CN113913326B

CN113913326B - 一株水稻科萨克氏菌hn05及其应用

Info

Publication number: CN113913326B
Application number: CN202111096588.1A
Authority: CN
Inventors: 武春媛; 阴文芳; 吴东明
Original assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Current assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Priority date: 2021-09-18
Filing date: 2021-09-18
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2041-09-18
Also published as: WO2023041008A1; JP2023544961A; CN113913326A

Abstract

本发明涉及环境微生物技术领域，尤其涉及一株水稻科萨克氏菌HN05及其应用，该菌株的分类命名为Kosakonia oryzae HN05，可在厌氧条件下降解敌草快，并具有蒽醌类化合物还原活性，其电子利用谱广；同时，菌株HN05可与AQDS协同作用，显著促进敌草快厌氧降解，应用于敌草快污染水处理和土壤修复中，在农药污染处理和土壤修复领域具有良好的应用前景。

Description

一株水稻科萨克氏菌HN05及其应用

技术领域

本发明涉及环境微生物技术领域，特别涉及一株水稻科萨克氏菌HN05及其应用。

背景技术

敌草快(1,1'-亚乙基-2,2'-联吡啶二溴盐，diquat)，是一种非选择性触杀型联吡啶类除草剂，广泛用于免耕种植、快速轮作、直播水稻等农林生产中。敌草快具有持久性及环境健康毒性：干扰斑马鱼胚胎的氧化磷酸化反应，引起虹鳟胚胎生长受损、西北蝾螈慢性死亡，导致水生生态系统失衡；通过地下水浸出或食物链形式，对哺乳动物产生较强毒性，长期接触敌草快，可对雌性小鼠产生生殖毒性，农民患帕金森病的风险增加；敌草快急性中毒可引起2128种疾病，且生物蓄积或急性中毒后并无特效解毒药。因此，加速敌草快在环境中的降解十分必要。

敌草快极易溶于水，随着地表径流进入土壤、地下水体、沉积在各种缺氧环境中，更具持久性，半衰期最高达十年。因此，加速环境中敌草快降解的关键在于强化其厌氧降解。已有报道称：高级氧化法、厌氧消化池法等方法可有效加速有机污染物的厌氧降解。然而，这些方法存在二次污染、成本高等缺点。微生物原位修复技术因具有便捷、经济、高效、绿色等特征，被认为是强化有机污染物厌氧降解的良好方法。

土壤中具有耐受敌草快的微生物，这类菌能以敌草快为碳源或氮源，或以共代谢形式进行好氧呼吸，目前已报道的敌草快好氧降解菌有黑曲霉Aspergillus niger、酵母菌Lipomyces starkeyi，厌氧条件下敌草快降解转化相关微生物尚未见报道。

科萨克氏菌属菌株现有9个种，据报道除了Kosakonia quasisacchari和Kosakonia cowanii是从人体中分离得到，其他7种Kosakonia sp.都是从植株根际中分离得到，具有固氮能力，是水稻、玉米、小麦、落花生等植物的优势固氮菌，目前尚无有关Kosakonia sp.能够进行蒽醌还原以及降解敌草快方面的文献报道。

发明内容

鉴于此，本发明提出一株水稻科萨克氏菌HN05及其应用，该菌株分离于土壤，具有敌草快厌氧降解和蒽醌还原的特性。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一株水稻科萨克氏菌HN05，其分类命名为Kosakonia oryzae HN05，于2021年7月30日保藏于位于湖北武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏中心给予该菌株的保藏号为CCTCC NO:M 2021956HN05。

进一步说明，水稻科萨克氏菌Kosakonia oryzae HN05的16S rDNA序列如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。

进一步说明，水稻科萨克氏菌Kosakonia oryzae HN05在蒽醌类化合物还原中的应用。

进一步说明，所述水稻科萨克氏菌Kosakonia oryzae HN05在用于农药污染处理和土壤修复中的应用。

进一步说明，所述水稻科萨克氏菌Kosakonia oryzae HN05用于降解敌草快，达到敌草快污染水处理和土壤修复的用途。

进一步说明，所述水稻科萨克氏菌Kosakonia oryzae HN05用于在厌氧条件下降解敌草快。

进一步说明，所述水稻科萨克氏菌Kosakonia oryzae HN05与蒽醌-2,6-二磺酸钠协同作用，促进敌草快厌氧降解中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明是由海南省南渡江河流沉积物土壤中富集分离纯化得到水稻科萨克氏菌HN05(Kosakonia oryzae HN05)，该菌株在厌氧条件下能够氧化降解敌草快，并具有蒽醌类化合物还原活性，其电子利用谱广；同时，水稻科萨克氏菌HN05可与AQDS协同作用，显著促进敌草快厌氧降解，有效应用于敌草快污染水处理和土壤修复中，在农药污染处理和土壤修复领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明水稻科萨克氏菌HN05的菌株形态透射电镜图；

