CN104178504A - 氨基甲酸酯类农药降解酶CFH与其编码基因cfd以及二者的应用 - Google Patents

氨基甲酸酯类农药降解酶CFH与其编码基因cfd以及二者的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及氨基甲酸酯类农药降解酶CFH与其编码基因cfd以及二者的应用。本发明降解呋喃丹等氨基甲酸酯类农药降解酶基因cfd的开放阅读框全长为2139 bp，序列如SEQ ID NO.1所示，其编码产物CFH含712个氨基酸，序列为SEQ ID NO.2。CFH能降解呋喃丹等氨基甲酸酯类农药。基因cfd可用于构建可降解呋喃丹等氨基甲酸酯类农药的转基因工程菌或作物，降解酶CFH可用于消除土壤、水体和农产品中呋喃丹等氨基甲酸酯类农药残留。

Description

氨基甲酸酯类农药降解酶CFH与其编码基因cfd以及二者的应用
技术领域
本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及能降解呋喃丹等氨基甲酸酯类农药的酶CFH与其编码基因cfd以及二者的应用。 
背景技术
我国人多地少，大量使用化学农药是保证作物高产稳产的必要措施，但同时也带来严重污染。农药的难降解性，导致土壤和农产品残留率较高，如目前在长三角和珠三角农田土壤检出率达90％以上，受农药污染的农产品更是如此，如国际绿色和平组织2009年检测结果表明，我国90％农产品检出农药残留，66％的样品残留至少5种以上农药，2010年4月份发生的青岛毒韭菜事件就是有机磷杀虫剂污染导致的，造成了恶劣影响。生物(酶)降解技术是一种新型原位生物修复技术，具有效果好、费用低和无二次污染等特点，是降解土壤和农产品上农药残留的理想方式。 
呋喃丹等氨基甲酸酯类农药是一类在世界范围内应用广泛的杀虫剂。该类农药毒性作用机理与有机磷农药相似，主要是抑制胆碱酯酶活性。氨基甲酸酯类农药可经呼吸道、消化道侵入机体，也可经皮肤粘膜缓慢吸收，主要分布在肝、肾、脂肪和肌肉组织中。近年来，由于其高毒性以及频繁发生的农药中毒事件，部分品种被世界各国限用，甚至禁用。以呋喃丹为例，欧盟和加拿大已禁用，美国禁用于任何作物(人食用)；2014年版的中国国家禁用和限用农药名单中，呋喃丹属于限用农药，蔬菜、果树、茶树、中草药材是其禁止使用的范围。这也就意味着呋喃丹等氨基甲酸酯类农药仍然在被大量使用，其在土壤和农产品中残留是依然我们要面对和解决的问题。 
要利用生物(酶)降解技术解决氨基甲酸酯类农药残留问题首先要获得优良的菌株和基因资源。目前能够降解该类农药的微生物已有较多报道，但是相应的基因资源却报道很少。目前共有三个相关的基因cehA(GenBank登陆号：AB069723)、cahA(GenBank登陆号：AB081302)和mcd，前两个基因编码的降解酶只对西维因有较强活性，mcd的序列虽然可以从GenBank(登陆号：AF160188)中获得，但并未有直接的文献报道，相关文献只报道了其出发菌株、酶的纯化和基因的定位。因此，至今还没有针对氨基甲酸酯类农药的广谱、高效降解酶基因的报道。这限制了人们利用生物(酶)降解技术消除土壤和农产品上的氨基甲酸酯类农药残留。 
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供呋喃丹等氨基甲酸酯类农药降解酶CFH与其编码基因cfd以及二者的应用。基因cfd可用于构建降解氨基甲酸酯类农药的转基因微生物或植物，亦可用于生产降解氨基甲酸酯类农药的酶制剂，用于消除土壤、水体和农产品中氨基甲酸酯类农药残留。 
本发明的目的可通过如下技术方案实现： 
一种氨基甲酸酯类农药降解酶基因cfd，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。 
基因cfd的出发菌株鞘氨醇杆菌(Sphingobium sp.)YBL3保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M208076。质谱分析结果表明菌株YBL3的粗酶液可以把呋喃丹、西维因和异丙威等氨基甲酸酯类农药的酰胺键断裂而降解这些农药，消除其毒性。 
克隆氨基甲酸酯类农药降解酶基因的策略为鸟枪法。首先提取菌株YBL3的总DNA，总DNA采用Sau3AI部分酶切后和BamHI用酶切的质粒pUC118酶连，酶连产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞获得总DNA文库。用高效液相色谱(HPLC)检测法筛选出能够降解呋喃丹的克隆，然后将用降解能力的克隆测序、分析，确定目标基因的开放阅读框(ORF)。最后获得目标基因的开放阅读框大小为2139bp，命名为cfd，其编码的酶命名为CFH。这是首次针对氨基甲酸酯类农药的广谱、高效降解酶基因的报道。 
