CN107760621A

CN107760621A - 异菌脲降解菌、降解酶IpaH与其编码基因ipaH及其应用

Info

Publication number: CN107760621A
Application number: CN201710969473.6A
Authority: CN
Inventors: 洪青; 杨战功; 邱吉国; 闫新; 何健; 蒋建东; 黄星; 陈凯; 朱建春
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2017-10-18
Filing date: 2017-10-18
Publication date: 2018-03-06
Anticipated expiration: 2037-10-18
Also published as: CN107760621B

Abstract

本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及异菌脲降解菌、降解酶IpaH与其编码基因ipaH及其应用。本发明降解异菌脲降解酶基因ipaH的开放阅读框全长为1410bp，序列如SEQ ID NO.1所示，其编码产物IpaH含469个氨基酸，序列为SEQ ID NO.2。IpaH能降解异菌脲。基因ipaH可用于构建降解异菌脲的转基因工程菌或作物，降解酶IpaH可制备酶制剂用于消除土壤、水体和农产品中异菌脲的残留。

Description

异菌脲降解菌、降解酶IpaH与其编码基因ipaH及其应用

技术领域

本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及异菌脲降解菌、降解酶IpaH与其编码基因ipaH及其应用。

背景技术

杀菌剂是防治作物病害最重要的武器。异菌脲为二甲酰亚胺类高效广谱、触杀型杀菌剂，杀菌谱广，主要防治对象为葡萄孢属、丛梗孢属等引起的多种蔬菜、果树和果实贮藏期病害，对作物早期落叶病、灰霉病、早疫病等真菌病害具有良好的防治效果。由于大部分杀菌剂为较低效或低效农药，在施用后一段时间内才可以看到明显的防治效果，因此使用过程中用量常被刻意提高数倍甚至数十倍,杀菌剂就成了蔬菜生产的重要污染源之一。欧盟早在1996年就指出异菌脲、腐霉利、百菌清、苯菌灵、代森类等几种杀菌剂是作物生产中主要的危害残留物，日本、韩国、美国对异菌脲在蒜及蒜制品的残留限量有着严格的要求，均为0.1ppm；欧盟对异菌脲的使用限制更严，从2009年起禁止使用异菌脲。在中国，异菌脲属于限制使用农药，登记作物仅为苹果、番茄、香蕉和油菜。这也就意味着异菌脲仍然在使用，其在土壤和农产品中残留是依然我们要面对和解决的问题。

要利用微生物(酶)降解技术解决异菌脲残留留问题首先要获得优良的菌株和基因资源。目前已经报道了几株降解异菌脲的菌株，但是截止本专利申请日期还没有关于异菌脲降解酶和基因方面的报道，这就限制了人们利用微生物(酶)降解技术消除土壤和农产品上的异菌脲残留。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供异菌脲降解酶IpaH与其编码基因ipaH以及二者的应用。基因IpaH可用于构建降解异菌脲的转基因微生物或植物，亦可用于生产降解异菌脲的酶制剂，用于消除土壤、水体和农产品中异菌脲残留。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一株异菌脲降解YJN-5,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO.M2017440。

基因ipaH的出发菌株Paenarthrobacter ureafaciens.YJN-5保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为(CCTCC NO.M 2017440)。质谱分析结果表明菌株YJN-5的粗酶液可以通过断裂异菌脲的C-N键来降解异菌脲。

一种异菌脲降解酶基因ipaH，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

克隆异菌脲降解酶基因的策略为鸟枪法。首先提取菌株YJN-5的总DNA，总DNA采用Sau3AI部分酶切后和BamHI用酶切的质粒pUC118酶连，酶连产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞获得总DNA文库。用高效液相色谱(HPLC)检测法筛选出能够降解异菌脲的克隆，然后将用降解能力的克隆测序、分析，确定目标基因的开放阅读框(ORF)。最后获得目标基因的开放阅读框大小为1410bp，命名为ipaH，其编码的酶命名为IpaH。它和菌株Bradyrhizobiumdiazoefficiens USDA 110注释的Indole-3-acetamide hydrolase(吲哚-3-乙酰胺水解酶)和菌株Bradyrhizobium japonicum注释的Indole-3-acetamide hydrolase同源性分别为40％和39％，推测该酶属于酰胺酶超家族。这些结果显示ipaH是一个全新的异菌脲降解酶基因。

