CN115449494B

CN115449494B - 一种嗜吡啶红球菌及其应用

Info

Publication number: CN115449494B
Application number: CN202211138432.XA
Authority: CN
Inventors: 张颖; 曲建华; 张鑫淼; 刘芮忻; 魏书奇; 张博; 姜昭; 陶月; 吴志欢
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2022-09-19
Filing date: 2022-09-19
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2042-09-19
Also published as: CN115449494A

Abstract

一种嗜吡啶红球菌及其应用，涉及环境污染生态修复技术领域。本发明的目的是为了解决现有的微生物针对环境中Bap存在降解效率低的问题。一种嗜吡啶红球菌，为嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)DNR25，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2022年6月21日，保藏号为GDMCC NO.62560。一种嗜吡啶红球菌的应用，所述的嗜吡啶红球菌用于去除苯并(a)芘。本发明可获得一种嗜吡啶红球菌及其应用。

Description

一种嗜吡啶红球菌及其应用

技术领域

本发明涉及环境污染生态修复技术领域，具体涉及一种嗜吡啶红球菌及其应用。

背景技术

苯并(a)芘(benzo(a)pyrene,Bap)是具有5环结构的、世界公认的强致癌性多环芳烃(PAHs)污染物，具有高度的稳定性、难降解、毒性强和“三致”(致癌、致畸、致突变)效应等特征。因此，Bap早被美国环保局列入优先控制有毒有机污染物的黑名单。它常存在于石油污染物中，通过石油开采与运输过程的泄漏、石油污染水灌溉及大气飘尘的沉降等途径进入土壤，由于Bap具有较高的辛醇－水分配系数和较高的蒸汽压，在自然环境中很难降解，因此很容易在土壤等环境中积累，造成土壤污染，因而受到越来越多研究者的关注。

Bap经多种途径进入土壤、大气和水体环境中，在不同环境介质和生物体组织中均有广泛检出，且通过迁移转化与生物链传递作用威胁生态系统安全与人体健康。大量研究证实，Bap由于具有神经毒性，对内分泌系统有干扰作用，同时具有生殖发育毒性、免疫毒性和致癌毒性，对人体健康和生态环境造成很大的威胁。因此，必须不断深入对降解技术的研究。

对于Bap的降解，我国目前主要采用的方法有化学氧化法和生物法，在诸多降解技术研究过程中，生物降解被认为是当前对于Bap降解最具有前景的手段之一，是污染修复和降低暴露风险的有效技术手段。微生物降解作为环境中有机污染物的重要降解途径，由于其成本低廉、可持续性高且降解效果明显，以及不会对环境造成二次污染，而受到人们的广泛关注。

Bap好氧微生物降解比厌氧微生物降解更高效快速且降解更彻底，然而目前所获得的微生物中，能够降解Bap的好氧微生物并不多且降解效果不显著。因此，寻找针对Bap的高效降解菌株，是对Bap污染进行环境治理和污染修复研究的热点问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的微生物针对环境中Bap存在降解效率低的问题，而提供一种嗜吡啶红球菌及其应用。

一种嗜吡啶红球菌，为嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)DNR25，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2022年6月21日，保藏号为GDMCC NO.62560。

一种嗜吡啶红球菌的应用，所述的嗜吡啶红球菌用于去除苯并(a)芘。

本发明的原理：

污染物浓度梯度驯化：在细菌培养基中加入靶向环境基质BaP，让嗜吡啶红球菌DNR25适应并依赖BaP，从而使其在BaP污染环境中也能表现出较好的生长趋势和降解特性。

最大污染物浓度驯化：高浓度胁迫处理的嗜吡啶红球菌DNR25表现出了较强的去除BaP的优势，说明了其对高环多环芳烃(BaP)具有较强的耐性特征。

固体无机盐培养基上菌株的驯化：由于外界环境的高浓度污染压力，单个嗜吡啶红球菌容易出现抗逆境冲击性差的问题；因此，通过固体无机盐培养基上菌株的驯化，富集嗜吡啶红球菌DNR25菌落降解BaP。

在梯度驯化过程中，随着BaP浓度的逐级提升，固体培养基中菌落数逐级递减，随着驯化逐渐达到稳定阶段，最终得到以BaP为唯一碳源的单一嗜吡啶红球菌DNR25菌落，既耐受高浓度BaP胁迫，又能表现出较强的BaP降解能力。