所述cfd基因所编码的酶CFH，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。 
含有所述cfd基因的重组表达载体。 
所述的重组表达载体优选将所述cfd基因插入pET-29a(+)的NdeI和EcoRI位点之间所得 
含有所述cfd的基因工程菌。 
所述的基因工程菌的出发菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。 
所述cfd基因在构建降解氨基甲酸酯类农药的转基因作物中的应用。 
所述cfd基因在去除农产品、土壤和水体中氨基甲酸酯类农药残留中的应用。 
所述降解酶CFH在降解氨基甲酸酯类农药中的应用。 
所述降解酶CFH在去除农产品、土壤和水体中氨基甲酸酯类农药残留中的应用。 
所述重组表达载体在构建降解氨基甲酸酯类农药的转基因作物中的应用。 
所述重组表达载体在去除水体中氨基甲酸酯类农药残留中的应用。 
有益效果 
1.本发明用鸟枪法成功的从菌株YBL3(CCTCC NO:M208076)中克隆出基因cfd。在GenBank比对结果表明该基因为一个新的基因，全长(从起始密码子到终止密码子)为2139bp，编码 712个氨基酸。 
2.本发明中的降解酶CFH或携带cfd基因的工程菌能高效降解氨基甲酸酯类农药。基因cfd可用于构建降解氨基甲酸酯类农药的转基因微生物或植物，亦可用于生产降解氨基甲酸酯类农药的酶制剂，用于消除土壤、水体和农产品中氨基甲酸酯类农药残留。 
附图说明
图1基因cfd在BL21(pET-29a(+))中表达策略图。 
图2基因cfd在BL21(pET-29a(+))中表达产物降解呋喃丹生成呋喃酚的质谱检测图。图2A为降解产物的一级质谱图；图2B为物质S1(呋喃丹)的二级质谱图；图2C为物质S2(呋喃酚)的二级质谱图。 
生物材料保藏信息 
鞘氨醇杆菌YBL3，分类命名为Sphingobium sp.YBL3，保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M208076，保藏日期为2008年5月22日。 
具体实施方式
实施例1基因cfd的克隆 
(1)细菌基因组总DNA的提取 
YBL3(CCTCC NO:M208076)在液体LB培养基中(37℃、200rpm、18h)大量培养后，采用CTAB法提取高纯度、大片段的菌株YBL3基因组总DNA，溶于TE缓冲液(pH8.0)中，置于-20℃保藏，具体方法参考F·奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。 
(2)pUC118(BamHI)购买于宝生物工程(大连)有限公司。 
(3)采用Sau3AI部分酶切菌株YBL3总DNA。 
(4)DNA的回收 
酶切后的总DNA通过电泳(TAE缓冲液)进行纯化，采用axygen biosciences(China)回收试剂盒进行回收，回收的DNA溶于10mmol/L的Tris·HCl(pH8.0)中，置于-20℃保藏。 
(5)酶连 
建立如下反应体系： 
16℃温育12小时。 
(6)转化及筛选 
取10μl酶连产物转化200μl大肠杆菌DH5α感受态细胞(TaKaRa，Code:D9057)，具体方法参照F.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》P23。涂布含有100mg/kg氨苄青霉素的LB平板，培养24h后分别挑选克隆子进行扩大培养，将菌体细胞重悬于PBS(pH7.0)中，置于恒温摇床中180rpm,30℃振荡培养2小时，取出PBS菌悬液，调节菌体浓度至OD600＝2.0便制成了菌株克隆子的静息细胞，静息细胞悬液中加入50mg·L-1的呋喃丹，180rpm，30℃，于恒温摇床中振荡培养24h。加入等体积二氯甲烷终止反应并剧烈振荡提取产物，有机相经无水硫酸钠脱水、氮气吹干后溶于100μL甲醇待测。用HPLC检测克隆子能否降解呋喃丹，液相条件为：色谱柱，Kromasil 100-5C18(4.6mm×250mm×5μm)；流动相，甲醇/水(体积比70/30)；流速，1ml·min-1；紫外检测器，波长280nm和230nm；进样量，20μl。 
(7)基因核苷酸序列测定 
将(6)中获得的能降解呋喃丹的阳性克隆子委托上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，呋喃丹降解酶基因cfd的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，根据基因cfd核苷酸序列所推到的712个氨基酸序列为SEQ ID NO.2。 
实施例3呋喃丹水解酶CFH在BL21(pET-29a(+))中的高效表达及其功能测定(技术路线图1) 