所述ipaH基因所编码的酶IpaH，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

含有所述ipaH基因的重组表达载体。

所述的重组表达载体优选将所述ipaH基因插入pET-29a(+)的NdeI和XhoI位点之间所得。

含有所述ipaH的基因工程菌。

所述的基因工程菌的出发菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述的异菌脲降解YJN-5在消除土壤、水体或农产品中异菌脲残留中的应用。

所述ipaH基因在构建降解异菌脲的转基因作物中的应用。

所述ipaH基因在去除农产品、土壤和水体中异菌脲残留中的应用。

所述降解酶IpaH在降解异菌脲中的应用。

所述降解酶IpaH在去除农产品、土壤和水体中异菌脲残留中的应用。

所述重组表达载体在构建降解异菌脲的转基因作物中的应用。

所述含重组表达载体的工程菌在去除水体中异菌脲残留中的应用。

有益效果

1.本发明筛选获得一株Paenarthrobacter ureafaciens.YJN-5，质谱分析结果表明菌株YJN-5的粗酶液可以把C-N键断裂生成N-(3,5-二氯苯基)-2,4-二氧代咪唑烷和异丙胺。在此基础上，本发明用鸟枪法成功的从菌株YJN-5(CCTCC NO.M 2017440)中克隆出基因ipaH。在GenBank比对结果表明该基因为一个新的基因，全长(从起始密码子到终止密码子)为1410bp，编码469个氨基酸。

2.本发明中的降解酶IpaH或携带ipaH基因的工程菌能高效降解异菌脲。基因ipaH可用于构建降解异菌脲的转基因微生物或植物，亦可用于生产降解异菌脲的酶制剂，用于消除土壤、水体和农产品中异菌脲残留。

附图说明

图1水解酶基因ipaH克隆的策略图。

图2水解酶基因ipaH在BL21(pET-29a(+))中表达策略图。

图3水解酶IpaH蛋白电泳图谱；

其中泳道1为蛋白质marker，泳道2为纯化的水解酶IpaH蛋白。

图4水解酶IpaH催化的降解异菌脲的GC/MS图谱；

A：保留时间为9.83min异菌脲的一级质谱图；B：保留时间为5.0minN-(3,5-二氯苯基)-2,4-二氧代咪唑烷的一级质谱图。

图5水解酶IpaH降解异菌脲的途径。

生物材料保藏信息

降解菌YJN-5，分类命名为Paenarthrobacter ureafaciens.YJN-5，保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉大学，保藏日期为2017年8月10日，保藏编号为CCTCC NO.M 2017440。

具体实施方式

实施例1

1.1异菌脲降解菌YJN-5(CCTCC NO.M 2017440)的分离

用来富集异菌脲降解菌株的富集基质取自河北省廊坊市葡萄园农田土，取农田土5.0g加入100ml基础盐培养基中，加入50mg·L^-1的异菌脲，30℃，180r·min^-1培养5d，以5％的接种量转接到相同的培养基中，连续转接3次，梯度稀释富集液，取10^-4～10^-7稀释度的富集液各0.1mL涂布于加有100mg·L^-1异菌脲的固体培养基平板上，30℃培养3d后，挑取长出的单菌落接种于含100mg·L^-1异菌脲无机盐培养基中，30℃，180r·min^-1摇床培养3d，重复验证其降解效果。

基础盐培养基配方为(1L)：1.0g NH₄NO₃,1.0g NaCl,1.5g K₂HPO₄,0.5g KH₂PO₄,0.2g MgSO₄·7H₂O.pH 7.0.固体培养基加15.0g琼脂。

降解效果的验证方法：在培养液中加入等体积的二氯甲烷进行全量提取，剧烈振荡后静置分层，然后取1ml下层二氯甲烷挥发完全后，加入1mL乙腈溶解(色谱纯)，用滤膜(孔径0.22μm)过滤。采用高效液相色谱测定提取液中的异菌脲和N-(3,5-二氯苯基)-2,4-二氧代咪唑烷含量，液相色谱条件：流动相为乙腈：水：乙酸(70：30：0.5，V/V)，Phecda C18反相柱(5μm，4.6mm×250mm，Hanbon Sci.&Tech，China)，柱温为40℃，紫外检测器，测定波长230nm，进样量20μL，流速为0.8mL·min^-1。外标法按峰面积定量。