图2为本发明水稻科萨克氏菌HN05的16S rRNA系统发育树；

图3为本发明水稻科萨克氏菌HN05的厌氧还原AQDS的电子供体谱图；

图4为本发明水稻科萨克氏菌HN05厌氧降解敌草快的动力学图；

图5为本发明水稻科萨克氏菌HN05与AQDS协同促进敌草快厌氧降解一级动力学拟合曲线。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1-水稻科萨克氏菌HN05的富集与分离

1)无菌操作条件下取5g沉积物样品于100mL厌氧液体培养基中，每升培养基中0.5mmol/LAQDS(蒽醌-2,6-二磺酸钠，电子受体)、2.5g NaHCO₃、0.25gNH₄Cl、0.68gNaH₂PO₄·2H₂O、0.1g KCl、10.0mL维生素储备液、10.0mL微量元素储备液。

其中，维生素溶液是每升去离子水中含5.0mg叶酸、0.2mg维生素B6、6.5mg维生素B2、3.0mg维生素B1、10mg烟酰胺、1mg泛酸钙、0.2mg维生素B12、2.0mg维生素H；微量元素溶液是每升去离子水中含1.6g乙二胺四乙酸、3.0gMgSO₄·7H₂O、0.5g MnSO₄·H₂O、1.0gNaCl、0.1g CoCl₂·6H₂O、0.1g CaCl₂、0.01gCuSO₄·5H₂O、0.01g AlK(SO₄)₂·12H₂O、0.01gH₃BO₃、0.025g Na₂MoO₄·2H₂O。向上述土壤-培养基体系中鼓充(N₂/CO₂＝80/20)混合气30分钟排氧，充气完毕立即盖橡胶盖并加压铝盖密封，30℃静置避光培养，观察培养液的颜色变化情况；

2)当上清液颜色由无色逐渐变为橙黄色并趋于稳定时，以10％的接种量转接到另一新鲜的富集培养基中，如此转接3次；

3)最后将最终培养液以稀释涂布平板法在NA培养基(由NaCl 5g/L，牛肉浸膏5g/L，细菌学蛋白胨10g/L，琼脂粉18-20g/L，1％微量元素溶液及1％维生素溶液组成，1×10⁵Pa灭菌20min)表面进行涂布分离，30℃好氧培养至培养基表面形成单菌落，挑取单菌落进行单菌落分离与纯化，获得水稻科萨克氏菌HN05；

4)挑取单菌落于新鲜富集培养基中再次培养，当体系颜色由无色变橙黄色，表明菌株具有AQDS还原特性。

实施例2-水稻科萨克氏菌HN05的形态、生理生化及分子生物学特征

1)菌体形态特征

经光学显微镜下观察，该菌株为革兰氏阴性菌，直杆状，单个或成对。在透射电镜下观察菌株周生鞭毛(如图1所示)，具运动性。

在pH为7.2的NA琼脂固体培养基平板上30℃好氧培养24小时后，菌落呈圆形，表面湿润光滑、中间凸起、半透明、边缘整齐，菌落直径为1～3mm。

2)生理生化特征

菌株为发酵型、兼性厌氧；生长温度范围25～37℃(最适30℃)、pH范围4～9(最适pH＝6)、NaCl％范围0～5(最适0.5％)；其他生理生化特征见表1。

表1水稻科萨克氏菌HN05的部分生理生化特性

(注：“+”表示为阳性反应，“-”表示为阴性反应)。

3)分子生物学特征

用细菌DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司)提取细菌总DNA。利用细菌16SrRNA通用引物27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')和1492R(5'-TAC GGC TAC CTTGTT ACG ACT T-3')进行PCR扩增。反应体系50μL：模版DNA 2μL，通用引物27F和1492R各1μL，Taq mix酶25μL，ddH₂O11μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后由上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序。

根据测序结果，在http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/下载同源性较高的16SrRNA基因序列，用邻接法构建菌株的系统发育进化树(如图2所示)。综合形态、生理生化和分子鉴定结果，最终确定本发明菌株为水稻科萨克氏菌，命名为Kosakonia oryzaeHN05。