本发明的有益效果：

(1)随着对嗜吡啶红球菌认识和研巧的深入，越来越多的研究者发现该菌属菌株在各种污染物的降解方面发挥着巨大潜力，该菌对高分子量PAHs(三环以上的PAHs)具有较好的降解能力，能够以苯并[a]芘作为唯一碳源生长。刘芳等研究发现高分子量多环芳烃降解菌Sphingobium yanoikuyae不能以BaP为唯一碳源和能源进行降解，只能以共代谢的方式进行降解，且对10mg/L BaP的降解率仅为17％。

而本发明嗜吡啶红球菌DNR25经过污染物浓度梯度驯化法、最大污染物浓度驯化法和固体无机盐培养基上菌株的驯化，结果显示，该菌株在以BaP为唯一碳源的高浓度BaP胁迫下去除效果比低浓度表现突出，对高浓度BaP的胁迫具有良好的耐性；同时，该菌株对于3,4-苯并芘的降解效率较高，所需条件温和，在室温下就能很好的降解。由于3,4-苯并芘的细胞毒性及高环数，大多数已报道的能降解3,4-苯并芘的微生物耐受的底物浓度均不高，故而该菌株显示出了巨大的应用潜力，特别是在高浓度污染的土壤或水体中。

(2)在直接驯化条件下，即使经过多次扩大培养，菌种存活率仍极其有限，表明高浓度的Bap污染环境对嗜吡啶红球菌的生长繁殖有明显的抑制作用。因此，为了增强嗜吡啶红球菌对高浓度多环芳烃BaP环境的耐受能力，提高微生物在高浓度多环芳烃BaP环境中去除BaP的能力，本发明采用梯度驯化法筛选苯并芘降解菌。对于含BaP培养体系中的正常菌株，BaP浓度越高则延迟期越长，说明未驯化菌株对外界的BaP胁迫压力反应较为敏感。对于驯化菌株，生长情况最佳的为50mg/L BaP胁迫下的驯化菌株，即嗜吡啶红球菌DNR25。

本发明可获得一种嗜吡啶红球菌及其应用。

附图说明

图1为菌株DNR25的系统发育树；

图2为嗜吡啶红球菌DNR25对水体中BaP 7天的降解率；

图3为嗜吡啶红球菌DNR25对土壤中BaP 15天的降解率。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一种嗜吡啶红球菌，为嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinivorans)DNR25，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2022年6月21日，保藏号为GDMCC NO.62560。

具体实施方式二：本实施方式一种嗜吡啶红球菌的应用，所述的嗜吡啶红球菌用于去除苯并(a)芘。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同点是：一种嗜吡啶红球菌的应用，所述的嗜吡啶红球菌用于去除水体和土壤中的苯并(a)芘。

其他步骤与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同点是：所述的嗜吡啶红球菌在去除苯并(a)芘前采用污染物苯并(a)芘进行驯化，且驯化时苯并(a)芘的浓度为50mg/L。

其他步骤与具体实施方式二或三相同。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1：

1、样品来源：采集黑龙江省哈尔滨市某焦化场地Bap污染土壤样品。

焦化厂含有的Bap等大量有害物质已危害到周边各环境介质，是重要的污染源，严重危害人体健康及生命安全。采集自某焦化场地(0～20cm)土壤，去除样品中杂质，置于无菌袋中，灭菌采样袋收集并用样品冷藏箱迅速带回实验室。

2、主要实验试剂及培养基成分：

主要实验试剂包括：蛋白胨、氯化钠、琼脂、酵母粉和Bap等，以上药品均购置于阿拉丁试剂商城。

驯化培养基(g/L)：用丙酮配置500mg/L的Bap储备液，取一定量Bap储备液，置于灭菌的锥形瓶中，待丙酮挥发完全后加入灭菌的无机盐液体培养基/固体培养基。

无机盐液体培养基/固体培养基(g/L)：硫酸铵3g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钠0.5g、硫酸镁0.3g和微量元素溶液l mL，pH＝7.0，以ddH₂O定容至1000mL，121℃灭菌20min，备用。其中，微量元素溶液的配制为：三氯化铁0.3g、七水合硫酸亚铁0.3g、水合硫酸锰0.15g、硫酸锌0.14g和氯化钴0.2g，定容至1000mL，过滤除菌后备用。固体培养基在无机盐液体培养基的基础上加入20g琼脂，培养基倒入锥形瓶中，在121℃高温蒸汽下灭菌20min，备用。

LB富集培养基配方(液体)：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g和蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃下灭菌20min。

LB富集培养基配方(固体)：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、蒸馏水1000mL和琼脂20g，pH 7.0，121℃下灭菌20min。

