CN110283759B - 一株油脂降解菌Kosakonia cowaniiIUMR B67的分离及应用 - Google Patents

一株油脂降解菌Kosakonia cowaniiIUMR B67的分离及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种油脂降解菌Kosakonia cowaniIUMRB67及其应用,属于生物技术领域。实验证明,本发明的油脂降解菌IUMRB67可以在油脂为唯一碳源的环境中存活,具有很高的油脂降解活性。本发明所提供的油脂降解菌IUMRB67可以应用于污染环境中的油脂降解,在餐厨垃圾处理和环境修复方面具有很好的应用价值。

Description

一株油脂降解菌Kosakonia cowaniiIUMR B67的分离及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体为一种油脂降解菌及其对餐厨垃圾或废水油脂降解领域的应用。
背景技术
随着城市人口的增加和生活质量的提高,餐厨垃圾的总量以及油脂含量也相应的不断增加,由于餐厨垃圾营养丰富,处理不当极易腐烂变质,进而污染环境、危害人类健康。餐厨垃圾废弃油脂含有大量病原菌和毒素,未经处理直接去喂猪等牲畜,容易将病原菌和毒素传播给人;废弃油脂被不法分子加工成“地沟油”流入市场危害人类健康;此外,废弃油脂进入土壤后,使土壤的透气性和渗水性降低,阻碍植物根系的吸收与呼吸,引起根系腐烂,进而导致死亡;而排入水体的油脂会造成水体溶氧不足,严重影响水体的生态环境。因此,为了避免餐厨垃圾中废弃油脂引起的环境污染和食品安全等问题,如何有效处理废弃油脂成为国内外学者研究的难点和热点。
当前处理废油脂的方法主要有物理法、化学法和生物法。物理法和化学法占地大,投资大,易二次污染。生物法处理油脂废水则是微生物利用油脂作为生长所需的碳源,在酶的催化下将油脂水解为甘油和脂肪酸,最后降解为二氧化碳和水等代谢产物。相比之下,生物法处理成本低,无二次污染,是具有良好发展前景的油脂处理方法。而迄今为止,大部分研究工作集中于油脂废水的微生物分离和应用,而针对降解餐厨垃圾中油脂的研究报道较少。在餐厨垃圾生物处理过程中,油类物质会阻碍氧和电子的传导,导致微生物代谢紊乱,严重影响餐厨垃圾转换效率。因此,本研究将分离筛选具有高效降解油脂的微生物,并应用于餐厨垃圾处理,不仅消除了城市油脂污染、净化环境,同时也阻断了“地沟油”、“泔水猪”产生的源头,具有十分重要的现实意义。
自然界中含有丰富的微生物资源,因其种类多、分布广、繁殖快、易变异、有很强的生化适应能力、对各类人工合成农药能较快产生适应酶系。不同的微生物有着不同的降解酶系来降解废弃油脂等污染物。微生物将油脂作为其生长所需的碳源和能源,并在酶的作用下水解成甘油和长链脂肪酸,最终降解为H2O和CO2等代谢产物,且具有成本低,无二次污染优点。而环境可降解农药的微生物种类也非常丰富,包括细菌、真菌、藻类等。但是油脂的降解菌株很少有报道,需要我们进行进一步进行研究,对消除环境中废弃油脂的污染、缩短餐厨垃圾发酵周期、净化环境有着重大的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种油脂降解菌,及其对餐厨垃圾和废水油脂降解等方面的应用。
为解决上述技术问题,本发明提供了如下技术方案:一种油脂降解菌IUMR B67;其中油脂降解菌IUMR B67已于2019年6月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No:18023,分类命名为考氏科萨克氏菌(Kosakonia cowani)。
上述诉油脂降解菌,对被油脂污染的环境具有修复作用,尤其对被餐厨垃圾中废弃油脂污染的环境,以及被餐厨废水中的油脂污染的水体,具有修复作用。
上诉油脂降解菌对餐厨垃圾中的废弃油脂具有降解作用,对餐厨废水中所含的油脂具有降解作用,可直接应用于餐厨垃圾的净化处理领域。
上述的该油脂降解菌的筛选方法,步骤如下:
1)从餐馆垃圾桶中称取污泥,加入油脂降解菌筛选液体培养基进行富集,在35-40℃、150-200r/min恒温摇床中培养4-10天;
