CN108410756B - 嗜吡啶红球菌及其在降解有机污染物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种嗜吡啶红球菌及其在降解有机污染物中的应用，本发明提供的嗜吡啶红球菌可降解初始浓度0‑2.5mM的邻二甲苯，降解终产物为二氧化碳，水，大部分底物被转化为生物量，去除率为100％，平均降解速度为0.15mM/h；本发明嗜吡啶红球菌还能用于降解其他工业常见有机污染物，尤其是甲苯、乙苯、乙酸乙酯、乙酸丁酯等。本发明能实现工业废水废气中邻二甲苯的高效净化，且不产生任何二次污染。容易推广，净化成本低。

Description

嗜吡啶红球菌及其在降解有机污染物中的应用
(一)技术领域
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株具有邻二甲苯高效降解能力的嗜吡啶红球菌Rhodococcussp.ZJUT312及其在降解邻二甲苯中的应用。
(二)背景技术
二甲苯是一种环境中广泛存在的挥发性有机化合物，主要由原油经石油化工过程制得，常用作颜料油漆等的稀释剂，印刷、橡胶、皮革工业的溶剂。同时也是清洁剂、去油污剂和航空燃料中的一种成分、化学工厂和合成纤维工业的原材料和中间物质、织物和纸张的涂料和浸渍料。二甲苯有3种同分异构体，其中邻二甲苯具有较强的毒性，低浓度时能刺激皮肤、粘膜，可以经皮肤渗透入体内高浓度时，可以麻醉中枢神经系统，使人神志不清。长期接触可影响肝、肾功能，会引起神经衰弱综合症。
目前，已有吸附，吸收，燃烧，膜分离，光催化氧化和等离子等物理化学被用于邻二甲苯的去除，但其成本高，易造成二次污染。生物处理法具有处理效果好、费用低、对环境影响小、无二次污染及应用范围广的优点，较为常见的生物净化工艺包括生物过滤、膜生物反应器、生物洗涤法以及生物滴滤法。这些生物过程的成功应用不仅依赖于各生物反应器配置，而且高度依赖于特异性降解微生物菌株的筛选。在二甲苯的三种异构体中，邻二甲苯是最难被微生物降解的。目前，国内外学者陆续筛选出一些能够降解苯系物的微生物，包括Comamonas sp.JB、Cladophialophora sp.strain T1、Janibacter sp.SB2、Pseudomonasputida BCNU 106、Pseudomonas Putida F1、Pseudoxanthomonas spadix BD-a59、Pseudomonas putida OX1、Pseudomonas sp.strain FMB08和Rhodococcus sp.BTO62，但是它们的降解能力有限导致速度很慢(0.004-5mg/(L·h)-1)，阻碍了其工业应用。
本发明的嗜吡啶红球菌(Rhodococcussp.)ZJUT312对邻二甲苯的平均降解速度高达0.15mM/h(15.6mg/(L·h)-1)，并且生长环境温和，易扩大培养。该降解菌的发现对于工业废水废气中等苯系污染物的高效净化具有重要意义。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一株快速、高效、耐受能力强(0.65-3mM)，且具有有机污染物特别是邻二甲苯降解能力的嗜吡啶红球菌及其降解有机污染物的应用。
本发明采用的技术方案：
本发明提供一株具有邻二甲苯降解能力的新菌株--嗜吡啶红球菌(Rhodococcusspyridinivorans)ZJUT312，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017597，保藏日期为2017年10月23日，保藏地址为中国-武汉-武汉大学，邮编430072。
本发明嗜吡啶红球菌CCTCC NO：M2017597的基本特征为：菌落浅粉色，边缘整齐，不透光，光滑湿润，易挑取。透射电镜下观察该菌体的形态为短杆菌，无鞭毛，革兰氏染色阳性。
本发明还提供一种所述嗜吡啶红球菌在降解有机污染物中的应用，具体所述的应用是将嗜吡啶红球菌CCTCC NO：M2017597经扩大培养获得的静息细胞加入pH＝6-8、含有机污染物的无机盐培养液中，在25-35℃条件下进行反应，实现有机污染物的降解。
进一步，所述有机污染物包括邻二甲苯、甲苯、乙苯、乙酸乙酯和乙酸丁酯。
进一步，所述无机盐培养液中，静息细胞加入量以菌体干重计为10-50mg/L。
进一步，所述无机盐培养液中有机污染物的初始浓度为0.5-3mM。
进一步，所述无机盐培养液组成为：KH2PO4 1g/L、ZnSO4·7H2O 0.1mg/L、Na2HPO44.5g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、FeSO4·7H2O 1mg/L、MgSO4 0.1g/L、CaCl2 0.02g/L、FeSO4·7H2O1mg/L、CuSO4·5H2O 0.02mg/L、CoCl2·6H2O 0.02mg/L、MnSO4·4H2O 0.1mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.02mg/L，H3BO3 0.02mg/L，pH 6-8，溶剂为去离子水。
进一步，所述嗜吡啶红球菌静息细胞按如下步骤制备：
(1)斜面培养：
