CN110964660A - 一种用于降解氯苯类污染物的节杆菌及其培养方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于降解氯苯类污染物的节杆菌及其培养方法和应用，用于降解氯苯类污染物的节杆菌命名为金黄色节杆菌，该菌株保藏于广东微生物研究所，保藏号：GDMCC NO.60676，保藏日期：2019年5月15日。本发明提供的用于降解氯苯类污染物的节杆菌为好氧型革兰氏染色阳性菌，利用如一氯苯作为碳源和能源进行生长，并将其彻底降解为CO2、H2O和无机氯化物。在30℃、pH＝6.8‑7.2条件下对氯苯类VOCs降解效率最高，该菌株具有良好的底物适应能力和多底物降解能力，对一氯苯的最大降解效率达90％。通过对该菌株生物学特性和降解特性研究，能为医化行业氯苯类VOCs废气的生物处理提供技术支撑。

Description

一种用于降解氯苯类污染物的节杆菌及其培养方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物菌株领域，具体涉及一种用于降解氯苯类污染物的节杆菌及其培养方法和应用。
背景技术
我国经济的快速增长带来了严重的环境问题，如挥发性有机污染物(VolatileOrganic Compounds,VOCs)在多数行业生产过程中的泄露与排放等导致的污染，进而严重威胁人体健康。对大气环境中VOCs的来源进行研究发现：对于VOCs排放的人为源年平均贡献率分别为汽车尾气62％，石油液化气10％，汽油挥发9％，涂料6％，石油化工6％，未知源6％。并且VOCs废气一般都具有一定毒性，对人体与植物环境等都会造成危害。有研究表明,约70％的VOCs类物质对人体具有致癌性。还能损害细胞内部代谢活动。其中一些挥发性卤代烃还对动物的中枢神经系统产生不可逆转的损害。所以对于工业企业VOCs的排放浓度国内外环境监管部门制定了一系列严格的排放标准。
目前，国内外常见VOCs控制技术主要分为两大类，即物化处理技术和生物处理技术。其中，针对医药化工等工业企业排放的氯代烃、苯系物较成熟的治理技术主要有燃烧法和催化氧化法。但是，当废气中存在氯代烃、苯系物时，可能会产生大量一级致癌物“二噁英”，而这一问题已引起了社会各界人士的广泛关注。而催化氧化法是利用催化剂的催化活性，氧化吸附在催化剂表面的VOCs，最终将其转化为CO2和H2O等小分子物质，无二次污染，但是催化剂的失活和难以固定，已成为其商业应用的限制因素。
而生物处理技术由于环境友好、投资运行费用低等特点，已发展成为当前的主要处理方法之一。生物法是基于真菌、细菌的自然代谢过程去除污染物的技术，可将污染物彻底降解为CO2、H2O和无机氯化物，从而使废气中的污染物得到彻底去除。生物法由于具有反应条件温和常温、常压，无二次污染，具有低耗、高效和环境安全的优点，尤其在处理大流量、低浓度的有机废气时更显其经济性和优越性，因而受到了越来越多的重视,当前在我国也得到一定程度的工业应用。针对特定挥发性有机物(如苯系物、氯代烃)的高效微生物菌株的选育对于有机废气生物处理装置的处理效果及长期稳定运行至关重要，专门针对氯苯类 VOCs降解菌株的筛选分离是当今学术界的研究热点。
目前，可降解CBs的菌株已有很多发现。刘慧慧(环境工程学报，2011.5.9:2151-2155)等，从盐城芦苇湿地根际土壤中分离得到一株可高效降解1,2-二氯苯的菌株Bacillus cereus。在适宜条件下1,2-二氯苯降解率达到80.3％。戴青华(环境工程学报，2009.3.12:2219-2222)等从某污水处理曝气池的活性污泥中分离出一株能够以1,4-二氯苯为唯一碳源和能源生长的菌株Flavobacterium sp.。1,4-二氯苯降解率最高达94.5％。然而，通过对当前氯苯类降解菌研究现状的分析发现，基于医化行业筛选出的氯苯类VOCs降解菌在高浓度和低浓度之间没有深层次的研究，对于菌种的培养时间也没有具体要求，导致培养时间各不一样，最佳降解效率亦各有差异。
因此，筛选分离并利用定向驯化方法获得可降解氯苯类VOCs高效降解菌株，通过对其生物学特性和降解特性的研究，可为医化行业氯苯类VOCs废气的生物处理提供技术支撑和理论依据。