2)吸取步骤1中所得的培养基加入新的油脂降解菌筛选液体培养基进行传代,如此传代3-6次;
3)取步骤2中所得菌液在LB平板上划线分离,得到油脂降解菌IUMR B67;
其中油脂降解菌筛选培养基成分为:每1L去离子水中含有大豆油20mL,硫酸铵2g,磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g,七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.2g,磷酸氢二钾(K2HPO4)1.5g,氯化钠1g,pH 7.0-7.2;
LB固体培养基成分为:蛋白胨10g,酵母粉5g,氯化钠10g,琼脂粉15g,以去离子水补足体积至1L。
上述油脂降解菌的优选筛选方法,步骤如下:
1)从餐馆垃圾桶中称取污泥5克,加入100mL油脂降解菌筛选液体培养基进行富集,在37℃、180r/min恒温摇床中培养5-7天;
2)吸取步骤1中所得的培养基3mL加入新的油脂降解菌筛选液体培养基进行传代,如此传代4-5次;
3)取步骤2中所得菌液在LB平板上划线分离,得到油脂降解菌IUMR B67;
上述油脂降解菌IUMR B67的干粉剂,为用使用扩大培养后的油脂降解菌IUMRB67培养物,经过常规方法干燥而成。
所述油脂降解菌IUMR B67是按照如下所述方法筛选获得:
一、从江苏常州武进区餐馆垃圾桶污泥中分离菌株,称取污泥5克,加入100mL油脂降解菌筛选液体培养基进行富集,在37℃、180r/min恒温摇床中培养5-7天;然后吸取培养基3mL加入新的油脂降解菌筛选液体培养基进行传代,如此传代4-5次,在LB平板上划线分离,经过上百次分离试验筛选,最终得到一株能在油脂作为唯一碳源的培养基中生存的菌种;
所述油脂降解菌筛选培养基成分为:每1L去离子水中含有大豆油20mL,硫酸铵2g,磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g,七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.2g,磷酸氢二钾(K2HPO4)1.5g,氯化钠1g,pH 7.0-7.2;
所述LB固体培养基成分为:蛋白胨10g,酵母粉5g,氯化钠10g,琼脂粉15g,以去离子水补足体积至1L。
二、分析分离得到的不同菌种对培养基中大豆油的降解效率,筛选获得油脂降解效果最佳的菌株。
具体测定方法如下:
1、培养基制备
基础盐培养基:KH2PO40.5 g,K2HPO41.5 g,NaCl 1.0g,(NH4)2SO42.0 g,MgSO4·7H2O 0.2g,去离子水1000mL,pH 7.0,121℃灭菌20min。
LB液体培养基:酵母粉5g,氯化钠10g,蛋白胨10g,去离子水1000mL,pH 7.0,121℃灭菌20min。
2、油脂降解效率测定方法
2.1大豆油标准曲线的绘制
精确称取0.1g精制大豆油于25mL容量瓶中,用石油醚定容至标线,制备成每毫升含0.1g/25mL石油醚大豆油的标准溶液。然后向9个25mL的容量瓶中,分别加入0.0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07和0.1g的大豆油标准溶液,用石油醚定容至标线,配制成浓度梯度为0.0、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0和25.0mg/mL大豆油溶液作大豆油标准曲线。在225nm波长下,以纯石油醚作为参比,分别测量上述系列浓度的大豆油溶液的吸光值。根据得到的数据绘制出大豆油标准溶液的标准曲线。
2.2油脂降解率测定方法
培养液加50%硫酸铵溶液去除蛋白质后,4000rpm离心10min,上清液移入分液漏斗中,加50%硫酸5ml酸化。将10mL石油醚移入分液漏斗,并充分振荡3min,静置使之分层,将水层移入采样瓶中,将石油醚移入25ml容量瓶里,再将水层移回分液漏斗内,用5ml石油醚重复萃取一次,静置分层后将石油醚层移入25mL容量瓶,与第一次萃取液混合,用石油醚定容至25ml。在波长225nm条件下测定吸光度,利用大豆油标准曲线所建立的线性回归方程计算出油脂浓度,所有实验均设置三个重复。
2.3通过油脂降解菌对豆油的降解率,得出最优菌种
