CN112795505A

CN112795505A - 一种能够产生iaa并能促进丹参生长的促生菌及其应用

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Publication number: CN112795505A
Application number: CN202110018764.3A
Authority: CN
Inventors: 文艺; 杨瑾; 李雪梦; 王飞; 高素霞; 刘玉霞; 秦艳红; 戚文平; 鲁传涛
Original assignee: Institute of Plant Protection of Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-01-07
Filing date: 2021-01-07
Publication date: 2021-05-14

Abstract

本发明公开了一种能够产生IAA并能促进丹参生长的促生菌，该菌株编号为Kosakoniaoryzae 15‑1，已保藏于已保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学山国典型培养物保藏中心，登记入册的保藏号为CCTCCM 2020924，保藏日期为2020年12月21日。利用该促生菌制备的菌剂，具有促进丹参生长的作用，使用后不会有环境污染、农药残留等化学农药常见问题，对人畜健康、生态环境友好，符合人们对生态农业的需求。因此，使用促生菌提高丹参根部生物量的积累，不仅提高了丹参的产量，还降低了化肥农药的使用，起到保护环境的作用。

Description

一种能够产生IAA并能促进丹参生长的促生菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株能够产生IAA并能促进丹参生长的促生菌的筛选方法及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhizaBge)又名赤参、红根、大红袍、紫丹参等，为唇形科多年生草本，以干燥根和根茎入药，是治疗心脑血管疾病的首选药物之一。丹参在我国入药历史悠久，是一种大宗药材，分布极其广泛。近年来，丹参人工栽培面积逐年增加，栽培技术也日益成熟，丹参种植已然成为了河南省豫西贫困山区脱贫攻坚和乡村振兴的重要举措。但是，为追求丹参产量的增加，种植户在丹参的种植过程中广泛使用化学肥料和化学药剂，在一定程度上使得丹参品质降低，且还会出现严重药物残留、土壤板结等问题，对种植区的生态环境也造成了巨大的污染。因此，绿色安全的种植模式成为了丹参人工栽培可持续发展的必然选择。近些年来，促进植物生长的环境友好微生物方面的研究已经受到学者的广泛重视，开发微生物菌肥并加以应用，既可以保证丹参的品质和产量，又维护了生态环境，应用微生物来替代化肥的使用逐渐成为现代农业技术的研究热点。促生菌可通过产生植物生长激素如吲哚乙酸IAA、解磷、解钾和固氮等方式促进植物的生长和发育。其中，IAA是植物生长过程中必需的生长调节剂，促生菌可通过分泌IAA 来促进植物合成生长调节物质，进而促进植物生长发育。植物内生细菌对于自身寄主具有较好的适应和定殖能力，可安全稳定的在寄主上进一步的应用。本研究发现丹参产IAA的内生菌能够显著促进植株的生长。而近年来，关于丹参内生产IAA细菌的研究鲜有报道，因此筛选能够产生IAA并促进丹参生长的菌株具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题，是克服现有技术的不足，提供一种能够产生 IAA并促进丹参生长的促生菌，能有效促进丹参的生长，取代化学肥料和化学药剂，实现绿色种植。

本发明未解决上述技术问题所采用的技术方案是：

一种能够产生IAA并能促进丹参生长的促生菌，该菌株编号为Kosakoniaoryzae15-1，已保藏于“中国典型培养物保藏中心”(简称CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮编： 430072，登记入册的保藏号为CCTCCM2020924，保藏日期为2020年12月21日。

所述的一种能够产生IAA并能促进丹参生长的促生菌，其筛选方法为：取新鲜无病害的丹参植株根部，先用流水冲洗30min，然后用无菌水冲洗5次后，对材料表面进行消毒，先用75％乙醇浸泡45s，然后用0.1％升汞中浸泡3min，无菌水冲洗3～4次，无菌条件下，用灭菌剪刀将根段剪成3mm×3mm小块，接种到LB 培养基上，将最后一次冲洗用的无菌水涂布在LB培养基上作为对照，28℃避光培养1～2d，至菌落长出后分离纯化。若对照皿上无菌长出，则分离出来的菌为内生菌，筛选出可以产生IAA的菌株，鉴定得到Kosakoniaoryzae 15-1。

