CN113416671B - 一种红霉素降解菌iurm e94及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红霉素降解菌IURM E94及其应用，属于生物技术领域，实验证明，本发明的红霉素降解菌IURM E94可以在红霉素为唯一碳源的环境中存活，具有很高的红霉素降解活性，本发明所提供的红霉素降解菌IURM E94可以应用于污染环境中的红霉素降解，在水处理和土壤修复方面具有很好的应用价值。

Description

一种红霉素降解菌IURM E94及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一种红霉素降解菌IURM E94及其对土壤或废水中含红霉素降解领域的应用。

背景技术

红霉素菌渣是红霉素生产菌液体发酵红霉素时产生的废弃物，其成分包括菌体、未利用完的培养基、培养基降解物、菌体次级代谢物及在产品提取过程中添加的无机盐等。因红霉素菌渣中含有丰富的营养成分，有机质含量较高，可引起二次发酵，颜色变黑，产生恶臭味，严重影响环境。红霉素菌渣中残留的大量红霉素会进入环境中会抑制微生物生长，诱导抗性基因的产生；进入动物体后就可能引起抗生素在动物体内的积累，进而威胁人类健康；红霉素进入水体会抑制水体生物的生态平衡。

由于红霉素菌渣中残留红霉素危害严重，因此，红霉素生产企业亟需成熟有效、安全合理的处理菌渣的方法或技术处理。抗生素菌渣已经被列入危险废弃物，已有的填埋法和焚烧法不再适用于处理菌渣。填埋法污染土壤环境、加剧耐药性微生物的出现；焚烧法成本高且容易造成大气污染。而厌氧消化等资源化利用方法，仅有特定抗生素菌渣适用，由于不同种类抗生素菌渣的特性的差别，这一类方法没有普遍适用性，有些工艺成本投入相对较大，难以推广。

微生物处理技术法逐渐吸引专家和学者的关注，即根据红霉素的特性，从特定环境条件中筛选到能够降解红霉素的微生物，通过大环内酯酶，转移酶，裂解酶等对红霉素结构进行破坏，最终降解为无污染的小分子产物。该技术不仅成本低廉，而且在整个降解过程中不会引起二次污染，是一种十分高效的红霉素菌渣处理技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红霉素降解菌IURM E94及其应用，以及降解红霉素的方法、红霉素降解菌干粉剂。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一株红霉素降解菌IURM E94(Bacillus siamensis)，该菌已于2020年11月06日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.21116。

本发明的第二个目的是提供了上述的红霉素降解菌IURM E94在红霉素降解中的应用。

本发明的第三个目的是提供了上述的红霉素降解菌IURM E94在红霉素环境污染后修复中的应用。

本发明的第四个目的是提供了上述的红霉素降解菌IURM E94在红霉素残留污染后土壤修复中的应用。

本发明的第五个目的是提供了上述的红霉素降解菌IURM E94在红霉素残留污染后水体修复中的应用。

本发明的第六个目的是提供了一种降解红霉素的方法，将上述的红霉素降解菌IURM E94接种于含有红霉素的体系中培养，即可实现降解红霉素。

本发明的有益效果为：本发明提供的红霉素降解菌及其应用，以及降解红霉素的方法、红霉素降解菌菌剂，是通过微生物修复技术，即根据红霉素的特性，从特定环境条件中或者通过改造，得到能够降解红霉素的微生物，将红霉素结构进行破坏，得到无污染的代谢产物。实验证明，本发明的红霉素降解菌IURM E94可以在红霉素为唯一碳源的环境中存活，具有很高的红霉素降解活性，红霉素降解率可达到90％。本发明所提供的红霉素降解菌IURM E94可以应用于污染环境中的红霉素降解，在水处理和土壤修复方面具有很好的应用价值。

附图说明

图1为该红霉素降解菌IURM E94的单菌落形态图。

图2为实施例2中红霉素降解菌IURM E94的降解曲线图。

图3为实施例3中红霉素降解菌IURM E94的降解曲线图。

图4为实施例4中红霉素降解菌IURM E94的降解曲线图。

具体实施方式

实施例1：

红霉素降解菌IURM E94的筛选方法，步骤如下：

称取一定量红霉素菌渣堆肥产品，加入蒸馏水，稀释10倍。取1mL上清液，加入9mL无菌水进行梯度稀释，稀释至10^-2，取该梯度上清液1mL加入含红霉素100mg/L的MSM无菌培养基，置于37℃、180rpm摇床中培养5天。将上述所得上清液均匀涂布在含红霉素的MSM固体培养基上，然后放入37℃培养箱培养3-5天，在LB平板上划线分离，得到红霉素降解菌IURME94。

菌株鉴定

采用DNA试剂盒提取法获得红霉素降解菌IURM E94基因组DNA，通过PCR方法对菌株16S rRNA基因进行扩增并送至上海捷瑞生物公司进行测序分析；用于扩增16S rRNA基因的上游引物序列为：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’，下游引物序列为5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’。