发明内容
1.本发明提供了一种用于降解氯苯类污染物的节杆菌，该菌株可有效降解氯苯类VOCs。
2.一种用于降解氯苯类污染物的节杆菌，命名为金黄色节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens LY)，保藏号：GDMCC NO.60676。
该菌株的具体保藏信息如下：
名称：Paenarthrobacter ureafaciens LY
保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC
保藏单位地址：中国广州市先烈中路100号
保藏时间：2019年5月15日
保藏编号：GDMCC NO：60676
3.金黄色节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens LY)属于Paenarthrobacter属；为好氧革兰氏阳性菌，其菌落呈圆状，乳黄色，不透明，菌落边缘为锯齿状，边缘光滑整齐，直径约2μm。
4.本发明还提供了一种用于降解氯苯类污染物的节杆菌的培养方法，从郑州市某水务公司提取回流污泥，该污泥样品经长期投加液体培养液曝气定向驯化后，在液体培养基反复培养，在无菌操作台用固体培养基(培养基添加目标污染物)进行涂布置于恒温箱30℃培养，经多次分离，提纯出具有高效降解特性的优势菌种。
5.一种用于降解氯苯类污染物的节杆菌的培养方法，包括以下步骤：
1)取郑州市某水务公司的回流污泥，投加液体培养液曝气培养，然后将富集菌液的离心底物、液体培养基和氯苯类有机物加入血清瓶中，在摇床中培养，得到微生物群落。
2)利用固体培养基结合涂布法进行目标菌株的纯化分离，得到用于降解氯苯类污染物的节杆菌。
3)以液体培养基1L计，所述的液体培养基由如下重量的组分组成：
0.1g MgCl2·6H2O，0.002g ZnSO4·7H2O，0.0002g Na2MoM4·2H2O，0.001g CaCl2·2H2O，0.0002g CuSO4·5H2O，0.0004g CoCl2·6H2O，2.5g(NH4)2SO4，0.005g FeSO4·7H2O，1.6g K2HPO4·2H2O，0.8g NaH2PO4·2H2O，0.001g MnCl·4H2O和1L蒸馏水。
4)以固体培养基1L计，所述的固体培养基由如下重量的组分组成：
0.5g(C6H10O5)n，0.024g MgSO4，0.5g Peptones，0.5g C6H12O6，0.5g Yeast，0.3gK2HPO4，0.5g Casein hydrolysate，15.0g Agar，和1L H2O。
5)以营养液1L计，所述的四种营养液由如下重量的组分组成：
阴离子：0.002g Na2MoM4·2H2O，16.0g K2HPO4，8.0g NaH2PO4·2H2O和1L蒸馏水。
A营养液：0.05g FeSO4·7H2O，0.02g ZnSO4·7H2O，0.002g CuSO4和1L H2O。
B营养液：25.0g(NH4)2SO4和1L H2O。
C营养液：0.01g CaCl2·2H2O，1.0g MgCl2，0.004g CoCl2·6H2O，0.001g MnCl·4H2O 和1L H2O。
6.利用固体培养基结合涂布法进行目标菌株的纯化分离，即取100μL前面反复纯化后的液体培养基中的两种微生物菌液，再通过固体培养基实验方法步骤涂布到固体培养基上。放入30℃恒温培养箱中进行培养。4天之后，同样用固体培养基试验方法挑出单菌落培养，在液体培养基中扩大培养得到还原菌种，然后将菌液加入消过毒的50mL离心管中在运行条件为5000r/min，15min，15℃的离心机下离心，弃去上清液。
7.本发明用于降解对氯苯类VOCs菌株可用于处理氯苯类有机废气。具体为将本发明用于降解氯苯类污染物的节杆菌接种至生物膜反应器内进行氯苯类有机废气处理，经挂膜驯化至稳定阶段即可，获得了良好的氯苯类VOCs降解效果。