所述的一种能够产生IAA并能促进丹参生长的促生菌，其在促进丹参生长方面的应用。

所述的一种能够产生IAA并能促进丹参生长的促生菌，其在制备促进丹参生长的菌剂中的应用。

所述的菌剂的制备方法为：将Kosakoniaoryzae 15-1促生菌接种于LB培养基中，在28℃、180rpm条件下振荡培养12h制备种子菌，种子菌以2％的接种量接种于LB培养基中，在28℃、180rpm条件下发酵48h，形成发酵液，即为菌剂。所述的菌剂中Kosakoniaoryzae15-1促生菌浓度为10⁷～10⁸CFU/mL。

所述的LB培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，添加蒸馏水定容至1000mL，混匀后分装于三角瓶中，121℃灭菌30min。

所述的菌剂的使用方法为：菌剂用无菌水稀释10倍，使稀释液活菌浓度为 10⁶～10⁷CFU/mL，灌根于丹参根部周围；每7d灌根处理1次，共灌根2次。

本发明有益效果在于：本发明的目的是利用微生物促进丹参生长，因此本发明通过分离鉴定、促生特性检验和盆栽促生实验，首次从丹参根内分离出能够促进丹参生长的促生菌15-1，经鉴定为Kosakoniaoryzae。丹参是以根部为药用的中药材，本发明的Kosakoniaoryzae15-1具有促进丹参生长的作用，使丹参地下鲜重增加26.8％。本发明筛选的Kosakoniaoryzae 15-1使用后不会有环境污染、农药残留等化学农药常见问题，对人畜健康、生态环境友好，符合人们对生态农业的需求。因此，使用促生菌提高丹参根部生物量的积累，不仅提高了丹参的产量，还降低了化肥农药的使用，起到保护环境的作用。

附图说明

图1为菌株15-1分泌IAA定性测定图。

图2为菌株15-1的菌落形态显微图。

图3为菌株15-1对烟叶过敏性试验结果对比图。其中图左为阳性对照，图右为菌株15-1。

图4为菌株15-1对丹参盆栽促生试验结果对比图。图左为接种LB培养基，图右为接种菌株15-1。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。

(一)促生菌的分离

取新鲜无病害的丹参植株根部，先用流水冲洗30min，然后用无菌水冲洗5 次后，对材料表面进行消毒，先用75％乙醇浸泡45s，然后用0.1％升汞中浸泡3 min，无菌水冲洗3～4次。无菌条件下，用灭菌剪刀将根段剪成3mm×3mm小块，接种到LB培养基上，28℃避光培养1～2d。若对照皿上无菌长出，则分离出来的菌为内生细菌。至菌落长出，挑取颜色、大小或形态不同的菌落在LB固体培养基表面划线分离纯化，获得3株菌株，并分别命名为15-1、15-2和15-3。

(二)IAA测定

IAA定性测定，将15-1接种于装有5mLLB液体培养基的14mL无菌离心管中，每菌株重复3次，以不接菌LB培养基为对照，28℃、180r/min条件下振荡培养3d。吸取菌液200μL于白瓷板上，加等体积Spot比色液，其中标准液加 200μL 3-吲哚乙酸IAA(20μg/mL)，将白瓷板放置于室温黑暗条下，20min内观察并记录颜色变化，如图1所示，发现15-1颜色变为粉红色，即能分泌IAA。 IAA标准曲线制定,精确称取IAA 10mg，先用少量乙醇溶解，后用蒸馏水定容至 100m L(其浓度为100μg/mL)作为贮备液，然后用贮备液配成0、100μg/mL、 75μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、20μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL 的系列标准液，作为工作液(现用现配)。10mL离心管中依次加入IAA系列浓度工作液1mL，比色液4mL，黑暗培养20min，于535nm下比色，以OD值为横坐标，以IAA浓度为纵坐标，绘出一条标准曲线。