将油脂降解菌菌株在LB液体培养基中培养,离心收集菌体,用无菌水重悬,并稀释至OD600=1,将所选菌株接种1mL到100.0mL含100μL吐温80和1mL豆油的基础液体无机盐培养基中,置于恒温摇床中180r/min,37℃培养,分别在72h和144h测定降解率。
其中,筛选得到油脂降解菌IUMR B67,其72h和144h对大豆油的降解率分别为:71.8%和95.8%;油脂降解效率果明显。
2.4油脂降解菌IUMRB67对餐厨垃圾中的废弃油脂的降解
将油脂降解菌IUMRB67按1%的接种量接种于100克灭菌的餐馆剩饭垃圾中,经测定,餐厨垃圾中的含油量为6%,于37℃、180r/min条件下培养72h,测定降解率为:19.25%。
2.5油脂降解菌IUMRB67对废水中的废弃油脂的降解
将油脂降解菌IUMRB67按1%的接种量接种于100mL灭菌的含油脂的废水中,经测定该废水的含油量为0.8%,于37℃、180r/min条件下培养72h,测定油脂降解率为:33.33%。
菌株鉴定
采用振荡破碎法获得油脂降解菌IUMR B67基因组DNA,通过PCR方法对菌株16SrRNA基因进行扩增并送至上海捷瑞生物公司进行测序分析;用于扩增16S rRNA基因的上游引物序列为:5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’,下游引物序列为5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’。
PCR反应条件是:95℃预变性10min,95℃变性30s,55℃退火1min,72℃延伸1min,反应31个循环,72℃延伸5min。使用NCBI的BLAST功能在GeneBank数据库中进行序列比对,分析菌株的分类为:考氏科萨克氏菌(Kosakonia cowanii)
油脂降解菌IUMR B67 16S rRNA基因序列见序列表。
本发明的有益效果为:
1、筛选出一种可以在油脂为唯一碳源的环境中存活的油脂降解菌IUMRB67,经降解分析表明,该菌株可以在20mL/L油脂筛选固体培养基和液体培养基中生长良好,具有很高的油脂降解特性。
2、该油脂降解菌IUMR B67将在餐厨垃圾中油脂降解、水体污染油脂的降解、土壤中废弃油脂的降解和环境污染修复中具有应用前景。
3、本发明油脂降解菌的应用,有利于避免因物理或化学方法降解油脂而造成的二次污染。
附图说明
图1为该油脂降解菌IUMRB67单菌落形态图
具体实施方式
油脂降解菌IUMR B67的筛选过程
(一)、主要材料
1、培养基
每1L的油脂筛选液体培养基成分:分别加入豆油20mL,硫酸铵2g,磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g,七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.2g,磷酸氢二钾(K2HPO4)1.5g,氯化钠1g,配制的液体培养基用HCl或者NaOH调节pH为7.0-7.2,然后再加入去离子水补足至1L。
相对应的固体培养基则在1L液体培养基中添加琼脂粉15g配制成。
每1L的LB液体培养基成分:分别加入蛋白胨10克,酵母粉5克,NaCl 10克,配制的液体培养基用HCl或者NaOH调节pH为7.0-7.2,然后再加入去离子水补足至1L。
相对应的LB固体培养基则在1L液体培养基中添加琼脂粉15g配制成。
2、仪器设备
FlexCycler PCR扩增仪,Tanon-3500凝胶成像系统,北京市六一仪器厂电泳仪,灭菌锅,英衡电子天平,UV1900紫外可见分光光度计,恒温培养箱,eppendorf高速冷冻离心机,摇床,青岛海尔集团的低温冰箱(二)、油脂降解菌的筛选过程
(1)从江苏常州武进区餐馆垃圾桶污泥中分离菌株,称取污泥5克,加入100mL油脂降解菌筛选液体培养基进行富集,在37℃、180r/min恒温摇床中培养5-7天;然后吸取培养基3mL加入新的油脂降解菌筛选液体培养基进行传代,如此传代4次;在LB平板上划线分离,得到油脂降解菌IUMR B67;所述油脂降解菌筛选培养基成分为:每1L去离子水中含有大豆油2mL,硫酸铵2g,磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g,七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.2g,磷酸氢二钾(K2HPO4)1.5g,氯化钠1g,pH 7.0-7.2;