从富集液中，分离到1株异菌脲降解菌，命名为YJN-5，该菌在2d内对200mg·L^-1的异菌脲的降解率达到100％。

1.2异菌脲降解菌YJN-5的鉴定和生物学特性

异菌脲降解菌YJN-5为革兰氏阳性菌，在LB固体培养基上培养24h之后菌落呈圆形凸起、黄色、湿润光滑且边缘整齐，易挑取。能利用甘露醇、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、D-核糖、N-乙酰葡萄糖胺。

16S rRNA基因序列系统发育分析：菌株总DNA的提取采用高盐法，并以总DNA作为模板，进行16S rRNA基因序列的扩增。用于扩增反应的引物为一对通用引物，上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID No.5)，下游引物：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ IDNo.6)。25μL PCR反应体系为：模板1μL，dNTP(25mmol/L)2μL，引物(1mmol/L)各1μL，10×Taq缓冲液2.5μL，Mg²⁺(25mmol/L)1.5μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，超纯水15.5μL。聚合酶链式反应条件：95℃预变性5min；94℃变性0.5min，52℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环30次；72℃延伸10min。采用PCR回收试剂盒(AXYGEN公司)回收16S rDNA的基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小(1.5kb左右)，TA克隆后进行测序(由金斯瑞公司完成)。测序结果通过在线分析，与EzBioCloud数据库(http://www.ezbiocloud.net/)中的模式菌株16S rRNA基因序列进行相似性比较。结果显示菌株YJN-5与Paenarthrobacter sp.同源性最高，与Paenarthrobacter ureafaciens DSM 20126(T)的同源性达到99％，结合生理生化特征将该菌鉴定为Paenarthrobacter sp.，保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.M 2017440。

实施例2基因ipaH的克隆(技术路线图1)

克隆该基因采取的策略为鸟枪法。首先提取菌株YJN-5的总DNA，总DNA采用Sau3AI部分酶切后和pUC118BamHI/BAP载体(由pUC118DNA经其多克隆位点上的单切点被限制酶BamHI酶切后，用E.coli来源的碱性磷酸酶(BAP)去磷酸化后得到)酶连，酶连产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞构建菌株YJN-5的总DNA文库，将所有克隆子涂布在含有100ppm氨苄霉素抗性和500ppm异菌脲的LB平板中(异菌脲不溶于水，在LB平板中会有沉淀生成，遂采用透明水解圈的方法筛选阳性克隆)。利用这种克隆方法可以对文库进行高通量的筛选。

(1)细菌基因组总DNA的提取

YJN-5(保藏申请中)在液体LB培养基中(30℃、180rpm)培养至对数生长期后期，离心收集菌体采用CTAB法提取高纯度、大片段的菌株YJN-5基因组总DNA，溶于TE缓冲液(pH8.0)中，用0.75％的琼脂糖凝胶电泳观察总DNA的完整性，并用Nanodrop 2000分光光度计(Thermo)检测DNA的浓度和纯度。置于-20℃保藏，具体方法参考F·奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。

(2)pUC118(BamHI/BAP)购买于宝生物工程(大连)有限公司。

(3)采用Sau3AI部分酶切菌株YJN-5总DNA。

(4)DNA的回收

酶切后的总DNA通过0.75％琼脂糖凝胶电泳(TAE缓冲液)进行纯化，采用OMEGAbio-tek回收试剂盒进行回收，回收的DNA溶于10mmol/L的Tris·HCl(pH8.0)中，置于-20℃保藏。

(5)酶连

建立如下反应体系：

16℃温育酶连12小时。

(6)转化及筛选

取10μl酶连产物转化200μl大肠杆菌DH5α感受态细胞(TaKaRa，Code:D9057)，具体方法参照F.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》P23。涂布于含有100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，培养24h。将所有克隆子涂布在含有100ppm氨苄霉素抗性和500ppm异菌脲的LB平板中(异菌脲不溶于水，在LB平板中会有沉淀生成，遂采用透明水解圈的方法筛选阳性克隆)。利用这种克隆方法可以对文库进行高通量的筛选。