8.本发明用于降解氯苯类污染物的节杆菌降解氯苯类VOCs在30-35℃，pH＝6.8-7.2条件下进行，实验表明，该菌株可在96h内将液体培养基中不同初始浓度(50-350mg/L，以血清瓶体积计算)的氯苯类VOCs彻底降解，具有较强的底物适应能力；该菌株还有良好的底物宽泛性，可将氯苯类VOCs作为碳源和能源加以利用并彻底矿化为CO2、H2O和无机氯化物。
9.公开(公告)号为CN105032171A的发明专利描述了一种应用微生物优势菌群净化含挥发性有机废气的装置和方法(公开(公告)日：2015-11-11)，该申请所述方法包括：(1)优势菌种选取分离、(2)菌种驯化、(3)菌液配比、(4)生物净化塔内填料挂膜、调试及运行。该装置和方法具有处理效率高，投资及运行成本低，操作简单，环境友好，无二次污染的优点。但其中涉及的节杆菌(Arthrobacter)为气体生物净化反应器中的优势菌株之一，以宏观描述为主，并未阐明该菌株在氯苯类有机物降解过程中的具体作用和降解能力，且缺少氯苯作为主要目标底物条件下，对节杆菌(Arthrobacter)形态、生长特性、生物学信息等微观描述。
10.本发明用于降解氯苯类污染物的节杆菌，命名为金黄色节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens LY)，菌株为革兰氏染色阳性菌，其菌落呈圆状，乳黄色，不透明，菌落边缘为锯齿状，直径约2μm。具有氯苯类VOCs高效降解能力，能够以氯苯类VOCs为碳源和能源进行生长并完全降解不同初始浓度底物；该菌株能以共代谢方式同时降解氯苯类 VOCs；本发明为生物法处理含氯苯类VOCs有机废气的工业提供了一条可行的技术方向。
附图说明
图1为金黄色节杆菌系统进化树；
图2为菌株革兰氏染色照片；
图3为金黄色节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens LY)显微镜照片；
图4为不同pH对金黄色节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens LY)降解C6H5Cl效率影响；
图5为不同C6H5Cl浓度条件下金黄色节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens LY)降解 C6H5Cl效率影响；
图6为金黄色节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens LY)对不同底物的降解能力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不限于此：
实施例1：菌株的分离与鉴定：
1.菌株的驯化选育
将取自水务公司(2018年3月、中原环保股份有限公司郑州市某水务公司)污水排放口的活性污泥(投加液体培养液)进行曝气驯化(2d)，然后将富集菌液的离心底物(5mL)、液体培养基和不同浓度氯苯类有机物加入血清瓶中，在摇床中培养4天，获得可降解目标污染物(氯苯类VOCs)的微生物群落；利用固体培养基涂布法进行可降解菌株的纯化分离，即取100μL前面反复纯化后的液体培养基中的两种微生物菌液，通过之前的固体培养基实验方法步骤涂布到固体培养基上。倒置于恒温培养箱，30℃培养4天，挑取单菌落于液体培养基中，在液体培养基中扩大培养得到还原菌种，然后将菌液离心(5000r/min，15min，15℃)底物送去菌种鉴定。菌株命名为金黄色节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens LY)。
该菌株短期保藏，接入斜面固体培养基，于冰箱4℃保藏。长期保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：中国广州市先烈中路100号，保藏日期：2019.5.15，保藏编号：GDMCC NO：60676。
2.培养条件
以液体培养基1L计，所述的液体培养基由如下重量的组分组成：