将嗜吡啶红球菌CCTCC NO：M2017597接种至LB液体培养基中在30℃，160rpm下培养2d，使保藏的细菌活化复苏，再将活化的细菌画线于固体LB平板30℃培养箱培养，取单菌落继续平板画线以检测细菌的纯度，得到可常规保存(4℃)的细菌斜面，该细菌斜面需要每三个月转接一次，以保证菌种的活性；LB固体培养基组成：5g/L酵母膏，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，15-20g/L琼脂，pH自然，溶剂为去离子水；
(2)扩大培养
将步骤(1)斜面菌体接种至LB液体培养基中，在30℃、160rpm下培养12h，获得扩大培养液，离心，收集湿菌体，无机盐培养液洗涤，获得嗜吡啶红球菌静息细胞；LB液体培养基组成：5g/L酵母膏，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，pH自然，溶剂为去离子水。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明提供的嗜吡啶红球菌可降解初始浓度0-2.5mM的邻二甲苯，降解终产物为二氧化碳，水，大部分底物被转化为生物量，去除率为100％，平均降解速度为0.15mM/h(15.6mg/(L·h)-1)；本发明嗜吡啶红球菌还能用于降解其他工业常见有机污染物，尤其是甲苯、乙苯、乙酸乙酯、乙酸丁酯等。本发明能实现工业废水废气中邻二甲苯的高效净化，且不产生任何二次污染。容易推广，净化成本低。
(四)附图说明
图1为Rhodococcussp.ZJUT312在LB培养基上菌落形态照片。
图2为Rhodococcussp.ZJUT312的扫描电子显微镜照片(×20000)。
图3为Rhodococcussp.ZJUT312的系统发育树图。
图4为Rhodococcussp.ZJUT312降解不同浓度邻二甲苯曲线(a)及细菌生长曲线(b)。
图5不同初始浓度Rhodococcussp.ZJUT312对邻二甲苯的降解曲线(a)及其生长曲线(b)。
(五)具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：Rhodococcuss p.ZJUT312的分离、纯化及其鉴定。
1.Rhodococcus sp.ZJUT312的分离及纯化。
Rhodococcuss p.ZJUT312是从杭州萧山城市绿色能源能有限公司垃圾渗滤液处理废水中的活性污泥中驯化、分离得到的一株革兰氏阳性菌。具体步骤如下：
在300ml摇瓶中加入50ml无机盐培养液，并加入10ml活性污泥和500mg/L的邻二甲苯进行富集培养，待邻二甲苯浓度为初始的50％时从中取出5ml富集液于50ml新鲜无机盐中，加入相同量的邻二甲苯，重复上述富集过程5次后，将最后一次富集液梯度稀释涂布LB固体培养基，选择单菌落分离平板画线纯化(图1)，将得到的备选菌加入无机盐培养基，并加入邻二甲苯作为唯一的碳源及能源进行验证，得到目的菌株ZJUT312，通过扫描电子显微镜确定其外部形态(图2)。
菌株ZJUT312特征：菌落浅粉色，边缘整齐，不透光，光滑湿润，易挑取。透射电镜下观察该菌体的形态为短杆菌，无鞭毛，革兰氏染色阳性。
无机盐培养液配方为：KH2PO4 1g/L、ZnSO4·7H2O 0.1mg/L、Na2HPO4 4.5g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、FeSO4·7H2O 1mg/L、MgSO4 0.1g/L、CaCl2 0.02g/L、FeSO4·7H2O 1mg/L、CuSO4·5H2O 0.02mg/L、CoCl2·6H2O 0.02mg/L、MnSO4·4H2O 0.1mg/L、Na2MoO4·2H2O0.02mg/L，H3BO3 0.02mg/L，pH 7，溶剂为去离子水。
LB固态培养基的成分为：5g/L酵母膏，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，18g/L琼脂，pH自然，溶剂为去离子水。上述所有培养基需经高温高压(121℃，15min)灭菌后使用。
2.菌株ZJUT312的鉴定
通过16S rRNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定该菌株为RhodococcusSp.。具体步骤如下：
采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程股份有限公司)提取和纯化菌株ZJUT312的DNA，4℃保存。用细菌的通用引物对纯化的DNA进行PCR扩，引物分别为7F(CAGAGTTTGATCCTGGCT)和1540R(AGGAGGTGATCCAGCCGCA)，PCR反应程序设定为94℃预变性4min，然后94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环30个周期，最后72℃修复延伸10min。将PCR产物纯化回收后进行测序(上海生物工程股份有限公司)，16S rRNA测序结果(SEQ ID NO.1所示)上传至NCBI，获得登录号MF503599，同时同NCBI中的基因序列进行同源性比较，发现其属于Rhodococcus属，与Rhodococcus pyridinvorans.DSM 4455的同源性为97％(图3)。通过16S rRNA序列分析和biolog实验鉴定菌株ZJUT312为嗜吡啶红球菌(Rhodococcuss p.)ZJUT312，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017597，保藏日期为2017年10月23日，保藏地址为中国-武汉-武汉大学，邮编430072。