用上面的策略筛选鸟枪法构建的基因文库获得一个能在上述LB培养基中产生水解圈的阳性克隆子，进一步的降解实验表明该阳性克隆子能降解异菌脲。

克隆子对异菌脲的降解效果的验证方法：

在培养液中加入等体积的二氯甲烷进行全量提取，剧烈振荡后静置分层，然后取1ml下层二氯甲烷挥发完全后，加入1mL乙腈溶解(色谱纯)，用滤膜(孔径0.22μm)过滤。采用高效液相色谱测定提取液中的异菌脲和N-(3,5-二氯苯基)-2,4-二氧代咪唑烷含量，液相色谱条件：流动相为乙腈：水：乙酸(70：30：0.5，V/V)，Phecda C18反相柱(5μm，4.6mm×250mm，Hanbon Sci.&Tech，China)，柱温为40℃，紫外检测器，测定波长230nm，进样量20μL，流速为0.8mL·min^-1。外标法按峰面积定量。

(7)基因核苷酸序列测定

将(6)中获得的能降解异菌脲的阳性克隆子委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定，异菌脲降解酶基因ipaH的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，根据基因ipaH核苷酸序列所推到的469个氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

实施例3异菌脲水解酶IpaH在BL21(pET-29a(+))中的高效表达、纯化及其功能测定(技术路线图2)

(1)基因ipaH的PCR扩增

以正向引物：5’-GGAATTCCATATGGGTACTTCACCCCAG-3’(SEQ ID NO.3)和反向引物：5’-CCGCTCGAGACCAGCGTTGATGAACGG-3’(SEQ ID NO.4)为引物，用PCR从Paenarthrobacterureafaciens.YJN-5(CCTCC NO.M 2017440)基因组DNA中扩增出ipaH基因片段

扩增体系：

PCR扩增程序：

a.98℃变性3min；

b.98℃变性0.5min，58℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，进行30个循环；

c.72℃延伸10min，冷却到室温。

(2)PCR产物用NdeI和XhoI双酶切。

酶切体系：

在37℃水浴中，反应30min。酶切产物进行0.75％的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。

(3)pET-29a(+)用NdeI和XhoI双酶切(参考(2))。

(4)转化

(2)中的回收片段和(3)中酶切好的pET-29a(+)进行酶连(参考实施例1步骤(5))获得含ipaH基因的pET-29a(+)重组质粒pET-29a(+)-IpaH。将重组质粒pET-29a(+)-ipaH转化到表达宿主菌BL21(DE3)涂布于100ppm卡那抗生素的LB平板中，37℃培养24h，挑取阳性克隆，获得含ipaH的重组菌BL21(IpaH)。

(5)IpaH的表达、纯化和功能验证

重组菌BL21(IpaH)在LB培养基(37℃，180rpm)中培养至OD_600nm为0.6，加IPTG至浓度1mM，16℃低温诱导10h。离心收集菌体，用15ml(20mM,pH 7.5)Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声破碎(Auto Science,UH-650B ultrasonic processor,30％intensity))10min，离心，收集上清，用镍离子亲和层析柱(Pre-Packed Gravity Column,Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd.)对IpaH进行纯化，得水解酶IpaH，IpaH电泳图谱见图3，其条带大小和理论预测的大小(50.1kDa)相一致。

(6)IpaH降解异菌脲产物的测定

酶活反应体系(3mL)：20mM Tris-HCl(pH 7.5)，0.3mM(100mg/L)靶标底物(异菌脲)、反应酶量(实施例2步骤(5)中纯化所得)50μl，35℃反应10min。每个反应以加入酶开始计时，用3ml二氯甲烷终止反应并萃取，分层后有机相经无水硫酸钠脱水，异菌脲的含量用HPLC测定(具体方法见实施例1步骤(6))。经HPLC检测得到一个保留时间为3.88min的产物峰，经过HPLC-MS(Surveyor-LCQ DECA XP Plus,Thermo Finnigan,USA)分析，质谱检测条件与HPLC检测条件一致；质谱检测采用电喷雾离子化方式在正离子模式下进行，质荷比扫描范围为50-500m/z。在正离子质谱检测条件下其m/z＝245.1，与N-(3,5-二氯苯基)-2,4-二氧代咪唑烷分子量相同，则说明IpaH能够将异菌脲水解为N-(3,5-二氯苯基)-2,4-二氧代咪唑烷。