实施例3-水稻科萨克氏菌HN05利用不同电子供体还原AQDS

本发明以AQDS为电子受体，考察水稻科萨克氏菌HN05的电子利用谱。

反应体系组成：菌悬液、无机盐、维生素、微量元素，各物质成分及含量同上述富集分离培养基；电子受体为0.5mmol/LAQDS；电子供体选取乙酸、丙三醇、蔗糖、或乳酸，添加浓度为5mmol/L；1mL菌悬液，将菌株HN05接种于NA液体培养基中，30℃好氧培养18h，8000r/min离心收集菌体，再用无机盐培养基洗涤菌体2次，最后将菌体悬浮于新鲜的无机盐培养基中，制成菌悬液。

设置三个重复。分别在培养1、3、6、9、12、15d测定厌氧体系中的AQDS还原产物AH₂QDS的变化情况。采用可见-紫外分光光度计在波长385nm处测定还原态AH₂QDS浓度。结果表明(如图3所示)，经15d厌氧培养，厌氧体系中的AQDS都有明显还原现象，前9天体系中的AH₂QDS大量生成，后期逐步稳定。水稻科萨克氏菌HN05对四种电子供体的利用能力明显不一样，利用能力从大到小依次为：蔗糖>乳酸>丙三醇>乙酸。

实施例4-水稻科萨克氏菌HN05对敌草快的厌氧降解

1)反应体系：在厌氧培养基体系中，设置7个处理，

①蔗糖(电子供体)+敌草快(对照，考察蔗糖与敌草快是否反应)；

②AQDS(电子受体)+敌草快(对照，考察AQDS与敌草快是否反应)；

③HN05+敌草快(对照，考察活菌是否直接降解敌草快)；

④蔗糖+HN05+敌草快(考察敌草快是否可作为HN05的电子受体被降解)；

⑤AQDS+HN05+敌草快(考察敌草快是否可作为HN05的电子供体被还原)；

⑥蔗糖+AQDS+HN05(灭活)+敌草快(对照，考察HN05死菌是否降解敌草快)；

⑦蔗糖+AQDS+HN05+敌草快(考察AQDS微生物还原是否促进敌草快厌氧降解)。

厌氧培养基由无机盐、维生素、微量元素(无机盐、微生物、微量元素的成分与浓度同富集分离培养基)组成；敌草快浓度为50mg/L、AQDS为0.5mmol/L、蔗糖为5mmol/L，1mL菌悬液(制备方法同电子供体试验)。敌草快、AQDS与其他成分分开灭菌，灭菌(115℃灭菌20min)后再混合，鼓充(N₂/CO₂＝80/20)混合气30分钟排氧，充气完毕立即盖橡胶盖并加压铝盖密封，30℃静置避光培养；

2)敌草快检测方法：利用高效液相色谱(Waters 2695)测定敌草快的含量，色谱条件为：检测器为PDA，色谱柱为Waters C18柱(5μm，250mm×4.6mm)，流动相为15mmol庚烷磺酸钠磷酸缓冲溶液(三乙胺调pH＝2.5):乙腈(v：v)＝76:24，流速为1.0mL/min，进样量为10μL，检测波长为309nm。

3)数据处理：敌草快降解率(％)＝(敌草快初始浓度C₀–反应后敌草快浓度C)/C₀×100％。

降解半衰期t_1/2＝ln2/k(即t_1/2＝0.693/k)，k通过公式C_t/C₀＝e^-kt计算，C₀为敌草快初始浓度，C_t为t时刻敌草快浓度。

结果如图4所示，厌氧培养0-22d对照组①、②中敌草快的浓度基本不变，说明敌草快与蔗糖、AQDS、单纯HN05之间无反应。处理⑤中敌草快也未减少，表明敌草快不能作为HN05的电子供体被降解。处理③和⑥中的敌草快浓度下降2.07％，说明初始菌体对敌草快具有微弱的吸附作用。处理④中的敌草快浓度降低8.60％，说明敌草快可以作为HN05的电子受体直接被菌株降解，但是效果较弱。处理⑦中的敌草快降解率在培养时间内呈线性增加，22d时达到41.93％，降解效果显著，说明HN05与AQDS协同作用可显著促进敌草快厌氧降解。

进一步，在HN05与AQDS协同促进敌草快降解体系中，对降解率进行了一级动力学拟合，结果如图5所示，决定系数R²＝0.9091、k＝0.0210±0.0030，符合一级动力学方程。再此基础上，计算该体系中菌株HN05对敌草快的降解半衰期范围为(33.7±4.6)d。