实施例2嗜吡啶红球菌静息细胞
(1)斜面培养：
将嗜吡啶红球菌CCTCCNO：M2017597接种至LB液态培养基中，在30℃、160rpm下培养活化2d，再将活化的细菌画线于固体LB平板30℃培养箱培养，取单菌落继续平板画线以检测细菌的纯度，进行LB试管斜面常规(4℃)保存。LB固体培养基组成同实施例1。
(2)扩大培养
将步骤(1)斜面菌体接种至LB液体培养基中，在30℃、160rpm下培养12h，获得扩大培养液，离心，收集湿菌体，无机盐培养液洗涤，获得嗜吡啶红球菌CCTCCNO：M2017597静息细胞。LB液体培养基组成是将LB固体培养基中琼脂去除，其它相同。
实施例3：Rhodococcussp.CCTCCNO：M2017597对不同浓度邻二甲苯的降解性能检测。
将无机盐培养液(组成同实施例1)分装于体积均为330ml的摇瓶中，每瓶50ml，110℃灭菌40min。灭菌结束后室温放置2天，确定无杂菌生长。加入终浓度达到30mg/L(以细胞干重记)实施例2方法获得的静息细胞，然后加入邻二甲苯作为唯一碳源使其终浓度分别为0.65、1、1.5、2.5、3mM，摇瓶用聚四氟乙烯瓶塞密封后，30℃，160rpm摇床培养，并做不加细菌的空白对照。定时测定摇瓶中残留的邻二甲苯浓度及生物量，绘制菌株对于不同初始浓度邻二甲苯的降解曲线，并计算相应的平均降解速率(V平均＝C邻二甲苯/H总降解时间，C邻二甲苯为残留的邻二甲苯浓度)，结果见图4所示。
图4中(a)、(b)为菌株对不同初始浓度邻二甲苯的降解和菌体的自身生长情况。结果表明，当邻二甲苯浓度低于2.5mM时，Rhodococcussp.CCTCCNO：M2017597可以快速的降解所添加的底物，同时细菌的量也在快速增加，底物的逐渐减少和细菌的大量繁殖，使得平均降解速度高达0.1、0.117、0.125、0.15mM/h，随着底物浓度的增加，完全降解底物所需要的时间越长；当邻二甲苯的浓度增高至3mM时，该菌初始8h对底物的降解较慢，是因为高浓度的底物对细菌的生长起到抑制作用，微生物的生长受到限制，使得Rhodococcussp.CCTCCNO：M2017597不能在短时间内大量繁殖，随后随着菌体菌体量的增加，底物对细菌的抑制作用逐渐解除，开始快速降解邻二甲苯，同时细菌的质量也开始快速增大。而且大部分的底物被用于微生物自身生长，随着底物的量的增加，最终所得微生物的质量也增加。
结论：Rhodococcussp.CCTCCNO：M2017597能完全降解0.65-3mM的邻二甲苯，平均速度为0.1-0.15mM/h，邻二甲苯被完全利用后，细菌CCTCCNO：M2017597的质量也明显增加。
实施例4：不同浓度Rhodococcussp.CCTCCNO：M2017597对邻二甲苯的降解性能探究。
按实施例2中邻二甲苯终浓度改为1mM，静息细胞初始浓度分别为10、15、30、40、50mg/L，其它操作同实施例2。
结果如图5中(a)、(b)所示，1mM的邻二甲苯可以在6.5-12.5h内被完全降解，初始加入的细菌的量对降解速度有明显的影响，初始菌体浓度为10、15、30mg/L时，平均降解速度为0.09、0.11、0.125Mm/h，虽然菌体浓度增加至40、50mg/L时，降解速度也有所提升，但是促进作用并不是很明显，这是因为菌体浓度过大时，环境中除了底物的其他因子成为限制因素(无机元素、微量元素等)。图5中(b)显示若底物被完全降解则生物量不再增加，而且会在短时间减少，可能是因为此时细胞开始死亡、裂解。
结论：结果表明，在50ml反应系统，初始菌体浓度维持在30mg/L较为合理。
实施例5:Rhodococcussp.CCTCCNO：M2017597对工业常见有机污染物降解性能分析
将实施例2中邻二甲苯分别改为苯、甲苯、乙苯、间二甲苯、对二甲苯、乙酸乙酯、乙酸丁酯作为唯一碳源，初始浓度均为100mg/L，其它操作同实施例2，结果见表1。
表1 Rhodococcussp.ZJUT312对其他VOCs去除
Figure BDA0001577228260000061
结果如表1所示，Rhodococcussp.CCTCCNO：M2017597对不同的VOCs的降解能力不同，因乙酸乙酯和乙酸丁酯的无环短链结构，使其去除效率可达100％；另外该菌对乙苯的降解效果也可达100％，在短时间内对其他苯系物的降解效果并不是很明显，但该降解能力与已报道的菌株具有相当的降解能力。结果表明，菌株能不同程度地降解上述有机污染物。
虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 嗜吡啶红球菌及其在降解有机污染物中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1370
<212> DNA
<213> 嗜吡啶红球菌(Rhodococcussp.)