本发明使用的微生物来源如下：

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 异菌脲降解菌、降解酶IpaH与其编码基因ipaH及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1410

<212> DNA

<213> YJN-5(Paenarthrobacter ureafaciens.YJN-5)

<400> 1

atgtcagatc agttgtggtc aaagagtgct accgagcttg ccggattggt tcgctccaaa 60

gtcgtctcag cgaccgaggt cgtagaagca catcttcagc ggatcgagga cgtgaatccg 120

gagctcaacg ccattgccgt cgtgctggcg gatgatgccc ggcagtctgc ccgcatcgct 180

gatgagaaga ctcgaacgga gccagaccag ctgggcagac ttcatggcgt cccgatcacc 240

ctcaaggtga atattgacct cgtcggttcg gcgacctcgg acgccgtacc cgctttcaaa 300

gacttctacc cgcctatgaa cacgcctcta gtggatcgac tcttggggga aggcgccata 360

gttgtcggtc gaacgaacat gtcggacatg ggcatgcgca tgacgaccga cagcacgctg 420

catggactca cgagaaaccc atggcatccg gggcgcacgg ctggcggatc gtcaggcggc 480

gagggcgccg ccctcgcatc tggcatgtcg gcgctgggag tcgggaatga tctcgttggt 540

tctctgcgga atcctgcgca ttgctgcggc atctcgactc tgaagcccac ccccggccgt 600

attccgtggg cggactcaat cctgccgcct gacggcccgc tctccttcca aatgatgttg 660

gtgcacggcc ccatggcgcg tcaggtggcg gacgttcggc tgggcatgga gatcatgagc 720

ggtgctcacc cacgcgaccc ctactcggtt gacgttccgc tgtaccgcgc cgattccaac 780

cagccgttca aagtcgccgt catggcggcg cctcctggag caccaacaga cccagaggtg 840

tcctctgtgg ttcgcaaggc aggggaggcg gtggccgcgg ctggctacga agtcgacgag 900

atcgatgctc ccgagtattt agagacgagg cagatttggc tcgacttcct gatgaccgaa 960

gtcaatgttc ttcaggatct cataaccgaa ccgatgggcc ctgcgggacg ccagttcctg 1020

agcgactttg tcgacctcgc ggccccgctt gaccttcccg ggtacatcga cctgtttgtg 1080

cggcgtcgtc ggatgagcag ggtctggaac gactttttcc aagagtaccc ggtgattatc 1140

gcgcccacgt ggcttgatgt cgcgttcgag cacgactggg acttgaagtc ggttgcggac 1200

actgtggata actgtgggcc gatcgtgcct gccaacgttc taggtcttcc ggcggctgtg 1260

accttcgggg gcctcgcaaa gggtatgcct gttggtgtcc aatgcatcgc tgcggccttc 1320

cacgacgatc aagcgatgca agtcgctgag gtcatcgagg ccgctgtggg agcaacccgc 1380

cccgtctcgc cgttcatcaa cgctggttag 1410

<210> 2

<211> 469

<212> PRT

<213> YJN-5(Paenarthrobacter ureafaciens.YJN-5)

<400> 2

Met Ser Asp Gln Leu Trp Ser Lys Ser Ala Thr Glu Leu Ala Gly Leu

1 5 10 15

Val Arg Ser Lys Val Val Ser Ala Thr Glu Val Val Glu Ala His Leu

20 25 30

Gln Arg Ile Glu Asp Val Asn Pro Glu Leu Asn Ala Ile Ala Val Val

35 40 45

Leu Ala Asp Asp Ala Arg Gln Ser Ala Arg Ile Ala Asp Glu Lys Thr

50 55 60

Arg Thr Glu Pro Asp Gln Leu Gly Arg Leu His Gly Val Pro Ile Thr

65 70 75 80

Leu Lys Val Asn Ile Asp Leu Val Gly Ser Ala Thr Ser Asp Ala Val

85 90 95

Pro Ala Phe Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Met Asn Thr Pro Leu Val Asp