3、主要实验仪器：

电子天平、烧杯、玻璃棒、锥形瓶、三角烧瓶、YXQ-100A立式压力蒸汽灭菌器、试管、接种环、酒精灯、SW-CJ-2D型超净工作台、SPX-250B-Z型生化培养箱、BSD-YX2200立式智能精密摇床、离心机、离心管和移液枪。

4、实验方法：

4.1污染物浓度梯度驯化法：

细菌驯化体系中BaP的浓度按5mg/L、10mg/L、50mg/L、75mg/L和100mg/L依次增加，7天为一个周期驯化，驯化共五个周期。

4.2最大污染物浓度驯化法：

细菌驯化体系BaP浓度为100mg/L，每7天一个周期进行驯化，驯化共五个周期，得到可以在BaP为唯一碳源的生长环境中存活或生长的菌群。

4.3固体无机盐培养基上菌株的驯化：

用平板划线法将得到的降解菌株转接至BaP浓度为5mg/L的固体培养基上进行培养，置于恒温培养箱中30℃下培养7天。7天后，用接菌环挑取形态不同、生长旺盛的菌落，转接至BaP浓度为10mg/L的灭菌固体培养基上继续平板划线分离纯化。每培养7天便将长出的单菌落接种至新鲜、灭菌的固体培养基中，直到BaP浓度增加至100mg/L且菌落形态不再发生变化，则完成降解菌在无机盐固体培养基中的进一步驯化过程，即得到纯种BaP降解菌株。

4.4梯度稀释涂布法：

吸取最后一个周期降解菌株筛选培养基中菌液1mL，按10倍稀释法将所取菌液稀释为10^-1～10^-6梯度的液体，取100μL液体涂布于酵母膏固体培养基上，用灭菌涂布棒涂抹均匀，放于30℃的恒温培养箱中进行培养。

4.5细菌的分离与纯化：

将已培养完毕梯度稀释涂布的平板在超净工作台中完成细菌的分离及纯化工作。长出单菌落之后，根据各菌落形态特征进行筛选，观察菌株的形态、直径大小、颜色及粘稠度等将不同类型的菌株进行分离，利用已灭菌的接种环蘸取菌株体在无机盐固体平板培养基上进行四区划线，四区平板在恒温培养箱中培养24h后将四区长出的单菌落挑出在无机盐平板培养基上进行一区划线。待一区划线平板长出菌株后在显微镜下观察菌株是否为单一类型的纯菌株，若不是则反复划线纯化直至筛选单一菌落得到纯菌。

4.6菌株降解能力测定：

将500mg/L的BaP丙酮储备液500μL添加至锥形瓶中，无菌条件下待正己烷挥发后，添加无机盐液体培养基50mL，BaP充分溶解后，使反应体系中BaP的最终浓度为5mg/L。将待测菌在无菌条件下接种于装有无机盐的锥形瓶中，充分混匀；再将降解反应体系置于恒温振荡培养箱中30℃、150r/min培养7d，测定体系中BaP含量，计算菌株的降解率，筛选出BaP降解率最高的菌株为目标菌株，命名为DNR25。

4.7菌株鉴定：

4.7.1菌株形态鉴定：

将菌株DNR25在LB平板上培养两天，对其进行形态观察和革兰氏染色，结果如表1所示，表1为目标菌株的形态鉴定；

表1

颜色

直径

质地

形状

边缘

表面

革兰氏染色

黄色

2mm

粘稠

圆形

整齐

平整

阳性

4.7.2菌株生理生化鉴定：

对菌株DNR25进行生理生化鉴定，结果如表2所示，表2为目标菌株的生理生化鉴定；

表2

VP测定	氧化酶	接触酶	淀粉酶	甲基红
					-	-	+	-	-

生理生化鉴定结果：VP试验反应阴性，氧化酶反应阴性，接触酶反应阳性，淀粉水解阴性，甲基红反应阴性。

4.7.3菌株16S rDNA鉴定：

采用菌落PCR方法，直接取单菌落裂解液为模板进行PCR。利用PCR扩增16S rDNA的通用引物，引物及测序工作皆由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

测序结果与通过MEGA7.0软件Alignment中的CLUSTAL W对目的序列和参考序列进行比对，参数为默认值。构建的系统发育树如图1所示。

结果显示，本发明所提供的嗜吡啶红球菌DNR25与嗜吡啶红球菌具有高达99.5％的同源性，因此认定本专利的菌株DNR25属于嗜吡啶红球菌属，其ITS的NCBI登录号为PRJNA854323。