<400> 1
ttggaagtgg aacgatgaag cccagcttgc tgggtggatt agtggcgaac gggtgagtaa 60
cacgtgggtg atctgccctg cactctggga taagcctggg aaactgggtc taataccgga 120
tatgacctcg ggatgcatgt cctggggtgg aaagtttttc ggtgcaggat gagcccgcgg 180
cctatcagct tgttggtggg gtaatggcct accaaggcga cgacgggtag ccggcctgag 240
agggcgaccg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg 300
gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagcgacg ccgcgtgagg gatgacggcc 360
ttcgggttgt aaacctcttt cacccatgac gaagcgcaag tgacggtagt gggagaagaa 420
gcaccggcca actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggtgcgagc gttgtccgga 480
attactgggc gtaaagagct cgtaggcggt ttgtcgcgtc gtctgtgaaa tcccgcagct 540
caactgcggg cttgcaggcg atacgggcag actcgagtac tgcaggggag actggaattc 600
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gtagtccacg ccgtaaacgg tgggcgctag gtgtgggttt ccttccacgg gatccgtgcc 780
gtagccaacg cattaagcgc cccgcctggg gagtacggcc gcaaggctaa aactcaaagg 840
aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag catgtggatt aattcgatgc aacgcgaaga 900
accttacctg ggtttgacat gtaccggacg actgcagaga tgtggtttcc cttgtggccg 960
gtagacaggt ggtgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1020
caacgagcgc aacccttgtc ctgtgttgcc agcacgtgat ggtggggact cgcaggagac 1080
tgccggggtc aactcggagg aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatgcc ccttatgtcc 1140
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agtcgctagt aatcgcagat cagcaacgct gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1320
accgcccgtc acgtcatgaa agtcggtaac acctgaagcc ggtggcctaa 1370

Claims (7)

1.嗜吡啶红球菌（Rhodococcus pyridinivorans）ZJUT312，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017597，保藏日期为2017年10月23日，保藏地址为中国-武汉-武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述嗜吡啶红球菌ZJUT312在降解有机污染物中的应用，其特征在于所述有机污染物为邻二甲苯、甲苯、乙苯、乙酸乙酯或乙酸丁酯。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用是将嗜吡啶红球菌CCTCC NO：M2017597经扩大培养获得的静息细胞加入pH=6-8、含有机污染物的无机盐培养液中，在25-35℃条件下进行反应，实现有机污染物的降解。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述无机盐培养液中静息细胞加入量以菌体干重计为10-50mg/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述无机盐培养液中有机污染物的初始浓度为0.5-3mM。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述无机盐培养液组成为：KH2PO4 1g/L、ZnSO4·7H2O 0.1mg/L、Na2HPO4 4.5g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、FeSO4·7H2O 1mg/L、MgSO4 0.1g/L、CaCl2 0.02g/L、CuSO4·5H2O 0.02mg/L、CoCl2·6H2O 0.02mg/L、MnSO4·4H2O 0.1mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.02mg/L，H3BO3 0.02mg/L，pH 6-8，溶剂为去离子水。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述嗜吡啶红球菌静息细胞按如下步骤制备：
（1）斜面培养：
将嗜吡啶红球菌CCTCC NO：M2017597接种至LB固体培养基中，在30℃下培养2d，获得斜面菌体；所述LB固体培养基组成：5g/L酵母膏，10g/LNaCl，10g/L蛋白胨，15-20g/L琼脂，pH自然，溶剂为去离子水；
（2）扩大培养
将步骤（1）斜面菌体接种至LB液体培养基中，在30℃、160rpm下培养12d，获得扩大培养液，离心，收集湿菌体，无机盐培养液洗涤，获得嗜吡啶红球菌CCTCC NO：M2017597静息细胞；LB液体培养基组成：5g/L酵母膏，10g/LNaCl，10g/L蛋白胨，pH 自然，溶剂为去离子水。
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