模式上调明显，表达量分别为对照组的4.00、8.76、6.06倍。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 438

<212> DNA

<213> 黄瓜(Cucumis sativus)

<400> 1

atggccgcaa tccagcttct cccctcacaa tatggctacg tcgtcctcgt tcttgtcctc 60

tacacctttc tcaatttctg gatggccggt caggtcggcc gcgctcgcaa gaagtataag 120

gtcttttacc ctaatttata cgctctcgaa tccgacaaca aggatgccaa actcttcaat 180

tgtgtccaga gagggcacca gaattcgcta gaaatgatgc ctttgttctt catgcttatg 240

attttgggag gaattgggca tccttgcctt accgcttcct ttggagttct ctatgttgtg 300

tgtcgattct tctacttcaa aggttacgct accggtgtgc ctgaaaagcg cctcaccatc 360

gggaaatttt cttttctggc attactcgga ttgatggttt gcacaatctc gttcggtgtt 420

aagcttcttc gtcattaa 438

<210> 2

<211> 145

<212> PRT

<213> 黄瓜(Cucumis sativus)

<400> 2

Met Ala Ala Ile Gln Leu Leu Pro Ser Gln Tyr Gly Tyr Val Val Leu

1 5 10 15

Val Leu Val Leu Tyr Thr Phe Leu Asn Phe Trp Met Ala Gly Gln Val

20 25 30

Gly Arg Ala Arg Lys Lys Tyr Lys Val Phe Tyr Pro Asn Leu Tyr Ala

35 40 45

Leu Glu Ser Asp Asn Lys Asp Ala Lys Leu Phe Asn Cys Val Gln Arg

50 55 60

Gly His Gln Asn Ser Leu Glu Met Met Pro Leu Phe Phe Met Leu Met

65 70 75 80

Ile Leu Gly Gly Ile Gly His Pro Cys Leu Thr Ala Ser Phe Gly Val

85 90 95

Leu Tyr Val Val Cys Arg Phe Phe Tyr Phe Lys Gly Tyr Ala Thr Gly

100 105 110

Val Pro Glu Lys Arg Leu Thr Ile Gly Lys Phe Ser Phe Leu Ala Leu

115 120 125

Leu Gly Leu Met Val Cys Thr Ile Ser Phe Gly Val Lys Leu Leu Arg

130 135 140

His

145

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggccgcaa tccagcttct c 21

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttaatgacga agaagcttaa caccgaac 28

Claims

1.降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG在构建低农药残留品系转基因黄瓜中的应用；所述的降低农药霜霉威残留的基因CsMAPEG的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。