IAA定量测定，将15-1菌株接种于LB培养液中，并在摇床进行液体过夜培养。将菌液OD600调整到1.0。在无菌的15mL离心管中加2.625mL LB液体培养液和20μL的OD值1.0发酵剂培养，用于色氨酸独立生产。另一支加入2mL 的LB培养液和加入625μLL-色氨酸(2mg/mL)(色氨酸过滤除菌)，并加入20μL 的OD值1.0的菌液于无菌的15mL离心管中。每处理重复3次。将离心管在摇床中28℃，180r/min，培养48h。吸取菌液至1.5mL离心管，5500Xg，离心10min。吸取1mL上清液，放入玻璃管中，加入4mL Salkowski's Reagent比色液摇匀，在室温下黑暗中培养20min。通过测量535nm处的吸光度来测量IAA的产生。根据标准曲线绘制值，测的15-1产IAA质量浓度可达到11.60μg/mL。

(三)促生菌鉴定

菌株形态及生理生化：15-1革兰氏染色阴性，在LB培养基上，28℃培养 48h，观测菌落形态如图2所示，菌落形态圆形凸起，表面光滑湿润，乳白色，半透明，培养基无色。能利用葡萄糖、乳糖、果糖、甘露醇、丙二酸钠，明胶液化，可解无机磷、解有机磷，有固氮性，能水解淀粉，V-P测试呈阳性，过氧化物酶呈阴性，甲基红试验为阴性，不产嗜铁素。

(四)促生菌测序

16SrDNA基因测序结果为：

(五)菌剂生产

将Kosakoniaoryzae 15-1促生菌接种于LB培养基中，在28℃、180rpm条件下振荡培养12h制备种子菌，种子菌以2％的接种量接种于LB培养基中，在28℃、180rpm条件下发酵48h，形成发酵液，即为菌剂，菌剂中Kosakoniaoryzae 15-1 促生菌浓度为10⁷～10⁸CFU/mL。

(六)菌剂对烟叶过敏性试验

以10mM MgSO₄为阴性对照，以烟草野火菌为阳性对照(YH)。在24℃， 60％-80％的高湿度条件下，经24～48h后出现过敏性坏死枯斑的为阳性反应， 3d后出现黄斑的为阴性反应。结果发现如图3所示，Kosakoniaoryzae 15-1过敏性试验为阴性反应，因此Kosakoniaoryzae 15-1无致病性，可作为促进丹参生长的促生菌。

(七)盆栽促生试验

将丹参种子在灭过菌的滤纸上萌发，然后移入灭菌后营养钵培养30d，再移入直径15cm的圆形盆中继续生长15d。采用灌根法接种促生菌，灌根前用少量清水湿润土壤，于根际接种Kosakoniaoryzae 15-1发酵液(活菌浓度为10⁷～ 10⁸CFU/mL)，发酵液用无菌水稀释10倍，每株10mL，间隔7d再接种10mL，对照组同样方法接入等量LB培养基(CK)。培养条件(24h)16h光照、28℃， 8h黑暗、28℃，75％湿度。待接种60d后，小心将苗整株挖出，洗去根部泥土，测量并记载各处理丹参苗株高、根长、地上部分鲜重、地上部分干重、根鲜重、根干重，对比参数结果如表1，生长状态对比如图4所示。

表1：Kosakoniaoryzae 15-1对丹参的促生分析

结果表明，Kosakoniaoryzae 15-1能够促进丹参株高的增加，提高地上部分鲜重及干重、地下部分鲜重，说明Kosakoniaoryzae 15-1具有良好的促生作用。