实施例5-水稻科萨克氏菌HN05利用蔗糖为电子供体还原蒽醌化合物

以蔗糖(5mmol/L)为电子供体，考察并比较水稻科萨克氏菌HN05对4种蒽醌化合物的还原能力。

将1mL菌悬液接种于基础厌氧培养基中，以0.5mmol/L蒽醌-1-磺酸钠(α-AQS)、蒽醌-2-磺酸钠(AQS)、蒽醌-2,6-二磺酸二钠(AQDS)、或蒽醌-1,5-二磺酸钠(1,5-AQDS)等4种蒽醌化合物作为潜在电子受体，以不加HN05和不加蔗糖的体系作为对照，培养条件同富集分离。设置三个重复。分别在培养1、3、6、9、12、15d测定厌氧体系中的蒽醌的还原产物蒽氢醌的变化情况。采用可见-紫外分光光度法测定蒽氢醌的浓度，α-AQS、AQS、AQDS、1,5-AQDS还原产物的紫外吸收波长分别为380nm、382nm、385nm、385nm。

结果如下表2所示，经15d厌氧培养，“HN05+蔗糖+蒽醌”厌氧体系中，4种蒽醌都有明显还原现象，而“HN05+蒽醌”和“蔗糖+蒽醌”的对照体系中，未检测到蒽氢醌，表明水稻科萨克氏菌HN05能以蔗糖为电子供体，厌氧还原4种蒽醌化合物，利用能力从大到小依次为：AQDS>α-AQS>AQS>1,5-AQDS。

表2“HN05+蔗糖+蒽醌”体系中15d时还原产物蒽氢醌浓度

注:AH₂QDS、α-AH₂QS、AH₂QS、1,5-AH₂QDS分别为AQDS、α-AQS、AQS、1,5-AQDS的还原产物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120> 一株水稻科萨克氏菌HN05及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1436

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tagggcgcag gcctacacat gcagtcgaac ggtagcacag agagcttgct ctcgggtgac 60

gagtggcgga cgggtgagta atgtctggga aactgcctga tggaggggga taactactgg 120

aaacggtagc taataccgca taacgtcgca agaccaaaga gggggacctt cgggcctctt 180

gccatcagat gtgcccagat gggattagct agtaggcggg gtaacggccc acctaggcga 240

cgatccctag ctggtctgag aggatgacca gccacactgg aactgagaca cggtccagac 300

tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg 360

ccgcgtgtgt gaagaaggcc ttcgggttgt aaagcacttt cagcggggag gaaggcggtc 420

cggttaataa ccgtgccgat tgacgttacc cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc 480

agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgca 540

cgcaggcggt ctgtcaagtc ggatgtgaaa tccccgggct caacctggga actgcattcg 600

aaactggcag gctggagtct cgtagaggga ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc 660

gtagagatct ggaggaatac cggtggcgaa ggcggcctcc tggacgaaga ctgacgctca 720

ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga 780

tgtcgatttg gaggttgtgc ccttgaggcg tggcttccgg agctaacgcg ttaaatcgac 840

cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag 900

cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggt cttgacatcc 960

acagaacctg gcagagatgc cggggtgcct tcgggaactg tgagacaggt gctgcatggc 1020

tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc 1080

ctttgttgcc agcggtccgg ccgggaactc aaaggagact gccagtgata aactggagga 1140

aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc cttacgacca gggctacaca cgtgctacaa 1200

tggcgcatac aaagagaagc gacctcgcga gagcaagcgg acctcataaa gtgcgtcgta 1260

gtccggattg gagtctgcaa ctcgactcca tgaagtcgga atcgctagta atcgtgaatc 1320

agaatgtcac ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag 1380

tgggttgcaa aagaagtagg tagcttaacc ttcgggaggg cgctacccac tttgga 1436

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims

1.一株水稻科萨克氏菌HN05，其特征在于：其分类命名为Kosakonia oryzae HN05，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2021956。

2.如权利要求1所述的水稻科萨克氏菌HN05的应用，其特征在于：所述水稻科萨克氏菌Kosakonia oryzae HN05和电子供体组合在蒽醌类化合物还原中的应用，所述电子供体为蔗糖或乳酸或丙三醇或乙酸。

3.如权利要求1所述的水稻科萨克氏菌HN05的应用，其特征在于：所述水稻科萨克氏菌Kosakonia oryzae HN05、蔗糖和蒽醌-2,6-二磺酸钠组合在敌草快厌氧降解和敌草快污染环境修复中的应用。