(1)基因cfd的PCR扩增 
以正向引物:5’-TCTGGACATATGTCTAGTGACAAACTCCAT-3’(SEQ ID NO.3)和反向引物:5’-TCTGGAGAATTCATTGTCTTTTTGCATCA-3’(SEQ ID NO.4)为引物，用PCR从菌株YBL3总DNA中扩增出基因cfd序列。 
扩增体系： 
PCR扩增程序： 
a.95℃变性3min； 
b.95℃变性1.5min，53℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，进行25个循环； 
c.72℃延伸10min，冷却到室温。 
(2)PCR产物用NdeI和EcoRI双酶切。 
酶切体系： 
在37℃水浴中，反应3h以上。酶切产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。 
(3)pET-29a(+)用NdeI和EcoRI双酶切(参考2.2)。 
(4)转化 
(2)中的回收片段和(3)中酶切好的pET-29a(+)进行酶连(参考实施例1步骤(5))获得含cfd基因的pET-29a(+)重组质粒pET-29a(+)-cfd。将重组质粒pET-29a(+)-cfd转化到表达宿主菌BL21(DE3)获得含cfd的重组微生物BL21(CFH)。 
(5)CFH的表达、纯化和功能验证 
BL21(CFH)在LB培养基中培养至OD600nm为0.6到0.8之间，加IPTG至浓度1mM，30℃培养4个小时。100ml菌液离心，用10ml(50mM,pH 7.0)PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎(Auto Science,UH-650B ultrasonic processor,30％intensity)5分钟，离心，收集上清，用镍离子亲和层析柱对上清进行了纯化得呋喃丹水解酶CFH。 
(6)CFH降解呋喃丹产物的测定 
CFH水解呋喃丹的反应体系：50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，50mg·L-1呋喃丹、CFH 50μl，30℃反应30min。加入3ml二氯甲烷终止反应并剧烈振荡提取产物，有机相经无水硫酸钠脱水、氮气吹干后溶于100μL甲醇待测。质谱检测结果显示CFH能将呋喃丹降解为呋喃酚(图2)。 
(7)CFH降解其它氨基甲酸酯类农药的能力测定 
CFH水解氨基甲酸酯类农药的反应体系：50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，50mg·L-1西维因、 异丙威或速灭威、CFH 50μl，30℃反应30min。加入3ml二氯甲烷终止反应并剧烈振荡提取产物，有机相经无水硫酸钠脱水、氮气吹干后溶于100μL甲醇后用质谱检测。检测结果显示CFH同样可以高效地降解西维因、异丙威和速灭威。 
本发明使用的微生物来源如下： 
pUC118(BamHI)                购自宝生物工程(大连)有限公司， 
大肠杆菌DH5α\               购自上海英骏生物技术有限公司， 
大肠杆菌高表达载体pET-29a(+) 购自Novegen公司， 
表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)  购自上海英骏生物技术有限公司。 

Claims (10)

1.一种氨基甲酸酯类降解酶基因cfd，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
2.权利要求1所述的基因cfd所编码的降解酶CFH，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
3.含有权利要求1所述的基因cfd的重组表达载体。
4.含有权利要求1所述的基因cfd的基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌的出发菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
6.权利要求1所述基因cfd在构建降解氨基甲酸酯类农药的转基因作物中的应用。
7.权利要求1所述基因cfd在去除水体中氨基甲酸酯类农药残留中的应用。
8.权利要求2所述降解酶CFH在消除土壤、水体或农产品中氨基甲酸酯类农药残留中的应用。
9.权利要求3所述重组表达载体在构建降解氨基甲酸酯类农药的转基因作物中的应用。
10.权利要求1所述重组表达载体在去除水体中氨基甲酸酯类农药残留中的应用。
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