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南省农业科学院植物保护研究所

<120> 一种能够产生IAA并能促进丹参生长的促生菌及其应用

<141> 2021-01-07

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1513

<212> DNA

<213> Kosakonia oryzae

<400> 1

atntnvrsna gagtttgatc atggctcaga ttgaacgctg gcggcaggcc taacacatgc 60

aagtcgaacg gtagcacaga gagcttgctc tcgggtgacg agtggcggac gggtgagtaa 120

tgtctgggaa actgcctgat ggagggggat aactactgga aacggtagct aataccgcat 180

aacgtcgcaa gaccaaagag ggggaccttc gggcctcttg ccatcagatg tgcccagatg 240

ggattagcta gtaggcgggg taacggccca cctaggcgac gatccctagc tggtctgaga 300

ggatgaccag ccacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg 360

ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagccatgc cgcgtgtgtg aagaaggcct 420

tcgggttgta aagcactttc agcggggagg aaggcggtac ggttaataac cgtgctgatt 480

gacgttaccc gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taatacggag 540

ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcac gcaggcggtc tgtcaagtcg 600

gatgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcattcga aactggcagg ctggagtctc 660

gtagagggag gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatctg gaggaatacc 720

ggtggcgaag gcggcctcct ggacgaagac tgacgctcag gtgcgaaagc gtggggagca 780

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gtcgatttgg aggttgtgcc 840

cttgaggcgt ggcttccgga gctaacgcgt taaatcgacc gcctggggag tacggccgca 900

aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960

tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctggtc ttgacatcca cagaacctgg cagagatgcc 1020

ggggtgcctt cgggaactgt gagacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgttgtga 1080

aatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatcc tttgttgcca gcggtccggc 1140

cgggaactca aaggagactg ccagtgataa actggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc 1200

atcatggccc ttacgaccag ggctacacac gtgctacaat ggcgcataca aagagaagcg 1260

acctcgcgag agcaagcgga cctcataaag tgcgtcgtag tccggattgg agtctgcaac 1320

tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtgaatca gaatgtcacg gtgaatacgt 1380

tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgcaaa agaagtaggt 1440

agcttaacct tcgggagggc gcttaccact ttgtgattca tgactggggt gaagtcgtaa 1500

caaggtaacc gta 1513

Claims

1.一种能够产生IAA并能促进丹参生长的促生菌，该菌株编号为Kosakoniaoryzae 15-1，已保藏于已保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学山国典型培养物保藏中心，登记入册的保藏号为CCTCC M 2020924，保藏日期为2020年12月21日。

2.根据权利要求1所述的一种能够产生IAA并能促进丹参生长的促生菌，其特征在于，其筛选方法为：取新鲜无病害的丹参植株根部，先用流水冲洗30min，然后用无菌水冲洗5次后，对材料表面进行消毒，先用75％乙醇浸泡45s，然后用0.1％升汞中浸泡3min，无菌水冲洗3～4次，无菌条件下，用灭菌剪刀将根段剪成3mm×3mm小块，接种到LB培养基上，将最后一次冲洗用的无菌水涂布在LB培养基上作为对照，28℃避光培养1～2d，至菌落长出后分离纯化，若对照皿上无菌长出，则分离出来的菌为内生菌，筛选出可以产生IAA的菌株，鉴定得到Kosakoniaoryzae 15-1。

3.根据权利要求1或2所述的一种能够产生IAA并能促进丹参生长的促生菌，其特征在于，其在促进丹参生长方面的应用。

4.根据权利要求1或2所述的一种能够产生IAA并能促进丹参生长的促生菌，其特征在于，其在制备促进丹参生长的菌剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的菌剂的制备方法为：将Kosakoniaoryzae 15-1促生菌接种于LB培养基中，在28℃、180rpm条件下振荡培养12h制备种子菌，种子菌以2％的接种量接种于LB培养基中，在28℃、180rpm条件下发酵48h，形成发酵液，即为菌剂。

6.根据权利要求5所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述的菌剂中Kosakoniaoryzae 15-1促生菌浓度为10⁷～10⁸CFU/mL。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述菌剂的使用方法为：菌剂用无菌水稀释10倍，使稀释液活菌浓度为10⁶～10⁷CFU/mL，灌根于丹参根部周围；每7d灌根处理1次，共灌根2次。