PCR反应体系：Prime STAR Max(2x)10μL，引物(25pmolμL^-1)各0.5μL，模板DNA 0.2μL，ddH₂O补齐至20μL；

PCR反应条件是：98℃预变性10min，98℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸1min，反应31个循环，72℃延伸5min。。使用NCBI的BLAST功能在GeneBank数据库中进行序列比对，分析菌株的分类为：暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。

红霉素降解菌IURM E94的16S rRNA基因序列见序列表。

(一)主要材料

1、培养基

LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，超纯水1000ml。

MSM无机盐培养基：NH₄Cl 0.630g，K₂HPO₄·3H₂O 1.965g，KH₂PO₄ 0.500g，NaNO₃1.0g，MgSO₄ 0.1g，超纯水1000ml。

相对应的固体培养基则在1L液体培养基中添加琼脂粉15g配制成。

2、仪器设备

FlexCycler PCR扩增仪，Tanon-3500凝胶成像系统，北京市六一仪器厂电泳仪，灭菌锅，英衡电子天平，UV1900紫外可见分光光度计，恒温培养箱，eppendorf高速冷冻离心机，摇床，青岛海尔集团的低温冰箱。

(二)红霉素降解测定

(1)红霉素标准曲线的绘制

准确称取100.0mg工业纯红霉素于10mL容量瓶中，用流动相定容至标线，制备成每毫升含有10.0mg的红霉素标准液。加入流动相稀释制备成10.0、20.0、40.0、50.0、60.0、80.0和100mg/L的红霉素标准溶液。

色谱条件：

色谱柱：反向C18(安捷伦)，4.6×250mm，5μm，80A；

流动相：乙腈:K₂HPO₄(0.01M)＝60:40；

流速：1.0mL/min；

柱温：35℃；

检测波长：215nm；

进样量：40μL。

标准曲线为y(峰面积)＝0.2031x(红霉素浓度)-0.2785

(2)红霉素降解率测定方法

将降解菌接种到100mL浓度为100mg/L液体MSM培养基中，接种量2％，置于37℃，pH＝7摇床中培养24h后，每12h取一次发酵液进行检测，一共取样4天。

取1mL发酵液10000rpm离心1min，将上清液通过0.22μm滤膜打入进样瓶中。再以制备标准曲线时相同的液相条件进行测定，得出实验组红霉素的降解率。

实施例2

将红霉素降解菌IURM E94在LB液体培养基中培养，离心收集菌体，用无菌水重悬，并稀释至OD₆₀₀＝1，将所选菌株接种1mL到100.0mL含100mg红霉素的基础液体无机盐培养基中，置于恒温摇床中180r/min，37℃培养72h降解率为90.67％，红霉素降解效率果明显(图2)。

实施例3

将红霉素降解菌IURM E94按1％的接种量接种于1千克灭菌的土壤中，并加入100mg红霉素，于37℃条件下培养72h，经测定，测定降解率为：70.67％(图3)。

实施例4

将红霉素降解菌IURM E94按1％的接种量接种于100mL灭菌的含红霉素的废水中，经测定该废水的红霉素浓度为130mg/L，于37℃、180r/min条件下培养72h，测定红霉素降解率为：73.73％(图4)。

实施例5

红霉素降解菌IURM E94干粉剂的制备，红霉素降解菌IURM E94扩大培养后，经过常规方法干燥制得。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 常州大学

江苏碧奥环保科技有限公司

伊犁川宁生物技术股份有限公司

<120> 一种红霉素降解菌IURM E94及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1461

<212> DNA

<213> 暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)

<400> 1

gggaatgggg gagccggact atactgatag tcgagcggac agatgggagc ttgctccctg 60

atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact 120

ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt gtttgaaccg catggttcag acataaaagg 180

tggcttcggc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg 240

gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga 300

gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt 360

ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag 420

ggaagaacaa gtgccgttca aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac 480

ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat 540

tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc 600

ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt 660

gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc 720

tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt 780

ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct 840

aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga 900

cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960

ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg 1020

acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080

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tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1200

acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc 1260

acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc 1320

tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380

gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg taacctttat ggagccagcc 1440

gaccgcaatg gagatcagag g 1461

Claims (6)

1.一种红霉素降解菌IURM E94，其特征在于，该红霉素降解菌为暹罗芽孢杆菌，已于2020年11月06日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNO.21116。

2.如权利要求1所述的红霉素降解菌IURM E94的应用，其特征在于，所述红霉素降解菌IURM E94，对被红霉素污染的环境具有修复作用。

3.如权利要求2所述的红霉素降解菌IURM E94的应用，其特征在于，所述红霉素降解菌IURM E94，对红霉素残留污染的土壤具有修复作用。

4.如权利要求2所述的红霉素降解菌IURM E94的应用，其特征在于，所述红霉素降解菌IURM E94，对红霉素残留污染的水体具有修复作用。

5.一种红霉素降解菌干粉剂，其特征在于，所述干粉剂中含有权利要求1所述的红霉素降解菌IURM E94。

6.一种红霉素降解菌IURM E94干粉剂的制备方法，其特征在于，采用如权利要求5所述的红霉素降解菌IURM E94扩大培养后，经过常规方法干燥制得。

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