所述LB固体培养基成分为:蛋白胨10g,酵母粉5g,氯化钠10g,琼脂粉15g,以去离子水补足体积至1L。
(2)将培养物在LB平板上划线分离,置于37℃恒温培养箱中培养12-26小时,获得油脂降解菌株IUMR B67单菌落形态图(见图1);
下面为具体实施例部分。
实施例1
将油脂降解菌IUMR B67在LB液体培养基中培养,离心收集菌体,用无菌水重悬,并稀释至OD600=1,将所选菌株接种1mL到100.0mL含100μL吐温80和1mL豆油的基础液体无机盐培养基中,置于恒温摇床中180r/min,37℃培养,其72h和144h对大豆油的降解率分别为:71.2%和95.5%;油脂降解效率果明显。
实施例2
将油脂降解菌IUMRB67按1%的接种量接种于100克灭菌的餐馆剩饭垃圾中,经测定,餐厨垃圾中的含含油量为6%,于37℃、180r/min条件下培养72h,测定油脂降解率为:19.25%。
实施例3
将油脂降解菌IUMRB67按1%的接种量接种于100mL灭菌的含油脂的废水中,经测定该废水的含油量为0.8%,于37℃、180r/min条件下培养72h,测定油脂降解率为:33.33%。
实施例4
将油脂降解菌IUMRB67按1%的接种量接种于100g灭菌的含油脂0.65%的土壤中,于37℃恒温培养箱分别培养72h,测定油脂降解率为16.07%。
实施例5
油脂降解菌IUMR B67干粉剂的制备,油脂降解菌IUMR B67扩大培养后,经过常规方法干燥制得。
序列表
<110> 常州大学
河北慈心环保科技有限公司
江苏碧奥环保科技有限公司
<120> 一株油脂降解菌Kosakonia cowanii IUMR B67及应用
<130> 67
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1506
<212> DNA
<213> 考氏科萨克氏菌(Kosakonia cowanii)
<400> 1
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gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagtgggt tgcaaaagaa gtaggtagct 1440
taaccttcgg gagggcgctt accactttgt gattcatgac tggggtgaag tcgtaacaag 1500
gtaacc 1506

Claims (7)

1.一株油脂降解菌,其特征在于,该油脂降解菌为考氏科萨克氏菌(Kosakoniacowanii),其中该油脂降解菌编号:IUMR B67,保藏单位为:中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏号为CGMCC NO.18023。
2.如权利要求1所述的油脂降解菌的应用,其特征在于,所述油脂降解菌,对被油脂污染的环境具有修复作用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述油脂降解菌,对被餐厨垃圾中废弃油脂污染的环境,具有修复作用。
4.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述油脂降解菌,对被餐厨废水中的油脂污染的水体,具有修复作用。
5.如权利要求1所述的油脂降解菌的应用,其特征在于,所述油脂降解菌对餐厨垃圾中的废弃油脂具有降解作用。
6.如权利要求1所述的油脂降解菌的应用,其特征在于,所述油脂降解菌对餐厨废水中所含的油脂具有降解作用。
7.如权利要求1所述的该油脂降解菌IUMR B67的干粉剂,其特征在于,所述干粉剂为用使用扩大培养后的油脂降解菌IUMR B67培养物,经过常规方法干燥而成。
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