0.1g MgCl2·6H2O，0.002g ZnSO4·7H2O，0.0002g Na2MoM4·2H2O，0.001g CaCl2·2H2O， 0.0002g CuSO4·5H2O，0.0004g CoCl2·6H2O，2.5g(NH4)2SO4，0.005g FeSO4·7H2O，1.6g K2HPO4·2H2O，0.8g NaH2PO4·2H2O，0.001g MnCl·4H2O和1L蒸馏水。
以固体培养基1L计,所述的固体培养基由如下重量的组分组成：
0.5g(C6H10O5)n，0.024g MgSO4，0.5g Peptones，0.5g C6H12O6，0.5g Yeast，0.3gK2HPO4，0.5g Casein hydrolysate，15.0g Agar，和1L H2O。搅拌溶解，灭菌15min。
以营养液1L计，所述的四种营养液由如下重量的组分组成：
阴离子：0.002g Na2MoM4·2H2O，16.0g K2HPO4，8.0g NaH2PO4·2H2O和1L蒸馏水。
A营养液：0.05g FeSO4·7H2O，0.02g ZnSO4·7H2O，0.002g无水硫酸铜和1L纯水。
B营养液：25.0g(NH4)2SO4和1L蒸馏水。
C营养液：0.01g CaCl2·2H2O，1.0g MgCl2，0.004g CoCl2·6H2O，0.001g MnCl2·4H2O和1 L蒸馏水。
培养条件：最适宜生长pH为6.8-7.2；最适宜生长温度为30-35℃。
3.菌株形态及分子生物学鉴定
得到的用于降解氯苯类污染物的节杆菌测得其16S rRNA基因序列与Genbank中已存在的核酸序列应用BLAST程序进行同源性比较，发现其与Paenarthrobacterureafaciens菌属的多个菌株序列相似性达99％以上。选取若干株菌株利用DNAStar软件将这些相应序列与该菌序列进行同源性比较，建立系统进化树，得到该菌的系统进化树(如图1)，并上传基因序列至Genbank，获取基因序列号(MN080147)；通过构建系统发育关系，确定该菌属与Paenarthrobacter ureafaciens的亲缘关系最近，相似度大于99％。因此将该菌株归属为 Paenarthrobacter ureafaciens属，并命名为Paenarthrobacter ureafaciensLY。
该菌株属于Paenarthrobacter属，菌株为革兰氏染色阳性菌，其菌落呈圆状，乳黄色，不透明，菌落边缘为锯齿状，当量直径约1.2μm(如图2、图3所示)。
实施例2:金黄色节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens LY)降解特性
1.不同pH条件(5.6-8.4)下节杆菌降解特性
取上述四种营养液各10mL于9个血清瓶中，定容至200mL。取160μL C6H5Cl、5mL 菌液加于Paenarthrobacter ureafaciens LY血清瓶中。用HCl(HCl 10mL加蒸馏水50mL配置)和NaOH(NaOH 10g加蒸馏水50mL配置)将1、2、3、4、5号培养瓶的pH值分别调节到pH＝5.3、pH＝6.2、pH＝7.0、pH＝8.0、pH＝9.0，分别置于30℃、180r·min-1恒温摇床内连续培养，间隔一定时间取样分析(结果如图4)。结果表明，Paenarthrobacter ureafaciens LY的最适降解pH为7.0，在C6H5Cl的逐步降解过程中，其降解特性明显优于其他pH值；pH值的过高或过低(小于6或大于8)，都会影响Paenarthrobacter ureafaciens LY的降解过程(底物降解不彻底)；在不同pH环境中节杆菌均能不同程度的降解C6H5Cl，为其在不同pH环境中的应用提供了保证。
2.不同C6H5Cl浓度下Paenarthrobacter ureafaciens LY的降解特性
以C6H5Cl作为节杆菌的唯一碳源，标号1、2、3、4号瓶分别加入梯度浓度的C6H5Cl和5mL Paenarthrobacter ureafaciens LY。分别置于30℃、180r·min-1恒温摇床内连续培养，间隔一定时间取样分析(结果如图5)。结果表明，Paenarthrobacter ureafaciens LY适宜的C6H5Cl浓度在实验室条件为0mg/L-200mg/L，对C6H5Cl的降解效率保持在80％以上，说明该菌株对C6H5Cl具有高效稳定的降解能力。