5、降解试验：

5.1BaP污染水体：

(1)将嗜吡啶红球菌DNR25接种在含有20mL液体LB培养基中，30℃摇床震荡培养过夜活化。

(2)将培养过夜后的菌液8000r/min离心2min，弃上清，用无菌水重悬，再次以8000r/min离心2min，弃上清，加无菌水重悬。将重悬得到的菌液OD₆₀₀调至1.0，按5％(V/V)的接种量转接于含有50mL以BaP为单一碳源的MSM培养基的250mL三角摇瓶中，30℃、150r/min摇床震荡培养7d，分别在第1、3、5和7d取样，每个处理3组重复。

(3)分别加入等体积正己烷有机溶剂萃取，摇床振荡萃取30min，倒入分液漏斗中，静置15min，待液体分层后将下层有机相转入50mL离心管中，上层水相再次倒入三角瓶中，重复萃取1次。

(4)将2次萃取得到的共100mL萃取物离心，将上层残留的水分用移液器吸干。

(5)将2次所得的萃取物用旋转蒸发器在40℃水浴中减压蒸干，向蒸干后的圆底烧瓶中加入50mL色谱纯的乙腈使BaP充分溶解。

(6)取1mL所得的BaP的乙腈溶液用0.22μm的有机过滤器滤去杂质制得待测样品。

5.2BaP污染土壤：

(2)将培养过夜后的菌液8000r/min离心2min，弃上清，用无菌水重悬，再次以8000r/min离心2min，弃上清，加无菌水重悬。将重悬得到的菌液OD₆₀₀调至1.0，按5％(V/V)的接种量转接于浓度为30mg/kg的BaP的土壤中，30℃、150r/min摇床震荡培养15d，分别在第1、3、5、7、10和15d取样，每个处理3组重复。

(3)离心，上清液萃取方式同5.1。土样分别加入等体积正己烷：丙酮＝1：1的有机溶剂萃取，超声萃取2h，离心后取上清液氮吹后用乙腈定容到10mL。

(4)取1mL所得的BaP的乙腈溶液用0.22μm的有机过滤器滤去杂质制得待测样品。

5.3BaP降解率的测定：

(1)将得到的待测样品用高效液相色谱HPLC检测，根据事先所测得的峰面积与浓度的标准曲线计算其浓度。

(2)高效液相色谱检测，所用的高效液相色谱仪器型号是Agilent 1260，所用色谱柱是120EC-C18色谱柱4.6×150mm，流动相为100％乙腈，流动相速率设置为1mL/min，每次上样量为10μL，检测波长为254nm。

5.4降解效果：

5.4.1该嗜吡啶红球菌DNR25对水体中浓度为5mg/L的BaP 7天的降解率高达75.1％，具有极强的降解能力，降解率数据件图2所示。图2所示的是在生物降解过程中水体中BaP含量随时间的变化。从中可以看出，BaP降解率随时间的延长而逐渐提高，说明随着DNR25的生长，培养基中残留的苯并芘的含量逐渐减少，7天后污染水体中苯并芘降解率达到最高的75.1％。

5.4.2该嗜吡啶红球菌DNR25对土壤中浓度为30mg/kg的BaP 15天的降解率高达78.2％，具有极强的降解能力。降解率数据如图3所示，图3所示的是在生物降解过程中土壤中BaP含量随时间的变化。从中可以看出，BaP降解率随时间的延长而逐渐提高，说明随着DNR25的生长，污染土壤中残留的苯并芘的含量逐渐减少，15天后污染土壤中苯并芘降解率达到最高的78.2％。

降解率的探究：

(1)嗜吡啶红球菌菌株本身具有的特性：含有降解BaP的关键基因--环羟化双加氧酶。由于Bap的结构复杂，降解途径多样性，相对研究的不多。BaP的降解机理：通过双加氧酶的作用使苯环上的两个碳原子羟基化，生成二氢二醇BaP，再经代谢生成二氧化碳和水。

(2)本发明从有机质含量丰富的焦化黑土场地取样筛菌，利用三步驯化富集了能适应极端逆境，即高浓度BaP污染胁迫的嗜吡啶红球菌DNR25，使得该菌株具有较强的降解Bap的能力。

Claims

1.一种嗜吡啶红球菌，其特征在于所述的嗜吡啶红球菌为嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinivorans)DNR25，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2022年6月21日，保藏号为GDMCC NO.62560。

2.如权利要求1所述的一种嗜吡啶红球菌的应用，其特征在于所述的嗜吡啶红球菌用于去除苯并(a)芘。

3.根据权利要求2所述的一种嗜吡啶红球菌的应用，其特征在于所述的嗜吡啶红球菌在去除苯并(a)芘前采用污染物苯并(a)芘进行驯化，且驯化时苯并(a)芘的浓度为50mg/L。