100 105 110

Arg Leu Leu Gly Glu Gly Ala Ile Val Val Gly Arg Thr Asn Met Ser

115 120 125

Asp Met Gly Met Arg Met Thr Thr Asp Ser Thr Leu His Gly Leu Thr

130 135 140

Arg Asn Pro Trp His Pro Gly Arg Thr Ala Gly Gly Ser Ser Gly Gly

145 150 155 160

Glu Gly Ala Ala Leu Ala Ser Gly Met Ser Ala Leu Gly Val Gly Asn

165 170 175

Asp Leu Val Gly Ser Leu Arg Asn Pro Ala His Cys Cys Gly Ile Ser

180 185 190

Thr Leu Lys Pro Thr Pro Gly Arg Ile Pro Trp Ala Asp Ser Ile Leu

195 200 205

Pro Pro Asp Gly Pro Leu Ser Phe Gln Met Met Leu Val His Gly Pro

210 215 220

Met Ala Arg Gln Val Ala Asp Val Arg Leu Gly Met Glu Ile Met Ser

225 230 235 240

Gly Ala His Pro Arg Asp Pro Tyr Ser Val Asp Val Pro Leu Tyr Arg

245 250 255

Ala Asp Ser Asn Gln Pro Phe Lys Val Ala Val Met Ala Ala Pro Pro

260 265 270

Gly Ala Pro Thr Asp Pro Glu Val Ser Ser Val Val Arg Lys Ala Gly

275 280 285

Glu Ala Val Ala Ala Ala Gly Tyr Glu Val Asp Glu Ile Asp Ala Pro

290 295 300

Glu Tyr Leu Glu Thr Arg Gln Ile Trp Leu Asp Phe Leu Met Thr Glu

305 310 315 320

Val Asn Val Leu Gln Asp Leu Ile Thr Glu Pro Met Gly Pro Ala Gly

325 330 335

Arg Gln Phe Leu Ser Asp Phe Val Asp Leu Ala Ala Pro Leu Asp Leu

340 345 350

Pro Gly Tyr Ile Asp Leu Phe Val Arg Arg Arg Arg Met Ser Arg Val

355 360 365

Trp Asn Asp Phe Phe Gln Glu Tyr Pro Val Ile Ile Ala Pro Thr Trp

370 375 380

Leu Asp Val Ala Phe Glu His Asp Trp Asp Leu Lys Ser Val Ala Asp

385 390 395 400

Thr Val Asp Asn Cys Gly Pro Ile Val Pro Ala Asn Val Leu Gly Leu

405 410 415

Pro Ala Ala Val Thr Phe Gly Gly Leu Ala Lys Gly Met Pro Val Gly

420 425 430

Val Gln Cys Ile Ala Ala Ala Phe His Asp Asp Gln Ala Met Gln Val

435 440 445

Ala Glu Val Ile Glu Ala Ala Val Gly Ala Thr Arg Pro Val Ser Pro

450 455 460

Phe Ile Asn Ala Gly

465

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggaattcca tatgtcagat cagttgtggt caaagag 37

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgaga ccagcgttga tgaacgg 27

Claims

1.一株异菌脲降解YJN-5,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNO.M2017440。

2.一个水解酶基因ipaH，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

3.权利要求2所述的水解酶基因ipaH编码的水解酶蛋白质IpaH，其特征在于氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

4.含有权利要求2所述的水解酶基因ipaH的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于将权利要求1所述的水解酶基因ipaH插入pET-29a(+)的NdeI和XhoI位点之间所得。

6.含有权利要求2所述的水解酶基因ipaH的基因工程菌，所述的基因工程菌优选以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株。

7.权利要求1所述的异菌脲降解YJN-5在消除土壤、水体或农产品中异菌脲残留中的应用。

8.权利要求2所述基因ipaH在构建降解异菌脲的转基因作物中的应用。

9.权利要求2所述基因ipaH在去除水体中异菌脲残留中的应用。

10.权利要求3所述水解酶IpaH在消除土壤、水体或农产品中异菌脲残留中的应用。