3.Paenarthrobacter ureafaciens LY降解不同底物分析
以C6H5Cl，C8H10作为节杆菌生长的碳源，标号1(1’)、2(2’)、3(3’)号瓶分别加入约150-200mg·m-3C6H5Cl，60-120mg·m-3C8H10和5mL Paenarthrobacter ureafaciens LY。分别置于30℃、180r·min-1恒温摇床内连续培养，间隔一定时间取样分析(结果如图6)。试验结果表明，Paenarthrobacter ureafaciens LY对C6H5Cl具有最佳降解效率，且最大降解效率达90％。

Claims (8)

1.一种用于降解氯苯类污染物的节杆菌，其特征在于，命名为金黄色节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens LY)，保藏号：GDMCC NO.60676，保藏日期：2019年5月15日。
2.基于权利要求1中一种用于降解氯苯类污染物的节杆菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取郑州市某水务公司回流污泥，投加液体培养液曝气培养，然后将富集菌液的离心底物、液体培养基和氯苯类VOCs加入血清瓶中，在摇床中培养，得到微生物群落；
2)基于涂布法于固体培养基进行目标菌株的纯化分离，得到用于降解含氯含苯有机物的菌株。
3.根据权利要求2所述的一种用于降解氯苯类污染物的节杆菌的培养方法，其特征在于，以液体培养基1L计，所述的液体培养基由如下重量的组分组成：
0.1g MgCl2·6H2O，0.002g ZnSO4·7H2O，0.0002g Na2MoM4·2H2O，0.001g CaCl2·2H2O，0.0002g CuSO4·5H2O，0.0004g CoCl2·6H2O，2.5g(NH4)2SO4，0.005g FeSO4·7H2O，1.6g K2HPO4·2H2O，0.8g NaH2PO4·2H2O，0.001g MnCl·4H2O，采用蒸馏水补至1L。
4.根据权利要求2所述的一种用于降解氯苯类污染物的节杆菌的培养方法，其特征在于，以固体培养基1L计，所述的固体培养基由如下重量的组分组成：
0.5g(C6H10O5)n，0.024g MgSO4，0.5g Peptones，0.5g C6H12O6，0.5g Yeast，0.3gK2HPO4，0.5g Casein hydrolysate，15.0g Agar，和1L H2O。
5.根据权利要求2所述的一种用于降解氯苯类污染物的节杆菌的培养方法，其特征在于，以营养液1L计，所述的四种营养液由如下重量的组分组成：
阴离子：0.002g Na2MoM4·2H2O，16.0g K2HPO4，8.0g NaH2PO4·2H2O和1L蒸馏水；
A营养液：0.05g FeSO4·7H2O，0.02g ZnSO4·7H2O，0.002g无水硫酸铜和1L纯水；
B营养液：25.0g(NH4)2SO4和1L蒸馏水；
C营养液：0.01g CaCl2·2H2O，1.0g MgCl2，0.004g CoCl2·6H2O，0.001g MnCl·4H2O和1L蒸馏水。
6.基于权利要求1所述的用于降解氯苯类污染物的节杆菌在处理氯苯类有机废气中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将权利要求1中的用于降解氯苯类污染物的节杆菌接种至生物膜反应器内进行氯苯类有机废气处理，经驯化至稳定阶段即可。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，降解氯苯类VOCs在25-35℃、pH＝5.6-8.4条件下进行。
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